BRPI0710752A2 - bactÉria pertencendo ao gÊnero bacillus, e, mÉtodos para produzir uma substÂncia derivada de purina e um nucleotÍdeo de purina - Google Patents

Abstract

BACTÉRIA PERTENCENDO AO GÊNERO BACILLUS, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA DERIVADA DE PURINA E UM NUCLEOTÍDEO DE PURINA. Uma substância de purina pode ser produzida cultivando uma bactéria Bacilius que é capaz de produzir a substância de purina e tem uma atividade enzimática reduzida de frutose bifosfatase em um meio de cultura para produzir e acumular a substância de purina no meio de cultura ou uma célula da bactéria, e coletar a substância de purina do meio de cultura ou da célula.

Description

"BACTÉRIA PERTENCENDO AO GÊNERO BACILLUS, E, MÉTODOSPARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA DERIVADA DE PURINA E UMNUCLEOTÍDEO DE PURINA"

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção se refere a um método para produzirsubstâncias derivadas de purina tal como nucleotídeos de purina tipicamenteincluindo 5'-ácido inosínico e 5'-ácido guanílico, e nucleosídeos de purina talcomo inosina e guanosina, que são substâncias importantes como matérias-primas para síntese dos nucleotídeos de purina, e assim por diante, e umabactéria pertencendo ao gênero Bacillus usado para o método. Substânciasderivadas de purina são úteis como condimentos, drogas, matérias-primasdestes, e assim por diante.

TÉCNICA ANTERIOR

Métodos para produzir inosina e guanosina por fermentaçãousando cepas auxotróficas de adenina de bactérias Bacillus e derivados destasque são adicionalmente concedidos com resistência a várias drogas tal comoanálogos de purina (Documentos de patente 1 a 8), e tais microorganismos dogênero Brevibaeterium (Documentos de patente 9 e 10, Documento de nãopatente 1), e assim por diante foram conhecidos.

Tais cepas mutantes são tipicamente obtidas tratando ummicroorganismo com radiação ultravioleta ou nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina), e selecionando um mutante alvo usando um meiode seleção adequado.

Além disso, cepas que produzem substâncias derivadas depurina também foram criadas usando técnicas de engenharia genética embactérias Bacillus (Documentos de patente lia 20), bactérias Brevibaeterium(Documento de patente 21), e bactérias Eseheriehia (Documento de patente22). Especificamente, por exemplo, um método para produzir eficientementeum composto derivado de ácido nucléico tal como hipoxantina, uracila,guanina e adenina com uma bactéria Bacillus na qual um gene (purR)codificando o repressor de operon de purina é rompido é descrito (Documentode patente 23).

Em Bacíllus subtilis, o repressor de operon de purina comodescrito acima é conhecido por regular, além dos genes de operon de purina, ogene purA que está envolvido em biossíntese de AMP (Documento de nãopatente 2), o gene glyA que está envolvido em biossíntese de ácidoformiltetrahidrofólico (Documento de não patente 3), o gene pbuG quecodifica o transportador de hipoxantina/guanina (Documento de não patente4), e assim por diante.

Além disso, um microorganismo que produz eficientementederivado de inosina por fornecimento de auxotrofia de adenina porrompimento do gene de succinil-AMP sintase (purA) em adição a rompimentodo gene purR, e supressão de decomposição de inosina em hipoxantina porrompimento do gene de nucleosídeo de purina fosforilase (deoD), e ummétodo para produzir inosina usando o microorganismo foram descritos(Documento de patente 8).

Frutose bifosfatase é uma das enzimas gliconeogênicas, quecatalisa a reação de gerar frutose-6-fosfato a partir de frutose-l,6-bifosfato.

Existe apenas pouco conhecimento sobre a relação entre esta enzima e a viabiossintética de substâncias derivadas de purina, e não foi tentado criar umabactéria produtora de substância derivada de purina reduzindo a atividadedesta enzima.

Documento de patente 1: Publicação Patente Japonesa(KOKOKU) No. 38-23099

Documento de patente 2: Publicação Patente Japonesa No. 54-17033

Documento de patente 3: Publicação Patente Japonesa No. 55-2956Documento de patente 4: Publicação Patente Japonesa No. 55-

45199

Documento de patente 5: Publicação Patente Japonesa No. 57-

14160

Documento de patente 6: Publicação Patente Japonesa No. 57-

41915

Documento de patente 7: Patente Japonesa Não-examinada(KOKAI) No. 59-42895

Documento de patente 8: Patente Japonesa Não-examinadaNo. 2004-242610

Documento de patente 9: Publicação Patente Japonesa No. 51-

5075

Documento de patente 10: Publicação Patente Japonesa No.

58-17592

Documento de patente 11: Patente Japonesa Não-examinada

No. 58-158197

Documento de patente 12: Patente Japonesa Não-examinada

No. 58-175493

Documento de patente 13: Patente Japonesa Não-examinada

No. 59-28470

Documento de patente 14: Patente Japonesa Não-examinada

No. 60-156388

Documento de patente 15: Patente Japonesa Não-examinada

No. 1-27477

Documento de patente 16: Patente Japonesa Não-examinada

No. 1-174385

Documento de patente 17: Patente Japonesa Não-examinada

No. 3-58787

Documento de patente 18: Patente Japonesa Não-examinadaNo. 3-164185

Documento de patente 19: Patente Japonesa Não-examinadaNo. 5-84067

Documento de patente 20: Patente Japonesa Não-examinadaNo. 5-192164

Documento de patente 21: Patente Japonesa Não-examinadaNo. 63-248394

Documento de patente 22: Publicação de Patente InternacionalW099/03988

Documento de patente 23: Patente Norte-Americana No.6.284.495

Documento de não patente 1: Agric. Biol. Chem., 1978, 42,399-405

Documento de não patente 2: Proc. Natl. Acad. Sei. USA,1995, 92, 7455-7459

Documento de não patente 3: J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183

Documento de não patente 4: J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Objetivo a ser atingido pela invenção

Um objetivo da presente invenção é construir uma bactériaBacillus adequada para produção por fermentação de substâncias derivadas depurina tal como nucleosídeos de purina e/ou nucleotídeos de purina, efornecer um método para produzir uma substância derivada de purina usandouma tal bactéria.

Meios para atingir o objetivo

Foram conduzidas várias pesquisas a fim de atingir o objetivomencionado acima. Como um resultado, foi encontrado que se a atividadeenzimática de frutose bifosfatase da via de gliconeogênese foi diminuída emuma bactéria Bacillus, uma capacidade da bactéria de produzir umnucleosídeo de purina ou um nucleotídeo de purina é melhorada, e consumadaa presente invenção.

A presente invenção assim fornece os seguintes.

(1) Uma bactéria pertencendo ao gênero Bacillus tendo umacapacidade de produzir substância derivada de purina, caracterizada pelo fatode que a bactéria foi modificada de forma que atividade enzimática de frutosebifosfatase é diminuída.

