JPS622797B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS622797B2 JPS622797B2 JP53110572A JP11057278A JPS622797B2 JP S622797 B2 JPS622797 B2 JP S622797B2 JP 53110572 A JP53110572 A JP 53110572A JP 11057278 A JP11057278 A JP 11057278A JP S622797 B2 JPS622797 B2 JP S622797B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- microorganism
- gdh
- dna
- plasmid
- phage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/32—Processes using, or culture media containing, lower alkanols, i.e. C1 to C6
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、遺伝子組換え微生物及びその調製方
法に関する。 メタノールおよびアンモニアの微生物による資
化によつてタンパク質が生産される場合、アンモ
ニア資化については下記(a)および(b)の二つの機構
が確認されている。 (a) 直接（GDH）機構 この反応はグルタメートデヒドロゲナーゼ
（GDH）酵素により接触され、グルタメート生成
物１分子当り３分子のATPに相当する１分子の
NAD（Ｐ）Ｈを消費する。 (b) 二段階（GS―GUS）機構 この反応はグルタミンシンセターゼ（GS）酵
素によつて接触される。 この反応は、グルタメートシンセターゼ
（GUS）酵素によつて接触される。この両反応の
組合せは１分子のグルタメートを生成するのに第
１段階について１分子のATPを消費し、そして
第２段についてATP3分子当量を消費する。 本明細書における略記号の主なものは下記の通
りである。 NAD（Ｐ）：酸化された型のGDHまたはGUS酵
素の補助因子を表わす。 NAD（Ｐ）Ｈ：還元された型のGDHまたはGUS
酵素の補助因子を表わす。 ATP：アデノシン三燐酸を表わす。 ADP：アデノシン二燐酸を表わす。 DNA：デオキシリボ核酸であり、関与する微生
物の遺伝物質を表わす。 Pi：燐酸イオンを表わす。 ATPが消費される正確な機構は余り問題事項
ではないが、上記２段階機構において全体として
ATPの消費量が大であることは、上記直接機構
におけるよりも多くのメタノールが炭酸ガスに変
化することになる。 ここに我々は慎重に検討研究することにより、
今までに提案されている方法によつてSCPを製造
する際には反応混合物（培地）に遊離アンモニア
および／またはアンモニウムイオンの十分な供給
がなされるにも拘らず、上記の２段階機構が支配
的であること、そしてもしも遺伝子を組換えた微
生物を採用すれば上記の一層経済的な直接機構が
可能となることを見出した。 本発明は、SCP製造方法において使用するのに
適した、GDH酵素経路によるアンモニア固定を
特異化する遺伝物質を含む微生物を提供する。そ
の遺伝物質は、例えばプラスミドもしくはプラス
ミドハイブリツドのDNA、またはフアージもし
くはフアージ・ハイブリツドのDNAである。 上記SCP製造方法は、資化性炭素源としてのメ
タノールとGDH反応機構を維持するに足る濃度
のアンモニアおよび／またはアンモニウムイオン
とを含む水性培地中で好気的に実施し、次いで単
細胞タンパク質または単細胞タンパク質含有組成
物をその水性培地から回収することにより行う。 このSCP製造方法の条件は、メタノール濃度分
布が最高の値である帯域（単数または複数）で
0.5mM（ミリモル）以上にアンモニアおよびア
ンモニウムイオンの合計濃度を維持することを除
いて、特公昭55―1038号公報（英国特許第
1370892号に対応）および特開昭50―52270号公報
（英国特許第1451020号に対応）に記載されるよう
な条件であるのが好適である。特公昭55―1038号
公報には水性培地中における無機化合物の濃度の
好ましい範囲はイオン濃度（重量％）で下記のよ
うに記載され、 K+ 0.01〜0.25 Mg++ 0.001〜0.1 PO4 --- 0.01〜0.5 SO4 -- 0.01〜0.2 その他（Ca，Cu，Fe，Co，Mn等）微量 そしてメタノール濃度は0.05〜10重量％（特に
0.1〜7.5重量％）であると記載され、適当な培地
組成として下記の組成が例示されている。 CH3OH 20.0ｇ H3PO4 0.0165モル （NH4）2SO4 9.0ｇ MgSO4・7H2O 1.05ｇ FeSO4・7H2O 5.0mg CuSO4・5H2O 0.1mg H3BO3 0.07mg MnSO4・4H2O 0.5mg Na2MoO4 0.1mg CaCl2・2H2O 13.24mg CoCl2・6H2O 0.1mg 水 全体を１とする量 上記SCP製造方法はバツチ式または連続式培養
法で実施できる。ATP消費量が少ないことの結
果として、全体的に炭酸ガスへのメタノールの転
化率が低くなり、従つてこのSCP製造方法では微
生物の繁殖に際しての発熱が小さくなり、培養温
度を34〜45℃の範囲の好ましい値に維持するのに
必要な冷却の程度を低減できる効果がある。微生
物がGDH経路によつて選択的にかつ好ましくは
もつぱらメタノールを同化することにより、培養
工程の経済最適化が達成される。 本発明は、GDH酵素生産を特異化するDNAを
それぞれ有するプラスミド、またはプラスミド・
ハイブリツド、またはフアージ、またはフアー
ジ・ハイブリツドによる遺伝子組換えの結果とし
てGDHアンモニア固定機構によりタンパク含有
細胞を生産するためにメタノールを同化しうる１
または２以上の種の好気培養微生物をも提供す
る。 遺伝子組換え微生物の誘導源たる「基本」微生
物としては、特に下記のものを挙げることができ
る。メチロフイラス・メチロトロフアス（Methy
―lophilus methylotrophus；このものはシユウ
ドモナス・メチロトロフアPseudomonas
methylot―rophaとして知られている） この特性は英国特許第1370892号明細書に記載
されている。そして菌株培養物は下記のように寄
託されている。 NCIB 10508〜10515および10592〜10596、 NRRL B5352〜B5364、 微工研菌寄第1215〜1227号。 シユウドモナス・メチロニカ（Pseudomonas
methylonica） このものの特性は英国特許第1451020号明細書
に記載され、その培養物はプソイドモナス・メチ
ロニカの名称で下記のように寄託されている。 微工研菌寄第2247号（nov.sp）および 同 第2248号（nov.sp）。 本発明に使用のためのその他の基本微生物の例
としては下記のものがある。 シユウドモナス sp.（Pseudomonas sp.） このものは英国特許第1326582号明細書に記載
