ES2349620T3 - Procedimiento para producir metabolitos sintetizados biológicamente mediante pirofosfato de fosforribosilo. - Google Patents
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Abstract
Se proporciona un procedimiento industrial más ventajoso para la producción de metabolitos sintetizados biológicamente vía fosforibosil pirofosfato (PRPP), haciendo uso de cepas modificadas metabólicamente en las cuales la actividad transcetolasa es deficiente o reducida si se compara con la cepa madre.
Description
Procedimiento para producir metabolitos
sintetizados biológicamente mediante pirofosfato de
fosforribosilo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de sustancias útiles que se
sintetizan por un procedimiento de fermentación en la serie de
reacciones de biosíntesis a partir de pirofosfato de fosforribosilo
(denominado "PRPP" en adelante) utilizando una cepa modificada
en el metabolismo, que es completamente carente de actividad de
transcetolasa o que presenta actividad de transcetolasa reducida en
comparación con la cepa original.
Los ejemplos de sustancias útiles sintetizadas a
partir de PRPP en la serie de reacciones metabólicas microbianas
incluyen sustancias relacionadas con ácidos nucleicos tales como
nucleótidos púricos, nucleótidos pirimidínicos, nucleósidos
púricos, nucleósidos pirimidínicos, bases púricas, bases
pirimidínicas y nucleótidos de flavina, así como
L-histidina y riboflavina.
Estas sustancias relacionadas con los ácidos
nucleicos, L-histidina, riboflavina y similares se
han producido industrialmente por un procedimiento de fermentación
o por una combinación de un procedimiento de fermentación con un
procedimiento de síntesis. Véase Applied Microbiology, editado por
Soichi Takao et al., Buneido Shuppan (1996); Amino Acid
Fermentation, editado por Hiroshi Aida et al., Gakkai Shuppan
Center (1986); documento
JP-A-6-225776
("JP-A" tal como se utiliza en la presente
memoria significa una solicitud de patente japonesa publicada sin
examinar'').
En los microorganismos, PRPP es sintetizado
biológicamente por una PRPP sintetasa a partir de ribosa
5-fosfato que es un compuesto intermedio en la
serie de reacciones de pentosa fosfato.
En cuanto a las series de reacciones de
biosíntesis de ribosa 5-fosfato, se conoce una serie
de reacción oxidativa de pentosa fosfato a través de la glucosa
6-fosfato deshidrogenasa, y es de esperar que una
serie de reacciones de pentosa fosfato no oxidativa esté también
implicada en su biosíntesis porque todas las enzimas en la serie de
reacciones no oxidativa de pentosa fosfato a través de la reacción
de transcetolasa son reversibles (véase la figura 1).
Se ha determinado mediante un estudio del
metabolismo de la glucosa marcada que ambas de estas series de
reacciones se refieren a la biosíntesis de ribosa
5-fosfato Escherichia coli, véase
Biochemistry, 12, 10, 1969 (1973). Además, se ha
demostrado mediante estudios genéticos, que la ribosa
5-fosfato es suministrada por la serie de
reacciones de pentosa fosfato no oxidativa a través de la reacción
de transcetolasa, porque las cepas carentes de glucosa
6-fosfato deshidrogenasa de Escherichia coli
y Corynebacterium glutamicum no presentan auxotrofía de la
ribosa, véase D.G. Fraenkel y R.T Vinopal, Ann. Rev.
Microbiol., 27, 69-100 (1973); E.D.
Ihnen y A L. Demain, J. Bacteriol., 98,
1151-1158 (1969).
Esta información sugiere que el aumento en la
actividad de la transcetolasa permite un aumento del aporte de
ribosa 5-fosfato y de PRPP procedente de la serie de
reacciones no oxidativa y por consiguiente aumenta la cantidad de
sustancias biológicamente sintetizadas a partir de PRPP.
Además, se ha publicado que una cepa carente de
actividad de transcetolasa en las cepas que producen inosina que
pertenecen al género Bacillus tal como Bacillus
subtilis acumula una cantidad considerable de ribosa en el
medio de cultivo de modo que el rendimiento de la producción de
nucleótidos púricos se reduce, véase K. Sasajima y M. Yoneda,
Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 2, 175-213
(1984).
Esta información sugiere también que la
actividad de la transcetolasa es necesaria para la producción de
sustancias biológicamente sintetizadas a partir de PRPP. Sin
embargo, hasta la fecha, con respecto a todos los microorganismos,
no se ha sabido que el rendimiento de la producción de metabolitos
que han de sintetizarse biológicamente a partir de PRPP mejore por
pérdida o reducción de la actividad de la transcetolasa.
Dado que la demanda de metabolitos sintetizados
biológicamente ha aumentado a partir de PRPP, las sustancias
relacionadas con el ácido nucleico específicamente,
L-histidina, riboflavina y similares, es muy
deseable el desarrollo de un procedimiento industrialmente
ventajoso para su producción.
El objetivo de la presente invención consiste en
proporcionar un procedimiento industrialmente ventajoso para la
producción de metabolitos sintetizados biológicamente a partir de
PRPP.
En los estudios convencionales sobre el cultivo
de microorganismos, se han alcanzado grandes logros por la mejora
del metabolismo de la serie de reacciones de biosíntesis terminal
afectadas en la biosíntesis de cada metabolito de interés.