(2) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, caracterizada pelo fato de que a substância derivada de purina é umnucleosídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de inosina,xantosina, guanosina e adenosina.

(3) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, caracterizada pelo fato de que a substância derivada de purina é umnucleotídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de ácidoinosínico, ácido xantílico, ácido guanílico e ácido adenílico.

(4) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, caracterizada pelo fato de que a atividade de frutose bifosfatase édiminuída por ruptura de um gene codificando frutose bifosfatase.

(5) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, caracterizada pelo fato de que o gene codificando frutose bifosfatase éum gene codificando uma proteína das seguintes (A) ou (B):

(A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 1,

(B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 1 o que inclui substituições, deleções, inserções, adições ouinversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos e tem atividade defrutose bifosfatase.(6) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que foi adicionalmente modificada de forma que atividade defosforribosil pirofosfato sintetase é aumentada.

(7) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que foi adicionalmente modificada de forma que quantidade de

expressão do operon de purina é aumentada.

(8) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, caracterizada pelo fato de que quantidade de expressão do operon depurina é aumentada por ruptura do gene purR, que é um gene codificando umrepressor do operon de purina.

(9) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que foi adicionalmente modificada de forma que atividade defosforilase de nucleosídeo de purina é diminuída.

(10) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que foi adicionalmente modificada de forma que atividade de IMPdesidrogenase é diminuída.

(11) A bactéria pertencendo ao gênero Bacillus como descritoacima, que é Bacillus subtilis.

(12) Um método para produzir uma substância derivada depurina, que compreende cultivar a bactéria pertencendo ao gênero Bacilluscomo descrito acima em um meio para causar acúmulo de uma substânciaderivada de purina em células da bactéria ou no meio, e coletar a substânciaderivada de purina das células ou meio.

(13) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato deque a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purina ou umnucleotídeo de purina.

(14) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato deque a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purina selecionado apartir do grupo consistindo de inosina, xantosina, guanosina e adenosina.(15) O método como descrito acima, caracterizado pelo fato deque a substância derivada de purina é um nucleotídeo de purina selecionado apartir do grupo consistindo de ácido inosínico, ácido xantílico, ácido guanílicoe ácido adenílico.

(16) Um método para produzir um nucleotídeo de purina, quecompreende produzir um nucleosídeo de purina pelo método como descritoacima, reagir o nucleosídeo de purina com um doador de fosfato selecionadoa partir do grupo consistindo de ácido polifosfórico, fenil fosfato e carbamilfosfato, e um microorganismo tendo uma capacidade de produzir um éster de5'-ácido fosfórico de nucleosídeo ou fosfatase ácida para produzir umnucleotídeo de purina, e coletar o nucleotídeo de purina.

Melhor modo para realizar a invenção

<1> Bactéria Bacillus da presente invenção

(I) Fornecer a capacidade de produzir uma substância derivada de purina

Na presente invenção, a frase "atividade é diminuída" abrangeum estado de que a atividade é menor do que a atividade em uma cepa nãomodificada tal como uma bactéria Bacillus tipo selvagem, um estado de que aatividade foi substancialmente eliminada.

A bactéria Bacillus da presente invenção é uma bactériaBacillus que tem a capacidade de produzir uma substância derivada de purinae foi modificada de forma que atividade enzimática de frutose bifosfatase édiminuída.

O termo "substância derivada de purina" significa umasubstância tendo um esqueleto de purina, e exemplos destas incluemnucleosídeos de purina, nucleotídeos de purina, e assim por diante. Osnucleosídeos de purina incluem inosina, xantosina, guanosina, adenosina, eassim por diante, e os nucleotídeos de purina incluem ésteres de 5'-ácidofosfórico de nucleosídeos de purina, por exemplo, ácido inosínico (inosina -5'-fosfato, de agora em diante também referido como "IMP"), ácido xantílico(xantosina-5'-fosfato, de agora em diante também referido como "XMP"),ácido guanílico (guanosina-5'-monofosfato, de agora em diante tambémreferido como "GMP"), ácido adenílico (adenosina-5'-monofosfato, de agoraem diante também referido como "AMP"), e assim por diante.

A frase "capacidade de produzir uma substância derivada depurina" significa uma capacidade da bactéria Bacillus da presente invenção deproduzir, secretar ou causar acúmulo de uma substância derivada de purinanas células bacterianas ou em um meio quando a bactéria é cultivada no meioaté um ponto em que a substância derivada de purina pode ser coletada dascélulas ou meio. A bactéria Bacillus da presente invenção pode ter umacapacidade de produzir dois ou mais tipos das substâncias derivadas de purinamencionadas acima.

A bactéria Bacillus tendo a capacidade de produzir umasubstância derivada de purina pode ser uma bactéria tendo inerentemente acapacidade de produzir uma substância derivada de purina, ou uma bactériaviável modificando tais bactérias Bacillus como descrito abaixo usando umatécnica de mutagênese ou DNA recombinante de forma que elas tenham acapacidade de produzir uma substância derivada de purina. Além disso, elapode ser uma bactéria Bacillus à qual a capacidade de produzir umasubstância derivada de purina é concedida ou de qual a capacidade deproduzir uma substância derivada de purina é melhorada modificando abactéria de forma que atividade enzimática de IBrutose bifosfatase sejadiminuída, de uma maneira tal como descrito posteriormente.

Na presente invenção, a frase "atividade enzimática édiminuída" abrange um estado que atividade enzimática de frutose bifosfatasedescrita acima, ou uma enzima de decompõe uma substância derivada depurina descrita posteriormente tal como inosina monofosfato (IMP)desidrogenase, ou os semelhantes é menor do que aquela em uma cepa nãomodificada, por exemplo, uma cepas tipo selvagem da bactéria Baeillus, e umestado em que a atividade foi substancialmente eliminada. 0 mesmo deve seaplicar à atividade do repressor de operon de purina descrito posteriormente.

Exemplos da bactéria Bacillus usada para obter a bactériaBacillus da presente invenção incluem Bacillus subtilis, Bacillusamyloliquefaeiens, Bacillus pumilus, e assim por diante.

Exemplos de Bacillus subtilis incluem Bacillus subtilis 168Marburg (ATCC 6051), Bacillus subtilis PY79 (Plasmid, 1984, 12, 1-9) eassim por diante, e exemplos de Bacillus amyloliquefaeiens incluem Bacillusamyloliquefaeiens T (ATCC 23842), Bacillus amyloliquefaeiens N (ATCC23845), e assim por diante. Exemplos de Bacillus pumilus incluem Bacilluspumilus Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005, Patente Norte-Americana No.3.616.206), e assim por diante. Estas cepas podem ser obtidas a partir daAmerican Type Culture Collection (Endereço: P.O. Box 1549, Manassas, VA20108, Estados Unidos da América).

