JPWO2007125782A1 - プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)プリン系物質生産能を有し、フルクトース−ビスフォスファターゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌。
(2)前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記バチルス属細菌。
(3)前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記バチルス属細菌。
(4)前記フルクトース−ビスフォスファターゼをコードする遺伝子を破壊することにより、フルクトース−ビスフォスファターゼ活性が低下した前記バチルス属細菌。
(5)前記フルクトース−ビスフォスファターゼをコードする遺伝子が下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードする遺伝子である前記バチルス属細菌。
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、フルクトース−ビスフォスファターゼ活性を有するタンパク質。
(6)さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(7)さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(8)プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるpurR遺伝子が破壊されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(9)さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(10)さらに、IMP脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする前記バチルス属細菌。
(11)バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである前記バチルス属細菌。
(12)前記バチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
(13)プリン系物質がプリンヌクレオシド又はプリンヌクレオチドである、前記方法。
(14)前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである前記方法。
(15)前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである前記方法。
(16)前記方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。
(I)プリン系物質生産能の付与
本発明において、「活性が低下する」とは、活性が、非改変株、例えば野生型のバチルス属細菌における活性よりも低いこと、及び、活性が実質的に消失していることを含む。
「プリン系物質」とはプリン骨格を含む物質をいうが、プリンヌクレオシド、プリンヌクレオチドなどが挙げられる。プリンヌクレオシドには、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンなどが含まれ、プリンヌクレオチドには、プリンヌクレオシドの5’−燐酸エステル、例えばイノシン酸(イノシン−5’−リン酸 以下「IMP」ともいう)、キサンチル酸(キサントシンー5’−リン酸 以下「XMP」ともいう)、グアニル酸(グアノシン−5’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう)、アデニル酸(アデノシン−5’−モノリン酸以下「AMP」ともいう)などが含まれる。
バチルス・ズブチリスとしては、バチルス・ズブチリス168 Marburg(ATCC6051)、バチルス・ズブチリスPY79(Plasmid, 1984, 12, 1-9)等が、バチルス・アミロリケファシエンスとしては、バチルス・アミロリケファシエンスT(ATCC23842)、及びバチルス・アミロリケファシエンスN(ATCC23845)等が挙げられる。また、バチルス・プミルスとしては、バチルス・プミルス Gottheil No.3218(ATCC No.21005)(米国特許第3,616,206号)等が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)、住所 P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)から入手することができる。
バチルス属に属するイノシン生産株の具体例として、バチルス・ズブチリスKMBS16株を使用することができる。同菌株は、プリンオペロンリプレッサーをコードするpurR遺伝子の欠損(purR::spc)、スクシニル−AMPシンターゼをコードするpurA遺伝子の欠損(purA::erm)、およびプリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子の欠損(deoD::kan)が導入された、既知のバチルス・ズブチリスtrpC2株チ(168 Marburg)の誘導体である(特開2004−242610、US2004166575A1)。また、バチルス・ズブチリス菌株AJ3772(FERM P−2555)(特開昭62−014794)等を使用することもできる。
イノシン酸生産菌としては、バチルス・ズブチリスのフォスファターゼ活性が弱化したイノシン生産株が報告されている(Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805、Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259)。グアニル酸生産菌としては、アデニン要求性を有しさらにデコイニンまたはメチオニンスルフォキシドに耐性を有し、かつ5’−グアニル酸(グアノシン−5’−モノリン酸、以下「GMP」ともいう)生産能を有するバチルス属の変異株が挙げられる。(特公昭56−12438号公報)
プリンオペロンの発現量を増大させる方法としては、プラスミドを用いる方法や染色体上に組込む方法などにより、プリンオペロン遺伝子をバチルス属細菌で高発現させる方法が挙げられる。
例えば、バチルス・ズブチリス(B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051)では、プリンオペロンの−35配列はコンセンサス配列(TTGACA)であるが、−10配列はTAAGATであり、コンセンサス配列TATAATとは異なっている(Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274−8287)。したがって、−10配列(TAAGAT)をコンセンサス配列あるいはコンセンサス配列に近づけることにより、TATAAT、またはTATGAT、もしくはTAAAATとなるように改変することで、プリンオペロンの転写活性を上昇させることができる。なお、プロモーター配列の置換は、下記の遺伝子置換と同様の方法で行うことが出来る。
