JP2000014396A - ホスホリボシルピロリン酸を経由して生合成される代謝産物の製造法 - Google Patents
ホスホリボシルピロリン酸を経由して生合成される代謝産物の製造法Info
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Abstract
由して生合成される代謝産物の工業的により有利な製造
法を提供する 【解決手段】 本発明によれば、トランスケトラーゼ活
性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株を用い
ることにより、PRPPを経由して生合成される代謝産
物の工業的により有利な製造法を提供することができ
る。
Description
ゼの活性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株
を用い、生合成経路上、ホスホリボシルピロリン酸(以
下、PRPPと略す)から合成される有用物質を発酵法
で製造する方法に関する。
される有用物質としては、プリンヌクレオチド、ピリミ
ジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジンヌ
クレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビンヌ
クレオチド等の核酸関連物質、L−ヒスチジン、リボフ
ラビン等が知られている。
フラビン等は、これまで発酵法、発酵法および合成法を
組合わせた方法等を用い、工業的に生産されている〔高
尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版(1996);
相田浩ら編、アミノ酸発酵、学会出版センター(198
6);特開平6-225776〕。微生物において、P
RPPはペントースリン酸経路の中間体リボース 5−
リン酸からPRPP合成酵素によって生合成される。
は、グルコース 6−リン酸デヒドロゲナーゼ反応経由
の酸化的ペントースリン酸経路が知られており、また、
トランスケトラーゼ反応経由の非酸化的ペントースリン
酸経路上の酵素が全て可逆であることより、該非酸化的
ペントースリン酸経路も関与していると考えられている
(図1)。
リン酸の生合成に、その両経路が関与していることがラ
ベルしたグルコースの代謝実験によって明らかにされて
いる〔Biochemistry, 12, 10, 1969 (1973)〕。さら
に、エシェリヒア コリやコリネバクテリウム グルタ
ミクムにおいて、グルコース 6−リン酸デヒドロゲナ
ーゼを欠損してもリボースの要求性を示さないことか
ら、リボース 5−リン酸はトランスケトラーゼ反応経
由の非酸化的ペントースリン酸経路によって供給される
ことが遺伝的にも示されている〔D. G. Fraenkel and
R. T. Vinopal,Ann. Rev. Microbiol., 27, 69-100 (19
73); E. D. Ihnen and A. L. Demain, J. Bacteriol.,
98, 1151-1158 (1969)〕。
高めることにより、非酸化的経路からリボース 5−リ
ン酸およびPRPPへの供給が高まり、PRPPから生
合成される物質の生成量が向上することを推測させるも
のである。また、バチルス サチルス等のバチルス属細
菌のイノシン生産菌において、トランスケトラーゼの活
性を欠損した株は、リボースを培地中に著量蓄積してし
まい、プリンヌクレオチドの生産収率は低下することが
報告されている〔K. Sasajima and M. Yoneda, Biotech
nol. Genet. Eng. Rev., 2, 175-213 (1984)〕。
る物質の生産にトランスケトラーゼの活性が必要である
ことを推測させるものである。これまでに、生物全般に
わたり、PRPPを経由して生合成されるいかなる代謝
産物においても、該生物のトランスケトラーゼ活性を欠
損または低下させることにより、これら代謝産物の生産
効率を向上させることができるとの知見はない。
物、特に、核酸関連物質、L−ヒスチジン、リボフラビ
ン等は、その需要が増大しており、工業的により有利な
製造法を開発することが強く望まれている。
PPを経由して生合成される代謝産物の工業的により有
利な製造法を提供することにある。
目的とする代謝産物の生合成に関わる末端生合成経路の
代謝増強を主眼として進められ、大きな成功を収めてき
た。本発明者らは、更なる代謝産物の生産性向上には、
該末端生合成経路の代謝増強とは別の改変、即ち、出発
基質の供給能力やプールを高める中央代謝の改変が必要
であると考え、微生物において中央代謝経路を操作する
ことによる、種々の代謝産物へのカーボンフローに対す
る影響を鋭意検討した。
あるトランスケトラーゼの活性を欠損させるか、または
親株に比べて低下させることにより、生合成経路上、P
RPPを経由して生合成される代謝産物の生産効率を向
上させることができることを見いだし、本発明を完成す
るに至った。即ち、本発明は下記、(1)〜(8)に関
する。
テリウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属す
る微生物のトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株
に比べて低下させることを特徴とする、該微生物におい
て、代謝経路上、PRPPを経由して生合成される代謝
産物の生産を増強させる方法。 (2)増強される代謝産物が、プリンヌクレオチド、ピ
リミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジ
ンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビ
ンヌクレオチド、L−ヒスチジン、リボフラビン等であ
る、上記(1)の方法。
ルタミクム TKT6、コリネバクテリウム グルタミ
クム TKT6/pPH8、コリネバクテリウム グル
タミクム TKT6/pFM41、エシェリヒア コリ
AI80/pFM201等である、上記(1)の方
法。 (4)コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属お
よびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、かつトラン
スケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させ
た微生物を培地に培養し、培養液中に、代謝経路上、P
RPPを経由して生合成される代謝産物から選ばれる1
もしくは数個の代謝産物を生成蓄積させ、該代謝産物を
採取することを特徴とする、該代謝産物の製造方法。
レオチド、ピリミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシ
ド、ピリミジンヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン
塩基、フラビンヌクレオチド、L−ヒスチジン、リボフ
ラビン等である、上記(4)の方法。 (6)微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム
TKT6、コリネバクテリウム グルタミクム TKT
6/pPH8、コリネバクテリウム グルタミクム T
KT6/pFM41、エシェリヒア コリ AI80/
pFM201等である、上記(4)の方法。
バクテリウム属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を
欠損、または親株に比べて低下させた微生物。 (8)微生物が、コリネバクテリウム グルタミクム
TKT6、コリネバクテリウム グルタミクム TKT
6/pPH8、コリネバクテリウム グルタミクム T
KT6/pFM41等である、上記(7)の微生物。 以下に、本発明を詳細に説明する。
は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およ
びエシェリヒア属に属し、かつトランスケトラーゼ活性
を欠損、または親株に比べて低下させた菌株であれば、
変異株、細胞融合株、形質導入株あるいは組換えDNA
技術を用いて造成した組換え株のいずれであっても良
い。
ーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた、コリ
ネバクテリウム グルタミクム、コリネバクテリウム
アセトアシドフィラム、コリネバクテリウム ハーキュ
リス、コリネバクテリウムリリウム、コリネバクテリウ
ム メラセコーラ、ブレビバクテリウム ディバリカツ
ム、ブレビバクテリウム フラブム、ブレビバクテリウ
ム イマリオフィラム、ブレビバクテリウム ラクトフ
ァーメンタム、ブレビバクテリウム チオゲニタリス、
エシェリヒアコリ等をあげることができる。
に用いられている、いわゆるコリネ型グルタミン酸生産
菌やエシェリヒアコリ、あるいは核酸発酵やリボフラビ
ン発酵に用いられているコリネバクテリウムアンモニア
ゲネス等をあげることができる。本発明の、コリネバク
テリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア
属から選ばれる属に属し、かつトランスケトラーゼ活性
を欠損、または親株に比べて低下させた微生物は、コリ
ネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェ
リヒア属から選ばれる属に属する公知の微生物に、トラ
ンスケトラーゼの活性を欠損または低下させる変異を、
通常の変異処理法、組換えDNA技術による遺伝子置換
法、形質導入法あるいは細胞融合法を用いて付与するこ
とにより取得できる。
発明の菌株を取得することができる。本発明の菌株は、
シキミ酸要求性かつリボース非資化性を指標として選択
することにより取得することができる。コリネバクテリ
ウム属、ブレビバクテリウム属およびエシェリヒア属か
ら選ばれる属に属する微生物を、通常の変異処理法、例
えば紫外線照射またはN−メチル−N’−ニトロ−N−
ニトロソグアニンジン(NTG)や亜硝酸等の化学処理
を施した後、親株では生育可能なグルコースを単一の炭
素源として含む最少培地において、生育できないかもし
くは生育不良であり、シキミ酸を添加した該最少培地で
は良好に生育する変異株を分離することにより、シキミ
酸要求変異株を取得する。
しかつグルコースまたはリボースを単一の炭素源として
含む最少培地にそれぞれ塗布し、グルコース培地では生
育可能であるが、リボース培地では生育できないかもし
くは生育不良である変異株を選択する。該菌株はトラン
スケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下した
変異株である。以上の方法で、シキミ酸要求性に加えて
リボース非資化性を有する、トランスケトラーゼ活性を
欠損、または親株に比べて低下させた変異株を取得する
ことができる。
伝子をインビトロで破壊したトランスケトラーゼ遺伝子
を用いた通常の遺伝子置換法によっても、トランスケト
ラーゼ変異株を取得することができる。トランスケトラ
ーゼをコードする遺伝子としては、公知のもの〔G. A.
