JP2003169679A

JP2003169679A - ヒトβ３受容体発現動物

Info

Publication number: JP2003169679A
Application number: JP2001373326A
Authority: JP
Inventors: Tomoyuki Yamashita; 知幸山下; Kohei Ogawa; 行平小川
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 2001-12-06
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2003-06-17

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒトβ３受容体発現動物の提供。【解決手段】非ヒト動物のβ３アドレナリン受容体をコ
ードする遺伝子のプロモーター領域の支配下にヒトβ３
アドレナリン受容体の構造遺伝子を連結したDNA、及び
該DNAを遺伝子導入してなる非ヒト動物又はその一部。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトβ３アドレナ
リン受容体遺伝子導入動物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】βアドレナリン受容体は、神経伝達物質
の一種であるノルアドレナリン、及びクロマフィン細胞
から放出されるアドレナリンにより活性化される受容体
の一種であり、β１、β２、β３に分類される。β１の
刺激は拍動数の増加を引き起こし、β２の刺激は平滑筋
組織の弛緩を誘起し、血圧を低下させ、β３は脂肪細胞
の脂肪分解を促進させ、熱産生を上昇させると考えられ
ている。従って、β３アドレナリン受容体作動薬が、糖
尿病、肥満、高脂血症の予防、治療薬として有用である
ことが示されている（Nature 309, p163-165, 1984、 I
nt. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 20, p191-199, 1
996、 Drug Development Research 32, p69-76, 1994、
J. Clin. Invest. 101, p2387-2393, 1998）。

【０００３】β３アドレナリン受容体は主に脂肪細胞に
存在する。薬理学的な解析により、β３アドレナリン受
容体が白色脂肪細胞における脂肪分解（脂肪を脂肪酸と
グリセロールに分解する）、及び褐色脂肪細胞における
熱産生（脂肪酸を熱と二酸化炭素に分解する）に関与し
ていることが示されている（Annu. Rev. Pharmacol.Tox
icol., 37, p421-450, 1997）。発生工学的な手法によ
るβ３アドレナリン受容体の機能解析も行われ、ススリ
ック（Susulic）らはβ３アドレナリン受容体が欠損し
たマウスを作製し、この欠損マウスの体脂肪量が野生型
マウスより多いことを示している（J. Biol. Chem., 27
0, p29483-29492, 1995）。またリヴェリ（Revelli）ら
もβ３アドレナリン受容体欠損マウスを作製し、野生型
マウスよりこの欠損マウスの方が体脂肪量が多いこと、
及び高脂肪食により体脂肪が増加しやすいことを示して
いる（J. Clin. Invest., 100, p1098-1106, 1997）。
これらノックアウトマウスを用いた解析により、β３ア
ドレナリン受容体の機能低下が、体脂肪の蓄積、すなわ
ち肥満症に結びつくことが明らかにされている。

【０００４】ところで、β１アドレナリン受容体又はβ
２アドレナリン受容体に作用するβ３作用薬は、患者に
投与すると副作用を生じる可能性が懸念される。従っ
て、上記β３アドレナリン受容体に関する知見から、こ
うした副作用を生じる可能性が懸念されるβ１アドレナ
リン受容体及びβ２アドレナリン受容体には作用せず、
選択的にβ３アドレナリン受容体を活性化する薬剤で肥
満症や糖尿病を治療する試みがなされている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトβ３ア
ドレナリン受容体遺伝子導入動物を提供することを目的
とする。具体的には、本発明は、ヒトβ３アドレナリン
受容体の機能の解明、脂質代謝研究、肥満症、糖尿病な
どにおける予防・治療方法の検討、ヒトβ３アドレナリ
ン受容体発現細胞の供給、ヒトβ３アドレナリン受容体
のリガンド結合研究、ヒトβ３アドレナリン受容体の標
的遺伝子制御機構などを解明することを目的として利用
するのに、最適な動物を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】従来より、β３アドレナ
リン受容体への選択性が高い薬剤が望まれているが、げ
っ歯類とヒトのβ３アドレナリン受容体の種差により、
げっ歯類のβ３アドレナリン受容体でスクリーニングし
た薬剤は、ヒトβ３アドレナリン受容体に対する作用が
弱いことが知られている（Horm. Metab. Res., 22, p17
-21, 1989, Br.J. Pharmacol., 110, p929-936, 1993,
Horm. Metab. Res., 28, p394-396, 1996）。この種差
を解決するため、近年、ヒトβ３アドレナリン受容体を
発現する培養細胞を用いたスクリーニングが行われてい
る。しかしながら、リコンビナント細胞によりスクリー
ニングされたヒトβ３アドレナリン受容体アゴニスト
は、種差の問題により、実験動物のβ３アドレナリン受
容体に作用しない可能性も十分に予測される。

【０００７】近年、イトウ（Ito）らはススリックらの
β３欠損マウスに、プロモーター領域を含むヒトβ３ア
ドレナリン受容体遺伝子を導入し、ヒトβ３アドレナリ
ン受容体のみを発現するトランスジェニックマウスを作
製している（Diabetes, 47,p1464-1471, 1998）。げっ
歯類のβ３アドレナリン受容体は白色脂肪組織及び褐色
脂肪組織の両方に発現しているが、ヒトではβ３アドレ
ナリン受容体は主に褐色脂肪組織に発現し、白色脂肪組
織にはわずかしか発現していないことが知られている
（Endocrinology, 135, p1025-1031, 1994）。また、It
oらのトランスジェニックマウスは、ヒトのβ３アドレ
ナリン受容体プロモーター領域を利用しているため、受
容体の発現量は褐色脂肪組織で高いものの白色脂肪組織
にはほとんど発現していない。従って、マウス等のげっ
歯類を用いてヒトβ３アドレナリン受容体アゴニストの
薬理作用を試験するためには、ヒトβ３アドレナリン受
容体がマウス脂肪組織での発現パターン、すなわち、白
色脂肪組織及び褐色脂肪組織の両方で発現しているマウ
スを用いることが望ましく、また、そのマウスが肥満、
糖尿病の病態を示していればなお良いことを本発明者ら
は見出した。しかしながら、こうした動物がまだ作製さ
れていないのが現状である。

【０００８】また、目的のタンパク質を脂肪細胞特異的
に発現させるトランスジェニックマウスを作製する場
合、ほとんどがaP2 脂肪酸結合タンパク質のプロモータ
ー領域（5.4kb）が用いられている（Endocrinology, 14
2, p348-358, 2001、J. Biol.Chem., 275, p34797-3480
2, 2000、Am. J. Physiol., 270, pE768-775, 1996、Pr
oc. Natle. Acad. Sci. U. S. A., 87, p9590-9594, 19
90）。脂肪組織特異的（白色脂肪組織＋褐色脂肪組織）
に目的タンパクを発現させるツールとして、マウスβ３
受容体のプロモーター領域を利用した報告はまだない。

【０００９】本発明者らは、上記の課題を解決するため
に鋭意研究した結果、非ヒト動物のβ３アドレナリン受
容体遺伝子のプロモーター領域の支配下にヒトβ３アド
レナリン受容体の構造遺伝子を組み込んだDNAを有する
非ヒト動物の作製に成功し、驚くべきことにそのヒトβ
３アドレナリン受容体の実質的な発現組織が白色脂肪及
び褐色脂肪組織であることを見出した。さらに、非ヒト
動物のβ３アドレナリン受容体遺伝子のプロモーター領
域の支配下にヒトβ３アドレナリン受容体の構造遺伝子
を組み込んだDNAを遺伝子導入した非ヒト動物に肥満、
糖尿病を発症させ、ヒトβ３を発現する肥満、糖尿病モ
デル動物の作製に初めて成功し、本発明を完成した。

