KR20040110730A - ＡＰＰｓｗ 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 APPsw 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 뇌특이적 NSE 유전자의 프로모터와 인간 유래의 APPsw 치매 유발 유전자를 연결시켜 제조한 융합 유전자를 마우스의 수정란에 미세주입하고, 이 수정란을 대리모 마우스의 난관에 이식함으로써 생산된 형질전환 치매 마우스에 관한 것이다. 이러한 형질전환 치매 마우스는 인간 치매환자의 치매 증상과 유사한 뇌기능 이상과 아밀로이드β-42 및 콕스-2와 같은 독성 단백질의 발현 증가 및 캐스파제-3 효소의 발현 증가 등의 특성을 나타내는 동물모델로써 치매 질환의 치료제 또는 치매 질환의 조기 진단법 개발에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 APPsw 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 뇌특이적 NSE(Neuron-Specific Enolase) 유전자의 프로모터와 인간 유래의 APPsw 치매 유발 유전자를 연결시켜 제조한 융합(hybrid) 유전자 NSE/APPsw를 마우스의 수정란에 미세주입(microinjection)하고, 이 수정란을 대리모 마우스의 난관(oviduct)에 이식함으로써 생산된 형질전환 치매 마우스에 관한 것이다.
치매(dementia)는 기억력 장애, 판단력 상실 등 전신기능의 전반적인 장애를 동반하는 질환이다. 치매의 발병 형태는 매우 다양한데, 약 50% 정도는 알츠하이머형 치매(dementia of Alzheimer type), 20∼30%는 혈관성 치매(dementia of Vascular type), 그리고 알코올성 치매, 파킨슨병 치매 등이 있으며, 약 15∼20%는 알츠하이머형과 혈관성 치매 양쪽성으로 발병하는 것으로 알려졌다.
이 중 치매의 가장 중요한 발병 형태인 알츠하이머 질환(Alzheimer disease; AD)은 50세 이전에는 증상이 나타나는 경우가 드물지만 60세 이후로는 발생 빈도가점진적으로 증가하는 노인성 치매질환으로서, 의학기술의 발전 및 삶의 질 향상으로 인한 노인 인구의 증가에 따라 우리나라뿐만 아니라 전세계적으로 발병 인구가 급속히 증가하고 있는 질환이다. 우리나라에서 1995년 65세 이상으로 등록된 알츠하이머 질환 환자수는 241,000명으로 노인 전체 인구의 8.3%를 차지하고 있으며, 2020년에는 619,000명이 될 것으로 예측된 바 있다[보건사회연구원(1995), 후생일보(제 4763) 1998년 12월 28일]. 알츠하이머 질환은 초기에 진단되는 경우에 한해 제한적으로 치료가 가능하기 때문에 이를 조기에 정확하게 진단할 수 있는 방법과 이의 치료 방법의 개발이 절실히 요구되고 있으나, 이에 대한 발병원인조차 정확하게 밝혀지지 않은 실정이다.
알츠하이머 질환의 원인은 아직 확실하게 규명되어 있지 않으나 다음 2가지 단백질의 기능이 주목을 받고 있다. 첫째는 아밀로이드 베타-39/43(Amyloidβ-39/ 43,Aβ-39/43)이라고 하는 신경 독성 단백질인데, 이것이 고농도로 농축되어 플라그(plague)를 형성, 뇌의 기억 및 인식을 담당하는 신경세포 부위에 침적되어 뉴런의 DNA에 상해를 일으켜 알츠하이머를 일으킨다는 것이다. 또 하나는 토(tau)라는 실처럼 생긴 가느다란 단백질인데, 이것이 서로 꼬여서 엉킨 모양의 수초(tangle)를 형성하여 단백질이 이상적으로 인산화됨에 따라 뇌신경 세포의 사멸이 초래된다는 것이다.