Uma bactéria Bacillus tendo a capacidade de produzir umasubstância derivada de purina pode ser obtida fornecendo, por exemplo,auxotrofia de nucleosídeo de purina ou resistência a uma droga tal comoanálogo de purina para tais bactérias Bacillus como descrito acima(Publicação Patente Japonesa Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160,57-41915 e 59-42895). Uma bactéria Bacillus tendo auxotrofia ou resistênciaa droga pode ser obtida tratando a bactéria com agente mutagênico que éusado para mutagênese usual tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina(NTG) ou EMS (etil metanossulfonato).

Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleosídeode purina incluem os seguintes.

Como um exemplo específico de cepa produtora de inosinapertencendo ao gênero Bacillus, a cepa KMBS16 de Bacillus subtilis pode serusada. Esta cepas é derivada da cepas trpC2 conhecida de Bacillus subtilis(168 Marburg), caracterizada pelo fato de que um gene purR codificando orepressor de operem de purina (purR::spc), um gene purA codificandosuccinil-AMP sintase (purA::erm), e um gene deoD codificando fosforilase denucleosídeo de purina (deoD::kan) são rompidos (Patente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610, US2004166575A1). Cepas AJ3772 de Bacillussubtilis (FERM P-2555, Patente Japonesa Não-examinada No. 62-014794) eassim por diante também pode ser usado.

Exemplos de bactérias Bacillus que tem uma capacidade deproduzir guanosina incluem uma bactéria Bacillus que tem atividadeaumentada de IMP desidrogenase (Patente Japonesa Não-examinada No. 3-58787), uma bactéria Bacillus que é obtida introduzindo um vetorcompreendendo um gene conferindo resistência a análogo de purina oudecoinina em um mutante auxotrófico de adenina (Publicação PatenteJaponesa No. 4-28357), e assim por diante.

Exemplos de bactérias Bacillus que produzem um nucleotídeode purina incluem os seguintes.

Como uma bactéria Bacillus produtora de ácido inosínico,cepas produtoras de inosina de Bacillus subtilis que têm atividade de fosfataseatenuada foram relatadas (Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805; Fujimoto, M., Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259).

Exemplos de bactérias Bacillus produtoras de ácido guanílico incluemmutantes de bactérias Bacillus que têm auxotrofia de adenina, resistência adecoinina ou sulfóxido de metionina, e uma capacidade de produzir 5'-ácidoguanílico (guanosina-5'-monofosfato, de agora em diante referido como"GMP") (Publicação Patente Japonesa No. 56-12438).

Além disso, uma bactéria produtora de ácido xantílico pode serconstruída pelo método usado para melhoramento de bactérias corineformestipicamente incluindo Corynebaeterium ammoniagenes. Por exemplo,obtendo uma cepas melhorada de PRPP amidotransferase (Patente JaponesaNão-examinada No. 8-168383), uma cepas resistente a aminoácido alifático(Patente Japonesa Não-examinada No. 4-262790), ou uma cepas resistente adihidroprolina (Publicação Não Examinada de Patente Sul Coreana No. 2003-56490), uma bactéria produtora de ácido xantílico pode ser construída.

Além disso, exemplo de um método para melhorar bactériasBacillus que têm a capacidade de produzir uma substância derivada de purinatambém inclui melhorar as atividades de enzimas envolvidas em biossíntesede purina que são comuns à biossíntese de nucleosídeos de purina enucleotídeos de purina, i.e., enzimas de biossíntese de purina, em célulasbacterianas. A atividade da enzima nas células é preferivelmente aumentadapara um nível maior do que aquele de uma cepas não modificada de bactériaBacillus, por exemplo, uma bactéria Bacillus tipo selvagem. A frase"atividade é aumentada" abrange, por exemplo, quando número de moléculasde enzima por célula é aumentado, e quando a atividade específica pormolécula de enzima é aumentada, e assim por diante. Por exemplo, aatividade pode ser aumentada aumentando a quantidade de expressão do geneda enzima.

Exemplos de uma enzima envolvida na biossíntese de purinaincluem, por exemplo, fosforribosil pirofosfato amidotransferase, fosforribosilpirofosfato sintetase (PRPP sintetase [EC: 2.7.6.1]), e assim por diante.

Alguns dos catabólitos produzidos por metabolismo de fontesde açúcar tal como glicose que circula na via de pentose fosfato sãoconvertidos em ribose-5-fosfato via ribulose-5-fosfato. A partir da ribose-5-fosfato biossintetizada, PRPP é produzido, o qual é um precursorindispensável para biossíntese de nucleosídeo de purina, histidina e triptofano.

Especificamente, ribose-5-fosfato é convertido em PRPP por fosforribosilpirofosfato sintetase. Portanto, uma capacidade de produzir substânciaderivada de purina pode ser concedida a uma bactéria Bacillus modificandode forma que a atividade de PRPP sintetase desta seja aumentada.

A frase "atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase éaumentada" significa que a atividade de fosforribosil pirofosfato sintetaseaumenta se comparada com aquela de uma cepas não modificada tal comouma cepas tipo selvagem ou uma cepas parental. A atividade da fosforribosilpirofosfato sintetase pode ser medida, por exemplo, pelo método de Switzer etal. (Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11) ou Roth et al. (Methods Enzymol.,1978, 51, 12-17). Uma bactéria Bacillus na qual a atividade de fosforribosilpirofosfato sintetase é aumentada pode ser produzida, por exemplo,aumentando expressão de um gene codificando a fosforribosil pirofosfatosintetase em uma bactéria Bacillus de acordo com um método de usar umplasmídeo contendo o gene ou integrando o gene em um cromossomo, o quepode ser realizado da mesma maneira que aquela do método descrito emPatente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610. Embora o gene prs deSEQ LD NO: 3 derivado de uma bactéria Bacillus (No. de Acesso de GenBankX16518) possa ser mencionado como o gene codificando fosforribosilpirofosfato sintetase utilizável para a presente invenção, qualquer dos genesderivados de outras bactérias, animais ou plantas codificando uma proteínatendo a atividade de fosforribosil pirofosfato sintetase pode ser usado.

Além disso, quando PRPP que é um precursor indispensávelpara biossíntese de nucleosídeo de purina, histidina e triptofano é produzidouma vez, uma parte é convertida em nucleotídeos de purina e nucleosídeos depurina pelas enzimas envolvidas na biossíntese de purina. Exemplos de genescodificando tais enzimas incluem os genes do operon de purina de Bacillussubtilis, especificamente, genes do operon de purD purEKB-purC(orf) QLF-purMNH(J) (Ebbole D.J. and Zalkin H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87) (no momento, também chamado purEKBCSQLFMNHD, Bacillus subtilisand Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press,Washington D.C., 2002, No. de Acesso de GenBank NC_000964), e os genesdo regulon pur de Eseheriehia eoli (Eseheriehia and Salmonella, SecondEdition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996).Por conseguinte, melhorar expressão destes genes concede oumelhora a capacidade de produzir uma substância derivada de purina. Emadição, genes do operon de purina que podem ser usados para a presenteinvenção não são limitados a estes, e genes derivados de outrosmicroorganismos, animais e plantas também podem ser usados.