En la presente invención se ha considerado que
otra modificación aparte de la mejora metabólica de la serie de
reacciones de biosíntesis terminal, es decir de la modificación del
metabolismo central capaz de modificar el aporte y la mezcla del
sustrato de partida, sería necesaria para mejorar más la
productividad de los metabolitos y realizar estudios exhaustivos
sobre la influencia del flujo del carbono en varios metabolitos
manipulando la serie de reacciones metabólica central en los
microorganismos.
Como resultado, se ha observado que la eficacia
de la producción de metabolitos biológicamente sintetizados a
partir de PRPP en la serie de reacciones de biosíntesis puede
mejorarse haciendo que la actividad de la transcetolasa sea
insuficiente o reducida en comparación con la de una cepa original
de la misma, dando como resultado de este modo la realización de la
presente invención.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar:
- (1)
- un procedimiento para el aumento de producción de metabolitos biológicamente sintetizados a partir de pirofosfato de fosforribosilo en la serie de reacciones metabólicas en un microorganismo, comparado con el de una cepa original del mismo, según la reivindicación 1.
- (2)
- procedimiento según el apartado (1) anterior, en el que el metabolito se selecciona de entre el grupo constituido por nucleótidos púricos, nucleótidos pirimidínicos, nucleósidos púricos, nucleósidos pirimidínicos, bases púricas, bases pirimidínicas, nucleótidos de flavina, L-histidina y riboflavina;
- (3)
- procedimiento según el apartado (1) o (2) anterior, en el que dicho microorganismo se selecciona de entre el grupo constituido por TKT6 de Corynebaterium glutamicum, TKT6/pPH8 de Corynebaterium glutamicum, TKT6/pFM41 de Corynebaterium glutamicum y AI80/pFM201 de Escherichia coli;
- (4)
- un microorganismo, en el que dicho microorganismo se selecciona de entre el grupo constituido por TKT6 de Corynebaterium glutamicum, TKT6/pPH8 de Corynebaterium glutamicum y TKT6/pFM41 de Corynebaterium glutamicum.
La figura 1 es un gráfico que presenta la serie
de reacciones metabólica desde glucosa hasta PRPP. En la figura 1,
las flechas grises muestran las reacciones mediante
transcetolasa.
A continuación se describe con detalle la
presente invención.
La frase "microorganismo en el que la
actividad de transcetolasa es reducida en comparación con una cepa
original de la misma" tal como se utiliza en la presente memoria
incluye todas las cepas que presentan cualquier grado de actividad
de transcetolasa reducida en comparación con una cepa original
determinada en las condiciones descritas en los ejemplos a
continuación. La reducción en la actividad de transcetolasa es del
30% o más, preferentemente 50% o más. Los ejemplos de cepas en las
que la actividad de transcetolasa es insuficiente o reducida
incluyen las cepas con una o más modificaciones de nucleótidos que
producen carencia o reducción en la actividad de transcetolasa,
modificaciones que se seleccionan de entre sustituciones,
eliminaciones, inserciones, adiciones e inversiones de nucleótidos
en la secuencia nucleotídica del gen estructural de transcetolasa o
del gen que participa en la transcripción o traducción del gen
estructural de transcetolasa.
El microorganismo que debe utilizarse en la
presente invención es cualquiera de las cepas naturales, cepas
mutantes, cepas de fusión celular, cepas transducidas o cepas
recombinantes construidas mediante técnicas de ADN recombinante,
siempre que pertenezcan al género Corynebaterium,
Brevibacterium o Escherichia, y siempre que la actividad
de transcetolasa del microorganismo sea insuficiente o reducida en
comparación con la cepa original del mismo.
Los ejemplos de los microorganismos incluyen
Corynebaterium glutamicum, Corynebaterium acetoacidophilum,
Corynebaterium herculis, Corynebaterium lilium, Corynebaterium
melassecola, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium flavum,
Brevibacterium immariophilum, Brevibacterium lactofermentum,
Brevibacterium thiogenitalis y Escherichia coli, en los
que la actividad de transcetolasa es insuficiente o reducida en
comparación con una cepa original de los mismos.
Los ejemplos preferidos de los microorganismos
que han de utilizarse como originales en la presente invención
incluyen las denominadas cepas productoras de ácido glutámico de
tipo coryne y Escherichia coli que se utilizan en la
fermentación de aminoácidos y Corynebaterium ammoniagenes que
se utiliza en la fermentación ácidos nucleicos y en la fermentación
de riboflavina.
El microorganismo de la presente invención puede
obtenerse a partir de un microorganismo conocido que pertenece al
género Corynebaterium, Brevibacterium o Escherichia,
provocando la mutación que produce carencia o reducción de la
actividad de transcetolasa en microorganismos conocidos por un
procedimiento de tratamiento por mutación habitual, un
procedimiento de sustitución génica por técnicas de ADN
recombinante, un procedimiento de transducción o un procedimiento
de fusión celular.
Como ejemplos ilustrativos, la cepa de la
presente invención se obtiene por selección utilizando auxotrofía
del ácido shikímico y la propiedad no asimiladora del la ribosa como
marcadores.
Después de someter a un microorganismo que
pertenece al género Corynebaterium, Brevibacterium o
Escherichia, al tratamiento por mutación habitual, tal como
irradiación de rayos ultravioletas o tratamiento químico con
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) o ácido nitroso, se obtienen mutantes auxótrofos con ácido
shikímico aislando las colonias que no pueden crecer o que
presentan escaso crecimiento en un medio mínimo que contiene
glucosa como única fuente de carbono, en el que la muestra original
puede crecer, pero presenta buen crecimiento en dicho medio mínimo
enriquecido con ácido shikímico.