【００１０】すなわち、本発明は以下の通りである。（１）非ヒト動物のβ３アドレナリン受容体遺伝子の
プロモーター領域の支配下にヒトβ３アドレナリン受容
体をコードする遺伝子を連結したDNA。（２）マウスのβ３アドレナリン受容体遺伝子のプロ
モーター領域の支配下にヒトβ３アドレナリン受容体を
コードする遺伝子を連結したDNA。（３）前記(1)又は(2)のDNAを遺伝子導入してなること
を特徴とする非ヒト動物又はその一部。（４）前記(1)又は(2)のDNAを遺伝子導入してなること
を特徴とするマウス又はその一部。（５）ヒトβ３アドレナリン受容体を白色脂肪組織及
び褐色脂肪組織に実質的に発現させたことを特徴とする
非ヒト動物又はその一部。

【００１１】本発明の動物（マウスを含む）又はその一
部は、高脂肪食を与えることにより肥満又は糖尿病のい
ずれかの病態を示すことを特徴とし、また、遺伝的な病
態を示す非ヒト動物との交配により肥満又は糖尿病のい
ずれかの病態を示すことを特徴とする。ここで、上記マ
ウスは、Ａ^ｙマウスとの交配により得られたマウスであ
って肥満又は糖尿病のいずれかの病態を示すものを例示
することができる。

【００１２】（６）前記動物若しくはその一部、又は
前記マウス若しくはその一部に被験物質を適用し、ヒト
β３アドレナリン受容体に関連する疾患に対する前記被
験物質の効果を検定することを特徴とする、β３アドレ
ナリン受容体に関連する疾患の予防又は治療のために用
いられる物質のスクリーニング方法。

【００１３】β３アドレナリン受容体に関連する疾患と
しては、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化
症、排尿障害、肝疾患、心疾患、脳疾患、消化器疾患、
内分泌疾患及び癌からなる群から選択される少なくとも
一つが挙げられ、本発明においては、単一の疾患をスク
リーニングすることも、これらの疾患から選択される複
数の疾患をスクリーニングすることもできる。

【００１４】（７）非ヒト動物のβ３アドレナリン受
容体遺伝子のプロモーター領域の支配下に目的タンパク
質をコードする遺伝子を連結したDNAを遺伝子導入して
なることを特徴とする非ヒト動物又はその一部。（８）目的タンパク質を実質的に白色脂肪組織及び褐
色脂肪組織に発現させたことを特徴とする非ヒト動物又
はその一部。（９）目的タンパク質を実質的に非ヒト動物の白色脂
肪組織及び褐色脂肪組織に発現させることを特徴とす
る、非ヒト動物又はその一部の作製方法。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明は、ヒトβ３アドレナリン
受容体をコードする遺伝子（ヒトβ３-ＡＲ遺伝子とも
いう）が、非ヒト動物のβ３アドレナリン受容体のプロ
モーターの制御下で発現できるように、当該プロモータ
ーの支配下にヒトβ３-ＡＲ遺伝子を連結したDNAに関す
るものであり、上記DNAを動物に導入することにより、
ヒトβ３アドレナリン受容体の実質的な発現組織を白色
脂肪組織及び褐色脂肪組織とすることを特徴とするもの
である。

【００１６】１．非ヒト哺乳動物のβ３アドレナリン受
容体遺伝子の発現ユニットを持つ発現用組換えDNAの作
製本発明において、宿主である非ヒト動物細胞を形質転換
するための発現用組換えDNAは、ヒト由来のβ３アドレ
ナリン受容体をコードする遺伝子（構造遺伝子）をプロ
モーターに連結又は挿入することにより得ることができ
る。ここで、プロモーターとは、非ヒト動物のβ３アド
レナリン受容体をコードする遺伝子の転写プロモーター
であって、上記ヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子を発
現させることができるように機能するものである。上記
プロモーターとしては、マウス由来のβ３アドレナリン
受容体をコードする遺伝子から得られるプロモーターが
挙げられる。

【００１７】本発明においては、ヒトβ３アドレナリン
受容体遺伝子に、予めプロモーターを連結した遺伝子発
現カセットを作製しておいて、これをベクターに組み込
むこともできる。プロモーターを連結する場合は連結及
び挿入の順序は任意であるが、ヒトβ３アドレナリン受
容体遺伝子がプロモーターの支配下に機能させるように
するため、プロモーターの下流に当該遺伝子を連結し、
さらにその下流にターミネーターを連結することが好ま
しい。本発明においては、ヒトβ３アドレナリン受容体
遺伝子、プロモーター及びターミネーターは、正しい転
写方向を有する限り順不同で組み込むことができる。

【００１８】ヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子及びプ
ロモーターは、公知の遺伝子単離方法により、又は市販
のキットを用いて得ることができる。ヒトβ３アドレナ
リン受容体遺伝子とプロモーターとの連結は、例えばリ
ガーゼを用いた公知の任意の手法により行うことができ
る。

【００１９】本発明で対象とし得るβ３アドレナリン受
容体遺伝子のプロモーター領域の由来となる非ヒト動物
としては、例えばウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、
イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット又はマウ
ス等の非ヒト哺乳動物があげられ、なかでもげっ歯目
（Rodentia）が好ましく、とりわけマウス、特にC57BL/
6系統のマウスがさらに好ましい。また、遺伝子を導入
する対象となる非ヒト動物も、上記と同様の動物を例示
することができる。遺伝子を導入して疾患モデル動物と
して使用する場合は、本発明ではC57BL/6系統のマウス
が最も好ましい。

【００２０】β３アドレナリン受容体遺伝子のプロモー
ター領域の由来となる非ヒト動物と、DNAを遺伝子導入
する非ヒト動物とは、異種であってもよいが、好ましく
は同種である。他に鳥類動物として、ニワトリなども本
発明で対象とする非ヒト動物に含まれる。これらの遺伝
子導入する非ヒト動物はノックアウトされていてもされ
ていなくても良い。

【００２１】ヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子はエモ
リン（Emorine）ら、（Science，245，p1118-1121，198
9）により初めて単離されている。該受容体は７回膜貫
通ドメインを有するG蛋白結合受容体（GPCR）に分類さ
れ、アドレナリンなどの刺激を受けると細胞内のcAMPが
増加する。単離されたヒトβ３アドレナリン受容体DNA
をCHO細胞で発現させると、アドレナリン刺激により細
胞内のcAMPが増加することから、機能面においてもヒト
β３アドレナリン受容体遺伝子であることが確認されて
いる。ヒトβ３アドレナリン受容体は、当初は402アミ
ノ酸のポリペプチドであるとされていたが、グラネマン
（Granneman）ら、（Mol. Pharmacol.，42，p964-970，
1992）の指摘により、今日ではヒトβ３アドレナリン受
容体遺伝子内にはイントロンが存在し、アミノ酸をコー
ドする領域は第1、第2エキソンに含まれ、408アミノ酸
のポリペプチドであることが知られている。上記したヒ
トβ３アドレナリン受容体遺伝子以外にも、レリアス
（Lelias）らによる、ヒトβ３アドレナリン受容体cDNA
（FEBS Letters，324，p127-130，1993）が公知であ
る。