され、ATCC21438および21439として寄託され、
またプソイドモナス種の名称で微工研菌寄第6598
および6599号として寄託されている。 メチロモナス・メタノリカ（Methylomonas
methanolica） このものは英国特許第1420264号明細書に記載
され、NRRL Ｂ―5458として寄託され、また微
工研菌寄第6600号として寄託されている。 シユウドモナス・ユチリス（Pseudomonas
utilis） このものは英国特許第1444072号明細書に記載
され、微工研菌寄第1690および1691号として寄託
されている。 シユウドモナス・イナウジタ（Pseudomonas
inaudita） このものは英国特許第1444072号明細書に記載
され、微工研菌寄第1693および1694号として寄託
されている。 （NCIBは、スコツトランド、アバーデーンのトー
リイ・リサーチ・ステーシヨンのザ・ナシヨナ
ル・コレクシヨン・オブ・インダストリアル・バ
クテリアであり； ATCCは、ジ・アメリカン・タイプ・カルチア・
コレクシヨンであり； NRRLは、イリノイ州ペオリアの米国農務省で維
持されているコレクシヨンである。） 上記の各種の微生物は、メチロモナダケアエ
（Methylomonadaceae）科に属する。 本発明は、上記の種の微生物中へGDH機構の
遺伝子を有する１または２以上のプラスミドある
いは１または２以上のフアージを導入することに
より遺伝子組換えした微生物を調製する方法を提
供する。その組換えをプラスミドで行なう場合、
その方法は： (a) 基本微生物から、GUS機構によるグルタメ
ート合成を特異化する遺伝物質を欠失した突然
変異株を生じさせ、 (b) GDH酵素の産性を特異化するDNAに共有結
合したプラスミドDNAからなるプラスミド・
ハイブリツドを調製し、 (c) このプラスミド・ハイブリツドをGUS欠失
基本微生物へ導入し、 (d) 得られた微生物をGDH機構による繁殖に好
適な条件中で培養し、 (e) GDH機構により繁殖する微生物の１または
２以上のクローンを選択する、各工程からな
る。 組換えをフアージによつて行なう場合、その方
法は、 (a) 基本微生物から、GUS機構によるグルタメ
ート合成を特異化する遺伝子物質を欠失した突
然変異株を生じさせ、 (b) 基本微生物のためのフアージDNAまたはテ
ンペレート・フアージを同定し、 (c) そのフアージまたはフアージDNAへ、GDH
酵素の産生を特異化するDNA断片を導入する
ことにより、フアージ・ハイブリツドを生じさ
せ、 (d) GUS欠失基本微生物をフアージ・ハイブリ
ツドで溶原化し、 (e) かくして得られた微生物を、GDH機構によ
る繁殖に好適な条件中で培養し、 (f) GDH機構で繁殖する微生物の１または２以
上のクローンを選択する、各工程からなる。 このような遺伝子組換えを行なうための適当な
一般操作は英国特許出願第34994／74号明細書
（ドイツ特許公告2535554号、特開昭51―125782号
に対応）に記載され、公知である。 どのようなルートを用いる場合でも、本発明は
それらの中間段階において存在する生成物それぞ
れの組成物も提供する。 突然変異株は標準的な技法によつて作ることが
できる。例えばガンマ線、Ｘ線または紫外線のよ
うな物理的突然変異誘発因子、亜硝酸、メタンス
ルホネートエステル（例：メチルもしくはエチ
ル・エステル）、５―ブロモウリジン、５―ブロ
モウラシル、２―アミノプリンまたはナイトロジ
エンマスタードのような化学的突然変異誘発因
子、あるいはミユー・フアージのような生物学的
突然変異誘発因子の下で処理することができる。 欠失突然変異株を生じさせるような処理が好ま
しい。通常、突然変異株はなおGS反応を行なう
能力を維持しているので、唯一の窒素源としてア
ンモニアではなくグルタメートを利用して生育す
る能力を基準にして選択することができる。 さらに処理されるために選択される突然変異基
本微生物は、GUS酵素産生特異化DNAを欠くこ
とに加えて、トリプトフアン合成（trp）を特異
化する遺伝子Ａおよび／またはＥをも欠くもので
あることが好ましい。この理由は、所要のGDH
特異化プラスミドまたはフアージを生成させるた
めに好都合な経路は、下記に述べるように遺伝標
識としてtrp特異化遺伝子を含むDNAの存在下で
実施されるからである。 基本微生物の１つへ移入しうることを条件とし
て、プラスミドはいずれの源から誘導されてもよ
い。適当な誘導源としては、E.coli，シユウドモ
ナス（Pseudomonas）およびクレブシエラ
（Klebsiella）がある。「Ｐ」不和合性群のプラス
ミドは、基本微生物として使用されうる種々のグ
ラム陰性細菌の間に自由に伝達しうるので、適当
である。例えばE.coliからの「Ｐ」不和合性群プ
ラスミドRP4は非常によく伝達することができ、
それがどこへ移転されても抗生物質のカナマイシ
ン、テトラサイクリンおよびアンピシリンに耐性
であるその特性（kta+）を表わす。 「Ｐ」不和合性群のプラスミドについては、例
えばA.I.Bukhari等の「DNA Insertion
Elements，Plasmids and Episomers」（1977年
Cold Spring Harbour Laboratory発行、国際標
準書籍番号ISBN ０―87969―118―２）に記載さ
れ、同書第630―631頁には「Ｐ」不和合性群に属
するプラスミドの一覧表が示され、それらのプラ
スミドについての重要な特徴が与えられ、また同
書第675―678頁にはプラスミドRP4の制限酵素マ
ツプが記載されている。これらのマツプと前記一
覧表の抗性物質耐性とによつて「Ｐ」不和合性群
のプラスミドが定義される。「Ｐ」不和合性群プ
ラスミドRP4はE.coliに含まれ、例えば接合また
はトランスフオーメーシヨンのような慣性法によ
つて他の細菌へ移入される。 プラスミド・ハイブリツドは多くのプラスミド
源（例えば基本微生物中に存在するいずれかのプ
ラスミド）から直接生じさせることができる。し
かし、それを取扱う際に得た多くの経験によれ
ば、薬剤耐性E.coliからのプラスミドRP4は好適
便宜な出発材料である。そのとき、第１段階は、
多くの異なる宿主微生物中に複製する能力を維持
するけれども薬剤耐性標識を有しないRP4誘導体
を作ることである。（初期の薬剤耐性標識除去を
せずに実施する別法は原理的には可能であるが、
大規模実施については環境に対して危険であ
る）。これはクラスのエンドヌクレアーゼ〔す
なわち位置のずれた切断点（従つて付着末端）を
有する多数のDNA断片を生成させるタイプのエ
ンドヌクレアーゼ〕での処理により、RP4上の遺
伝情報DNAを切断し、次いでそれらの断片を無
作為（アツトランダム）に再結合させることによ
り行うことができる。適当なエンドヌクレアーゼ
（制限酵素）はE.coR1である。またDNA断片の再
結合は、酵素法、適当にはリガーゼを使用するこ
とにより実施する。 E.coR1はE.coliから通常のタンパク分離法で得
られる制限酵素の一種である。前記のA.I.