Sprenger, Biochim. Biophys. Acta., 1216, 307 (199
3); A. Iida et al.,J. Bacteriol., 175, 5375-5383
(1993);特開平6―169785〕を利用することがで
きる。
ース非資化性を指標として選択することにより取得する
ことができるが、トランスケトラーゼの活性が親株に比
べて少しでも低下している菌株の中には、必ずしもシキ
ミ酸の要求性やリボースの非資化性を備えてはいないも
のもある。しかしながら、該菌株も本発明の微生物とし
てあげることができる。該微生物は、シキミ酸要求性を
示すトランスケトラーゼ変異株から、さらにシキミ酸を
全く要求しなくなった復帰変異、シキミ酸の要求量が減
少した復帰変異、あるいはリボースの資化性が部分的ま
たは完全に回復した復帰変異等を誘導することによって
取得することができる。
を経由して生合成される代謝産物の生産が増強された微
生物である。上記微生物の具体的な例として、コリネバ
クテリウム グルタミクム TKT6等をあげることが
できる。更に、上記により取得した、トランスケトラー
ゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生物
に、PRPPを経由して生合成される代謝産物から選ば
れる、目的とする代謝産物の生産能を向上させる公知の
方法、例えば変異手法や組換えDNA技術を用いて、分
解経路や分岐経路を遮断したり、生合成経路上の鍵酵素
のフィードバック調節の解除や活性増強を図る方法を用
いることにより、目的とする代謝産物をより効率良く製
造することのできる菌株を取得することができる。
する代謝産物の生合成遺伝子を含む組換え体プラスミド
を宿主に導入することにより、該代謝産物の生産能の向
上した菌株を取得することができる。具体的には、ヒス
チジンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミド、例え
ばpPH8をトランスケトラーゼ活性を欠損、または親
株に比べて低下させたコリネバクテリウム グルタミク
ムに導入することにより、ヒスチジンを著量生産する株
を取得することができる。具体的な菌株として、コリネ
バクテリウム グルタミクム TKT6/pPH8等を
あげることができる。
体プラスミド、例えばpFM41をトランスケトラーゼ
活性を欠損、または親株に比べて低下させたコリネバク
テリウム グルタミクムに導入することにより、リボフ
ラビンを著量生産する株を取得することができる。具体
的な菌株として、コリネバクテリウム グルタミクム
TKT6/pFM41等をあげることができる。
体プラスミド、例えばpFM201をトランスケトラー
ゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させたエシェリ
ヒア コリに導入することにより、リボフラビンを著量
生産する株を取得することができる。具体的な菌株とし
て、エシェリヒア コリ AI80/pFM201等を
あげることができる。
方法を用いることにより、目的とする代謝産物の生産能
の向上した菌株を取得することができる。イノシンの製
造ではアデニン要求性でかつプリンアナログの耐性を付
与する方法(発酵と工業、Vol.36、No.12 、1036-104
8、1978)、イノシン酸の製造ではアデニンおよびグア
ニン要求性でかつマンガン非感受性を付与する方法〔高
尾彰一ら編、応用微生物学、文永堂出版(199
6)〕、グアノシンの製造ではアデニンおよびヒスチジ
ン要求性でかつメチオニンスルホキシド、サイコフラニ
ンおよびデコイニンの耐性を付与する方法〔高尾彰一ら
編、応用微生物学、文永堂出版(1996)〕、ウリジ
ンやシチジンなどのピリミジンヌクレオシドの製造では
ピリミジンアナログの耐性を付与する方法〔バイオイン
ダストリー, 12, 6, 36-43 (1995)〕、アデニンやウラ
シルなどの塩基の製造では2-フルオロアデニンなどの
プリンアナログの耐性を付与する方法(農芸化学会誌、
第48巻、第1号、63-68、1974; 同会誌、第52巻、第3
号、129-133、1978)、L-ヒスチジンの製造では2−チ
アゾールアラニンや1,2,4−トリアゾールアラニン
などのヒスチジンアナログの耐性を付与する方法〔相田
浩ら編、アミノ酸発酵、学会出版センター(198
6)〕等をあげることができる。
ラーゼ活性を欠損、または親株に比べて低下させた微生
物を改良することにより、目的とした代謝産物の生産能
の向上した菌株を取得することができる。本発明の微生
物を培地に培養し、培養液中に、代謝経路上、PRPP
を経由して生合成される代謝産物から選ばれる1もしく
は数個の代謝産物を生成蓄積させ、該代謝産物を採取す
ることにより、該代謝産物を製造することができる。
従って実施することができる。使用培地としては、炭素
源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミン、その他使用
菌株の必要とする微量の栄養素を程よく含有するものな