【００２２】本発明におけるヒトβ３アドレナリン受容
体遺伝子とは、この遺伝子をCHO細胞に導入して発現さ
せたときに、上記細胞系においてアデニル酸シクラーゼ
の活性化に関与できるような部位を含む遺伝子であっ
て、その活性化が、エモリンらが報告（Science，24
5，p1118-1121，1989）しているように、サルブタモー
ル、BRL37344及び(1)-イソプロテレノールの順で増大
し、かつ、グラネマン（Granneman）らが報告（Mol.
Pharmacol.，42，p964-970，1992）しているように、制
限酵素地図における切断部位（図１）のうち少なくとも
BglII、SacI、BamHI及びPstIの位置が一致する遺伝子を
意味する。この遺伝子には、以上の機能的、構造的な特
徴を有する遺伝子の中で、好ましくは402アミノ酸又は4
08アミノ酸をコードしているものが含まれる。

【００２３】また、アミノ酸のコード領域だけをヒトβ
３アドレナリン受容体遺伝子とし、エクソン内の非翻訳
領域やイントロン領域を非ヒト動物由来の配列に置き換
えた、キメラヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子を用い
てもよい。また、ヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子の
アミノ酸コード領域の配列は、受容体としての機能が変
わらない限り、制限酵素サイトを作出する、活性部位で
ない部分を削除するなどの変更を行ってもよい。

【００２４】さらに、上記ヒトβ３アドレナリン受容体
遺伝子とプロモーターとが連結したDNAの一部と相補的
な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
し、かつ、ヒトβ３アドレナリン受容体を発現すること
ができるDNAも本発明に使用することができる。本発明
においてストリンジェントな条件とは、上記DNA同士を
ハイブリダイズさせたときに、塩濃度が15〜30mMであ
り、温度が60〜68℃であってもハイブリダイズ状態が維
持される条件をいう。

【００２５】ヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子とプロ
モーターとが連結した本発明のDNAを宿主内に導入する
ために使用されるDNAは、宿主細胞に遺伝的に保持(ゲノ
ム内への組込みを含む)されるものであれば特に限定さ
れず、例えば、プラスミド DNA、バクテリオファージ、
レトロトランスポゾンDNA等が挙げられる。また、ゲノ
ム内への組込み(integration)による宿主への導入のた
めの発現用組換えDNA断片としては、PCR法又は化学合成
により作製されたものを使用することも可能である。

【００２６】プラスミド DNAとしては、例えば大腸菌由
来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC1
18、pUC119などのColE系プラスミド等）、枯草菌由来の
プラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられ、
ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21
A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）等が挙げら
れる。レトロトランスポゾンとしては、Ty因子などが挙
げられる。

【００２７】さらに、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカーなどを連結することができる。転
写ターミネーターは、宿主中で活性を持つものであれば
いずれの遺伝子に由来するものでもよい。例えば動物細
胞での発現用としてSV40 poly A、TK(Thymidine kinas
e) poly A等を用いることができる。

【００２８】２．遺伝子導入動物本発明の遺伝子導入動物は、未受精卵、受精卵、精子及
びその始原細胞を含む胚芽細胞などに、所定の遺伝子導
入方法によって目的とするヒトβ３アドレナリン受容体
遺伝子を導入することにより作出される。導入の対象と
なる細胞は、非ヒト動物の発生における胚発生の段階の
細胞が好ましく、単細胞又は受精卵細胞の段階でかつ一
般に８細胞期以前の細胞がさらに好ましい。遺伝子導入
方法は特に限定されるものではなく、例えばリン酸カル
シウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集
法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン
法、DEAE-デキストラン法などが挙げられる。

【００２９】遺伝子が導入された細胞（例えば受精卵）
は、偽妊娠状態となった仮親の卵管に移植し、着床させ
る。例えば、仮親から生まれた子のうちトランスジェニ
ック動物を選ぶ。その後正常な動物と交配し、F1を得て
系統を樹立する。系統（トランスジェニック動物）樹立
ができたもののみについて発現パターンの解析、表現型
の解析、などを行なう。

【００３０】発現パターンの解析は、F1動物を交配し、
胚と成体における発現パターンを解析する。表現型の解
析は、樹立した動物系統について、ヘテロ及びホモ動物
の表現型を解析する。表現型は、肉眼的観察、解剖によ
る内部臓器の観察、各臓器の組織切片の観察、各臓器の
遺伝子発現の観察、X線撮影による臓器又は骨格系の観
察、行動や記憶の観察、血液検査等を用いて解析するこ
とができる。

【００３１】また本発明においては、該遺伝子導入方法
により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とす
る遺伝子を導入し、細胞培養、組織培養などに利用する
こともできる。さらに、これらの細胞を上述の胚芽細胞
と公知の細胞融合法によって融合させることにより遺伝
子導入動物を作出することもできる。

【００３２】さらに、このようにして作製された遺伝子
導入動物の一部も、本発明の「ヒトβ３アドレナリン受
容体遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト動物の生体
の一部」として、本発明の「ヒトβ３アドレナリン受容
体遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト動物」と同様
な目的に用いることが出来る。「遺伝子導入動物の一
部」としては、例えば、ヒトβ３アドレナリン受容体遺
伝子を組み込んだDNAを有する細胞、組織、臓器などが
挙げられ、あるいはこれらに由来する細胞又は組織を培
養し、必要に応じ、継代したものなども「一部」に含ま
れる。

【００３３】本発明のヒトβ３アドレナリン受容体遺伝
子を組み込んだDNAを有する非ヒト動物は、遺伝的な病
態を示す非ヒト動物（例えば肥満及び/又は糖尿病モデ
ル）との掛け合わせにより、ヒトβ３アドレナリン受容
体遺伝子を組み込んだDNAを有し、且つ、肥満又は糖尿
病のいずれかの病態を示す動物モデルを作製することが
可能である。遺伝的な病態とは、生後一定期間内発症す
ることが遺伝学上本来的に予定されている病態を意味す
る。遺伝的な肥満又は糖尿病モデルとしては、例えば、
ob/obマウス(Zhangら、Nature, 372, p425-432, 199
4)、db/dbマウス(Chenら、Cell, 84, p491-495, 199
6)、A^yマウス(Bultmanら、Cell, 71, p1195-1204, 199
2)、Zucker fattyラット(Chuaら、Science, 271, p994-
996, 1996)などが挙げられる。

【００３４】また、本発明のヒトβ３アドレナリン受容
体遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト動物に高脂肪
食を与え、肥満及び/又は糖尿病の病態を発症する動物
モデルを作製することが可能である。高脂肪食とは、例
えば420kcal/100g以上の熱量で、かつ、全熱量の40％以
上が脂肪由来である動物用飼料を意味する。より具体的
には、ミルクカゼインを24.5％、コーンスターチを2
1.5％、コーンオイルを20.0％、グラニュー糖を10.0％
含み、熱量が421kcal／100gで全熱量の43％が脂肪由来
である動物用飼料、あるいは、コーンスターチを36
％、ミルクカゼインを14％、グラニュー糖を10％含み、
精製ラードを20％含み、熱量が432kcal／100gで全熱量
の42％が脂肪由来である動物用飼料（いずれも日本クレ
ア社製）などが例示される。

【００３５】３．ヒトβ３アドレナリン受容体に関連す
る疾病の予防・治療のために用いる物質のスクリーニン
グ本発明の非ヒト動物のβ３アドレナリン受容体遺伝子の
プロモーター領域の支配下にヒトβ３アドレナリン受容
体構造遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト動物又は
該動物の組織は、被験物質を適用することにより、ヒト
β３アドレナリン受容体に関連する疾病の予防・治療の
ために用いる物質（薬物）をスクリーニングするための
実験モデルとして有効である。上記「ヒトβ３アドレナ
リン受容体に関連する疾病」としては、例えば肥満、糖
尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、排尿障害、肝疾
患、心疾患、脳疾患、消化器疾患、内分泌疾患又は癌な
どが挙げられ、１つの疾患も複数の疾患が合併したもの
も含まれる。