BLAST(ベーシックローカルアラインメント検索ツール)は、プログラムblastp、blastn、blastx、megablast、tblastn、およびtblastxにより使用されるヒューリスティック検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、SamuelおよびStephen F. Altschulの統計学的方法(「一般的なスコアリングスキームを使用することにより、分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法(Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes)」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68、「分子配列における多重ハイスコアリングセグメントに関する用途および統計学(Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences)」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7)を用いて、得られた結果が有意であると見なす。FASTA検索方法は、W.R. Pearsonにより記載されている(「FASTPおよびFASTAによる迅速かつ高感度な配列比較(Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA)」、Methods in Enzymology, 1990 183:63-98)。ClustalW方法は、Thompson J.D.、Higgins D.G.およびGibson T.J.により記載されている(「CLUSTAL W:配列重み付け、位置特異的ギャップペナルティおよび重み行列法選択による漸進的多重配列アラインメントの感度の改善(CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice)」、Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680)。
本発明のバチルス属細菌は、上述のようなプリン系物質生産能を有する菌株をフルクトース−ビスフォスファターゼの酵素活性が低下するように改変することによって取得することが出来る。ただし、改変の順は問わず、フルクトース−ビスフォスファターゼの酵素活性が低下するように改変したのちにプリンヌクレオチド生産能を付与してもよい。
本発明のバチルス属細菌はプリン系物質を効率よく生産する。したがって、本発明のバチルス属細菌を好適な培地で培養することによって、細菌の細胞内又は培地中にプリンヌクレオシド及びプリンヌクレオチドなどのプリン系物質を生成蓄積せしめることができる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
バチルス・ズブチリス(B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051)由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子(purR)、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子(purA)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(pupG)を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子(guaB)が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPPシンセターゼ遺伝子(prs)のSD配列を改変した組換え体KMBS310(特願2005−280186号)を用いて、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(deoD)を欠損した菌株の作製を、以下のようにして行った。尚、前記プリンオペロン及びPRPPシンセターゼ遺伝子は、各々プロモーター領域及びSD配列の改変により発現が強化されている。
(1)fbp遺伝子欠損株の作製
上述のバチルス・ズブチリス(B. subtilis 168 Marburg株; ATCC6051)由来で、プリンオペロンリプレッサー遺伝子(purR)、サクシニル−AMPシンターゼ遺伝子(purA)、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(pupG)を欠損し、かつIMP脱水素酵素遺伝子(guaB)が弱化され、かつプリンオペロンプロモーター領域、PRPP synthetase遺伝子(prs)のSD配列が改変され、かつプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子(deoD)を欠損した組換え体KMBS321を用いて、フルクトース−ビスフォスファターゼ遺伝子(fbp)を欠損させた菌株の作製を、以下のようにして行った。
遺伝子データバンク(GenBank Accession NC_000964およびV01277)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ28 mer、50 merのPCR用プライマーを作製した。
cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA(配列番号18;小文字の塩基はpC194上にクローニングされているクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)のプロモーター上流域の配列)
遺伝子データバンク(GenBank Accession NC_000964およびV01277)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 mer、27 merのPCR用プライマーを作製した。
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA(配列番号20)
B. subtilis 168 Marburg株の染色体DNAを鋳型とし、上記プライマーを用いてPCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 1.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、fbp遺伝子3’末端領域と下流の約1770 bp含む増幅断片を得た。
遺伝子データバンク(GenBank Accession No.V01277およびNC_000964)の情報に基づき、以下の塩基配列を有するそれぞれ50 merのPCR用プライマーを作製した。
(i)から(iii)で増幅したDNA断片をMicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)で精製後、適量を混合したものをテンプレートとし、配列番号17および20を用いて、PCR(98℃, 10秒; 55℃, 30秒; 72℃, 4.5分; 30サイクル; Gene Amp PCR System Model 9600(パーキンエルマー社製))を行い、cat遺伝子がfbp領域に挿入された増幅断片を得た。