Exemplos do método para aumentar quantidade de expressãodo operon de purina incluem aumentar expressão de genes do operon depurina em uma bactéria Bacillus por um método de usar um plasmídeocontendo os genes ou integrando os genes em um cromossomo ou ossemelhantes.

O segundo método para aumentar quantidade de expressão dooperon de purina inclui substituir um promotor do operon de purina por ummais forte, e substituir a região -35 ou -10 do promotor nativo por umaseqüência consenso.

Por exemplo, em Bacillus subtilis (B. subtilis cepas 168Marburg, ATCC 6051), a seqüência de -35 do operon de purina é umaseqüência consenso (TTGACA), mas a seqüência de -10 é TAAGAT, quedifere da seqüência consenso TATAAT (Ebbole, DJ. and H. Zalikn, J. Biol.Chem., 1987, 262, 8274-8287). Portanto, mudando a seqüência de -10(TAAGAT) para a seqüência consenso similar TATAAT, TATGAT ouTAAAAT, a atividade transcricional do operon de purina pode ser aumentada.Uma seqüência de promotor pode ser substituída pelo mesmo método queaquele da substituição gênica, que é descrito abaixo.

O terceiro método para aumentar quantidade de expressão dooperon de purina inclui reduzir quantidade de expressão do repressor deoperon de purina (Patente Norte-Americana No. 6.284.495). A frase"expressão de um repressor de operon de purina" inclui tanto transcrição deum gene de operon como tradução de um produto de transcrição. Além disso,"quantidade de expressão é diminuída" inclui quando a quantidade deexpressão é menor do que aquela em uma cepas não modificada tal como umabactéria Bacillus tipo selvagem, e quando a expressão foi substancialmenteeliminada.

Quantidade de expressão do repressor de operon de purina(repressor de purina) pode ser diminuída, por exemplo, tratando uma bactériaBacillus com radiação de raios ultravioleta ou agente mutagênico usado emum tratamento de mutagênese usual tal como NTG ou EMS e selecionandoum mutante mostrando quantidade de expressão diminuída do repressor depurina pode ser empregado.

Além disso, uma bactéria Bacillus exibindo uma quantidade deexpressão diminuída do repressor de purina também pode ser obtida por, porexemplo, além de um tratamento de mutagênese, substituindo um genecodificando o repressor de purina em um cromossomo (purR, Acesso deGenBank NC_000964, região de codificação corresponde aos números 54439a 55293 de nucleotídeos, SEQ ID NO: 5) com um gene correspondente quenão funciona normalmente (daqui para frente, também referido como "genetipo rompido") por recombinação homóloga utilizando uma técnica derecombinação gênica (Experiments in Molecular Genetics, Cold SpringHarbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J.Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202).

Por exemplo, um gene tipo rompido para um gene normalpode ser substituído por um gene tipo rompido no cromossomo hospedeiro deuma maneira como descrito abaixo. A seguir, a ruptura do gene purR éexplicada. Outros genes tal como os genes purA, deoD, guaB e ft>p podem sersimilarmente rompidos.

Quando um plasmídeo ou o semelhante que tem umaseqüência homóloga a uma seqüência no cromossomo e que não é capaz de sereplicar em células de bactérias Bacillus é introduzido na célula, resultandoem recombinação no sítio da seqüência tendo homologia em uma certafreqüência. O plasmídeo inteiro é então recombinado no cromossomo.Posteriormente, se recombinação é adicionalmente causada no sítio daseqüência tendo homologia no cromossomo, o plasmídeo é removido docromossomo. Neste momento, dependendo do sítio onde a recombinaçãoocorre, o gene tipo rompido pode ser mantido no cromossomo, e o genenormal original pode ser removido do cromossomo com o plasmídeo.Selecionando uma tal cepas, é possível obter uma cepas na qual o genQpurRnormal no cromossomo foi substituído pelo gene purR tipo rompido.

Tais técnicas de ruptura gênica baseadas em recombinaçãohomóloga já foram estabelecidas e incluem um método de utilizar um DNAlinear, um método de utilizar um plasmídeo sensível a temperatura e assimpor diante. Além disso, o gene purR também pode ser rompido usando umplasmídeo que contém o gene purR no qual um gene marcador tal como umgene de resistência a droga foi inserido e que não é capaz de replicar na célulabacteriana alvo. Isto é, em um transformante que foi transformado com umplasmídeo tal como descrito acima, o gene marcador é incorporado no DNAcromossômico e concede resistência a droga. Uma vez que o gene marcador éincorporado no cromossomo em uma alta taxa por recombinação homólogadas seqüências de gene purR que coloca o gene marcador no plasmídeo entreo gene purR no cromossomo, uma cepas com gene purR rompido pode sereficientemente selecionada.

O gene purR tipo rompido usado para a ruptura gênica podeser obtido, especificamente, deletando uma certa região do gene purR pordigestão com uma enzima de restrição e re-ligação, inserindo outro fragmentode DNA (gene marcador etc.) no gene purR, ou causando substituição,deleção, inserção, adição ou inversão de um ou mais nucleotídeos in aseqüência de nucleotídeos da região de codificação, região promotora ou ossemelhantes do gene purR por uma mutagênese específica de sítio (Kramer,W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 1987, 154, 350-367) ou por PCRrecombinante (PCR Technology, Stockton Press (1989)) ou por tratamentocom um agente químico tal como hipossulfito de sódio ou hidroxilamina(Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1978, 75, 2170-2174), seguido por seleção de uma cepas na qual a atividade do repressorcodificado pelo gene purR é diminuída ou transcrição do gene é diminuída.Entre estes métodos, deletar uma certa região do gene purR por digestão comuma enzima de restrição e re-ligação ou inserir outro fragmento de DNA nogene purR é preferível em vista de confiabilidade e estabilidade. A regiãocerta do gene purR a ser deletada pode ser uma seqüência de extremidade 5',seqüência interna ou seqüência de extremidade 3' do gene purR. Entretanto, sea região responde por 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais,particularmente 97% ou mais, do comprimento completo de gene purR,certeza de redução da atividade de repressor é aumentada. Além disso, quandouma mutação de mudança de quadro é causada por deleção ou inserção denucleotídeos na região de codificação do gene purR, é preferível causardeleção ou inserção de nucleotídeos em múltiplos sítios e causar deleção ouinserção de nucleotídeos no lado de extremidade 3', em vista de reduzirseguramente a atividade de repressor.