Bukhari等の文献の第757〜768頁にはE.coR1を包
含する多くのエンドヌクレアーゼの基本的な性質
が記載されている。また「Proc.Nat.Akad.Sci.
USA」第69巻第44号（1972年11月）第3448〜
3452頁にもE.coR1についての記載がある。また
英国のマイルズ（Miles）・ラボラトリーズ・リミ
テツドのリサーチ・プロダクツ・デイビジヨンの
1980年カタログの第88頁には酵素E.coR1の分離
源が記載され、精製法に関してのP.J.Greene等の
文献「Methods in Molecular Biology」（1974
年、Marcel Bekker Inc.発行、ニユー・ヨー
ク）が引用されている。E.coR1酵素は、例えば
前記マイルズ・ラボラトリーズ・リミテツド等か
ら市販されている。マイルズ・ラボラトリーズ・
リミテツドの住所は「PO Box 37，Stoke
Court，Stoke Poges，Slough，England，SL2
4BR」である。 上記一般法の好ましい一態様では、プラスミド
遺伝情報の切断および結合は（プラスミドが薬剤
耐性標識を含んでいなくても）、trp遺伝子のよう
な遺伝標識を含む追加のDNA断片の存在下に行
われる。（そのような遺伝子は以下に述べるよう
にE.coR1を用いて適当な形質導入フアージ・ゲ
ノムから切削により容易に調製できる）。E.coli
のtrp遺伝子Ｂ，ＣおよびＤは、Hind制限酵素
の標的である。これらの遺伝子は、従つて、選択
された標識を破壊することなく、その次の外来の
DNA断片を挿入する操作のために用いることが
できる。その理由は遺伝子ＡおよびＥは制限酵素
Hindの作用を受ける標的の外にあり、それら
の機能は容易に選択されうるからである。次いで
プラスミド断片をリガーゼと共に反応させて、二
重らせんDNA中に共有結合を再び形成させ、か
くしてtrp遺伝子を有するが薬剤耐性を有しない
若干のプラスミドを生じさせる。 基本微生物が前述のようなtrp欠失突然変異を
受けたものである場合には、trp遺伝子を含むプ
ラスミドが特に用いられる。 上記Hind制限酵素は、例えば前記のマイル
ズ・ラボラトリーズ・リミテツド（英国）から入
手できる。この制限酵素の精製法はH.O.スミス
等の「J.Mol.Biol.」第51巻 第379頁（1970年）
に記載されている。また前記の「外来のDNA断
片」とは、それが導入されようとしている、また
は導入された細菌中には元来存在せず、当該細菌
以外のものから分離されたDNA断片を意味す
る。 E.coR1制限酵素を用いてのDNA切断操作にお
ける条件は、この酵素のE.coR1活性を与えるよ
うなもの、すなわち高PHおよび低Mg++濃度にお
いてその活性を与えるようなものとすべきであ
る。これらの条件において、DNA二重らせん中
の塩基配列 が認識され、開裂され、その酵素が通常の条件に
おいて での切断に際して作られると同じ付着末端が生ず
る。かかるE.coR1の一層短い認識配列は、いず
れの二重らせん状DNA分子についても非常に多
くの断片が開裂される可能性があることを意味す
る。 上記の表示において、 Ａ＝アデニン Ｃ＝シトシン Ｇ＝グアニン Ｔ＝サイミン。 フアージを用いて行なう方法について、もしあ
るフアージが直接に用いられるときにはそれは
（突然変異株も含め）、自然宿主域中の基本微生物
を含むタイプのものであるべきである。もしフア
ージDNAを用いるときには、それは野生型フア
ージから、または自然宿主域中の基本微生物を通
常は含まないフアージから抽出することができ
る。 いずれの方法においても、GDH特異化遺伝子
がプラスミド経路の工程(c)またはフアージ経路の
工程(d)によつて、基本微生物のGUS欠失突然変
異株中へ導入された場合には、GDH利用微生物
の存在は、唯一の窒素源としてアンモニアを利用
する能力によつて認識される。 下記の表において： 表１は遺伝子組換え微生物を作るためのプラス
ミド経路を最も単純化した形態を示し、 表２は表１中の経路の好ましい一態様を示し、
（この態様では、GDH酵素の産生を特異化する
DNAを有することが公知のE.coliを「GDH＋微
生物」（表１）として用い、基本微生物は２回の
突然変異により、GUS機構によるグルタメート
合成特異化遺伝物質を欠失したのみならず、トリ
プトフアン合成（trp）特異化遺伝子Ａ―Ｅを欠
失したものであつた。）、 表３は表２中の経路の好ましい一改変を示し、 表４はフアージ法の三態様を示す。 これらの表中に示されたDNA断片Ａ，Ｂ，
Ｃ，Ｄ及びＦについては、当業界において周知で
あり、従つて、これらの表に図示された操作は、
一般的に自明であると考えられる。しかし表３に
ついて述べると、完全微生物から作られたDNA
断片Ｂは所要のGDH＋遺伝子を低濃度でのみ含
むので、その結果プラスミドＰ（kta-，trp+A―
Ｅ）とこれらの遺伝子がリガーゼで結合される確
率は高くない。しかしもしDNA断片Ｂ（完全微
生物から得られた）が、ラムダ・フアージもしく
はプラスミドから誘導されたDNA断片Ｆとリガ
ーゼで結合されると、それによつて得られる
DNA組合せはGDH欠失E.coli中で殖えることが
でき、次いで分離されうる。その生成物は、比較
的高濃度のGDH＋遺伝子であり、これはフアー
ジまたはプラスミドのDNAから容易に精製でき
る。プラスミドＰ（kta-，trp+A―Ｅ）との結合
の確率はかくして有効に向上される。 各表中に特定した出発物のうち下記のものにつ
いてさらに説明する。trp形質導入ラムダ・フア
ージ：良好に特性化され、trpオペロンの遺伝子
Ａ―Ｅを含むものが入手できる。 GDH特異化DNA（すなわちGDH＋DNA）GDH
利用宿主を作り、それからDNAを分離し、Hind
のような制限酵素でDNAを切断し、それを同
じ制限酵素を用いて作つたベクターDNAの断片
とリガーゼで結合することにより同定できる。こ
の結合済DNAを次いでGDH欠失宿主中へ移入す
る。その移入処理済の宿主をGDH経路が機能し
うる適当な条件中で繁殖させ、次いでそれからベ
クター・ハイブリツドDNAを分離する。 各表中に特定の酵素が示されている場合に、単
に例示であると理解されるべきである。 実施例 １ 微工研菌寄第1222号菌株を基本微生物として用
いて表１の方法により、GDH機構の遺伝子を組
込んだメタノール資化性微生物を得た。但し、プ
ラスミドおよびGDH特異化DNAの切断のための
制限酵素としてHindの代りにSalを用いた。 上記基本微生物および遺伝子組換え微生物を、
別々に、稀釈率0.2h-1で、１当り菌体重量（乾
燥重量）30ｇを支持するように設計された前記例
示組成のメタノール・無機塩培地で連続培養し
た。温度は37±１℃に制御し、PHは必要に応じて