Cada mutante auxótrofo con ácido shikímico se
extiende en un medio mínimo que contiene ácido shikímico y glucosa
o ribosa como única fuente de carbono, y se selecciona la cepa
mutante que puede desarrollarse en el medio con glucosa pero no
puede desarrollarse o presenta poco desarrollo en el medio de
ribosa. Esta cepa es un mutante en el que la actividad de la
transcetolasa es insuficiente o reducida en comparación con la cepa
original de la
misma.
misma.
Mediante este procedimiento, puede obtenerse
fácilmente un mutante que tiene auxotrofía con ácido shikímico y la
propiedad no asimilante de ribosa, en la que la actividad de la
transcetolasa es insuficiente o reducida en comparación con una
cepa original de la misma. Además, una cepa mutante con actividad de
transcetolasa insuficiente o reducida puede obtenerse mediante el
procedimiento de sustitución génica habitual utilizando un gen de
transcetolasa en el que un gen que codifica a la transcetolasa se
destruye in vitro.
Como gen que codifica a la transcetolasa, pueden
utilizarse genes conocidos, véase G.A. Sprenger, Biochim.
Biophys. Acta., 1216, 307 (1993); A. Iida et al.,
J. Bacteriol., 175, 5375-5383 (1993);
documento
JP-A-6-169785. La
secuencia de ADN del gen de la transcetolasa de Corynebaterium
glutamicum ha sido sometida a DDBJ/GenBank/
EMBL en el contexto de la presente invención y se le ha asignado el número de registro AB023377.
EMBL en el contexto de la presente invención y se le ha asignado el número de registro AB023377.
Aunque la cepa de la presente invención puede
obtenerse por selección utilizando auxotrofía del ácido shikímico y
la propiedad no asimilante de la ribosa como marcadores,
determinadas cepas con actividad de transcetolasa ligeramente
reducida comparadas con la cepa original no siempre presentan la
auxotrofía del ácido shikímico y la propiedad no asimilante de
ribosa. Dichas cepas, sin embargo, se desea también que sean
ilustrativas como microorganismos adecuados para su utilización en
la presente invención. Es decir, el microorganismo de la presente
invención, es un microorganismo con aumento de la actividad de
metabolitos biológicamente sintetizados a partir de PRPP en la
serie de reacciones metabólicas.
Dichos microorganismos pueden obtenerse a partir
de una cepa mutante de transcetolasa que presenta auxotrofía del
ácido shikímico produciendo una mutación inversa en la que la
auxotrofía del ácido shikímico desaparece completamente, una
mutación inversa en la que la auxotrofía del ácido shikímico resulta
defectuosa o una mutación inversa en la que la propiedad de
asimilación de la ribosa se restablece parcial o completamente.
Ejemplos ilustrativos de dicho microorganismo
incluyen TKT6 de Corynebaterium glutamicum.
Además, una cepa capaz de producir el metabolito
de interés de manera más eficaz puede obtenerse a partir del
microorganismo obtenido de este modo en el que la actividad de la
transcetolasa es insuficiente o reducida en comparación con la de
una cepa original del mismo, utilizando además un procedimiento
conocido para mejorar la productividad de un metabolito de interés
seleccionado de entre metabolitos biológicamente sintetizados a
partir de PRPP, tal como el procedimiento en el que una serie de
reacciones de degradación o una serie de reacciones de ramificación
está bloqueada o el procedimiento en el que se libera el control de
retroalimentación de una enzima clave en la serie de reacciones de
biosíntesis o la actividad de la enzima aumenta, haciendo uso de
técnicas de mutación o de ADN recombinante.
Utilizando las técnicas del ADN recombinante,
una cepa con productividad mejorada de un metabolito de interés
puede obtenerse transformando un hospedador con un plásmido
recombinante que contiene un gen para la biosíntesis de dicho
metabolito.
A título ilustrativo, puede obtenerse una cepa
capaz de producir histidina en una cantidad considerable
introduciendo un plásmido recombinante que contiene un gen para
biosíntesis de histidina, tal como pPH8, en Corynebaterium
glutamicum en el que la actividad de transcetolasa es
insuficiente o reducida en comparación con una cepa original del
mismo. Los ejemplos ilustrativos de dichas cepas incluyen TKT6/pPH8
de Corynebaterium glutamicum.
Puede obtenerse una cepa capaz de producir
riboflavina en una cantidad considerable introduciendo un plásmido
recombinante que contiene un gen para la biosíntesis de riboflavina,
tal como pFM41, en Corynebaterium glutamicum en el que la
actividad de transcetolasa es insuficiente o reducida en comparación
con una cepa original del mismo. Los ejemplos ilustrativos de
dichas cepas incluyen TKT6/pFM41 de Corynebaterium
glutamicum.
Puede obtenerse también una cepa capaz de
producir riboflavina en una cantidad considerable introduciendo un
plásmido recombinante que contiene un gen para la biosíntesis de
riboflavina, tal como pFM201, en Escherichia coli en el que
la actividad de transcetolasa es insuficiente o reducida en
comparación con una cepa original del mismo. Los ejemplos
ilustrativos de dichas cepas incluyen AI80/pFM201 de
Corynebaterium glutamicum.
Una cepa con productividad mejorada de un
metabolito de interés puede obtenerse también utilizando los
procedimientos de mutación siguientes.