Redução da atividade de repressor de purina também pode ser20 atingida, além da ruptura gênica mencionada acima, introdução de umamutação que reduz a atividade intracelular de repressor de purina no genepurR no cromossomo baseado em um método de mutagênese convencional.Por exemplo, ela pode ser atingida introduzindo uma substituição deaminoácido (mutação de sentido incorreto), um códon de parada (mutaçãosem sentido), ou uma mutação de mudança de quadro que adiciona ou deletaum ou dois nucleotídeos, ou deletando o gene parcialmente ou inteiramente.Além disso, a atividade do repressor também pode ser diminuída inserindoum transposon no gene purR no cromossomo.

Redução da atividade do repressor de purina também pode seratingida substituindo uma seqüência de controle de expressão do gene purRtal como promotor no DNA cromossômico por um mais fraco. A força de umpromotor é definida pela freqüência de atos de iniciação de síntese de RNA.

Exemplos de método para avaliar a força de promotores e promotores fortessão descritos no artigo de Goldstein et al. (Prokaryotic promoters inbiotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128), e assim por diante.

Além disso, também é possível introduzir substituição de nucleotídeo paradiversos nucleotídeos em uma região promotora de um gene alvo e com issomodificar o promotor a ser enfraquecido como descrito em Publicação dePatente Internacional W000/18935. Além disso, sabe-se que substituição dediversos nucleotídeos no espaçador entre o sítio de ligação de ribossomo(RBS) e o códon de início, em particular, uma seqüência imediatamente antesdo códon de início, afeta fortemente eficiência de tradução de mRNA. Estamodificação de RBS pode ser combinada com transcrição decrescente de umgene alvo.

Além disso, um DNA recombinante no qual uma mutação quedesestabiliza RNA mensageiro transcrito a partir do gene purR é introduzidopode ser preparado e transformado em uma bactéria Bacillus hospedeira.

Atividades de enzimas codificadas pelos genes purA, deoD,guaB, e fbp descritos posteriormente também podem ser diminuídas damesma maneira como descrito acima.

O gene purR pode ser obtido a partir de um DNAcromossômico de um microorganismo tendo o operon de purina por PCRusando oligonucleotídeos preparados baseado na seqüência de nucleotídeosconhecida do gene purR como iniciadores. O gene purR também pode serobtido a partir de uma biblioteca de DNA cromossômico de ummicroorganismo tendo o operon de purina por hibridização usando umoligonucleotídeo preparado com base na seqüência conhecida de nucleotídeosdo gene purR como uma sonda. A seqüência de nucleotídeos do gene purR dacepas 168 Marburg de Bacillus subtilis foi relatada (No. de Acesso deGenBank D26185 (a região de codificação corresponde aos números denucleotídeos 118041 a 118898), ou NC_000964 (a região de codificaçãocorresponde aos números de nucleotídeos 54439 a 55296)). A seqüência denucleotídeos do gene purR e a seqüência de aminoácidos codificada pelo genesão mostradas em SEQ ID NOS: 5 e 6 de Listagem de Seqüências (PatenteJaponesa Não-examinada No. 2004-242610).

Iniciadores usados para PCR para obter o gene purR podemser quaisquer daqueles possibilitando amplificação de uma parte oucomprimento completo do gene purR, e exemplos específicos incluemoligonucleotídeos tendo as seqüências de nucleotídeos mostradas em SEQ IDNO: 15 (GAAGTTGATGATCAAAA) e SEQ ID NO: 16(ACATATTGTTGACGATAAT).

Exemplos do gene marcador descrito acima incluem genes de resistência a droga tal como um gene de resistência a espectinomicina e genede resistência a canamicina. O gene de resistência a espectinomicina deEnterococcus faeealis pode ser obtido preparando o plasmídeo pDG1726 dacepas ECElOl de Eseheriehia eoli comercialmente disponível a partir doBacillus Genetic Stock Center (BGSC) e removendo o gene de resistênciacomo uma gaveta do plasmídeo. O gene de resistência a eritromicina deStaphyloeoeeus aureus pode ser obtido preparando o plasmídeo pDG646 dacepas ECE91 de Eseheriehia eoli comercialmente disponível a partir doBacillus Genetic Stock Center (BGSC) e removendo o gene de resistênciacomo uma gaveta do plasmídeo. O gene de resistência a canamicina derivadode Streptoeoceus faeealis pode ser obtido preparando o plasmídeo pDG783 dacepas ECE94 de Eseheriehia eoli comercialmente disponível a partir doBacillus Genetic Stock Center (BGSC) e removendo o gene de resistênciacomo uma gaveta do plasmídeo. Além disso, o gene de resistência acloranfenicol de Staphyloeoeeus aureus pode ser obtido preparando oplasmídeo pC194 da cepas IEl7 de Bacillus subtilis comercialmentedisponível a partir do Bacillus Genetic Stock Center (BGSC) e realizandoPCR usando tal plasmídeo como um modelo para amplificar o plasmídeo.

Quando um gene de resistência a droga é usado como o genemarcador, uma cepas com gene purR rompido pode ser obtida inserindo ogene de resistência a droga no gene purR em um plasmídeo em um sítioapropriado, transformando um microorganismo com o plasmídeo obtido eselecionando um transformante que se tornou resistente a droga. Ruptura dogene purR no cromossomo pode ser confirmada analisando o gene purR ou ogene marcador no cromossomo usando Southern blotting ou PCR.

Incorporação do gene de resistência a espectinomicina, gene de resistência aeritromicina ou gene de resistência a canamicina mencionados acima em umDNA cromossômico pode ser confirmada por PCR usando iniciadores quepodem amplificar estes genes.

Também se sabe que expressão do operon de purina é reguladapela seqüência de terminador-antiterminador localizada depois do promotor(de agora em diante referido como seqüência atenuadora) (Ebbole, D.J. andZalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287; Ebbole D.J. and Zalkin H.,J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894-10902; Ebbole, D.J. and Zalkin, H., J.Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141). Portanto, quantidade de expressão dooperon de purina pode ser aumentada deletando a seqüência atenuadora.Deleção da seqüência atenuadora pode ser atingida pelo mesmo método queaquele para ruptura de purR.

A fim de adicionalmente aumentar transcrição do operon depurina, os métodos descritos acima podem ser combinados. Por exemplo, ogene purR pode ser rompido, e depois, o operon de purina do qual a seqüênciaatenuadora é deletada pode ser amplificado usando um plasmídeo oumúltiplas cópias de um tal operon de purina podem ser introduzidas em umcromossomo.As atividades de uma enzima envolvida em biossíntese depurina também podem ser melhoradas dessensibilizando a enzima envolvidaem biossíntese de purina para regulação desta, por exemplo, de acordo com ométodo mencionado acima para dessensibilizar uma enzima para inibição porretroalimentação (Patente Internacional 99/03988).