アンモニアガスを導入して6.8〜7.0に制御した。
酵素源として空気を培地中へ通気した。なお遺伝
子組換え微生物の場合には、そのGDH機構を充
足するように50mM以下のアンモニアが常時存在
させて培養した。 メタノール炭素の菌体有機炭素への転化率は全
炭素分析により決定した。その結果、基本微生物
よりも遺伝子組換え微生物の方が４〜７％の菌体
収量の改善を示すことが判明した。また培養中に
熱交換による温度制御のために用いた冷媒（15℃
の水）の単位時間当り使用量の割合は平均で基本
微生物の場合の１に対して遺伝子組換え微生物の
場合はほぼ0.65〜0.8であつた。
法に関する。 メタノールおよびアンモニアの微生物による資
化によつてタンパク質が生産される場合、アンモ
ニア資化については下記(a)および(b)の二つの機構
が確認されている。 (a) 直接（GDH）機構 この反応はグルタメートデヒドロゲナーゼ
（GDH）酵素により接触され、グルタメート生成
物１分子当り３分子のATPに相当する１分子の
NAD（Ｐ）Ｈを消費する。 (b) 二段階（GS―GUS）機構 この反応はグルタミンシンセターゼ（GS）酵
素によつて接触される。 この反応は、グルタメートシンセターゼ
（GUS）酵素によつて接触される。この両反応の
組合せは１分子のグルタメートを生成するのに第
１段階について１分子のATPを消費し、そして
第２段についてATP3分子当量を消費する。 本明細書における略記号の主なものは下記の通
りである。 NAD（Ｐ）：酸化された型のGDHまたはGUS酵
素の補助因子を表わす。 NAD（Ｐ）Ｈ：還元された型のGDHまたはGUS
酵素の補助因子を表わす。 ATP：アデノシン三燐酸を表わす。 ADP：アデノシン二燐酸を表わす。 DNA：デオキシリボ核酸であり、関与する微生
物の遺伝物質を表わす。 Pi：燐酸イオンを表わす。 ATPが消費される正確な機構は余り問題事項
ではないが、上記２段階機構において全体として
ATPの消費量が大であることは、上記直接機構
におけるよりも多くのメタノールが炭酸ガスに変
化することになる。 ここに我々は慎重に検討研究することにより、
今までに提案されている方法によつてSCPを製造
する際には反応混合物（培地）に遊離アンモニア
および／またはアンモニウムイオンの十分な供給
がなされるにも拘らず、上記の２段階機構が支配
的であること、そしてもしも遺伝子を組換えた微
生物を採用すれば上記の一層経済的な直接機構が
可能となることを見出した。 本発明は、SCP製造方法において使用するのに
適した、GDH酵素経路によるアンモニア固定を
特異化する遺伝物質を含む微生物を提供する。そ
の遺伝物質は、例えばプラスミドもしくはプラス
ミドハイブリツドのDNA、またはフアージもし
くはフアージ・ハイブリツドのDNAである。 上記SCP製造方法は、資化性炭素源としてのメ
タノールとGDH反応機構を維持するに足る濃度
のアンモニアおよび／またはアンモニウムイオン
とを含む水性培地中で好気的に実施し、次いで単
細胞タンパク質または単細胞タンパク質含有組成
物をその水性培地から回収することにより行う。 このSCP製造方法の条件は、メタノール濃度分
布が最高の値である帯域（単数または複数）で
0.5mM（ミリモル）以上にアンモニアおよびア
ンモニウムイオンの合計濃度を維持することを除
いて、特公昭55―1038号公報（英国特許第
1370892号に対応）および特開昭50―52270号公報
（英国特許第1451020号に対応）に記載されるよう
な条件であるのが好適である。特公昭55―1038号
公報には水性培地中における無機化合物の濃度の
好ましい範囲はイオン濃度（重量％）で下記のよ
うに記載され、 K+ 0.01〜0.25 Mg++ 0.001〜0.1 PO4 --- 0.01〜0.5 SO4 -- 0.01〜0.2 その他（Ca，Cu，Fe，Co，Mn等）微量 そしてメタノール濃度は0.05〜10重量％（特に
0.1〜7.5重量％）であると記載され、適当な培地
組成として下記の組成が例示されている。 CH3OH 20.0ｇ H3PO4 0.0165モル （NH4）2SO4 9.0ｇ MgSO4・7H2O 1.05ｇ FeSO4・7H2O 5.0mg CuSO4・5H2O 0.1mg H3BO3 0.07mg MnSO4・4H2O 0.5mg Na2MoO4 0.1mg CaCl2・2H2O 13.24mg CoCl2・6H2O 0.1mg 水 全体を１とする量 上記SCP製造方法はバツチ式または連続式培養
法で実施できる。ATP消費量が少ないことの結
果として、全体的に炭酸ガスへのメタノールの転
化率が低くなり、従つてこのSCP製造方法では微
生物の繁殖に際しての発熱が小さくなり、培養温
度を34〜45℃の範囲の好ましい値に維持するのに
必要な冷却の程度を低減できる効果がある。微生
物がGDH経路によつて選択的にかつ好ましくは
もつぱらメタノールを同化することにより、培養
工程の経済最適化が達成される。 本発明は、GDH酵素生産を特異化するDNAを
それぞれ有するプラスミド、またはプラスミド・
ハイブリツド、またはフアージ、またはフアー
ジ・ハイブリツドによる遺伝子組換えの結果とし
てGDHアンモニア固定機構によりタンパク含有
細胞を生産するためにメタノールを同化しうる１
または２以上の種の好気培養微生物をも提供す
る。 遺伝子組換え微生物の誘導源たる「基本」微生
物としては、特に下記のものを挙げることができ
る。メチロフイラス・メチロトロフアス（Methy
―lophilus methylotrophus；このものはシユウ
ドモナス・メチロトロフアPseudomonas
methylot―rophaとして知られている） この特性は英国特許第1370892号明細書に記載
されている。そして菌株培養物は下記のように寄
託されている。 NCIB 10508〜10515および10592〜10596、 NRRL B5352〜B5364、 微工研菌寄第1215〜1227号。 シユウドモナス・メチロニカ（Pseudomonas
methylonica） このものの特性は英国特許第1451020号明細書
に記載され、その培養物はプソイドモナス・メチ
ロニカの名称で下記のように寄託されている。 微工研菌寄第2247号（nov.sp）および 同 第2248号（nov.sp）。 本発明に使用のためのその他の基本微生物の例
としては下記のものがある。 シユウドモナス sp.（Pseudomonas sp.） このものは英国特許第1326582号明細書に記載
され、ATCC21438および21439として寄託され、
またプソイドモナス種の名称で微工研菌寄第6598
および6599号として寄託されている。 メチロモナス・メタノリカ（Methylomonas
methanolica） このものは英国特許第1420264号明細書に記載