Es decir, el procedimiento para producir inosina
en el que se crean la auxotrofía de la adenina y la resistencia al
análogo púrico [Hakko to Kogyo (Fermentation and Industry),
36, 12, 1036-1048 (1978)], el procedimiento
para producir ácido inosínico en el que se crean la auxotrofía de
adenina y guanina y la propiedad insensible al manganeso [Applied
Microbiology, editado por Shoichi Takab et al., Buneido
Shuppan (1996)], el procedimiento para producir guanosina en el que
se crean la auxotrofía de la adenina y la histidina y la resistencia
contra el sulfóxido de metionina, la psicofuranina y la deconina
[Applied Microbiology, editado por Shoichi Takao et al.,
Buneido Shuppan (1996)], el procedimiento para producir nucleósidos
pirimidínicos tales como la uridina y la citidina en los que se
crea la resistencia contra un análogo pirimidínico
[Bioindustry, 12, 6, 36-43 (1995)],
el procedimiento para producir bases tales como adenina y uracilo,
en el que se crea la resistencia contra un análogo púrico tal como
2-fluoroadenina [Nippon Nogei Kagaku Kaishi
(Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan)
48, 1, 63-68 (1974) el mismo diario,
52, 3, 129-133 (1978)], y el procedimiento
para producir L-histidina en el que se crea la
resistencia contra un análogo de histidina tal como
2-tiazolalanina o
1,2,4-triazolalanina [Amino Acid Fermentation,
editado por Hiroshi Aida et al., Gakkai Shuppan Center
(1986)].
Mejorando un microorganismo en el que la
actividad de transcetolasa es insuficiente o reducida en comparación
a una cepa original del mismo, haciendo uso de estos procedimiento
conocidos, puede obtenerse una cepa con productividad mejorada de
un metabolito de interés.
Uno o diversos metabolitos seleccionados de
entre metabolitos biológicamente sintetizados a partir de PRPP en
la serie de reacciones metabólicas puede producirse cultivando el
microorganismo de la presente invención en un medio, efectuando de
este modo la formación y acumulación de dichos metabolitos en el
caldo de cultivo, y posteriormente recuperando dichos metabolitos
del mismo.
El cultivo del microorganismo de la presente
invención puede realizarse según un procedimiento de cultivo
utilizado generalmente.
El medio que ha de utilizarse puede ser un medio
sintético o un medio natural, con la condición de que contenga
cantidades apropiadas de fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno,
sustancias inorgánicas, aminoácidos y vitaminas necesarias, así
como cantidades insignificantes de sustancias nutrientes requeridas
por la cepa que ha de utilizarse. Cuando la cepa que ha de
utilizarse necesita ácido shikímico para su desarrollo en el medio
que ha de utilizarse, se añade una pequeña cantidad de ácido
shikímico al medio. El mismo objetivo puede conseguirse añadiendo
pequeñas cantidades de los tres aminoácidos aromáticos en lugar de
ácido shikímico.
Los ejemplos de la fuente de carbono que debe
utilizarse incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa,
sacarosa, maltosa, manosa, glicerol, almidón, hidrolizado de almidón
y molasas, polialcoholes y varios ácidos orgánicos tales como ácido
pirúvico, ácido fumárico, ácido láctico y ácido acético. Dependiendo
de la capacidad de asimilación del microorganismo, pueden
utilizarse también hidrocarburos y alcoholes.
Los ejemplos de fuente de nitrógeno incluyen
amoniaco o varias sales de amonio inorgánico y orgánico, tal como
cloruro de amonio, sulfato de amonio, carbonato de amonio y acetato
de amonio, urea y otras sustancias que contienen nitrógeno, y
sustancias orgánicas que contienen nitrógeno tales como peptona,
NZ-amina, extracto de carne, extracto de levadura,
jarabe de maíz fermentado, hidrolizado de caseína y pescado o un
extracto de los mismos.
Los ejemplos de sustancia inorgánica incluyen
fosfato dibásico de potasio, fosfato monobásico dipotásico, sulfato
de amonio, cloruro de amonio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio,
sulfato ferroso, sulfato de manganeso y carbonato de calcio.
Pueden añadirse aminoácidos y vitaminas al medio
según requiera la ocasión dependiendo de la fuente de carbono, de
la fuente de nitrógeno y de otras sustancias utilizadas en la
presente.
El cultivo se lleva a cabo en condiciones
aeróbicas tal como cultivo en agitación o cultivo en agitación por
aireación. En general, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura
preferentemente entre 20 y 40ºC, es deseable mantener el pH del
medio aproximadamente neutro. El cultivo se lleva a cabo
generalmente en un período de 1 a 5 días.
El metabolito de interés formado y acumulado en
el medio de cultivo puede recuperarse por el procedimiento
siguiente.
Las células se retiran después de la
finalización del cultivo, y el metabolito de interés se recupera por
un procedimiento conocido tal como un procedimiento de
cristalización por concentración, un procedimiento de tratamiento
en carbón activado o un procedimiento con resina de intercambio
iónico, véase "Bioseparation Process Manual", Isao Endo et
al., The Society of Chemical Engineers (editado) Kyoritsu
Shuppan (1996).
A continuación se proporcionan ejemplos de la
presente invención a título ilustrativo y no limitativo.