らば、合成培地または天然培地のいずれも使用できる。
用いる菌株が使用培地で生育にシキミ酸を要求する場合
は、培地に少量のシキミ酸を添加すればよい。シキミ酸
の代わりに芳香族アミノ酸を少量添加することによって
も同様の目的を達成することができる。
ス、スクロース、マルトース、マンノース、グリセロー
ル、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜等の炭水化物、ポリア
ルコール類、ピルビン酸、フマール酸、乳酸、酢酸等の
各種有機酸が使用できる。さらに微生物の資化性によっ
て、炭化水素、アルコール類等も用いることができる。
窒素源としては、アンモニアまたは塩化アンモニウム、
硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム等の各種無機および有機アンモニウム塩類、あるいは
尿素および他の窒素含有物質、ならびにペプトン、NZ
−アミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカ
ー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその
消化物等の窒素含有有機物等をあげることができる。
ム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫
酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等をあげるこ
とができる。アミノ酸、ビタミンは使用する培地の炭素
源、窒素源等によって異なるが、必要に応じ、添加する
ことができる。
の好気的条件下に行う。培養温度は、一般に20〜40
℃が好適である。培地のpHは中性付近に維持すること
が望ましい。培養期間は通常1〜5日間である。培養液
中に生成蓄積された、目的とする代謝産物は以下の方法
で採取することができる。
方法、活性炭処理法、あるいはイオン交換樹脂法等の公
知の方法〔遠藤 勲ら、化学工学会(編)「バイオセパ
レーションプロセス便覧」、共立出版(1996)〕を用いる
ことにより目的とする代謝産物を採取することができ
る。以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの
実施例に限定されるものではない。
クムのトランスケトラーゼ欠損変異株の取得 コリネバクテリウム グルタミクムL22〔野生株AT
CC31833から誘導されたリゾチーム感受性変異
株;R. Katsumata et al., Proc. 4th Eur. Congr. Bio
technol., 4, 767 (1987)〕をNB培地〔粉末ブイヨン
20g、酵母エキス5gを水1Lに含み、pH7.2に
調整した培地〕3ml中に植菌し、30℃でOD660が
約0.6になるまで培養した。
菌体を50mMトリスマレイン酸緩衝液(pH6.0)
で一回洗浄し、NTG400mg/Lを含む同緩衝液3
ml中、室温で20分間変異処理を行った。該処理菌体
を同緩衝液で2回遠心洗浄後、NB培地3ml中、30
℃で1時間培養した。
希釈し、得られた希釈液0.1mlをNB寒天培地〔N
B培地に寒天を1.4%含む培地、pH7.2〕に塗布
し、30℃で2日間培養した。寒天培地上に生育してき
たコロニーを、最少寒天培地M1〔グルコース 10
g、(NH4)H2PO4 1g、KCl 0.2g、Mg
SO4・7H2O 0.2g、FeSO4・7H2O 10m
g、MnSO4・4〜6H2O 0.2mg、ZnSO4・
7H2O 0.9mg、CuSO4・5H2O 0.4m
g、Na2B4O7・10H2O 0.09mg、(NH4)
6Mo7O24・4H2O 0.04mg、ビオチン 50m
g、p-アミノ安息香酸 2.5mg、チアミン塩酸塩
1mgおよび寒天 16gを水1Lに含み、pH7.2
に調整した培地〕およびシキミ酸50mg/Lを含むM
1寒天培地に各々塗布し、培養した。
50mg/Lを含むM1寒天培地で生育できる株を、シ
キミ酸要求変異株として分離した。分離されたシキミ酸
要求変異株を、シキミ酸50mg/Lを含むM1寒天培
地および該培地中のグルコースをリボースに置き換えた
培地に各々塗布し、培養した。
で生育するが、該培地中のグルコースをリボースに置き
換えた培地では生育できない株を、シキミ酸要求性でか
つリボース非資化性の変異株として分離した。分離され
たシキミ酸要求性でかつリボース非資化性の変異株を、
シキミ酸50mg/Lを含むM1培地で培養後、遠心分
離して得た菌体から超音波破砕による公知の方法に従っ
て粗酵素液を調製した〔M. Ikeda and R. Katsumata, A
ppl. Environ. Microbiol., 58, 781-785 (1992)〕。
活性を以下のようにして測定した。トリス 50mM
(pH7.5)、NADH 0.2mM、チアミンピロ
リン酸0.01mM、MgCl2 1mM、キシルロース
-5−リン酸 0.5mM、リブロース-5−リン酸 0.