Além disso, a capacidade de produzir substância derivada depurina também pode ser melhorada atenuando absorção de substânciasderivadas de purina pelas células. Por exemplo, a absorção de nucleosídeos depurina pelas células pode ser atenuada bloqueando uma reação envolvida naabsorção de nucleosídeos de purina pelas células. Um exemplo da reaçãoenvolvida na absorção de os nucleosídeos de purina pelas células incluireações catalisadas por nucleosídeo permeases.

Além disso, quando um nucleosídeo de purina é produzido,atividade de uma enzima de decompõe o nucleosídeo de purina pode serdiminuída a fim de melhorar a capacidade de produzir um nucleosídeo depurina. Um exemplo de uma tal enzima inclui nucleosídeo de purinafosforilase.

Nucleotídeos de purina biossintetizados a partir de PRPP porenzimas envolvidas em biossíntese de purina são desfosforilados e com issoconvertidos em um nucleosídeo de purina. Para causar eficientementeacúmulo de um nucleosídeo de purina, é preferível reduzir uma atividade denucleosídeo de purina fosforilases, o que adicionalmente degradanucleosídeos de purina em hipoxantina ou os semelhantes. Isto é, é preferívelatenuar ou eliminar uma atividade de um nucleosídeo de purina fosforilaseque emprega nucleosídeos de purina, tal como inosina, como um substrato.

Especificamente, a atividade de nucleosídeo de purinafosforilase pode ser diminuída rompendo os genes deoD e pupG codificandonucleosídeo de purina fosforilase em bactérias Bacillus. A bactéria Bacillus dapresente invenção pode ser modificada rompendo um ou ambos os genesdeoD e pupG. Como os genes deoD e pupG, por exemplo, aqueles genesderivados de bactérias Bacillus (deoD: No. de Acesso de GenBankNC 000964 (SEQ ID NO: l\pupG\ No. de Acesso de GenBank NC_000964(SEQ ID NO: 9)) podem ser usados, e uma cepas com gene rompido pode serobtida da mesma maneira que aquela usada para a ruptura mencionada acimado gene purR.

A capacidade de produzir uma substância derivada de purinatambém pode ser melhorada diminuindo a atividade de succinil-AMP sintase.Um exemplo do gene codificando succinil-AMP sintase inclui o gene purA.Um exemplo do gene purA inclui, por exemplo, aqueles tendo a seqüência denucleotídeos registrada como No. de Acesso de GenBank NC_000964 (regiãode codificação corresponde aos números de nucleotídeos 4153460 a 4155749da fita complementar, SEQ ID NO: 11).

A capacidade de produzir uma substância derivada de purinatambém pode ser melhorada diminuindo uma atividade de inosinamonofosfato (IMP) desidrogenase. Um exemplo do gene codificando IMPdesidrogenase inclui o gene guaB. Um exemplo do gene guaB inclui, porexemplo, aqueles tendo a seqüência de nucleotídeos registrada como No. deAcesso de GenBank NC 000964 (região de codificação corresponde aosnúmeros de nucleotídeos 15913 a 17376, SEQ ID NO: 13).

Além disso, como um método para melhorar uma capacidadede produzir substância derivada de purina, amplificação de um genecodificando uma proteína tendo uma atividade de secretar uma substânciaderivada de purina pode ser contemplada. Um exemplo de uma bactéria naqual um tal gene foi amplificado inclui, uma bactéria Bacillus na qual o generhtA é amplificado (Patente Japonesa Não-examinada No. 2003-219876).

Os genes purR, deoD, pupG, purA e guaB a serem rompidoscomo descrito acima, e o gene prs cuja expressão deve ser melhorada podemser variantes conservativas, por exemplo, DNAs codificando proteínas tendoseqüências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 12, 14, 16 e 4 o queinclui substituições, deleções, inserções, adições ou inversões de um oudiversos resíduos de aminoácidos, respectivamente, e tendo atividade dorepressor de purina, nucleosídeo de purina fosforilase, succinil-AMP sintase,EMP desidrogenase ou fosforribosil pirofosfato sintetase, respectivamente.Número pretendido pelo termo mencionado acima "diversos" é, por exemplo,2 a 50, preferivelmente 2 a 30, mais preferivelmente 2 a 10.

Tal mudança de seqüências de aminoácidos como descritoacima normalmente é mudança conservativa que mantém atividades deproteínas. Exemplos de substituição conservativa de aminoácidos incluem:substituição de Ser ou Thr por Ala; substituição de Gln, His ou Lys por Arg;substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn; substituição de Asn, Gluou Gln por Asp; substituição de Ser ou Ala por Cys; substituição de Asn, Glu,Lys, His, Asp ou Arg por Gln; substituição de Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu;substituição de Pro por Gly; substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr porHis; substituição de Leu, Met, Val ou Phe por lie; substituição de lie, Met, Valou Phe por Leu; substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys;substituição de lie, Leu, Val ou Phe por Met; substituição de Trp, Tyr, Met, Ileou Leu por Phe; substituição de Thr ou Ala por Ser; substituição de Ser ou Alapor Thr; substituição de Phe ou Tyr por Trp; substituição de His, Phe ou Trppor Tyr; e substituição de Met, Ile ou Leu por Vai.

Exemplos específicos de variantes conservativas dos genespurR, deoD, pupG, purA, guaB e fbp e do gene prs descrito acima incluemDNAs mostrando uma homologia de, por exemplo, 70% ou mais,preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais,particularmente preferivelmente 95% ou mais, com DNAs tendo asseqüências de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 15 e 3,respectivamente. Mais especificamente, os exemplos das variantesconservativas incluem DNAs que são capazes de hibridizar com DNAs tendoseqüências de nucleotídeos complementares às seqüências de nucleotídeos deSEQ ID NOS: 5, 7, 9, 11, 13, 15 e 3 em condições estringentes. Um exemplodas condições estringentes inclui condições de lavagem a 60°C econcentrações salinas de lxSSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 0,1><SSC,0,1% de SDS, uma vez ou mais vezes, preferivelmente duas vezes ou trêsvezes.

Homologia de DNAs pode ser avaliada por busca BLAST,busca FASTA, o método de cálculo de Crustal W, e assim por diante.

BLAST (ferramenta básica de busca de alinhamento local) éum algoritmo de busca heurística usado pelos programas blastp, blastn, blastx,megablast, tblastn e tblastx, e os resultados obtidos por estes programas sãoconsiderados significantes com base em uso do método estatístico de Karlin,Samuel, and Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statisticalsignificance of molecular sequence features by using general scoringschemes", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications andstatisties for multiple high-scoring segments in molecular sequences", Proc.Natl. Acad. Sei. USA, 1993, 90:5873-7). O método de busca FASTA foidescrito por W.R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison withFASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). O métodode Clustal W é descrito por Thompson J.D., Higgins D.G., and Gibson TJ.(" CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting, position-specific gap penalties andweight matrix choice", NucleicAcids Res., 1994, 22:4673-4680).