Se inoculó L22 de Corynebaterium
glutamicum [un mutante sensible a la lisozima procedente de una
cepa ATCC 31833; R. Katsumata et al., Proc. 4th
Eur. Congr. Biotechnol., 4, 767 (1987)] se inoculó en 3
ml de medio NB (medio preparado disolviendo 20 g de caldo en polvo y
5 g de extracto de levadura en 1 l de agua y ajustando el pH del
medio a 7,2) y cultivado a 30ºC hasta que la DO_{660} sea
aproximadamente 0,6.
Después del cultivo se recogieron las células
por centrifugación, se lavaron una vez con tampón de ácido
Tris-maleico 50 mM (pH 6,0) y a continuación se
sometieron a 20 minutos de tratamiento de mutación a temperatura
ambiente en 3 ml del mismo tampón que contenía 400 mg/l de NTG.
Las células tratadas se lavaron dos veces por
centrifugación utilizando el mismo tampón y a continuación se
cultivaron a 30ºC durante 1 hora en 3 ml del medio NB.
El caldo de cultivo obtenido de este modo se
diluyó por un factor de 10^{-5} a 10^{-6} con solución salina
fisiológica y 0,1 ml del caldo de cultivo diluido se extendió en un
medio NB de agar-agar (medio NB que contenía 1,4%
de agar-agar, pH 7,2) y se cultivó a 30ºC durante 2
días.
Cada una de las colonias cultivada en el medio
de agar-agar se extendió y se cultivó en un medio M1
mínimo de agar-agar [medio preparado disolviendo 10
g de glucosa, 1 g de (NH_{4})H_{2}PO_{4}, 0,2 g de KCl,
0,2 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 10 mg de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,2 mg de
MnSO_{4}\cdot4-6H_{2}O, 0,9 mg de
ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,4 mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O,
0,09 mg de Na_{2}B_{4}O_{7}\cdot10H_{2}O, 0,04 mg de
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4H_{2}O, 50 mg de
biotina, 2,5 mg de ácido
p-aminobenzoico, 1 mg de hidrocloruro de tiamina y
16 g de agar-agar en 1 l de agua y ajustando el pH
del medio a 7,2] y el medio M1 con agar-agar se
enriqueció con 50 mg/l de ácido shikímico.
Las cepas que no pudieron desarrollarse en el
medio M1 mínimo con agar-agar pudieron desarrollarse
en el medio M1 con agar-agar que contenía 50 mg/l
de ácido shikímico se aislaron como mutantes auxótrofos de ácido
shikímico.
Cada mutante auxótrofo de ácido shikímico
aislado de este modo se extendió y se cultivó en un medio M1 con
agar-agar que contenía 50 mg/l de ácido shikímico y
un medio en el que la glucosa en dicho medio fue sustituida por
ribosa.
Las cepas pudieron desarrollarse en el medio M1
de agar-agar que contenía 50 mg/l de ácido shikímico
pero que no pudieron desarrollarse en el medio en el que la glucosa
en dicho medio estaba sustituida por ribosa se aislaron como
mutantes auxótrofo por ácido shikímico y no asimilantes de
ribosa.
Cada mutante auxótrofo por ácido shikímico y no
asimilante de ribosa obtenido de este modo se cultivó en el medio
M1 que contenía 50 mg/l de ácido shikímico, y las células cultivadas
se recuperaron por centrifugación y se sometieron a un
procedimiento de disgregación ultrasónica conocido para preparar una
solución enzimática en bruto [M. Ikeda y R. Katsumata, Appl.
Environ. Microbiol., 58, 781-785
(1992)].
Utilizando la solución enzimática en bruto
preparada de este modo se midió la actividad de la transcetolasa de
la siguiente manera.
La solución enzimática en bruto se añadió a una
solución de reacción que contenía 50 mM de Tris (pH 7,5), 0,2 mM de
NADH, 0,01 mM de pirofosfato de tiamina, 1 mM de MgCl_{2}, 0,5 mM
de xilosa 5-fosfato, 0,5 mM de ribulosa
5-fosfato y 20 mg de
glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa/triosa-fosfato isomerasa y 20 mg de
una solución mixta de
glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa/triosa-fosfato isomerasa (producida
por Boehringer-Mannheim) y la mezcla resultante en
un volumen total de 1,5 ml se sometió a la reacción a 30ºC.
La cantidad de
gliceraldheído-3-fosfato formado se
determinó midiendo la absorbancia disminuida de NADH a 340 nm.
Mediante este ensayo enzimático, se seleccionó
un mutante TKT6 con insuficiente actividad de transcetolasa incapaz
de formar gliceraldheído 3-fosfato a partir de las
cepas mutantes que presentan auxotrofía de ácidos shikímico y sin
capacidad de asimilación de ribosa.
TKT6 de Corynebacterium glutamicum se
depositó el 30 de junio de 1998, en el National Institute of
Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Higashi 1-1-3, Tsukuba,
Ibaraki, Japón (Código Postal: 305-0046) bajo el
Tratado de Budapest como FERM BP-6399.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa TKT6 se cultivó a 30ºC durante 24 horas
en 3 ml de medio NB. Después, del cultivo, se recogieron las
células por centrifugación. Se lavaron las células tres veces por
centrifugación utilizando solución salina fisiológica y a
continuación se pusieron en suspensión en solución salina
fisiológica hasta una densidad celular de aproximadamente
10^{9}/ml.
\newpage
Una parte de 0,1 ml de la suspensión celular se
extendió en el medio M1 de agar-agar y se cultivó a
30ºC durante 3 días. Las cepas capaces de desarrollarse en el medio
M1 de agar-agar se aislaron como transcriptores no
auxótrofos del ácido shikímico.