5mM、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼおよ
びトリオースフォスフェートイソメラーゼ混合液(ベー
リンガーマンハイム社製)20mgを含む反応液に粗酵
素液を加えて1.5mlとし、30℃で反応を行った。
少を測定することにより、生成されるグリセルアルデヒ
ド-3-リン酸量を測定した。該測定により、分離された
シキミ酸要求性でかつリボース非資化性の変異株より、
グリセルアルデヒド-3-リン酸を全く生成しない、トラ
ンスケトラーゼ活性を欠損した変異株TKT6株を選択
した。
T6株は、ブダペスト条約に基づいて、平成10年6月
30日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本
国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305-
0046)にFERMBP−6399号として寄託され
ている。
養した。培養後、遠心分離により集菌した。得られた菌
体を生理食塩水で3回遠心洗浄後、生理食塩水に菌濃度
が約109/mlになるように懸濁した。
布し、30℃で3日間培養した。該M1寒天培地上で生
育可能な株をシキミ酸非要求性復帰株として取得した。
シキミ酸非要求性復帰株はいずれも、リボース資化性お
よびトランスケトラーゼの活性ともに野生型に戻ってい
た。該結果は、シキミ酸要求性およびリボース非資化性
の両形質がトランスケトラーゼ活性の欠損に起因して生
じていることを示している。上記で取得されたシキミ酸
非要求性復帰株(トランスケトラーゼ欠損変異の復帰
株)の内の一株をREV3と命名した。
クムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるアデニンの
製造 コリネバクテリウム グルタミクムL22、TKT6お
よびREV3のアデニンの製造を以下のように行った。
グルコース10g/Lを添加したNB培地3mlに、上
記3株を各々植菌し、30℃で20時間培養した。
g/Lの入ったM1培地5mlを含む太型試験管にそれ
ぞれ接種し、30℃で24時間振とう培養した。各培養
液をろ過し、得られたろ液中のアデニンの生成量を、イ
オン交換カラム〔Shodex Asahipak GS-320 7E(旭化成
社製)〕HPLCを用い、波長254nmにおける吸収
強度を測定することにより求めた。結果を第1表に示
す。
養液中にアデニンを分泌蓄積していた。
ゼの復帰株REV3では再びアデニンを生産しなくなる
ことから、TKT6株におけるアデニンの生成はトラン
スケトラーゼの欠損に起因していることがわかる。
クムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるL−ヒスチ
ジンの製造 トランスケトラーゼの欠損がコリネバクテリウム グル
タミクムによるヒスチジン生産に与える効果を調べるた
め、L22株、TKT6株およびREV3株に、ヒスチ
ジンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドpPH8
を導入してヒスチジン生産能を増強し、それら3株のヒ
スチジンの蓄積量を比較した。
クムのプラスミドベクターpCG11のBglII部位
にコリネバクテリウム グルタミクムのヒスチジン生合
成に関与する遺伝子を有する約10.6kbのDNA断
片が挿入されたスペクチノマイシン耐性マーカーを有す
るプラスミドである。pPH8を有するコリネバクテリ
ウム グルタミクムは米国アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションにコリネバクテリウム グルタミク
ムK32(ATCC39281)として寄託されてい
る。
常のアルカリ溶解法〔J. Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989)〕によって単離するこ
とができる。pPH8のL22株、TKT6株およびR
EV3株への導入は、コリネ型細菌で一般的に用いられ
ているプロトプラスト法〔R. Katsumata et al., J. Ba
cteriol., 159, 306-311 (1984)〕やジーン・パルサー
装置(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA)を用いた