이 중, AD의 핵심 원인 물질로서 최근 주목을 받고 있는Aβ-39/43은 39에서 43개의 아미노산으로 되어 있는데, APP(Amyloid Precursor Protein)의 세포외 도메인(extracellular domain)의 28개 아미노산과 트랜스멤브레인 도메인(transmembrane domain)의 11∼15개 아미노산으로부터 구성된다. 따라서, Aβ-39/43는 APP 유전자의 프로세싱(processing) 과정에서도 유도되어 형성되는 것이다. 이러한 Aβ-39/43의 형성은 다음의 핵심적인 유전자 및 단백 효소의 기능에 그 원인이 있다. 우선, 조기유발 AD 유전자인 프리세닐린(presenilins) PS-1 및 PS-2 중에서 PS-2 돌연변이(PS-2mt, N141Ⅰ의 Volga German Families)에 의해서Aβ-39/43의 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 또한, APPsw 발현에 의해서Aβ-39/43의 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다.
이러한 치매의 원인을 밝히고, 치료 물질을 개발하기 위해서는 임상실험을 하기 전에 실제로 실험을 할 수 있는 치매 동물 모델의 개발이 필수적이다. 이를 위하여, 미국에서 'Tg2575' 및 '런던형 마우스' 등 2종류의 치매 실험쥐가 개발되어 이용된 바 있으나, 상기 설명한 바와 같은 NSE 조절 하의 APPsw 유전자가 삽입되어 치매가 유발된 치매 실험쥐는 아직까지 개발된 바 없다.
상기와 같은 기술현실을 파악하고 알츠하이머 치매 질환의 진단 및 치료를 위한 동물 모델을 개발하기 위하여 연구한 결과, 본 발명자들은 치매 유발 유전자 인 APPsw 유전자를 도입시킨 형질전환 마우스를 개발할 수 있었다. 즉, 동물 체내에서 발현되어 치매의 원인이 되는 독성 단백질 중 하나인 아밀로이드 베타-42의 생성을 증가시키는 APPsw 유전자를 NSE 프로모터 조절 하에서 결합시키고 이러한 융합 유전자를 마우스의 수정란에 주입시킨 수정란을 착상시켜 생산한 형질전환 치매 마우스가 치매환자에게서 관찰되는 병리학적 특징을 나타냄을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 APPsw 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스를 제공하는데 있다.
상기한 본 발명의 특징 및 그 외의 다른 특징들은 후술하는 본 발명의 상세한 설명에 의하여 당업자에게 잘 드러날 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스에 있어서 APPsw 유전자의 삽입을 확인하기 위한 pNSE-APPsw의 구조와 DNA-PCR 분석 결과이다. 여기에서, A는 재조합 융합 유전자 NSE/APPsw가 삽입된 pNSE-APPsw 플라스미드의 구조를, B는 삽입 유전자의 동정 결과를 각각 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스에서의APPsw 유전자의 조직-특이적 발현을 확인하기 위한 RT-PCR 및 서던 블랏 분석 결과이다. 여기에서, A는 RT-PCR 결과를, B는 서던 블랏 분석 결과를 각각 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스 및 age-matched 대조군 마우스의 수중 미로 검사(Water Maze Tests) 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스와 대조군 마우스의 뇌 조직에서의 아밀로이드 베타-42(Amyloidβ-42)의 침적을 도트 블랏 및 면역염색법으로 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스와 대조군 마우스의 뇌 조직에서의 캐스파제-3(caspase-3)의 발현을 웨스턴 블럿 및 면역염색법으로 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스와 대조군 마우스의 뇌 조직에서의 콕스-2(Cox-2)의 발현을 웨스턴 블럿 및 면역염색법으로 확인한 결과이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뇌특이적 NSE(Neuron-Specific Enolase) 유전자의 프로모터(promoter)와 인간 APPsw 치매 유전자를 연결시켜 융합 유전자 NSE/APPsw를 제조한 다음, 상기 융합 유전자를 마우스의 수정란에 미세주입하고, 이 수정란을 대리모 마우스의 난관(oviduct)에 이식함으로써 형질전환된 치매 마우스를 제조함을 그 특징으로 한다.