され、NRRL Ｂ―5458として寄託され、また微
工研菌寄第6600号として寄託されている。 シユウドモナス・ユチリス（Pseudomonas
utilis） このものは英国特許第1444072号明細書に記載
され、微工研菌寄第1690および1691号として寄託
されている。 シユウドモナス・イナウジタ（Pseudomonas
inaudita） このものは英国特許第1444072号明細書に記載
され、微工研菌寄第1693および1694号として寄託
されている。 （NCIBは、スコツトランド、アバーデーンのトー
リイ・リサーチ・ステーシヨンのザ・ナシヨナ
ル・コレクシヨン・オブ・インダストリアル・バ
クテリアであり； ATCCは、ジ・アメリカン・タイプ・カルチア・
コレクシヨンであり； NRRLは、イリノイ州ペオリアの米国農務省で維
持されているコレクシヨンである。） 上記の各種の微生物は、メチロモナダケアエ
（Methylomonadaceae）科に属する。 本発明は、上記の種の微生物中へGDH機構の
遺伝子を有する１または２以上のプラスミドある
いは１または２以上のフアージを導入することに
より遺伝子組換えした微生物を調製する方法を提
供する。その組換えをプラスミドで行なう場合、
その方法は： (a) 基本微生物から、GUS機構によるグルタメ
ート合成を特異化する遺伝物質を欠失した突然
変異株を生じさせ、 (b) GDH酵素の産性を特異化するDNAに共有結
合したプラスミドDNAからなるプラスミド・
ハイブリツドを調製し、 (c) このプラスミド・ハイブリツドをGUS欠失
基本微生物へ導入し、 (d) 得られた微生物をGDH機構による繁殖に好
適な条件中で培養し、 (e) GDH機構により繁殖する微生物の１または
２以上のクローンを選択する、各工程からな
る。 組換えをフアージによつて行なう場合、その方
法は、 (a) 基本微生物から、GUS機構によるグルタメ
ート合成を特異化する遺伝子物質を欠失した突
然変異株を生じさせ、 (b) 基本微生物のためのフアージDNAまたはテ
ンペレート・フアージを同定し、 (c) そのフアージまたはフアージDNAへ、GDH
酵素の産生を特異化するDNA断片を導入する
ことにより、フアージ・ハイブリツドを生じさ
せ、 (d) GUS欠失基本微生物をフアージ・ハイブリ
ツドで溶原化し、 (e) かくして得られた微生物を、GDH機構によ
る繁殖に好適な条件中で培養し、 (f) GDH機構で繁殖する微生物の１または２以
上のクローンを選択する、各工程からなる。 このような遺伝子組換えを行なうための適当な
一般操作は英国特許出願第34994／74号明細書
（ドイツ特許公告2535554号、特開昭51―125782号
に対応）に記載され、公知である。 どのようなルートを用いる場合でも、本発明は
それらの中間段階において存在する生成物それぞ
れの組成物も提供する。 突然変異株は標準的な技法によつて作ることが
できる。例えばガンマ線、Ｘ線または紫外線のよ
うな物理的突然変異誘発因子、亜硝酸、メタンス
ルホネートエステル（例：メチルもしくはエチ
ル・エステル）、５―ブロモウリジン、５―ブロ
モウラシル、２―アミノプリンまたはナイトロジ
エンマスタードのような化学的突然変異誘発因
子、あるいはミユー・フアージのような生物学的
突然変異誘発因子の下で処理することができる。 欠失突然変異株を生じさせるような処理が好ま
しい。通常、突然変異株はなおGS反応を行なう
能力を維持しているので、唯一の窒素源としてア
ンモニアではなくグルタメートを利用して生育す
る能力を基準にして選択することができる。 さらに処理されるために選択される突然変異基
本微生物は、GUS酵素産生特異化DNAを欠くこ
とに加えて、トリプトフアン合成（trp）を特異
化する遺伝子Ａおよび／またはＥをも欠くもので
あることが好ましい。この理由は、所要のGDH
特異化プラスミドまたはフアージを生成させるた
めに好都合な経路は、下記に述べるように遺伝標
識としてtrp特異化遺伝子を含むDNAの存在下で
実施されるからである。 基本微生物の１つへ移入しうることを条件とし
て、プラスミドはいずれの源から誘導されてもよ
い。適当な誘導源としては、E.coli，シユウドモ
ナス（Pseudomonas）およびクレブシエラ
（Klebsiella）がある。「Ｐ」不和合性群のプラス
ミドは、基本微生物として使用されうる種々のグ
ラム陰性細菌の間に自由に伝達しうるので、適当
である。例えばE.coliからの「Ｐ」不和合性群プ
ラスミドRP4は非常によく伝達することができ、
それがどこへ移転されても抗生物質のカナマイシ
ン、テトラサイクリンおよびアンピシリンに耐性
であるその特性（kta+）を表わす。 「Ｐ」不和合性群のプラスミドについては、例
えばA.I.Bukhari等の「DNA Insertion
Elements，Plasmids and Episomers」（1977年
Cold Spring Harbour Laboratory発行、国際標
準書籍番号ISBN ０―87969―118―２）に記載さ
れ、同書第630―631頁には「Ｐ」不和合性群に属
するプラスミドの一覧表が示され、それらのプラ
スミドについての重要な特徴が与えられ、また同
書第675―678頁にはプラスミドRP4の制限酵素マ
ツプが記載されている。これらのマツプと前記一
覧表の抗性物質耐性とによつて「Ｐ」不和合性群
のプラスミドが定義される。「Ｐ」不和合性群プ
ラスミドRP4はE.coliに含まれ、例えば接合また
はトランスフオーメーシヨンのような慣性法によ
つて他の細菌へ移入される。 プラスミド・ハイブリツドは多くのプラスミド
源（例えば基本微生物中に存在するいずれかのプ
ラスミド）から直接生じさせることができる。し
かし、それを取扱う際に得た多くの経験によれ
ば、薬剤耐性E.coliからのプラスミドRP4は好適
便宜な出発材料である。そのとき、第１段階は、
多くの異なる宿主微生物中に複製する能力を維持
するけれども薬剤耐性標識を有しないRP4誘導体
を作ることである。（初期の薬剤耐性標識除去を
せずに実施する別法は原理的には可能であるが、
大規模実施については環境に対して危険であ
る）。これはクラスのエンドヌクレアーゼ〔す
なわち位置のずれた切断点（従つて付着末端）を
有する多数のDNA断片を生成させるタイプのエ
ンドヌクレアーゼ〕での処理により、RP4上の遺
伝情報DNAを切断し、次いでそれらの断片を無
作為（アツトランダム）に再結合させることによ
り行うことができる。適当なエンドヌクレアーゼ
（制限酵素）はE.coR1である。またDNA断片の再
結合は、酵素法、適当にはリガーゼを使用するこ
とにより実施する。 E.coR1はE.coliから通常のタンパク分離法で得
られる制限酵素の一種である。前記のA.I.