【００３６】被験物質としては、例えば、合成化合物、
発酵生産物、ペプチド、非ペプチド性化合物、蛋白質な
どが用いられる。これらの被験物質を、ヒトβ３アドレ
ナリン受容体遺伝子を導入した本発明の非ヒト動物に投
与し、又はその生体の一部（例えば細胞、組織、臓器な
ど）に添加ないし接触し、肥満、糖尿病、高血圧、高脂
血症、動脈硬化症、排尿障害、肝疾患、心疾患、脳疾
患、消化器疾患、内分泌疾患又は癌などに対する効果
（例えば改善効果等）を検定することによって、該疾患
の予防・治療用薬物をスクリーニングすることが出来
る。例えば、改善効果が体脂肪の減少効果である場合
は、被検物質は抗肥満作用を有すると判定し、空腹時血
糖の低下作用である場合は、抗糖尿病作用を有すると判
定することが一例として挙げられる。

【００３７】スクリーニングの対象となる物質として
は、例えば合成化合物、発酵生産物、ペプチド、非ペプ
チド性化合物、蛋白質などが挙げられる。また、本発明
のスクリーニング方法により肥満、糖尿病、高血圧、高
脂血症、動脈硬化症、排尿障害、肝疾患、心疾患、脳疾
患、消化器疾患、内分泌疾患又は癌などの改善作用を有
すると判定される物質（ヒトβ３アドレナリン受容体ア
ゴニストなど）は、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、
動脈硬化症、排尿障害、肝疾患、心疾患、脳疾患、消化
器疾患、内分泌疾患又は癌などの予防・治療のために有
効であり、これを用い、公知の製剤手段に従って、肥
満、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、排尿障
害、肝疾患、心疾患、脳疾患、消化器疾患、内分泌疾患
又は癌などの疾患の予防・治療用医薬を調製することが
可能である。

【００３８】本発明の非ヒト動物のβ３アドレナリン受
容体遺伝子のプロモーター領域の支配下にヒトβ３アド
レナリン受容体構造遺伝子を組み込んだDNAを有する非
ヒト動物又は該動物の組織は、ヒトβ３アドレナリン受
容体アゴニストなどの薬理評価に最適な動物を供給する
ものである。本発明の完成以前にヒトβ３アドレナリン
受容体を発現する非哺乳動物を作製した例として、β３
アドレナリン受容体のノックアウトマウスにヒトβ３ア
ドレナリン受容体遺伝子を導入したイトウ（Ito）らの
報告（Diabetes, 47, p1464-1471, 1998）があるが、こ
の遺伝子導入マウスは、ヒトβ３アドレナリン受容体の
プロモーター領域を使用しているため、ヒトβ３は主に
褐色脂肪組織に発現し、白色脂肪組織での発現量は低
い。薬理学的な解析により、β３アドレナリン受容体が
白色脂肪細胞における脂肪分解（脂肪を脂肪酸とグリセ
ロールに分解する）、及び褐色脂肪細胞における熱産生
（脂肪酸を熱と二酸化炭素に分解する）に関与している
ことが示されている（Annu.Rev. Pharmacol. Toxicol.,
37, p421-450, 1997）。イトウらの遺伝子導入マウス
は、白色脂肪組織でのヒトβ３アドレナリン受容体の発
現量が、褐色脂肪組織におけるヒトβ３アドレナリン受
容体の発現量に比べ、著しく低いため、ヒトβ３アドレ
ナリン受容体作動薬を投与しても、マウスβ３アドレナ
リン受容体作動薬の投与により通常のマウスで見られる
脂肪分解、熱産生の上昇作用が十分に認められない恐れ
がある。またイトウらの遺伝子導入マウスは、肥満、糖
尿病などの病態を有しておらず、β３アドレナリン受容
体に関連した疾病（肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、
動脈硬化症、排尿障害、肝疾患、心疾患、脳疾患、消化
器疾患、内分泌疾患又は癌など）の予防、治療用薬物の
評価には適していないものと思われる。一方、本発明の
非ヒト動物のβ３アドレナリン受容体遺伝子のプロモー
ター領域の支配下にヒトβ３アドレナリン受容体構造遺
伝子を組み込んだDNAを遺伝子導入した非ヒト動物のヒ
トβ３アドレナリン受容体の発現組織は、実質的に白色
脂肪組織及び褐色脂肪組織である。

【００３９】従って、ヒトβ３アドレナリン受容体作動
薬の投与でも、通常のマウスにマウスβ３アドレナリン
受容体作動薬を投与した際に見られる脂肪分解又は熱産
生の上昇作用を評価することが出来る。また、前述のご
とく、本発明のヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子を組
み込んだDNAを有する非ヒト動物は、遺伝的な肥満、糖
尿病モデルとの掛け合わせにより、ヒトβ３アドレナリ
ン受容体遺伝子を組み込んだDNAを有し、且つ、肥満、
糖尿病のいずれかの病態を示す動物モデルを作製するこ
とが可能である。また、本発明のヒトβ３アドレナリン
受容体遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト動物に高
脂肪食を与え、肥満、糖尿病の病態を発症する動物モデ
ルを作製することが可能である。このようなヒトβ３ア
ドレナリン受容体遺伝子を主に白色脂肪組織及び褐色脂
肪組織に発現し、且つ、肥満、糖尿病のいずれかの病態
を示す動物モデルは、β３アドレナリン受容体に関連し
た疾病（肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化
症、排尿障害、肝疾患、心疾患、脳疾患、消化器疾患、
内分泌疾患又は癌など）の予防、治療用薬物の評価に最
適な動物であるといえる。

【００４０】本発明において、白色脂肪組織及び褐色脂
肪組織に「実質的に発現する」とは、ある哺乳動物１個
体における、白色脂肪組織及び褐色脂肪組織以外の組織
の目的タンパク質の発現量が全組織の発現量に対しmRNA
レベルで10％以下、好ましくは８％以下、さらに好まし
くは５％以下であることをいう。従って、白色脂肪組織
及び褐色脂肪組織に目的タンパク質が発現している量
が、mRNAレベルで全組織の発現量に対し90％以上であれ
ば、実質的に発現しているものといえる。

【００４１】この場合の白色脂肪組織及び褐色脂肪組織
以外の組織とは、白色脂肪組織及び褐色脂肪組織以外の
全組織（例えば脳、肝臓、心臓、骨格筋、腎臓、小腸、
膵臓、肺など）をいう。各組織での目的タンパク質の発
現量の解析方法として、mRNAレベルでの解析を行う場合
は、RT-PCR法、ノーザンブロッティング法又はRNAプロ
テクションアッセイ法などが挙げられる。また、タンパ
ク質レベルでの解析を行う場合は、ELISA法やウェスタ
ンブロッティング法などが挙げられる。

【００４２】本発明において、目的タンパク質の発現組
織が、実質的に白色脂肪組織及び褐色脂肪組織である非
ヒト動物又はその一部（該動物の細胞、組織、臓器等）
の作製方法は、マウスβ３アドレナリン受容体のプロモ
ーター領域の支配下に目的タンパク質の遺伝子を連結し
たDNAを、マウス受精卵へマイクロインジェクションす
ることによって行う。マウスβ３アドレナリン受容体の
プロモーター領域としては、例えば、ナーミアス（Nahm
ias）ら、（EMBO J., 10, p3721-3727, 1991）が単離し
たマウスβ３アドレナリン受容体遺伝子の第1エキソン
の上流のBamHIサイトまでの約5kbの領域が挙げられる。
該「目的タンパク質」としては、遺伝子導入する非ヒト
動物と同種又は異種のどちらの哺乳動物由来のものであ
ってもよいが、同種である場合は、β３アドレナリン受
容体以外である。また、主に脂肪組織に発現するタンパ
ク質、主に脂肪組織以外の組織で発現するタンパク質、
あるいは脂肪組織とそれ以外の組織で発現しているタン
パク質であってもよい。さらに、哺乳動物以外の生物由
来であるタンパク質であってもよく、例えば、ホタルル
シフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられ
る。このように本発明の方法により、ヒトβ３アドレナ
リン受容体以外のタンパク質の発現組織も、実質的に白
色脂肪組織及び褐色脂肪組織とすることができる。