본 발명은 형질전환 치매 마우스로서, 그의 크로모좀 내에 APPsw 유전자가 삽입되어 있고, 이 유전자는 뇌특이적 NSE 프로모터에 기능적으로 연결되어 있으며, 상기 APPsw 유전자가 치매를 유발하는 수준으로 발현되어 그 결과 아밀로이드 베타-42 및 콕스-2(cox-2) 단백질의 발현이 촉진되고 캐스파제-3(caspase-3) 효소의 생산이 증가되는 치매 모델 동물로서의 형질전환 치매 마우스를 제공함을 그 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
정상인의 뇌에 존재하는 아밀로이드 전구 단백질(Amyloid precursor protein ;APP)은 대개 α-세크리타제(α-secretase)에 의해 대사되어 분비형인 APPs로 대부분 존재하게 되나, 알츠하이머 환자의 뇌에서는 베타 또는 감마 세크리타제(β- or γ-secretase)가 활성화되어 APP가 프로세싱(processing)되는 과정에서 39∼43개의 아미노산으로 구성되는 아밀로이드 베타-39/43(Amyloidβ-39/43)가 다량으로 생산되게 된다. 알츠하이머 질환은 이렇게 생성된Aβ-39/43가 뇌 영역 중 기억 또는 인식을 담당하는 뉴런에 고농도로 장기간 축적되면서 이들이 단백질 플라크(plaque) 덩어리를 형성하고 DNA에 상해를 일으킴으로써 발생하는 것으로 알려져 있다. 알츠하이머 환자의 뇌에서는 APP 유전자의 돌연변이에 의하여 생산이 증가된 아밀로이드 베타-42에 의하여 캐스파제-3의 발현이 촉진되고, 콕스-2의 발현이 증가한다. 아밀로이드 베타-42는 뇌에서 기억과 인식을 담당하는 뉴런에 손상을 입히는 독성 단백질이고, 콕스 2는 염증을 유발하는 단백질이며, 캐스파제 3은 기억담당 유전자를 절단, 기억장애를 초래하는 효소이다.
상기 물질 중 아밀로이드 베타-42는 세 가지 경로를 통하여 뇌신경세포를 사멸시킨다. 먼저, 뇌세포의 소포체 수용체와 결합하여 신경세포를 죽이는 효소인 캐스파제-3을 활성화시킨다. 즉, 아밀로이드 베타-42가 뇌에 축적되면 그 자체의 독성으로 신경세포가 위축되어 신호를 전달하지 못하고 신호전달 라인들이 잘리는 현상이 발생한다. 또, 세포내에 해로운 유리기 산소를 증가시켜 그 독소로 세포를 죽인다.
이처럼 알츠하이머에 치명적인 아밀로이드 베타-42는 아밀로이드 전구 단백질(APP) 유전자의 돌연변이와 밀접한 관계에 있는데, APP 돌연변이 유전자는 치매를 일으키는 핵심 원인 유전자로 주목받고 있다.
본 발명에서의 APPsw 유전자는 인간 알츠하이머 질환을 일으키는데 관여하는 원인 유전자 중 하나이다. APP 유전자는 사람의 21번 염색체에 위치하고 있는 유전자로, 이 유전자의 돌연변이체가 유전된 사람들은 보통 65세 이전에 알츠하이머 질환이 진전된다. 이러한 APP의 돌연변이 형태로서, 670과 671 위치의 아미노산이 KM에서 AL로 변경된 돌연변이 유전자 형태를 APPsw(APP swedish) 유전자라고 한다. 이러한 APPsw 유전자는 당업계에 알려져 있는 유전자를 임의로 선택하여 사용할 수 있고, 예를 들면 Genbank 등의 유전자 정보 기관으로부터 서열에 관한 정보를 쉽게 획득할 수 있다. 이와 같은 APPsw 유전자는 치매 환자로부터 직접 분리한 것을 이용할 수도 있고, 인공적으로 합성한 것을 이용할 수도 있다.