Se observó que las propiedades de cada
transcriptor no auxótrofo con ácido shikímico, incluyendo la
propiedad de asimilación de ribosa y la actividad de transcetolasa,
se restablecieron para los de tipo natural.
Este resultado indica que tanto los caracteres
de auxotrofía del ácido shikímico como la propiedad de no
asimilación de ribosa se producen debido a la carencia de actividad
de la transcetolasa.
Uno de los transcriptores no auxótrofos con
ácido shikímico obtenido de este modo (cepas transcritas de mutación
por eliminación de transcetolasa) se denominó REV3.
\vskip1.000000\baselineskip
La producción de adenina por L22, TKT6 y REV3 de
Corynebacterium glutamicum se llevó a cabo de la siguiente
manera.
Cada una de las aproximadamente tres cepas se
inoculó en 3 ml de medio NB enriquecido con 10 g/l de glucosa y se
cultivó a 30ºC durante 20 horas.
Una parte de 0,1 ml de cada caldo de cultivo
obtenido de este modo se inoculó en un tubo de ensayo grande que
contenía 5 ml de medio M1 enriquecido con 100 mg/l de ácido
shikímico y se cultivó en un vibrador a 30ºC durante 24 horas.
Cada caldo de cultivo obtenido de este modo se
filtró, y la cantidad de adenina formada en el filtrado resultante
se determinó midiendo la absorbancia a 254 nm utilizando una columna
HPLC de intercambio iónico (Shodex Asahipak GS-320
7E, producida por Asahi Chemical Industry).
Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Solamente la cepa TKT6 carente de actividad de
transcetolasa segregó y acumuló adenina en el medio de cultivo.
Debido a que el REV3 transcrito de transcetolasa
obtenido a partir de TKT6 de nuevo pierde la capacidad para
producir adenina, es obvio que la formación de adenina por TKT6 se
atribuye a la carencia de transcetolasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de examinar el efecto de la carencia
de transcetolasa en la producción de histidina por
Corynebacterium glutamicum, se introdujo un plásmido
recombinante pPH8 que contenía el gen de biosíntesis de histidina en
las cepas L22, TKT6 y REV3 para mejorar su productividad de
histidina, y se compararon las cantidades de histidina producidas
por las tres cepas.
El plásmido pPH8, es un plásmido con un marcador
con resistencia a la espectinomicina, en el que un fragmento de ADN
de aproximadamente 10,6 kb que tiene un gen que tiene que ver con la
biosíntesis de histidina en Corynebacterium glutamicum se
inserta en la secuencia BglII del vector plásmido pCG11 de
Corynebacterium glutamicum.
La cepa de Corynebacterium glutamicum que
lleva pPH8 se ha depositado en American Type Culture Collection,
USA: como K32 de Corynebacterium glutamicum (ATCC 39281).
El plásmido pPH8 puede aislarse de la cepa ATCC
39281 por un procedimiento convencional de lisis con álcali [J.
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)].
La introducción pPH8 en las cepas L22, TKT6 y
REV3 puede llevarse a cabo por un procedimiento con protoplastos
generalmente utilizados en bacterias corineformes [R. Katsumata
et al., J. Bacteriol; 159,
306-311 (1984)] o por un procedimiento de
electroporación (voltaje 2,5 kV, capacidad eléctrica 25 mF,
resistencia 200 W) [J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press
(1989)] utilizando un aparato pulsador de genes
(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) y se utilizó el
procedimiento con protoplastos en esta prueba.
La producción de histidina por las cepas L22,
TKT6 y REV3 que tienen pPH8 se realizó de la manera siguiente.
Cada una de estas tres cepas se inoculó en 3 ml
de un medio de cultivo con semillas S5 (medio preparado disolviendo
20 g de glucosa, 15 g de polipeptona, 15 g de extracto de levadura,
2,5 g de NaCl y 1 g de urea en 1 l de agua y ajustando la solución
a pH 7,2) enriquecido con 100 mg/l de espectinomicina y la misma
cantidad de ácido shikímico y se cultivó en un vibrador a 30ºC
durante 24 horas.
Una fracción de 0,5 ml de cada cultivo obtenido
de este modo se inoculó en un tubo de ensayo grande que contenía 5
ml de un medio de producción P1 (medio preparado disolviendo 60 g de
glucosa, 1 g de KH_{2}PO_{4}, 1 g de K_{2}HPO_{4}, 1 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 20 g de (NH_{4})_{2}SO_{4},
5 g de jarabe de maíz fermentado, 10 mg de MnSO_{4}, 30 mg de
biotina y 20 g de CaCO_{3} en 1 l de agua y ajustando la solución
a pH 7,2) que se ha enriquecido con 100 mg/l de espectinomicina y
200 mg/l de ácido shikímico y cultivado en un vibrador a 30ºC
durante 72 horas.
Cada caldo de cultivo obtenido de este modo se
filtró, y la cantidad de L-histina formada en el
filtrado resultante se determinó por el método de formación de
derivados en la columna OPA post [Anal. Chem., 51,
1338 (1979)] utilizando HPLC.
Los resultados se presentan en la Tabla 2.