【００４３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言う
までもない。実施例１ヒトβ３アドレナリン受容体（ヒトβ３−Ａ
Ｒという）発現ユニットを持つプラスミドの作製 1)ｐＭＨＢ３の構築マウスβ３アドレナリン受容体（マウスβ３−ＡＲとい
う）遺伝子は、ナーミアス(Nahmias)ら、（EMBO J., 1
0, p3721-3727, 1991）記載の方法により調製した。ヒ
トβ３−ＡＲ遺伝子は、エモリン（Emorine）ら、（Sci
ence, 245, p1118-1121, 1989）に記載の方法により調
製した。図２にヒトβ３−ＡＲ遺伝子、マウスβ３−Ａ
Ｒ遺伝子及び作製したヒトβ３−ＡＲ発現ユニットを持
つトランスジーンの構造を示した。マウスβ３−ＡＲプ
ロモーターの下流にヒトβ３−ＡＲ構造遺伝子のエクソ
ン１、イントロン１及びエクソン２を有するpMHB3（図
２、ｃ）は以下の方法により作製した。プラスミドpUC1
19（宝酒造株式会社製）を制限酵素BbeIで切断し、生じ
た3’-突出末端をタカラブランティングキット（宝酒造
株式会社製）で処理して平滑末端とした。これをライゲ
ーションキット（宝酒造株式会社製）でセルフライゲー
ションし、BbeIで切断されないΔBbeI-pUC119を得た。
センス合成DNA（5’-CTAGAGGCGCCACACGAGATGGCTCCGTGGC
CTCACGAGAACAGCTCTCTTGCCCCATGG-3’ ：配列番号１）、
及びアンチセンス合成DNA（5’-TCGACCATGGGGCAAGAGAGC
TGTTCTCGTGAGGCCACGGAGCCATCTCGTGTGGCGCCT-3’ ：配
列番号２）をアニーリングし、制限酵素XbaI及びSalIで
切断したΔBbeI-pUC119とライゲーションキット（宝酒
造株式会社製）を用いてライゲーションさせ、pMH-1を
得た。この遺伝子コンストラクトの塩基配列を解析した
ところ、合成DNA部分がΔBbeI-pUC119のXbaI-SalI断片
内に正方向に結合されていることが確認され、且つ、検
出しうる塩基配列の転位を含まなかった。

【００４４】次に、上記マウスβ３−ＡＲ遺伝子を制限
酵素BamHI及びBbeIで切断し、マウスβ３−ＡＲプロモ
ーター領域を含む5kbpの断片を得た。これをBamHI及びB
beIで切断したpMH-1にクローニングして、pMH-2を得
た。この遺伝子コンストラクトの塩基配列を解析したと
ころ、合成DNAとマウスプロモーター領域との連結部分
に検出しうる塩基配列の転位を含まなかった。さらに、
pMH-2を制限酵素NcoIで部分分解し、アガロースゲル電
気泳動後の約8kbpのバンドからジーンクリーン（Bio 10
1社製）による精製を行い、１ヶ所でのみ切断されてい
るpMH-2遺伝子を調製した。これに上記ヒトβ３−ＡＲ
遺伝子のNcoI切断によって得られた構造遺伝子領域を含
む2.4kbpの断片をクローニングし、pMHB3を構築した。
この遺伝子コンストラクトを多重制限酵素切断によって
検査したところ、検出しうる転位を認めなかった。この
プラスミドの構築図を図３に示す。

【００４５】２）pMHEX1の構築マウスβ３−ＡＲプロモーターの下流にヒトβ３−ＡＲ
構造遺伝子のエクソン１を有するpMHEX1（図２、d）は
以下の方法により作製した。前述のpMHB3を制限酵素Sph
Iで部分分解し、アガロースゲル電気泳動後のバンドか
らジーンクリーン（Bio 101社製）による精製を行い9.3
kbの断片を得た。これをライゲーションキット（宝酒造
株式会社製）でセルフライゲーションし、pMHEX1を構築
した。この遺伝子コンストラクトを多重制限酵素切断に
よって検査したところ、検出しうる転位を認めなかっ
た。このプラスミドの構築図を図４に示す。

【００４６】３) pGTB3の構築コーディング領域のみをヒトβ３−ＡＲ遺伝子に置換し
た、マウス−ヒトキメラβ３−ＡＲ遺伝子を有するプラ
スミドpGTB3（図２、e）は、図２、fに示すように４つ
の部分をそれぞれ調製し、連結することで作製した。前
述のΔBbeI-pUC119を制限酵素AatIIで切断し、生じた
3’-突出末端をタカラブランティングキット（宝酒造株
式会社製）で処理して平滑末端とした。これをライゲー
ションキット（宝酒造株式会社製）でセルフライゲーシ
ョンし、AatIIで切断されないΔBbeI,ΔAatII-pUC119を
得た。次に、フラグメントＡを調製するために、前述の
ヒトβ３−ＡＲ遺伝子を鋳型にして、20マーのプライマ
ー１（5’-CACTCTCTGCTGGTTGCCCT-3’ ；配列番号３）
及び60マーのプライマー２（5’-GACGTCCCCACCCAGAGACT
CCGGTCCCCCGCTCGTGTCCCCTACCCGTCGAGCCGTTGG-3’ ；配
列番号４）を用いて、ポリメラーゼチェインリアクショ
ン（PCR）を行った。プライマー２のヒトβ３−ＡＲコ
ーディング配列の3’-側には、マウスβ３−ＡＲ第１イ
ントロンのAatIIサイトまでの配列を付与した。

【００４７】PCRはEX-Taqポリメラーゼ（宝酒造株式会
社製）を用いて行った。PCR産物をアガロースゲル電気
泳動にて精製し、pT7Blue T-ベクター（Novagen社製）
にサブクローニングし、pMHAを得た。この遺伝子コンス
トラクトの塩基配列を解析したところ、検出しうる塩基
配列の転位を含まなかった。

【００４８】次に、フラグメントBを調製するために、
前述のマウスβ３−ＡＲ遺伝子を鋳型にして、19マーの
プライマー３（5’-GCGCAGTCACCTTCCCAGC-3’ ；配列番
号５）及び26マーのプライマー４（5’-GCTAGCCCTTTGAG
AGAGAGCGGGAC-3’ ；配列番号６）を用いて、PCRを行
った。プライマー４のマウスβ３第１イントロンの配列
の3'-側には、ヒトβ３−ＡＲ第２エキソンの一部の配
列を付与した。この際、塩基配列を改変し、アミノ酸配
列に影響せずに新たに、ヒトβ３−ＡＲ第２エキソン内
にNheIサイトを付与した（GCTTCT Ala⁴⁰³Ser⁴⁰⁴ →
GCTAGC Ala⁴⁰³Ser⁴⁰⁴）。PCRはKODポリメラーゼ（東洋
紡績株式会社製）を用いて行った。PCR産物をアガロー
スゲル電気泳動にて精製し、pT7Blue T-ベクター(Novag
en社製）にサブクローニングし、pMHBを得た。この遺伝
子コンストラクトの塩基配列を解析したところ、検出し
うる塩基配列の転位を含まなかった。