エレクトロポレーション法(電圧2.5kV、電気容量
25mF、抵抗200W)〔J. Sambrook et al., Molecu
larCloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press (1989)〕により実施する
ことができ、本実験においてはプロトプラスト法を用い
た。
およびREV3株を用いたヒスチジンの製造は以下のよ
うにして行った。スペクチノマイシンおよびシキミ酸を
それぞれ100mg/L添加したS5種培地〔グルコー
ス 20g、ポリペプトン 15g、酵母エキス 15
g、NaCl 2.5g、尿素 1gを水1Lに含み、p
H7.2に調整した培地〕3mlに上記3株を各々植菌
し、30℃で24時間振とう培養した。
ノマイシン100mg/Lおよびシキミ酸200mg/
Lを添加したP1生産培地〔グルコース 60g、KH2
PO4 1g、K2HPO4 1g、MgSO4・7H2O
1g、(NH4)2SO420g、コーン スチープ リ
カー 5g、MnSO4 10mg、ビオチン 30mg、
CaCO3 20gを水1Lに含み、pH7.2に調整
した培地〕5mlの入った太型試験管にそれぞれ接種
し、30℃で72時間振とう培養した。
ヒスチジンの生成量を、HPLCを用いたOPAポスト
カラム誘導体化法〔Anal. Chem., 51, 1338 (1979)〕に
より定量した。結果を第2表に示す。
L-ヒスチジンの蓄積量が約2倍に向上している。一
方、REV3/pPH8株のL-ヒスチジンの蓄積量は
L22/pPH8株と同レベルであることから、TKT
6/pPH8株におけるL-ヒスチジン生産性の向上は
トランスケトラーゼの欠損に起因していることは明白で
ある。
クムのトランスケトラーゼ欠損変異株によるリボフラビ
ンの製造 トランスケトラーゼの欠損がコリネバクテリウム グル
タミクムによるリボフラビン生産に与える効果を調べる
ため、L22株、TKT6株およびREV3株に、リボ
フラビンの生合成遺伝子を含む組換え体プラスミドpF
M41を導入してリボフラビン生産能を増強し、それら
3株のリボフラビンの蓄積量を比較した。
ミクムのプラスミドベクターpCG11のBglII部
位にコリネバクテリウム アンモニアゲネスのリボフラ
ビン生合成に関与する遺伝子を有する約4.2kbのD
NA断片が挿入されたスペクチノマイシン耐性マーカー
を有するプラスミドである。pFM41を有するコリネ
バクテリウム アンモニアゲネスは工業技術院微生物工
業技術研究所に、コリネバクテリウム アンモニアゲネ
スFM41(FERMBP−4003)として寄託され
ている。
pFM41のL22株、TKT6株およびREV3株へ
の導入は、実施例4記載の方法に準じて実施した。pF
M41を保有するL22株、TKT6株およびREV3
株を用いたリボフラビンの製造は以下のようにして行っ
た。スペクチノマイシンおよびシキミ酸をそれぞれ10
0mg/L添加したS5種培地3mlに上記3株を各々
植菌し、30℃で24時間振とう培養した。
ノマイシン100mg/Lおよびシキミ酸200mg/
Lを添加したP1生産培地5mlの入った太型試験管に
それぞれ接種し、30℃で72時間振とう培養した。各
培養液をろ過し、得られたろ液中のリボフラビンの生成
量を、逆相カラム〔RP―18(メルク社製)〕HPL
Cを用い、発光波長530nmおよび励起波長450n
mにおける蛍光強度を測定することにより、定量した。
結果を第3表に示す。
べリボフラビンの蓄積量が2倍以上に向上している。一
方、REV3/pFM41株のリボフラビンの蓄積量は
L22/pFM41株と同レベルであることから、TK
T6/pFM41株におけるリボフラビン生産性の向上
はトランスケトラーゼの欠損に起因していることは明白
である。
ケトラーゼ活性低下株によるリボフラビンの製造 トランスケトラーゼの欠損がエシェリヒア コリによる
リボフラビンの生産に与える効果を調べるため、エシェ
リヒア コリ EJ500株およびそのトランスケトラ
ーゼ変異株AI80に、リボフラビンの生合成遺伝子を
含む組換え体プラスミドpFM201を導入してリボフ
ラビン生産能を付与し、両組換え株のリボフラビンの蓄
積量を比較した。
cfs)からTn10の転移により得られたトランス
ケトラーゼ変異株で、2つのトランスケトラーゼ遺伝子