La cantidad de L-histidina
producida por TKT6/pPH8 es aproximadamente dos veces superior que la
de L22/pPH8. Por otra parte, la cantidad
L-histidina producida por REV3/pPH8 está al mismo
nivel que la de L22/pPH8, así que es evidente que la mejora de
productividad de L-histidina en TKT6/pPH8 se
atribuye a la carencia de transcetolasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de examinar el efecto de la carencia
de transcetolasa en la producción de riboflavina por
Corynebacterium glutamicum, se introdujo un plásmido
recombinante pFM41 que contenía el gen de biosíntesis de riboflavina
en las cepas L22, TKT6 y REV3 para mejorar su productividad de
riboflavina, y se compararon las cantidades de riboflavina
producidas por las tres cepas.
El plásmido pFM41, es un plásmido con un
marcador con resistencia a la espectinomicina, en el que un
fragmento de ADN de aproximadamente 4,2 kb que tiene un gen que
tiene que ver con la biosíntesis de riboflavina en
Corynebacterium ammoniagenes se inserta en la secuencia
BglII del vector plásmido pCG11 de Corynebacterium
glutamicum.
La Corynebacterium ammoniagenes con pFM41
se ha depositado en el National Institute of Bioscience and Human
Technology, Agency of Industrial Science and Technology, como FM41
de Corynebacterium ammoniagenes (FERM
BP-4003).
El aislamiento del plásmido pFM41 de la cepa
FM41 y la introducción del pFM41 en las cepas L22, TKT6 y REV3 se
llevó a cabo según los procedimientos descritos en el Ejemplo 4.
La producción de riboflavina por las cepas L22,
TKT6 y REV3 que tienen pFM41 se realizó de la manera siguiente.
Cada una de las tres cepas se inoculó en 3 ml de
un medio de cultivo con semillas S5 que se ha enriquecido con 100
mg/l de espectinomicina y la misma cantidad de ácido shikímico y se
cultivó en un vibrador a 30ºC durante 24 horas.
Una fracción de 0,5 ml de cada cultivo obtenido
de este modo se inoculó en un tubo de ensayo grande que contenía 5
ml del medio de producción P1 enriquecido con 100 mg/l de
espectinomicina y 200 mg/l de ácido shikímico y cultivado en un
vibrador a 30ºC durante 72 horas.
Cada caldo de cultivo obtenido de este modo se
filtró, y la cantidad de riboflabina formada en el filtrado
resultante se determinó midiendo las intensidades de fluorescencia a
una longitud de onda de emisión de 530 nm y una longitud de onda de
excitación de 450 nm utilizando una columna de HPLC en fase inversa
(RP-18, producida por Merck).
Los resultados se presentan en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de riboflavina producida por
TKT6/pFM41 es aproximadamente dos veces superior que la de
L22/
pFM41. Por otra parte, la cantidad riboflavina producida por REV3/pFM41 está al mismo nivel que la de L22/pFM41, así que es evidente que la mejora de productividad de riboflavina en TKT6/pFM41 se atribuye a la carencia de transcetolasa.
pFM41. Por otra parte, la cantidad riboflavina producida por REV3/pFM41 está al mismo nivel que la de L22/pFM41, así que es evidente que la mejora de productividad de riboflavina en TKT6/pFM41 se atribuye a la carencia de transcetolasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para examinar el efecto de la carencia de
transcetolasa sobre la producción de riboflavina por Escherichia
coli, se introdujo un plásmido pFM201 recombinante que contiene
el gen de la biosíntesis de rioboflavina en una cepa EJ500 de
Escherichia coli y su cepa AI80 con carencia de transcetolasa
para proporcionar las cepas con productividad de riboflavina, y se
compararon las cantidades de riboflavina producida por ambas cepas
recombinantes.
La cepa AI80 es una cepa con carencia de
transcetolasa obtenida a partir de la cepa EJ500 (W3100 cfs)
por inserción de Tn10, en la que su actividad de transcetolasa se
redujo hasta aproximadamente 30% de la cepa original debido a la
destrucción de uno de los dos genes de transcetolasa, el gen
tktA, mediante la inserción de Tn10 [A. Iida et al., J.
Bacteriol., 175, 5375-5383 (1993)].
El plásmido pFM201 es un plásmido que tiene un
marcador con resistencia a la ampicilina, en el que un fragmento de
ADN que tiene un gen que tiene que ver con la biosíntesis de la
riboflavina en Corynebacterium ammoniagenes se inserta en la
secuencia corriente abajo del activador lac de pUC19 y se
preparó según el procedimiento descrito en el documento
JP-A-6-225776.
La introducción de pFM201 en las cepas EJ500 y
AI80 se realizó por un procedimiento de electroporación habitual o
por un procedimiento con calcio [J. Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989)] y el procedimiento con calcio se utilizó en
esta prueba.
La producción de riboflavina por las cepas EJ500
y AI80 que tienen pFM201 se realizó de la manera siguiente.
Cada una de las dos cepas se inoculó en 3 ml de
un medio LB (medio preparado disolviendo 10 g de
Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura y 5 g
de NaCl en 1 l de agua y ajustando la solución a pH 7,2) que se ha
enriquecido con 100 mg/l de ampicilina y se cultivó en un vibrador
a 30ºC durante 16 horas.
Una fracción de 0,1 ml de cada caldo de cultivo
obtenido de este modo se inoculó en un tubo de ensayo grande que
contenía 5 ml de un medio de producción P6 (medio preparado
disolviendo 5 g de glucosa, 3 g de KH_{2}PO_{4}, 0,25 g de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 5 g de NaCl, 1 g de NH_{4}Cl 6 g de
NaH_{2}PO_{4} y 4 mg de hidrocloruro de tiamina en 1 l de agua
y ajustando la solución a pH 7,2) que se ha enriquecido con 100 mg/l
de ampicilina y la misma cantidad de ácido shikímico y cultivado en
un vibrador a 37ºC durante 24 horas.