【００４９】次に、フラグメントCを調製するために、
前述のマウスβ３−ＡＲ遺伝子を鋳型にして、40マーの
プライマー５(5’-GCTAGCTGGGGAGTTTCTTAGAGGGCCGTGAAG
ATCCAGC-3’；配列番号７）及び19マーのプライマー６
(5’-AAAGGGAGGGAGGGGTGCT-3’；配列番号８）を用い
て、PCRを行った。プライマー７の５‘−側にはヒトβ
３第２エキソンの一部の配列を付与した。この際、塩基
配列を改変し、アミノ酸配列に影響せずに新たに、ヒト
β３第２エキソン内にNheIサイトを付与した（GCTTCT
Ala⁴⁰³Ser⁴⁰⁴ → GCTAGC Ala⁴⁰³Ser⁴⁰⁴）。PCRはKOD
ポリメラーゼ（東洋紡績株式会社製）を用いて行った。
PCR産物をアガロースゲル電気泳動にて精製し、ΔBbeI,
ΔAatII-pUC119にサブクローニングし、pGT-1を得た。
この遺伝子コンストラクトの塩基配列を解析したとこ
ろ、検出しうる塩基配列の転位を含まなかった。次に、
pMHBを制限酵素XbaI及びNheIで切断し、580bpの断片を
得た。これをXbaI及びNheIで切断したpGT-1にクローニ
ングして、pGT-2を得た。この遺伝子コンストラクトを
多重制限酵素切断で検査したところ、検出しうる転位を
含まなかった。さらに、pMHAを制限酵素EcoRI及びAatII
で切断し、350bpの断片を得た。これをEcoRI及びAatII
で切断したpGT-2にクローニングして、pGT-3を得た。こ
の遺伝子コンストラクトを多重制限酵素切断で検査した
ところ、検出しうる転位を含まなかった。pGT-3を制限
酵素Pst1及びSmaIで切断し、1.7kbpの断片を得た。これ
を、PstI及びSmaIで切断し、ベクター部分をアガロース
ゲル電気泳動で精製した、上記pMHB3にクローニング
し、pGTB3を得た。この遺伝子コンストラクトを多重制
限酵素切断によって検査したところ、検出しうる転位を
認めなかった。このプラスミドの構築図を図５に示す。

【００５０】実施例２ヒトβ３−ＡＲ遺伝子が導入さ
れたトランスジェニックマウスの作製 pMHB3、pMHEX1及びpGTB3を制限酵素EcoRI及びSalIで切
断し、アガロースゲル電気泳動によりマウスβ３−ＡＲ
制御遺伝子の下流にヒトβ３−ＡＲ構造遺伝子が結合し
たトランスジーン（MHB3、MHEX1及びGTB3）を調製し
た。各トランスジーンは、30 ng/μlの濃度でトリス-ED
TA緩衝液に溶解した。C57BL/6系雌マウスに卵胞刺激ホ
ルモン（5IU/固体）を腹腔内に注射し、48時間後に黄体
形成ホルモン（5IU/固体）を腹腔内注射して過排卵状態
にした後、同系雄マウスにメイティングした。膣栓確認
した固体から受精卵を集め、前記した各トランスジーン
溶液を、雄性前核にそれぞれ微量注入した。ゴードン
（Gordon）ら、(Proc. Natle.Acad. Sci. U. S. A.., 7
7, p7380-7384 , 1980)に記載された方法に従って、偽
妊娠のICR系雌マウスの卵管に移植し、着床させた。相
沢ら、（ジーンターゲッティング−ES細胞を用いた変異
マウスの作製−、羊土社、1995）に記載された方法によ
り、離乳した出産仔の尾の約1cm断片からDNAを抽出し
た。採取したDNAを用いて、ポリメラーゼチェインリア
クション（PCR）法により試験した。すなわち、ヒトβ
３−ＡＲ遺伝子中の21マーのプライマー７(5’-GGCTCCG
TGGCCTCACGAGAA-3’：配列番号９）、及び25マーのプ
ライマー８(5’-CCCAACGGCCAGTGGCCAGTCAGCG-3’：配
列番号10）を用いてPCRを行った。尾DNA調製物1μlを用
いて、まず95℃、７分間1回、続いて95℃１分→68℃１
分→72℃２分のサイクルを30回反復し、その後72℃７分
反応した。反応物を2.0％アガロースゲルに通して電気
泳動し、315bpの大きさのDNAバンドが見られるマウスを
選別した。59個体の産仔マウスを解析した結果、PCR陽
性個体は８個体（A〜G：雄性、Z：雌性）であった。こ
れらのマウスはC57BL/6jマウス（日本クレア）と交配さ
せ、系統化を行った。

【００５１】実施例３ヒトβ３−ＡＲ遺伝子導入マウ
スの遺伝子解析前述の尾DNA調製物を、導入したヒトβ３−ＡＲ遺伝子
を１ヶ所で切断する制限酵素BglIIで完全分解し、1.0％
アガロースゲルを通して電気泳動を行い、かつサザン
（Southern）、（J. Mol. Biol., 98, p503-517, 197
5）に記載された方法でナイロンフイルターへ移した。
ヒトβ３遺伝子配列を含む315bpのジコキシゲニン(DIG)
−DNAプローブは前述のヒトβ３遺伝子中の21マーのプ
ライマー７(5’-GGCTCCGTGGCCTCACGAGAA-3’：配列番
号９）、25マーのプライマー８(5’-CCCAACGGCCAGTGGCC
AGTCAGCG-3’：配列番号10）、及びpMHB3を鋳型とし
て用いて、DIG-PCRラベリングキット（ロッシュ・ダイ
アグノスティック株式会社製）を用いて調製した。上記
のフィルターに対し、DIG-DNAプローブで42℃で一晩ハ
イブリダイゼーションを行い、その後2xSSC、0.1％SDS
にて室温で2回洗浄し、次に0.1xSSC、0.1％SDSにて68℃
で2回洗浄した。このサザンハイブリダイゼーションの
結果、マウスβ３−ＡＲに由来する3.5kbpのバンド以外
に、ヒトβ３−ＡＲ遺伝子に起因するバンドを検出し
た。遺伝子解析の結果を図６に示す。