Além disso, DNA usado para preparação de um gene tiporompido também pode ser uma variante conservativa de gene purR, deoD,pupG, purA ou guaB.

A incorporação de um gene alvo no DNA cromossômico debactéria Bacillus pode ser realizada da mesma maneira que aquela para o genecodificando frutose bifosfatase descrito posteriormente.(II) Modificação para diminuir atividade enzimática de frutose bifosfatase

A bactéria Bacillus da presente invenção pode ser obtidamodificando uma cepas tendo a capacidade de produzir uma substânciaderivada de purina tal como aquelas descritas acima de forma que a atividadeenzimática de frutose bifosfatase é diminuída. A ordem da modificação não élimitada, e depois de modificar uma bactéria de forma que a atividadeenzimática de frutose bifosfatase desta seja diminuída, capacidade produtorade nucleotídeo de purina pode ser concedida à bactéria.

Frutose bifosfatase é uma enzima que catalisa uma reaçãogerando frutose-6-fosfato a partir de frutose-1,6-bifosfato, e esta reação é umadas reações da via de gliconeogênese. A "via de gliconeogênese" significauma via na qual ácido oxaloacético intracelular é convertido em ácidofosfoenolpirúvico por descarboxilação catalisada por fosfoenolpiruvatocarboxiquinase (EC: 4.1.1.49) e fosforilação, ácido fosfoenolpirúvico éconvertido em frutose-1,6-bifosfato pelas reações reversas de enzimasglicolíticas, frutose-1,6-bifosfato é adicionalmente convertido em frutose-6-fosfato por frutose bifosfatase (EC: 3.1.3.11), e glicose é biossintetizada apartir de frutose-6-fosfato por glicose-6-fosfato isomerase e glicose-6-fosfatase (EC: 3.1.3.9).

A atividade enzimática de frutose bifosfatase pode ser medidapelo método seguinte. Por exemplo, ela pode ser medida convertendo frutose-6-fosfato gerada em NADPH por fosfoglucoisomerase e glicose-6-fosfatodesidrogenase, e medindo NADPH.

Tal modificação que a atividade enzimática de frutosebifosfatase é diminuída pode ser atingida por, por exemplo, como explicadoacima para ruptura do gene purR, substituindo um gene correspondente quenão funciona normalmente (e.g., gene tipo rompido obtido inserindo um genemarcador tal como gene de resistência a droga no gene de frutose bifosfatase)para o gene de frutose bifosfatase no cromossomo por recombinaçãohomóloga. Além disso, como descrito para o gene purR, uma mutação parareduzir atividade enzimática de frutose bifosfatase intracelular pode serintroduzida no gene de frutose bifosfatase no cromossomo por métodosconvencionais de mutagênese.

Um exemplo de frutose bifosfatase de Bacillus subtilis incluiuma proteína consistindo de 671 aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 2,e um gene codificando a proteína, preferivelmente um gene tendo a seqüênciade nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 (gene fòp, números de nucleotídeos4127053 a 4129065 de No. de Acesso de GenBank NC_000964), pode serusado para a modificação. O gene ft>p se localiza a cerca de 323° nocromossomo de Bacíllus subtilis.

Exemplos de DNA codificando uma proteína substancialmenteidêntica a frutose bifosfatase incluem, especificamente, um DNA codificandouma proteína mostrando uma homologia de 50% ou mais, preferivelmente70% ou mais, mais preferivelmente 80% mais, particularmentepreferivelmente 90% ou mais, mais preferivelmente 95% ou mais, com aseqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, e tendo a atividadeenzimática de frutose bifosfatase.

O gene codificando frutose bifosfatase também pode ser umavariante conservativa do gene fbp como os genes mencionados acima.Especificamente, exemplos incluem um DNA codificando uma proteína tendoa seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 incluindo substituições,deleções, inserções, adições ou inversões de um ou diversos resíduos deaminoácidos e tendo atividade de frutose bifosfatase. Exemplos incluemadicionalmente um DNA codificando uma proteína mostrando umahomologia de 50% ou mais, preferivelmente 70% ou mais, maispreferivelmente 80% mais, particularmente preferivelmente 90% ou mais,mais preferivelmente 95% ou mais, com a seqüência de aminoácidosmostrada em SEQ ID NO: 2, e tendo a atividade enzimática de frutosebifosfatase. Mais especificamente, exemplos incluem um DNA que é capaz dehibridizar com um DNA tendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ LD NO: 1em condições estringentes. As condições estringentes incluem condições delavagem a 60°C e concentrações salinas de lxSSC, 0,1% de SDS, preferivelmente 60°C, O5IxSSC, 0,1% de SDS, uma vez ou mais vezes,preferivelmente duas vezes ou três vezes.

Um tal DNA codificando uma proteína substancialmenteidêntica a frutose bifosfatase como descrito acima pode ser obtido, porexemplo, modificando uma seqüência de nucleotídeos codificando uma talenzima de forma que o resíduo de aminoácido de uma parte específica ésubstituído, deletado, inserido, adicionado ou invertido pela mutagêneseespecífica de sítio. Um tal DNA modificado como descrito acima tambémpode ser obtido por um tratamento de mutagênese convencionalmenteconhecido. Exemplos do tratamento de mutagênese incluem um tratamento in vitro de DNA antes de tratamento de mutagênese com hidroxilamina, e umtratamento de um microorganismo tal como bactéria Escherichia contendoDNA antes de tratamento de mutagênese com radiação ultravioleta ou umagente mutagênico usado para tratamento de mutagênese convencional talcomo N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou ácido nitroso.

O gene alvo pode ser obtido, por exemplo, por método de PCR(reação em cadeia da polimerase, White, TJ. et al., Trends Genet., 1989, 5,185-189) usando um DNA cromossômico de uma bactéria Bacillus como ummodelo e oligonucleotídeos preparados baseado em seqüência de nucleotídeosde gene alvo como iniciadores. O DNA cromossômico pode ser preparado a partir de uma bactéria servindo como uma doadora de DNA, por exemplo,pelo método de Saito e Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys.Acta, 1963, 72, 619-629; Text for Bioengineering Experiments, Editado pelaSociety for Bioscience and Bioengineering, Japan, pp.97-98, Baifiikan, 1992)ou os semelhantes. Os iniciadores para PCR pode ser preparado baseado emuma seqüência gênica conhecida de uma bactéria Bacillus, ou baseado eminformação em uma região conservada entre genes de outras bactérias cujasseqüências são conhecidas.

Exemplos do vetor para incorporar um gene alvo em um DNAcromossômico de bactéria Bacillus incluem um vetor tendo uma origem dereplicação sensível a temperatura, tal como pHV1248 (Prtit, M.-A., et. al., J.Bacteriol., 1990, 172, 6736-6740), vetores para E. coli tal como pHSG398(Takara Shuzo) e pBluescript SK- (Stratagene), e assim por diante.