본 발명에서의 NSE 프로모터는 상기 인간 APPsw 유전자가 동물 모델 내에서 잘 발현될 수 있도록 조절하기 위한 프로모터로, 상기 APPsw 유전자는 NSE 프로모터에 기능적으로 연결된다.
본 발명에서는 상기와 같은 APPsw 유전자와 NSE 프로모터가 서로 결합된 융합 유전자 NSE/APPsw를 인간을 제외한 각종 동물에 도입할 수 있다. 이러한 동물로는 마우스(mouse) 또는 렛트(rat) 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니고, 바람직하게는 마우스를 이용하는 것이 좋다.
본 발명에서 APPsw 유전자와 NSE 프로모터가 결합된 융합 유전자는 당업계에 주지된 각종 형질전환 방법에 따라 동물의 크로모좀 내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 형질전환 방법의 예를 들면, 동물의 수정란에 융합 유전자를 미세주입하는 방법또는 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 또는 상기 재조합 융합 유전자를 수컷 실험쥐의 정자핵에 주입한 다음 이를 암컷 실험쥐의 난자핵과 결합시켜 수정란을 만든 뒤 이를 다른 대리모 실험쥐에 착상시키는 방법을 이용할 수도 있다. 그러나, 실험을 하는 조작자의 안전성의 측면에서, 융합 유전자를 수정란에 미세주입하는 방법이 보다 바람직하다.
본 발명의 하기 제조예에서는 상기와 같은 치매 유발 유전자인 인간 APPsw 유전자와 NSE 프로모터가 서로 결합된 재조합 융합 유전자 NSE/APPsw를 BDF1 마우스의 수정란에 미세주입하고, 이와 같이 유전자가 주입된 수정란을 ICR 마우스로 이식하여 형질전환 치매 마우스 새끼를 생산하였다.
상기와 같이 APPsw 유전자와 NSE 프로모터가 기능적으로 결합된 융합 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스는 APPsw 유전자가 NSE 프로모터에 의하여 발현됨으로써 알츠하이머로 인한 다양한 병리현상을 모두 나타내는 치매 유발 마우스 모델이다. 즉, 상기 제조된 APPsw 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스를 번식시켜 알츠하이머의 표현형(phenotype)을 측정한 결과, 치매 환자에게서 특징적으로 나타나는 병리현상으로 아밀로이드 베타-42(Amyloidβ-42) 및 콕스-2(Cox-2) 등의 독성 단백질과 캐스파제-3(Caspase-3) 효소의 발현 증가가 확인되었으며, 수중 미로 검사(Water Maze Test)를 통하여 뇌기능에도 이상이 있음이 확인되었다. 이를 통하여, 본 발명에 따른 형질전환 치매 마우스는 치매 환자와 매우 유사한 행동 장애를 보이는 것을 알 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 형질전환 치매 마우스를 정상 마우스와 교배하는 경우, APPsw 유전자가 그 다음 세대로 전달된다. 즉, 교배에 의하여 상기 APPsw 유전자는 유전 가능한 것이다.
본 발명에 따른 형질전환 치매 마우스는 치매 환자가 나타내는 것과 유사한 행동이상을 나타내며, 아밀로이드 베타-42 단백질 뿐 아니라, 콕스-2 단백질과 캐스파제-3 효소의 발현 증가까지 관찰되는 등 거의 완벽한 치매증상을 보이는 것이 특징이다. 따라서, 상기와 같은 치매 관련성 물질의 발현 증가와 같은 표현 형질을 이용하는 경우 치매 발병 매커니즘의 연구에 매우 유용하게 이용할 수 있으며, 특히 치매의 치료제 또는 조기 진단법의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다. 현재 국내·외에서 개발되었거나 개발중인 치매 치료제를 투여하여 인체와 유사한 조건하에서 나타나는 다양한 치매 치료 효과, 즉 아밀로이드 베타-42 축적의 억제, 치매로 인한 행동 이상의 완화, 캐스파제-3 및 콕스-2 활성의 저하를 확인함으로써 치매 치료제의 치매 치료 효과를 검정할 수 있으며, 또한 치매 질환의 원인을 연구하는 동물 모델로도 사용 가능하다.