Bukhari等の文献の第757〜768頁にはE.coR1を包
含する多くのエンドヌクレアーゼの基本的な性質
が記載されている。また「Proc.Nat.Akad.Sci.
USA」第69巻第44号（1972年11月）第3448〜
3452頁にもE.coR1についての記載がある。また
英国のマイルズ（Miles）・ラボラトリーズ・リミ
テツドのリサーチ・プロダクツ・デイビジヨンの
1980年カタログの第88頁には酵素E.coR1の分離
源が記載され、精製法に関してのP.J.Greene等の
文献「Methods in Molecular Biology」（1974
年、Marcel Bekker Inc.発行、ニユー・ヨー
ク）が引用されている。E.coR1酵素は、例えば
前記マイルズ・ラボラトリーズ・リミテツド等か
ら市販されている。マイルズ・ラボラトリーズ・
リミテツドの住所は「PO Box 37，Stoke
Court，Stoke Poges，Slough，England，SL2
4BR」である。 上記一般法の好ましい一態様では、プラスミド
遺伝情報の切断および結合は（プラスミドが薬剤
耐性標識を含んでいなくても）、trp遺伝子のよう
な遺伝標識を含む追加のDNA断片の存在下に行
われる。（そのような遺伝子は以下に述べるよう
にE.coR1を用いて適当な形質導入フアージ・ゲ
ノムから切削により容易に調製できる）。E.coli
のtrp遺伝子Ｂ，ＣおよびＤは、Hind制限酵素
の標的である。これらの遺伝子は、従つて、選択
された標識を破壊することなく、その次の外来の
DNA断片を挿入する操作のために用いることが
できる。その理由は遺伝子ＡおよびＥは制限酵素
Hindの作用を受ける標的の外にあり、それら
の機能は容易に選択されうるからである。次いで
プラスミド断片をリガーゼと共に反応させて、二
重らせんDNA中に共有結合を再び形成させ、か
くしてtrp遺伝子を有するが薬剤耐性を有しない
若干のプラスミドを生じさせる。 基本微生物が前述のようなtrp欠失突然変異を
受けたものである場合には、trp遺伝子を含むプ
ラスミドが特に用いられる。 上記Hind制限酵素は、例えば前記のマイル
ズ・ラボラトリーズ・リミテツド（英国）から入
手できる。この制限酵素の精製法はH.O.スミス
等の「J.Mol.Biol.」第51巻 第379頁（1970年）
に記載されている。また前記の「外来のDNA断
片」とは、それが導入されようとしている、また
は導入された細菌中には元来存在せず、当該細菌
以外のものから分離されたDNA断片を意味す
る。 E.coR1制限酵素を用いてのDNA切断操作にお
ける条件は、この酵素のE.coR1活性を与えるよ
うなもの、すなわち高PHおよび低Mg++濃度にお
いてその活性を与えるようなものとすべきであ
る。これらの条件において、DNA二重らせん中
の塩基配列 が認識され、開裂され、その酵素が通常の条件に
おいて での切断に際して作られると同じ付着末端が生ず
る。かかるE.coR1の一層短い認識配列は、いず
れの二重らせん状DNA分子についても非常に多
くの断片が開裂される可能性があることを意味す
る。 上記の表示において、 Ａ＝アデニン Ｃ＝シトシン Ｇ＝グアニン Ｔ＝サイミン。 フアージを用いて行なう方法について、もしあ
るフアージが直接に用いられるときにはそれは
（突然変異株も含め）、自然宿主域中の基本微生物
を含むタイプのものであるべきである。もしフア
ージDNAを用いるときには、それは野生型フア
ージから、または自然宿主域中の基本微生物を通
常は含まないフアージから抽出することができ
る。 いずれの方法においても、GDH特異化遺伝子
がプラスミド経路の工程(c)またはフアージ経路の
工程(d)によつて、基本微生物のGUS欠失突然変
異株中へ導入された場合には、GDH利用微生物
の存在は、唯一の窒素源としてアンモニアを利用
する能力によつて認識される。 下記の表において： 表１は遺伝子組換え微生物を作るためのプラス
ミド経路を最も単純化した形態を示し、 表２は表１中の経路の好ましい一態様を示し、
（この態様では、GDH酵素の産生を特異化する
DNAを有することが公知のE.coliを「GDH＋微
生物」（表１）として用い、基本微生物は２回の
突然変異により、GUS機構によるグルタメート
合成特異化遺伝物質を欠失したのみならず、トリ
プトフアン合成（trp）特異化遺伝子Ａ―Ｅを欠
失したものであつた。）、 表３は表２中の経路の好ましい一改変を示し、 表４はフアージ法の三態様を示す。 これらの表中に示されたDNA断片Ａ，Ｂ，
Ｃ，Ｄ及びＦについては、当業界において周知で
あり、従つて、これらの表に図示された操作は、
一般的に自明であると考えられる。しかし表３に
ついて述べると、完全微生物から作られたDNA
断片Ｂは所要のGDH＋遺伝子を低濃度でのみ含
むので、その結果プラスミドＰ（kta-，trp+A―
Ｅ）とこれらの遺伝子がリガーゼで結合される確
率は高くない。しかしもしDNA断片Ｂ（完全微
生物から得られた）が、ラムダ・フアージもしく
はプラスミドから誘導されたDNA断片Ｆとリガ
ーゼで結合されると、それによつて得られる
DNA組合せはGDH欠失E.coli中で殖えることが
でき、次いで分離されうる。その生成物は、比較
的高濃度のGDH＋遺伝子であり、これはフアー
ジまたはプラスミドのDNAから容易に精製でき
る。プラスミドＰ（kta-，trp+A―Ｅ）との結合
の確率はかくして有効に向上される。 各表中に特定した出発物のうち下記のものにつ
いてさらに説明する。trp形質導入ラムダ・フア
ージ：良好に特性化され、trpオペロンの遺伝子
Ａ―Ｅを含むものが入手できる。 GDH特異化DNA（すなわちGDH＋DNA）GDH
利用宿主を作り、それからDNAを分離し、Hind
のような制限酵素でDNAを切断し、それを同
じ制限酵素を用いて作つたベクターDNAの断片
とリガーゼで結合することにより同定できる。こ
の結合済DNAを次いでGDH欠失宿主中へ移入す
る。その移入処理済の宿主をGDH経路が機能し
うる適当な条件中で繁殖させ、次いでそれからベ
クター・ハイブリツドDNAを分離する。 各表中に特定の酵素が示されている場合に、単
に例示であると理解されるべきである。 実施例 １ 微工研菌寄第1222号菌株を基本微生物として用
いて表１の方法により、GDH機構の遺伝子を組
込んだメタノール資化性微生物を得た。但し、プ
ラスミドおよびGDH特異化DNAの切断のための
制限酵素としてHindの代りにSalを用いた。 上記基本微生物および遺伝子組換え微生物を、
別々に、稀釈率0.2h-1で、１当り菌体重量（乾
燥重量）30ｇを支持するように設計された前記例
示組成のメタノール・無機塩培地で連続培養し
た。温度は37±１℃に制御し、PHは必要に応じて
アンモニアガスを導入して6.8〜7.0に制御した。
酵素源として空気を培地中へ通気した。なお遺伝
子組換え微生物の場合には、そのGDH機構を充
足するように50mM以下のアンモニアが常時存在
させて培養した。 メタノール炭素の菌体有機炭素への転化率は全
炭素分析により決定した。その結果、基本微生物
よりも遺伝子組換え微生物の方が４〜７％の菌体
収量の改善を示すことが判明した。また培養中に
熱交換による温度制御のために用いた冷媒（15℃
の水）の単位時間当り使用量の割合は平均で基本
微生物の場合の１に対して遺伝子組換え微生物の
場合はほぼ0.65〜0.8であつた。
【表】
【表】
【表】