【００５２】実施例４ヒトβ３−ＡＲ発現組織の解析遺伝子導入マウス及び野生型C57BL/6マウスはいずれも
雄性マウスを用い、副睾丸周囲の白色脂肪組織、肩甲骨
間の褐色脂肪組織、脳、心臓、下肢部の骨格筋、腎臓、
小腸、膵臓、及び肺を摘出した。摘出組織から、Isogen
（日本ジーン社製）を用いて全RNAを抽出した。それぞ
れの組織の全RNA 1μgを用いて、RNA PCRKit(AMV) Ver.
2（宝酒造株式会社製）により、cDNAを合成した。さら
に1μlのcDNA溶液を鋳型として、ヒトβ３−ＡＲ遺伝子
中の21マーのプライマー７(5’-GGCTCCGTGGCCTCACAGAAA
-3’: 配列番号9)、及び25マーのプライマー８(5’-CCC
AACGGCCAGTGGCCAGTCAGCG-3’：配列番号10）を用いて
PCRを行った。反応は、まず95℃、７分間1回、続いて95
℃１分→68℃１分→72℃２分のサイクルを30回反復し、
その後72℃７分反応した。反応物を2.0％アガロースゲ
ルに通して電気泳動し、315bpの大きさのDNAバンドが見
られる組織をヒトβ３−ＡＲ発現組織とした。マウスβ
３−ＡＲの発現組織を解析する場合は、上記のcDNA溶液
1μlを鋳型として、マウスβ３−ＡＲ遺伝子中の21マー
のプライマー９(5’-GGCTCCGTGGCCTCACGAGAA-3’: 配列
番号11)、及び21マーのプライマー10(5’-TGGCCCCTGGTG
GCATTACGA-3’：配列番号12）を用いてPCRを行った。
反応は、まず95℃、７分間1回、続いて95℃１分→68℃
１分→72℃２分のサイクルを30回反復し、その後72℃７
分反応した。反応物を2.0％アガロースゲルに通して電
気泳動し、275bpの大きさのDNAバンドが見られる組織を
マウスβ３−ＡＲ発現組織とした。解析の結果、野生型
C57BL/6マウスでは、解析を行ったすべての組織でヒト
β３−ＡＲの発現は検出されず、マウスβ３−ＡＲの発
現が、主に白色脂肪組織及び褐色脂肪組織で検出され
た。この結果は、(Nahmias)ら、（EMBO J., 10, p3721-
3727, 1991）記載の結果と同様であった。一方、ヒトβ
３−ＡＲ遺伝子が導入されたトランスジェニックマウス
では、ヒトβ３−ＡＲ及びマウスβ３−ＡＲの発現が主
に白色脂肪組織及び褐色脂肪組織で検出された。これら
の結果から、作製したトランスジェニックマウスにおけ
るヒトβ３−ＡＲ発現組織は、マウスβ３−ＡＲの発現
組織と同様、白色脂肪組織及び褐色脂肪組織であること
が示された。ヒトβ３−ＡＲ発現組織の解析結果の一例
を図７に示す。

【００５３】同様の解析を他の系統でも行い、導入した
トランスジーンに関係なく、ヒトβ３−ＡＲが主に白色
脂肪組織及び褐色脂肪組織で発現していることが示され
た。インターロイキン４（Huralら、J. Immunol., 165,
p3239-3249, 2000）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）
受容体（Kappelら、Blood, 93, p4284-4292, 1999）及
びコレステロール７α−ヒドロキシラーゼ（Antesら、
J. Biol. Chem., 275,p26649-26660, 2000）などでは発
現組織特異性を決定するエンハンサーが、プロモーター
領域では無くイントロンに有することが知られている。
しかしながら、マウスβ３−ＡＲ遺伝子の脂肪組織特異
性を決定するエンハンサー領域は第1イントロンではな
く、３種類のトランスジーンに共通するマウスβ３−Ａ
Ｒプロモーター領域（5.0kbp）に存在することが示唆さ
れた。従って、マウスβ３−ＡＲプロモーター領域は、
目的タンパク質を脂肪組織特異的に発現させる際の有効
なツールになると思われた。

【００５４】実施例５１）遺伝的肥満、糖尿病マウス（Ａ^ｙマウス）との掛け
合わせによるモデル動物の作製雄性のＦ系統マウスを雌性のＡ^ｙマウス（C57BL/6j(A^y/
a）（ジャクソン研究所））と交配させ、Ｆ１マウスを
得た。離乳後、毛色が黒色のものは正常マウス、黄色の
ものはＡ^ｙマウスとして判別した。また、PCRは、実施
例２に記載した方法により試験した。すなわち、ヒトβ
３−ＡＲ遺伝子中の21マーのプライマー７(5’-GGCTCCG
TGGCCTCACGAGAA-3’：配列番号９）、及び25マーのプ
ライマー８(5’-CCCAACGGCCAGTGGCCAGTCAGCG-3’：配
列番号10）を用いてPCRを行った。尾DNA調製物1μlを用
いて、まず95℃、７分間1回、続いて95℃１分→68℃１
分→72℃２分のサイクルを30回反復し、その後72℃７分
反応した。反応物を2.0％アガロースゲルに通して電気
泳動し、315bpの大きさのDNAバンドが見られるマウスを
選別した。毛色及びPCR解析により、ヒトβ３−ＡＲ遺
伝子を有する正常マウスC57BL6j(hβ3/-、a/a)、及び、
ヒトβ３−ＡＲ遺伝子を有するＡ^ｙマウスC57BL/6j(hβ
3/-、A^y/a)を得た。ヒトβ３−ＡＲ遺伝子をホモ接合体
として有するマウスを得るために、上記Ｆ１マウスC57B
L6j(hβ3/-、a/a)とC57BL/6j(hβ3/-、A^y/a)を交配さ
せ、Ｆ２マウスを得た。上記と同様にPCRによる遺伝子
解析を行い、ヒトβ３−ＡＲ遺伝子を有するマウスを選
択した。さらに、ヒトβ３−ＡＲ遺伝子を有するマウス
の尾DNA調製物を、トランスジーン内に切断サイトが存
在する制限酵素で完全分解し、1.0％アガロースゲルを
通して電気泳動を行い、かつサザン（Southern）、（J.
Mol. Biol., 98, p503-517, 1975）に記載された方法
でナイロンフイルターへ移した。ヒトβ３−ＡＲ遺伝子
配列を含む315bpのジコキシゲニン(DIG)-DNAプローブは
ヒトβ３−ＡＲ遺伝子中の21マーのプライマー７(5’-G
GCTCCGTGGCCTCACGAGAA-3’：配列番号９）、25マーの
プライマー８(5’-CCCAACGGCCAGTGGCCAGTCAGCG-3’：
配列番号10）、及びpMHB3を鋳型として用いて、DIG-PCR
ラベリングキット（ロッシュ・ダイアグノスティック株
式会社製）を用いて調製した。上記のフィルターに対
し、DIG-DNAプローブで42℃で一晩ハイブリダイゼーシ
ョンを行い、その後2xSSC、0.1％SDSにて室温で2回洗浄
し、次に0.1xSSC、0.1％SDSにて68℃で2回洗浄した。こ
のサザンハイブリダイゼーションによりマウスβ３−Ａ
Ｒ遺伝子由来のバンドとヒトβ３−ＡＲ遺伝子由来のバ
ンドが観察された。ホモ接合体の判別は、これらのバン
ドの濃さを、モデルGS-700イメージングデンシトメータ
ー（バイオラッド社製）により解析して行った。Ｆ１マ
ウス（ヘテロ接合体）より、（ヒトβ３−ＡＲのバンド
の濃さ／マウスβ３−ＡＲのバンドの濃さ）の値が大き
いマウスをホモ接合体と判別した。ヒトβ３−ＡＲ遺伝
子をホモ接合体として有するマウスの判別結果の典型例
を図８に示す。