이하, 본 발명의 구성을 제조예 및 시험예를 들어 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이들에 한정하는 것은 아니다.
〔제조예 1〕APPsw 유전자가 삽입된 형질전환 치매 마우스의 제조
① 유전자의 확보 및 재조합
본 실험에 사용된 유전자 중 NSE 프로모터는 Sutcliffe 박사(Research Institute of Scrippe Clinic)로부터, APPsw 유전자는 미국 컬럼비아 대학의 김태완 교수로부터 기증받아 사용하였다.
유전자의 재조합은 NSE 프로모터, APPsw 유전자, 종결인자의 순서대로 결합하여 사용하였다. APPsw 유전자(Martin C, Tilman O, Christian H, Lisa M, Albert YH, Peter S, Carmen VP, Ivan L, Dennis JS (1992) Mutation of the β-amyloid precursor protein in familial Alzheimer's disease increases β-protein production.Nature360:672-674; Gen Bank Acession Number:Y00264)를 이 유전자에 대하여 특이적인 프라이머(센스:5'-TCTAG ATCGC GATGC TGC-3', 안티센스:5'-GTCTA GAGTC TAGTT CTGCA-3')를 이용하여 PCR 증폭한 후 TA 벡터에 클로닝하고 XbaI/SpeI로 절단하여 XhoI/EcoRI으로 절단된 pNSE-splice 벡터에 삽입하여 융합 유전자 NSE/APPsw를 완성하였다.
② 융합 유전자의 순수분리 및 마우스 수정란에 미세주입
재조합 융합 유전자(recombinant fusion gene) NSE/APPsw를 순수분리하기 위하여 박테리아에서 기원된 유전자 부위를 절단하여 제거하고, 진핵세포 발현 부위만을 수확하여 물에 녹여 사용하였다. 순수분리된 상기 융합 유전자 NSE/APPsw를 4ng/㎕의 농도로 희석하여 마우스(BDF1)의 수정란에 미세주입하였다. 상기 유전자가 주입된 수정란을 가임신한 ICR 마우스에 착상시켜 새끼를 생산하였다.
③ 형질전환 마우스의 확인
상기에서 생산된 새끼의 꼬리를 절단하여 genomic DNA를 분리한 후, 상기 재조합 융합 유전자에 특이적인 프라이머(Gibco BRL Co. 제작의뢰)를 이용한 DNA-PCR을 수행하여 APPsw 유전자의 삽입을 확인하였다.
상기 재조합 융합 유전자에 특이적인 프라이머 서열은 하기와 같다.
sense : 5'-TCGCG ATGCT GC-3'
anti-sense : 5'-CTCTT CTCAC TGCAT GTCTC-3'
그 결과를 도 1에 나타내었다. 플라스미드 pNSE-APPsw는 NSE 유전자 프로모터의 조절 하에 위치하고 있는 APPsw 유전자를 포함하고 있다(도 1A). 또한, DNA-PCR 분석 결과, NSE/APPsw 트랜스 유전자를 갖는 형질전환 생쥐에서 509 bp 크기의 PCR 산물이 확인되었다(도 1B의 #1223 및 #1228).
또한, 상기와 같이 APPsw 유전자가 확인된 형질전환 마우스를 정상의 마우스와 교배한 결과, APPsw 유전자가 후대로 전달됨을 확인할 수 있었다.