La cantidad de riboflavina formada en los
filtrados resultantes se determinó utilizando HPLC según el
procedimiento descrito en el Ejemplo 5.
Los resultados se presentan en la Tabla 4.
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de riboflavina producida por
AI80/pFM201 es aproximadamente 1,8 veces mayor que la de
EJ500/
pFM201, lo que demuestra que la productividad de la riboflavina se mejora al reducir la actividad de la transcetolasa.
pFM201, lo que demuestra que la productividad de la riboflavina se mejora al reducir la actividad de la transcetolasa.
Según la presente invención, se proporciona un
procedimiento industrialmente más ventajoso para la producción de
metabolitos biológicamente sintetizados a partir de PRPP, haciendo
uso de cepas biológicamente modificadas en las que la actividad de
la transcetolasa es insuficiente o reducida en comparación con la
cepa original según las reivindicaciones 1 a 3.
Esta solicitud se basa en la solicitud de
patente japonesa nº Hei. 10-187992, presentada el 3
de julio de 1998.
Claims (4)
1. Procedimiento para la producción aumentada de
metabolitos biológicamente sintetizados mediante pirofosfato de
fosforribosilo en la serie de reacciones metabólicas en un
microorganismo, comparada con la de una cepa original del mismo,
que comprende
- (a)
- aislar un microorganismo que es un ácido shikímico auxótrofo y no puede asimilar ribosa, y en el que la actividad de la transcetolasa es insuficiente o reducida 30% o más en comparación con la de una cepa original del mismo, en el que el microorganismo pertenece al género Corynebacterium, Brevibacterium o Escherichia;
- (b)
- cultivar en un medio dicho microorganismo hasta que se forme y se acumule en el cultivo uno o una pluralidad de metabolitos seleccionados de entre los metabolitos biológicamente sintetizados a partir del pirofosfato de fosforribosilo en la serie de reacciones metabólicas; y
- (c)
- recuperar dichos metabolitos del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el metabolito es un nucleótido púrico, nucleótido
pirimidínico, nucleósido púrico, nucleósido pirimidínico, base
púrica, base pirimidínica, nucleótido de flavina,
L-histidina y riboflavina.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho microorganismo es TKT6 de Corynebacterium
glutamicum, TKT6/pPH8 de Corynebacterium glutamicum,
TKT6/pFM41 de Corynebacterium glutamicum o AI80/pFM201 de
Escherichia coli.
4. Microorganismo que pertenece al género
Corynebacterium o Brevibacterium, en el que la
actividad de transcetolasa es insuficiente o reducida en
comparación con una cepa original del mismo, en el que dicho
microorganismo es TKT6 de Corynebacterium glutamicum,
TKT6/pPH8 de Corynebacterium glutamicum o TKT6/pFM41
de Corynebacterium glutamicum.
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| JP2009165355A (ja) | 2006-04-28 | 2009-07-30 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法 |
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| RU2006143864A (ru) | 2006-12-12 | 2008-06-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ |
| BRPI0703692B1 (pt) * | 2006-12-25 | 2016-12-27 | Ajinomoto Kk | método para se obter os cristais de um hidrocloreto de aminoácido básico compreendendo gerar um aminoácido básico usando células microbianas por fermentação em um caldo de fermentação ou por um método enzimático em uma solução de reação de enzima usando as células como catalisadores |
| BRPI0806790B1 (pt) | 2007-01-22 | 2017-02-14 | Ajinomoto Kk | microorganismo, e, método para produzir um l-aminoácido |
| JP2010110217A (ja) | 2007-02-22 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2396336C2 (ru) | 2007-09-27 | 2010-08-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia |
| JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
| KR20100120663A (ko) | 2008-01-23 | 2010-11-16 | 아지노모토 가부시키가이샤 | Ｌ-아미노산의 제조법 |
| RU2008105793A (ru) | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена |
| PE20110369A1 (es) | 2008-09-08 | 2011-06-24 | Ajinomoto Kk | Un microorganismo que produce l-aminoacido y un metodo para producir un l-aminoacido |
| BRPI1007069A2 (pt) | 2009-01-23 | 2015-08-25 | Ajinomoto Kk | Método para produzir um l-aminoácido. |
| BRPI1014661B1 (pt) | 2009-07-29 | 2020-12-15 | Ajinomoto Co., Inc. | Método para produzir um l-aminoácido |
| RU2460793C2 (ru) | 2010-01-15 | 2012-09-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae |
| RU2471868C2 (ru) | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот |
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| RU2482188C2 (ru) | 2010-07-21 | 2013-05-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE |
| JP2014036576A (ja) | 2010-12-10 | 2014-02-27 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸の製造法 |
| RU2011134436A (ru) | 2011-08-18 | 2013-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности |
| KR101335853B1 (ko) * | 2011-12-01 | 2013-12-02 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법 |
| RU2013118637A (ru) | 2013-04-23 | 2014-10-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK |
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| JP2016192903A (ja) | 2013-09-17 | 2016-11-17 | 味の素株式会社 | 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法 |
| RU2013144250A (ru) | 2013-10-02 | 2015-04-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР |
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| BR112018017227A2 (pt) | 2016-02-25 | 2019-02-05 | Ajinomoto Kk | método para produzir um l-aminoácido |
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