【００５５】２）高脂肪食による、肥満、糖尿病モデル
動物の作製食餌による肥満、糖尿病モデルを作製するため、前述の
ヒトβ３−ＡＲ遺伝子をヘテロ接合体に有する正常マウ
スC57BL/6j(hβ3/-、a/a)に長期間、高脂肪食（日本ク
レア社製）を与えた。コントロールの標準食として、CR
F-1（チャールズリヴァー日本社製）を用いた。雄性の
ヒトβ３−ＡＲ遺伝子をヘテロ接合体に有する正常マウ
スC57BL/6j(hβ3/-、a/a)８匹を一つのケージで飼育
し、高脂肪食を与えた（グループ１）。雄性の野生型マ
ウスC57BL6/j(-/-、a/a)８匹を一つのケージで飼育し、
高脂肪食を与えた（グループ２）。雄性のヒトβ３−Ａ
Ｒ遺伝子をヘテロ接合体に有する正常マウスC57BL/6j(h
β3/-、a/a)７匹を一つのケージで飼育し、標準食を与
えた（グループ３）。そして雄性の野生型マウスC57BL6
/j(-/-、a/a)７匹を一つのケージで飼育し、標準食を与
えた（グループ４）。４グループとも６週齢から15週齢
までの９週間、自由に摂水、摂餌できる条件下で飼育
し、週１回、それぞれのマウスの体重を測定した。その
結果、ヒトβ３−ＡＲ遺伝子をヘテロ接合体に有する正
常マウスC57BL/6j(hβ3/-、a/a)の体重変化は、野生型
マウスC57BL6/j(-/-、a/a)のそれとほとんど変わり無
く、ヒトβ３−ＡＲ遺伝子の導入が体重に影響を与えて
はいないことが判明した。また、高脂肪食の摂取によ
り、ヒトβ３−ＡＲ遺伝子をヘテロ接合体に有する正常
マウスC57BL/6j(hβ3/-、a/a)の、食餌由来の肥満、糖
尿病モデルが作製できることが判明した。体重変化の結
果を図９に示す。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、ヒトβ３アドレナリン受
容体遺伝子導入動物が提供される。本発明の動物は、食
餌由来の肥満又は糖尿病のモデル動物として有用であ
る。

【００５７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ASAHI KASEI <120> A transgenic animal expressing human beta 3 adrenaline receptor <130> X13-1393 <140> <141> <160> 12 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 1 ctagaggcgc cacacgagat ggctccgtgg cctcacgaga acagctctct tgccccatgg 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 2 tcgaccatgg ggcaagagag ctgttctcgt gaggccacgg agccatctcg tgtggcgcct 60 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 3 cactctctgc tggttgccct 20 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 4 gacgtcccca cccagagact ccggtccccc gctcgtgtcc cctacccgtc gagccgttgg 60 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 5 gcgcagtcac cttcccagc 19 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 6 gctagccctt tgagagagag cgggac 26 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 7 gctagctggg gagtttctta gagggccgtg aagatccagc 40 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 8 aaagggaggg aggggtgct 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 9 ggctccgtgg cctcacgaga a 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 10 cccaacggcc agtggccagt cagcg 25 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 11 ggctccgtgg cctcacgaga a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 12 tggcccctgg tggcattacg a 21

【００５８】

【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成DNA 配列番号２：合成DNA 配列番号３：合成DNA 配列番号４：合成DNA 配列番号５：合成DNA 配列番号６：合成DNA 配列番号７：合成DNA 配列番号８：合成DNA 配列番号９：合成DNA 配列番号10：合成DNA 配列番号11：合成DNA 配列番号12：合成DNA

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子の制限酵素
地図。TはTaqI、BgはBglII、EはEcoNI、SはSacII、BはB
amHI、PはPstIを示す。ATGは開始コドン、TAGは終止コ
ドンを示す。

【図２】ヒト及びマウスβ３アドレナリン受容体遺伝子
の構造、作製したトランスジーン（MHB3、MHEX1、GTB
3）の構造、並びにGTB3作製方法の概略図。 a) ヒトβ３アドレナリン受容体遺伝子の構造 b) マウスβ３アドレナリン受容体の構造 c) トランスジーンMHB3の構造 d) トランスジーンMHEX1の構造 e) トランスジーンGTB3の構造 f) GTB3作製方法の概略

【図３】トランスジーンMHB3の構築図。

【図４】トランスジーンMHEX1の構築図。

【図５】トランスジーンGTB3の構築図。

【図６】ジコキシゲニン標識した315bpのDNAプローブに
よるトランスジェニック(Tg)マウスのサザン解析の結果
を示す図（各サンプル10μｇ；アルカリ・ブロッティン
グ）。

【図７】トランスジェニックマウスF系統の各組織にお
けるマウスβ３−ＡＲmRNA及びヒトβ３-ＡＲ mRNA発現
の解析結果を示す図（RT-PCR；アガロースゲル電気泳
動）。マウスプライマー；マウスβ３−ＡＲ遺伝子を特異的に
増幅ヒトプライマー；ヒトβ３−ＡＲ遺伝子を特異的に増幅

【図８】ジコキシゲニン標識した315bpのDNAプローブに
よるトランスジェニックマウスF系統のホモ接合体の選
択結果を示す図（各サンプル10μｇ；アルカリ・ブロッ
ティング）。

【図９】高脂肪食によるトランスジェニックマウスF系
統（ヘテロ接合体）の肥満モデルの作製結果を示す図。

フロントページの続きＦターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 GA18 HA08 HA09 4B065 AA90X AA93Y AB01 CA24 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】非ヒト動物のβ３アドレナリン受容体遺
伝子のプロモーター領域の支配下にヒトβ３アドレナリ
ン受容体をコードする遺伝子を連結したDNA。
【請求項２】マウスのβ３アドレナリン受容体遺伝子
のプロモーター領域の支配下にヒトβ３アドレナリン受
容体をコードする遺伝子を連結したDNA。
【請求項３】請求項１又は２に記載のDNAを遺伝子導
入してなることを特徴とする非ヒト動物又はその一部。
【請求項４】請求項１又は２に記載のDNAを遺伝子導
入してなることを特徴とするマウス又はその一部。
【請求項５】ヒトβ３アドレナリン受容体を白色脂肪
組織及び褐色脂肪組織に実質的に発現させたことを特徴
とする非ヒト動物又はその一部。
【請求項６】高脂肪食を与えることにより肥満又は糖
尿病のいずれかの病態を示すことを特徴とする、請求項
３又は５に記載の非ヒト動物又はその一部。
【請求項７】高脂肪食を与えることにより肥満又は糖
尿病のいずれかの病態を示すことを特徴とする請求項４
に記載のマウス又はその一部。
【請求項８】遺伝的な病態を示す非ヒト動物との交配
により肥満又は糖尿病のいずれかの病態を示すことを特
徴とする請求項３、５又は６に記載の非ヒト動物又はそ
の一部。
【請求項９】遺伝的な病態を示すマウスとの交配によ
り肥満又は糖尿病のいずれかの病態を示すことを特徴と
する請求項４又は７に記載のマウス又はその一部。
【請求項１０】マウスが、Ａ^ｙマウスとの交配により
得られたものであって肥満又は糖尿病のいずれかの病態
を示すものである請求項４に記載のマウス又はその一
部。
【請求項１１】請求項３、５、６若しくは８に記載の
動物若しくはその一部、又は請求項４、７、９若しくは
１０に記載のマウス若しくはその一部に被験物質を適用
し、ヒトβ３アドレナリン受容体に関連する疾患に対す
る前記被験物質の効果を検定することを特徴とする、β
３アドレナリン受容体に関連する疾患の予防又は治療の
ために用いられる物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】 β３アドレナリン受容体に関連する疾
患が、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症、
排尿障害、肝疾患、心疾患、脳疾患、消化器疾患、内分
泌疾患及び癌からなる群から選択される少なくとも一つ
である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】非ヒト動物のβ３アドレナリン受容体
遺伝子のプロモーター領域の支配下に目的タンパク質を
コードする遺伝子を連結したDNAを遺伝子導入してなる
ことを特徴とする非ヒト動物又はその一部。
【請求項１４】目的タンパク質を実質的に白色脂肪組
織及び褐色脂肪組織に発現させたことを特徴とする非ヒ
ト動物又はその一部。
【請求項１５】目的タンパク質を実質的に非ヒト動物
の白色脂肪組織及び褐色脂肪組織に発現させることを特
徴とする、非ヒト動物又はその一部の作製方法。