상기와 같이, NSE/APPsw 융합 유전자를 진핵세포 발현부위로 삽입시켜 형질전환시킨 마우스의 수정란, 즉 APPsw 유전자가 크로모좀 내로 삽입된 형질전환 치매 마우스의 수정란을 국제기탁기관인 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2003년 6월 10일자로 기탁하였으며, 그로부터 기탁번호 KCTC 10448BP를 부여받았다.
〔시험예 1〕형질전환 치매 마우스의 각 조직에서의 APPsw 유전자의 발현 확인
상기 형질전환 치매 마우스로부터 각 조직을 분리하여 APPsw 유전자가 조직 특이적으로 발현하는가를 확인하였다. 이를 위하여, 상기 형질전환 치매 마우스의 뇌, 폐, 심장, 간, 신장, 소장 조직을 이용하여 랫드 NSE 프로모터 조절하의 APPsw 유전자의 각 조직에서의 발현을 RT-PCR 및 서던 블랏으로 확인하였다.
그 결과를 도 2에 나타내었다. 대조군으로서의 β-액틴 시그널 및 그들의 전사체(transcript, 640 bp)를 RNA의 로딩을 가리키기 위하여 나타내었다. RT-PCR 결과(도 2A) 뇌 조직으로부터 509bp의 PCR 산물이 확인되었으며, 서던 블랏 분석 결과(도 2B) 120kDa 크기의 APP 유전자 산물이 확인되었다. 즉, APPsw 융합 유전자의 발현은 뇌-특이적 방식(brain-specific manner)으로 조절됨을 확인할 수 있다.
〔시험예 2〕뇌 기능이상의 측정
상기 NSE/APPsw 형질전환 치매 마우스가 정상적인 쥐와 비교했을 때 뇌 기능에 이상이 있는지의 여부를 확인하기 위해 수중 미로 검사(Water Maze Test)를 실시하였다.
그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3A는 수중 미로의 전방 플랫폼 위치를 가로지르는 도피 지연(escape latency), 도피 거리(escape distance) 및 수영 속도(swimming velocity)의 패턴을 측정한 결과이다[3회 실험의 평균±SD, water maze subjects와 수행된 3회 실험의 메디안 지수(median values) 및 SD는 n=3,P<0.01이다]. 형질전환 치매 마우스의 도피 지연 및 도피 거리는 대조군 마우스의 그것에 비하여 더 길게 나타나는 일관적인 경향을 나타내었다. 그러나, 수영 속도에 있어서는, 형질전환 마우스와 대조군 마우스가 동일한 수준을 보였다. 도 3B는 형질전환 치매 마우스 및 대조군 마우스의 수영 패턴을 나타낸 것으로, 형질전환 치매 마우스와 대조군 마우스 사이의 패턴은 유의적인 차이가 있음을 알 수 있다.
상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, NSE/APPsw 형질전환 치매 마우스와 정상쥐 사이에서 도피 지연 및 도피 거리 측정치의 현저한 차이가 나타났으며, 결과적으로 본 발명 형질전환 치매 마우스는 뇌 기능의 이상으로 인하여 행동에 이상이 나타남을 알 수 있다.
〔시험예 3〕형질전환 치매 마우스의 뇌에서의 Aβ-42 침적 확인
형질전환 치매 마우스의 뇌에서 치매의 원인이 되는 독성 단백질인 아밀로이드β-42(Amyloid beta-42)의 침적이 증가하였는가를 도트 블랏(dot blot)과 면역염색으로 확인하였다.
형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 뇌로부터 분리한 단백질 40 ㎍을 전이시킨 니트로셀룰로스 필터를 항-인간 Aβ-42 항체와 함께 배양하고 그 수준을 정량화하였다(도 4A). 각각의 수치는 3회 실험 결과를 평균±SD로 나타낸 것이다(P<0.028).