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ GUS酵素の産生を特異化するDNAの欠失の
結果、ならびにGDH酵素の産性を特異化する
DNAをそれぞれ有するプラスミドもしくはプラ
スミド・ハイブリツドまたはフアージもしくはフ
アージ・ハイブリツドによる遺伝子組換えの結果
として、GDHアンモニア固定機構により、メタ
ノールを用いてタンパク質含有菌体を産生しうる
グラム陰性、好気性桿状菌であるメチロモナダケ
アエ（Methylomonadaceae）科の一または二以
上の種の好気培養した微生物。 ２ メチロフイラス・メチロトロフアス種の一ま
たは二以上の菌株の遺伝子組換えによつて生じた
特許請求の範囲第１項に記載の微生物。 ３ 基本微生物内へGDH機構の遺伝物質を有す
る一または二以上のプラスミドを導入することに
より遺伝子組換えした微生物を調製する方法であ
つて、 (a) 基本微生物から、GUS機構によるグルタメ
ート合成を特異化する遺伝物質を欠失した変異
株を生じさせ、 (b) GDH酵素の産生を特異化するDNAに共有結
合したプラスミドDNAから構成されるプラス
ミド・ハイブリツドを調製し、 (c) このプラスミド・ハイブリツドを前記GUS
欠失基本微生物へ導入し、 (d) 得られた微生物をGDH機構による繁殖に好
適な条件中で培養し、 (e) GDH機構により繁殖する微生物の一または
二以上のクローンを選択する、 ことを特徴とする遺伝子組換え微生物の調製方
法。 ４ 基本微生物体内へGDH機構の遺伝子を有す
る一または二以上のフアージを導入することによ
り遺伝子組換えした微生物を調製する方法であつ
て、 (a) 基本微生物から、GUS機構によるグルタメ
ート合成を特異化する遺伝物質を欠失した変異
株を生じさせ、 (b) その基本微生物のためのフアージDNAまた
はテンペレート・フアージを同定し、 (c) そのフアージDNAまたはテンペレート・フ
アージ中へ、GDH酵素の産生を特異化する
DNA断片を導入し、かくしてフアージ・ハイ
ブリツドを生じさせ、 (d) 前記GUS欠失基本微生物をそのフアージ・
ハイブリツドで溶原化し、 (e) かくして得られた微生物を、GDH機構によ
る繁殖に好適な条件下で培養し、 (f) GDH機構により繁殖する微生物の一または
二以上のクローンを選択する、 ことを特徴とする遺伝子組換え微生物の調製法。 ５ 変異株はGUS機構によるグルタメート合成
を特異化するDNAを欠失した変異株である特許
請求の範囲第３項に記載の方法。 ６ 変異株はGUS機構によるグルタメート合成
を特異化するDNAを欠失した変異株である特許
請求の範囲第４項に記載の方法。 ７ さらに処理するために選択される変異株基本
微生物はトリプトフアン合成（trp）特異化遺伝
子Ａおよび／またはＥを欠失したものである特許
請求の範囲第３項に記載の方法。 ８ さらに処理するために選択される変異株基体
微生物はトリプトフアン合成（trp）特異化遺伝
子Ａおよび／またはＥを欠失したものである特許
請求の範囲第４項に記載の方法。 ９ プラスミドはE.coli、シユウドモナスまたは
クレブシエラから誘導される特許請求の範囲第３
項に記載の方法。 １０ プラスミドは「Ｐ」不和合性群に属する特
許請求の範囲３または９項に記載の方法。 １１ プラスミドは薬剤耐性E.coliから誘導され
たプラスミドRP4である特許請求の範囲第９項に
記載の方法。 １２ プラスミド・ハイブリツドの調製は、遺伝
標識としてトリプトフアン合成（trp）特異化遺
伝子を含む追加のDNA断片の存在下で実施する
特許請求の範囲第３項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB3755977 | 1977-09-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5467084A JPS5467084A (en) | 1979-05-30 |
| JPS622797B2 true JPS622797B2 (ja) | 1987-01-21 |
Family
ID=10397383
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11057278A Granted JPS5467084A (en) | 1977-09-08 | 1978-09-08 | Production of unicellular protein |
| JP57109076A Pending JPS5886076A (ja) | 1977-09-08 | 1982-06-24 | 単細胞タンパク質の産生方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57109076A Pending JPS5886076A (ja) | 1977-09-08 | 1982-06-24 | 単細胞タンパク質の産生方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS5467084A (ja) |
| AU (1) | AU525490B2 (ja) |
| BE (1) | BE870188A (ja) |
| DE (1) | DE2839052A1 (ja) |
| FR (1) | FR2402704A1 (ja) |
| NL (1) | NL7809125A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63159098U (ja) * | 1987-04-07 | 1988-10-18 | ||
| JPH0586788A (ja) * | 1991-09-26 | 1993-04-06 | Sanwa Shutter Corp | 電動ブラインドシヤツターにおける停電時操作可能な開閉機 |
| US9765568B2 (en) | 2011-10-03 | 2017-09-19 | Hunter Douglas Inc. | Methods and apparatus to control architectural opening covering assemblies |
| US10648232B2 (en) | 2012-10-03 | 2020-05-12 | Hunter Douglas Inc. | Methods and apparatus to control an architectural opening covering assembly |
| US10718159B2 (en) | 2010-05-28 | 2020-07-21 | Hunter Douglas Inc. | Architectural opening coverings powered by rotary motors |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4171824A (en) * | 1977-05-23 | 1979-10-23 | Foster Edwin E | Bicyle |
| EP0035831B1 (en) * | 1980-03-07 | 1986-01-08 | Imperial Chemical Industries Plc | Method for making genetically modified microorganisms |