の内の一方のtktA遺伝子がTn10の挿入によって
破壊されているため、トランスケトラーゼの活性が親株
の約30%に低下している〔A. Iida et al., J. Bacte
riol., 175, 5375-5383 (1993)〕。
モーターの下流にコリネバクテリウム アンモニアゲネ
スのリボフラビン生合成に関与する遺伝子を含むDNA
断片が挿入されたアンピシリン耐性マーカーを有するプ
ラスミドであり、特開平6―225776に記載された
方法で調製した。pFM201のEJ500株およびA
I80株への導入は、通常のエレクトロポレーション法
やカルシウム法〔J. Sambrook et al., Molecular Clon
ing:A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harb
or Laboratory Press (1989)〕により実施することがで
き、本実験においてはカルシウム法を用いた。
びAI80株のリボフラビンの製造は以下のようにして
行った。100mg/Lのアンピシリンを添加したLB
培地〔バクトトリプトン 10g、酵母エキス 5g、N
aCl 5gを水1Lに含み、pH7.2に調整した培
地〕3mlに上記2株を各々植菌し、30℃で16時間
振とう培養した。
リンおよびシキミ酸をそれぞれ100mg/L添加した
P6生産培地〔グルコース 5g、KH2PO4 3g、
MgSO4・7H2O 0.25g、NaCl 5g、NH
4Cl 1g、NaHPO46g、チアミン塩酸塩 4mg
を水1Lに含み、pH7.2に調整した培地〕5mlの
入った太型試験管にそれぞれ接種し、37℃で24時間
振とう培養した。
施例5記載の方法に準じて、HPLCを用いて定量し
た。結果を第4表に示す。
1株に比べ、リボフラビンの蓄積量が約1.8倍に向上
しており、トランスケトラーゼ活性を低下させることに
よりリボフラビンの生産性が向上することが示された。
性を欠損、または親株に比べて低下させた変異株を用い
ることにより、PRPPを経由して生合成される代謝産
物の工業的により有利な製造法を提供することができ
る。
路を示した図である。
Claims (6)
- 【請求項1】 コリネバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属する微
生物のトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比
べて低下させることを特徴とする、該微生物において、
代謝経路上のホスホリボシルピロリン酸を経由して生合
成される代謝産物の生産を増強させる方法。 - 【請求項2】 コリネバクテリウム属、ブレビバクテリ
ウム属およびエシェリヒア属から選ばれる属に属し、か
つトランスケトラーゼ活性を欠損、または親株に比べて
低下させた微生物を培地に培養し、培養液中に、代謝経
路上のホスホリボシルピロリン酸を経由して生合成され
る代謝産物から選ばれる1もしくは数個の代謝産物を生
成蓄積させ、該代謝産物を採取することを特徴とする、
該代謝産物の製造方法。 - 【請求項3】 代謝産物が、プリンヌクレオチド、ピリ
ミジンヌクレオチド、プリンヌクレオシド、ピリミジン
ヌクレオシド、プリン塩基、ピリミジン塩基、フラビン
ヌクレオチド、L−ヒスチジンおよびリボフラビンから
選ばれる代謝産物である、請求項1または2記載の方
法。 - 【請求項4】 微生物が、コリネバクテリウム グルタ
ミクム TKT6、コリネバクテリウム グルタミクム
TKT6/pPH8、コリネバクテリウムグルタミク
ム TKT6/pFM41およびエシェリヒア コリ
AI80/pFM201から選ばれる、請求項1または
2記載の方法。 - 【請求項5】 コリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属し、かつトランスケトラーゼ活性を欠
損、または親株に比べて低下させた微生物。 - 【請求項6】 微生物が、コリネバクテリウム グルタ
ミクム TKT6、コリネバクテリウム グルタミクム
TKT6/pPH8およびコリネバクテリウム グル
タミクム TKT6/pFM41から選ばれる、請求項
5記載の微生物。
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