형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 뇌로부터 분리한 단백질 10 ㎍을 전이시킨 니트로셀룰로스 필터를 항-인간 Aβ-42 항체와 함께 배양하였다. Aβ-42의상대적 수준을 획득하기 위한 사진농도측정(densitometry)에 의하여 그 밴드를 정량화하였다(도 4B). 각각의 수치는 3회 실험 결과를 평균±SD로 나타낸 것이다 (P<0.029).
또한, Aβ-42의 면역화학 염색(immunochemical staining)을 위하여, 형질전환 마우스 및 대조군 마우스로부터 절단한 20 ㎛ 두께의 뇌 절편을 항 인간 Aβ-42 일차 항체 및 HRP-컨쥬게이티드 거트 항-래빗 IgG와 함께 배양하였다. 그 결과 조직을 현미경(microscope)으로 관찰하여 도 4C에 나타내었다. 이 때, 대뇌 피질(cortex)을 현미경 배율 ×40로 관찰한 경우를 a와 b에, ×400인 경우를 c와 d에 나타내었고, 해마회(hippocampus) 영역을 ×40의 배율로 관찰한 결과를 e와 f에 나타내었다.
형질전환 마우스의 뇌 조직에서 Aβ-42 축적의 광범위한 분포 및 센 강도를 확인할 수 있었는데, 대조군 마우스에 비하여 약 3배 정도 증가한 것으로 나타났다.
〔시험예 4〕형질전환 치매 마우스의 caspase-3의 활성
캐스파제-3(caspase-3) 효소 활성이 치매 환자에서 나타나는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명에 따른 NSE/APPsw 형질전환 치매 마우스에서도 캐스파제-3 효소 활성이 나타나는가를 알아보기 위하여, 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 대뇌 피질 및 해마회 영역의 뉴런을 대상으로 캐스파제-3의 웨스턴 블럿팅 및 면역염색을 실시하였다.
웨스턴 블럿팅 결과를 도 5A에 나타내었다. 형질전환 치매 마우스에서는 캐스파제의 활성화 상태인 P17이 관찰되었으며, 대조군 마우스에서는 불활성화 상태인 CPP32이 관찰되었다. 즉, 형질전환 치매 마우스에서 캐스파제-3 효소의 활성화 형태(activated form) 밴드가 나타난 것을 확인할 수 있었다.
도 5B는 형질전환 마우스 및 aga-matched 대조군 마우스의 뇌 절편을 항-캐스파제-3 항체 및 페록시다제 중화 처리한 후, 캐스파제-3에 대하여 제조된 항체로 표지하고, 항-래빗-HRP 구체화(visualization)를 실시한 결과이다. 대조군 마우스의 피질 및 해마 영역에서 캐스파제-3-음성 뉴런(negative neuron)이 흩어져 있었으며(a, c, e), 형질전환 마우스의 피질 및 해마 영역에서는 캐스파제-3-양성이 강하게 관찰되었다(a, e, b, f; c와 d는 현미경 배율 ×200으로 관찰한 것). 이를 통하여, 본 발명의 형질전환 치매 마우스에서 캐스파제-3가 활성화되었음을 확인하였다.
〔시험예 5〕형질전환 치매 마우스의 Cox-2의 발현 유도 측정
치매환자의 뇌에서는 콕스-2(Cox-2) 효소의 활성도가 높은 것으로 알려져 있다. 이에, NSE/APPsw 형질전환 치매 마우스에서도 콕스-2의 활성이 나타나는가를 웨스턴 블럿팅에 의해 확인하였다. 형질전환 치매 마우스 및 대조군 마우스의 뇌 균등물의 펠렛(pellet)을 웨스턴 블럿으로 분석하였다. 블럿은 설치류 및 인간 APP를 인식하는 인간 APP-특이적 항체로 면역염색하였다. 고분자량에서 밴드 이동의 동일성(identity)은 알려져 있지 않다.