| JPS58115846A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-09 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 相補型絶縁ゲ−ト型半導体装置 |
| SU1364343A1 (ru) * | 1984-07-13 | 1988-01-07 | Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов | Способ получени человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1521032A (en) * | 1974-08-08 | 1978-08-09 | Ici Ltd | Biological treatment |
-
1978
- 1978-09-04 BE BE190240A patent/BE870188A/xx not_active IP Right Cessation
- 1978-09-05 FR FR7825482A patent/FR2402704A1/fr active Granted
- 1978-09-05 AU AU39546/78A patent/AU525490B2/en not_active Expired
- 1978-09-07 DE DE19782839052 patent/DE2839052A1/de not_active Ceased
- 1978-09-07 NL NL7809125A patent/NL7809125A/xx not_active Application Discontinuation
- 1978-09-08 JP JP11057278A patent/JPS5467084A/ja active Granted
-
1982
- 1982-06-24 JP JP57109076A patent/JPS5886076A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63159098U (ja) * | 1987-04-07 | 1988-10-18 | ||
| JPH0586788A (ja) * | 1991-09-26 | 1993-04-06 | Sanwa Shutter Corp | 電動ブラインドシヤツターにおける停電時操作可能な開閉機 |
| US10718159B2 (en) | 2010-05-28 | 2020-07-21 | Hunter Douglas Inc. | Architectural opening coverings powered by rotary motors |
| US9765568B2 (en) | 2011-10-03 | 2017-09-19 | Hunter Douglas Inc. | Methods and apparatus to control architectural opening covering assemblies |
| US10648232B2 (en) | 2012-10-03 | 2020-05-12 | Hunter Douglas Inc. | Methods and apparatus to control an architectural opening covering assembly |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU525490B2 (en) | 1982-11-11 |
| JPS5886076A (ja) | 1983-05-23 |
| AU3954678A (en) | 1980-03-13 |
| BE870188A (fr) | 1979-03-05 |
| NL7809125A (nl) | 1979-03-12 |
| JPS5467084A (en) | 1979-05-30 |
| DE2839052A1 (de) | 1979-03-29 |
| FR2402704B1 (ja) | 1983-08-12 |
| FR2402704A1 (fr) | 1979-04-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FR2484448A1 (fr) | Procede pour produire de la l-arginine par fermentation | |
| EP0035831B1 (en) | Method for making genetically modified microorganisms | |
| JPS622797B2 (ja) | ||
| JP3953578B2 (ja) | 耐熱性ジアホラーゼ遺伝子 | |
| JP3399993B2 (ja) | プラスミドを安定化するための微生物 | |
| JPS62155081A (ja) | 新規微生物およびそれを用いる醗酵法によるビオチンの製造法 | |
| JPS6296082A (ja) | 生育の速いリゾビウム・ジヤポニカムのｎｉｆプロモ−タ− | |
| EP0107400A1 (en) | Hybrid plasmid and process for producing glutathione using said plasmid | |
| JPH062061B2 (ja) | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 | |
| JP2587764B2 (ja) | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 | |
| JPH0630583B2 (ja) | Ｄνａおよびその用途 | |
| EP0179025B1 (en) | Method for the production of neutral protease | |
| JPS6066984A (ja) | 発酵法によるｌ−フェニルアラニンの製造法 | |
| JP2656329B2 (ja) | フラビンヌクレオチド類の製造法 | |
| EP0178744A2 (en) | Shuttle vector | |
| JP3357405B2 (ja) | フラビンヌクレオチド類の製造法 | |
| CN101137743A (zh) | 能够将XMP转化成GMP并保持与GMP降解有关的基因为失活状态的Escherichia菌株及其使用方法 | |
| JPH044881A (ja) | シチジンアナログ耐性化遺伝子ｄｎａおよびその用途 | |
| CN121109332A (zh) | 一种泰乐菌素还原酶第21位氨基酸突变体及其应用 | |
| JPS63207383A (ja) | 耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法 | |
| JPS59159778A (ja) | 耐熱性のロイシン脱水素酵素の製造法 | |
| JP2003230377A (ja) | 新規な微生物及びプラバスタチンの製造方法 | |
| JPH07163355A (ja) | ホスホマイシン生合成関連遺伝子及びそれらを含む遺伝子クラスター | |
| JPS58158195A (ja) | 発酵法による５′−イノシン酸の製造法 | |
| WO1991013975A1 (en) | CLONING AND EXPRESSION OF RESTRICTION ENDONUCLEASES FROM $i(NEISSERIA) |