(iv)で取得したcat遺伝子を挿入したfbp領域(fbp::cat)のDNA断片をアガロースゲル電気泳動後、目的とする断片をゲルより抽出した。このようにして精製したDNA断片を用いて、DubnauとDavidoff-Abelsonの方法(J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221)により調製したB. subtilis KMBS321株のコンピテントセルを形質転換し、2.5 μg/mlのクロラムフェニコールと20 μg/mlのグアニンを含むLB寒天プレート上で生育するコロニーを取得した。これらのコロニーから染色体DNAを調製し、(iv)に示したPCR法により、染色体上のfbp領域が、内部がクロラムフェニコール耐性遺伝子で置換されたfbp領域(fbp::cat)と2回組換えにより置換した菌株を同定し、これらの内の一株をTABS133と名づけた。
fbp遺伝子欠損株TABS133およびコントロール株であるKMBS321を、グアニン20 mg/Lを含むLB培地プレート上にまんべんなく塗布し、34℃で一晩培養した。1/8プレート分の菌体を、500 ml容の坂口フラスコ中の発酵培地20 mlに接種し、その後、炭酸カルシウムを50 g/Lとなるように加えて、34℃で振とう培養した。培養開始後72時間目にサンプリングし、培養液中に含まれるイノシンおよびヒポキサンチン量を公知の方法で測定した。fbp遺伝子欠損株TABS133のイノシンの蓄積は、コントロール株であるKMBS321株のそれよりも高かった。
グルコース 30 g/L
KH2PO4 1 g/L
NH4Cl 32 g/L
豆濃(T-N)* 1.35 g/L
DL-メチオニン 0.4 g/L
L-トリプトファン 0.02 g/L
アデニン 0.1 g/L
グアノシン 0.075 g/L
MgSO4 0.4 g/L
FeSO4 0.01 g/L
MnSO4 0.01 g/L
アデカノール(消泡剤) 0.5 ml/L
(KOHでpH 7.0に調整)
炭酸カルシウム 50 g/L
*:大豆蛋白加水分解物
配列番号1:fbp遺伝子の塩基配列
配列番号2:フルクトース−ビスフォスファターゼのアミノ酸配列
配列番号3:prs遺伝子の塩基配列
配列番号4:ホスホリボシルピロリン酸シンセターゼのアミノ酸配列
配列番号5:purR遺伝子の塩基配列
配列番号6:プリンリプレッサーのアミノ酸配列
配列番号7:deoD遺伝子の塩基配列
配列番号8:deoD遺伝子産物(プリンヌクレオシドホスホリラーゼ)のアミノ酸配列
配列番号9:pupG遺伝子の塩基配列
配列番号10:pupG遺伝子産物(プリンヌクレオシドホスホリラーゼ)のアミノ酸配列
配列番号11:purA遺伝子の塩基配列
配列番号12:サクシニル−AMPシンターゼのアミノ酸配列
配列番号13:guaB遺伝子の塩基配列
配列番号14:IMP脱水素酵素のアミノ酸配列
配列番号15:purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号16:purR遺伝子増幅用プライマー
配列番号17:fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号18:fbp遺伝子上流域増幅用プライマー
配列番号19:fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号20:fbp遺伝子下流域増幅用プライマー
配列番号21:cat遺伝子増幅用プライマー
配列番号22:cat遺伝子増幅用プライマー
Claims (16)
- プリン系物質生産能を有し、フルクトース−ビスフォスファターゼの酵素活性が低下するように改変されたバチルス属細菌。
- 前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである請求項1に記載のバチルス属細菌。
- 前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、及びアデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである請求項1に記載のバチルス属細菌。
- 前記フルクトース−ビスフォスファターゼをコードする遺伝子を破壊すること、または、フルクトース−ビスフォスファターゼをコードする遺伝子の発現量を低下させることにより、フルクトース−ビスフォスファターゼ活性が低下した請求項1〜3のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。
- 前記フルクトース−ビスフォスファターゼをコードする遺伝子が下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコードする遺伝子である請求項4に記載のバチルス属細菌。
(A)配列番号1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質
(B)配列番号1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、かつ、フルクトース−ビスフォスファターゼ活性を有するタンパク質。 - さらにホスホリボシルピロリン酸シンセターゼ活性が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載のバチルス属細菌。
- さらに、プリンオペロンの発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。
- プリンオペロンのリプレッサーをコードする遺伝子であるpurR遺伝子が破壊されたことにより、プリンオペロンの発現量が上昇したことを特徴とする請求項7に記載のバチルス属細菌。
- さらに、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載のバチルス属細菌
- さらに、IMP脱水素酵素活性が低下するように改変されたことを特徴とする請求項1〜9に記載のバチルス属細菌。
- バチルス属細菌がバチルス・ズブチリスである請求項1〜10のいずれか一項に記載のバチルス属細菌。
- 請求項1〜11のいずれか1項に記載のバチルス属細菌を培地に培養して、同細菌の細胞内又は培地中にプリン系物質を蓄積せしめ、同細胞又は培地からプリン系物質を回収することを特徴とするプリン系物質の製造法。
- プリン系物質がプリンヌクレオシド又はプリンヌクレオチドである、請求項12に記載の方法。
- 前記プリン系物質がイノシン、キサントシン、グアノシン、アデノシンからなる群より選択されるプリンヌクレオシドである請求項13に記載の方法。
- 前記プリン系物質がイノシン酸、キサンチル酸、グアニル酸、アデニル酸からなる群より選択されるプリンヌクレオチドである請求項13に記載の方法。
- 請求項14に記載の方法によりプリンヌクレオシドを製造し、該プリンヌクレオシドに、ポリ燐酸、フェニル燐酸、及びカルバミル燐酸からなる群より選択された燐酸供与体と、ヌクレオシド−5’−燐酸エステルを生成する能力を有する微生物又は酸性フォスファターゼを作用させて、プリンヌクレオチドを生成せしめ、該プリンヌクレオチドを採取することを特徴とするプリンヌクレオチドの製造法。
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