형질전환 치매 마우스 및 대조군 마우스 뇌의 피질 및 해마회 영역에서 낮은 수준의 콕스-2 항체가 확인되었다. 각각의 수치는 3회 실험 결과의 평균±SD로 나타낸 것이다(P<0.044)(도 6A).
피질층과 해마회에서의 콕스-2 면역활성(immunoreactivity)의 강한 축적은 형질전환 마우스에서 독특하게 나타난 것이다(b, d, f). 배율 ×200의 고배율에서의 형질전환 마우스 및 대조군 마우스의 콕스-2 유전자 면역활성을 각각 c 및 d에, 배율 ×40의 저배율에서의 형질전환 마우스의 그것을 b 및 f에, 대조군 마우스의 그것을 a 및 e에 나타내었다.
콕스-2의 활성화된 형태의 밴드가 확인되었는데, 형질전환 치매 마우스에서 정상인 대조군 마우스보다 5배 이상 증가하는 것으로 나타났다.
이상에서 설명한 바와 같이, 치매 유발 유전자인 APPsw 유전자와 NSE 프로모터를 결합시킨 재조합 융합 유전자를 마우스 수정란에 주입하여 제조한 형질전환 치매 마우스는 APPsw 유전자를 발현함에 따라 치매 환자의 행동이상을 그대로 나타내며, 특히 아밀로이드 베타-42 단백질 뿐 아니라, 콕스-2 단백질과 캐스파제-3 효소의 발현 증가까지 관찰되는 등 거의 완벽한 치매증상을 보이는 뛰어난 효과가 있으므로, 치매 치료제 또는 조기 진단법의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다.
Claims (7)
- 염색체 안에 인간 유래의 APPsw 유전자가 통합되어 있고, 상기 APPsw 유전자는 NSE 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 형질전환된 비인간 동물.
- 제 1항에 있어서, 상기 형질전환된 비인간 동물은 상기 APPsw 유전자가 발현되어 치매가 유발된 것을 특징으로 하는 형질전환된 비인간 동물.
- 제 2항에 있어서, 상기 형질전환된 비인간 동물은 상기 APPsw 유전자가 발현되어 아밀로이드 베타-42, 콕스-2 또는 캐스파제-3의 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 비인간 동물.
- 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비인간 동물을 마우스 (mouse)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 비인간 동물.
- (1) APPsw 유전자와 NSE 프로모터를 기능적으로 연결시켜 재조합 융합 유전자를 준비하는 단계;(2) 상기 재조합 융합 유전자를 마우스의 수정란에 미세주입하는 단계; 및(3) 상기 수정란을 대리모 마우스에 착상시켜 새끼를 생산하는 단계;를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 형질전환 치매 마우스의 제조방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 (3) 단계의 수정란은 BDF1으로 명명된 기탁번호 KCTC 10448BP의 수정란임을 특징으로 하는 형질전환 치매 마우스의 제조방법.
- 제 5항 또는 제 6항의 제조방법에 의하여 제조된 형질전환 치매 마우스.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030040171A KR20040110730A (ko) | 2003-06-20 | 2003-06-20 | ＡＰＰｓｗ 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030040171A KR20040110730A (ko) | 2003-06-20 | 2003-06-20 | ＡＰＰｓｗ 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20040110730A true KR20040110730A (ko) | 2004-12-31 |
Family
ID=37383081
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020030040171A KR20040110730A (ko) | 2003-06-20 | 2003-06-20 | ＡＰＰｓｗ 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20040110730A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100734815B1 (ko) | 2006-02-15 | 2007-07-09 | 대한민국 | Ｈｔａｕ24 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 및 그제조방법 |
-
2003
- 2003-06-20 KR KR1020030040171A patent/KR20040110730A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100734815B1 (ko) | 2006-02-15 | 2007-07-09 | 대한민국 | Ｈｔａｕ24 유전자를 발현하는 형질전환 치매 마우스 및 그제조방법 |
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