A fim de ligar um gene objetivo e um vetor carregando ummarcador que funciona em bactérias Bacillus para preparar um DNArecombinante, o vetor é digerido com uma enzima de restrição se combinandocom a extremidade do gene objetivo. A ligação normalmente é realizadausando uma ligase tal como T4 DNA ligase.

Para introduzir um DNA recombinante preparado comodescrito acima em uma bactéria Bacillus, qualquer dos métodos detransformação conhecidos que foram até agora relatados pode ser empregado.Exemplos incluem, por exemplo, um método de preparar células competentesa partir de células que estão na fase de crescimento seguido por introduzir oDNA nestas, (Dubunau D. and Davidoff-Abelson, R., J. Mol. Biol., 1971, 56,209-221) e um método de fazer células hospedeiras em protoplastos ouesferoplastos, que podem facilmente adquirir DNA recombinante, seguido porintroduzir o DNA recombinante nas células aceptoras de DNA (Chang, S. andChoen, S.N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115).<2> Método para produzir uma substância derivada de purina

A bactéria Bacillus da presente invenção produzeficientemente uma substância derivada de purina. Portanto, cultivando abactéria Bacillus da presente invenção em um meio apropriado, umasubstância derivada de purina, tal como nucleosídeo de purina e nucleotídeode purina pode ser produzida e acumulada em células da bactéria ou no meio.Como para o meio usado para a presente invenção, culturapode ser realizada de uma maneira convencional usando um meioconvencional contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e saisminerais assim como nutrientes traço orgânicos tal como aminoácidos evitaminas, como requerido. Ou um meio sintético ou um meio natural podeser usado. Quaisquer tipos de fonte de carbono e fonte de nitrogênio podemser usados contanto que eles possam ser utilizados por uma cepas a sercultivada.

Como a fonte de carbono, açúcares tal como glicose, frutose,sacarose, maltose, manose, galactose, arabinose, xilose, trealose, ribose,hidrolisados de amido e melaço, e álcoois tal como glicerol e manitol sãousados, e ácidos orgânicos tal como ácido glucônico, ácido acético, ácidocítrico, ácido maleico, ácido fumárico e ácido succínico também podem serusados independentemente ou em combinação com outras fontes de carbono.

Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio tal comosulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato deamônio e acetato de amônio, sais de ácido nítrico, nitrogênio orgânico talcomo hidrolisado de soja, e assim por diante são usados.

Como os nutrientes traço orgânicos, aminoácidos, vitaminas,ácidos graxos, ácidos nucléicos, aqueles contendo estas substâncias tal comopeptona, ácido casamino, extrato de levedura e produto de decomposição deproteína de soja e assim por diante são usados. Quando uma cepas mutanteauxotrófica que requer um aminoácido ou os semelhantes para crescimento éusada, é necessário suplementar o nutriente requerido.

Como os sais minerais, sais de ácido fosfórico, sais demagnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e assim por diante são usados.

Embora as condições de cultura possam variar dependendo dotipo de bactéria Bacillus a ser usado, Bacillus subtilis, por exemplo, écultivada como cultura sob aeração, enquanto que a temperatura defermentação é controlada para ser de 20 a 50°C, e pH para ser de 4 a 9.Quando pH cai durante a cultura, o meio é neutralizado com uma basealcalina tal como gás amônia. Um nucleosídeo de purina é acumulado nomeio depois de cerca de 40 horas a 3 dias de cultura de uma maneira tal comodescrito acima.

Depois de término da cultura, inosina acumulada no meio podeser coletada de uma maneira convencional. Por exemplo, ela pode ser isoladapor precipitação, cromatografia de troca iônica e assim por diante.

Além disso, se o microorganismo usado para a presenteinvenção carece de um gene codificando uma nucleosidase ou nucleotidase,um nucleosídeo ou nucleotídeo correspondente pode ser acumulado. Alémdisso, se auxotrofia de inosina é concedida, um precursor ou substânciasrelevantes envolvidas na via de biossíntese desta podem ser acumulados.

Além disso, reagindo inosina ou guanosina preparada pelométodo da presente invenção com nucleosídeo de purina fosforilase oufosforribosiltransferase, 5'-ácido inosínico ou 5'-ácido guanílico podem serobtidos.

Além disso, também é possível fosforilar o nucleosídeo depurina produzido usando o microorganismo da presente invenção reagindofosfotransferase no nucleosídeo de purina para produzir um nucleotídeo depurina (éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo) (Patente Japonesa Não-examinada No. 2000-295996). Por exemplo, o método para produzir umnucleotídeo de purina usando uma bactéria Escherichia na qual um genecodificando inosina guanosina quinase de Eseheriehia eoli é introduzido(Patente Internacional 91/08286), e o método para produzir um nucleotídeo depurina usando Corynebaeterium ammoniagenes na qual um gene codificandoinosina guanosina quinase de Exiguobaeterium aeetylieum é introduzido(Patente Internacional 96/30501) pode ser usado.Além disso, também é possível produzir um nucleotídeo depurina (éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo) reagindo o nucleosídeo depurina produzido usando o microorganismo da presente invenção com umdoador de fosfato selecionado a partir do grupo consistindo de ácidopolifosfórico, fenil fosfato e carbamil fosfato, e um microorganismo tendouma capacidade de produzir um éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo oufosfatase ácida (EC 3.1.3.2). Embora o microorganismo tendo umacapacidade de produzir um éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo não sejaparticularmente limitado contanto que um microorganismo tendo umacapacidade de converter um nucleosídeo de purina em um nucleotídeo depurina seja escolhido, exemplos incluem, por exemplo, o microorganismodescrito em Publicação de Patente Internacional W096/37603.

Além disso, Escherichia blattae JCM 1650, Serratia ficariaATCC 33105, Klebsiella planticola IFO 14939 (ATCC 33531), Klebsiellapneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724), Klebsiella terrigena IFO 14941 (ATCC33257), Morganella morganii IFO 3168, Enterobaeter aerogenes IFO 12010,Enterobaeter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048), Chromobaeteriumfluviatile IAM 13652, Chromobaeterium violaeeum IFO 12614, Cedeeealapagei JCM 1684, Cedeeea davisiae JCM 1685, Cedeeea neteri JCM 5909, eassim por diante descritas em Patente Japonesa Não-examinada No. 07-231793 também podem ser usadas.

Como a fosfatase ácida, por exemplo, a fosfatase ácida descritaem Patente Japonesa Não-examinada No. 2002-000289 pode ser usada, e umafosfatase ácida cuja afinidade com um nucleosídeo é aumentada (PatenteJaponesa Não-examinada No. 10-201481), uma fosfatase ácida mutante cujaatividade de nucleotidase é diminuída (Patente Internacional 96/37603), umafosfatase ácida mutante cuja atividade de hidrólise de éster de ácido fosfóricoé diminuída (Patente Japonesa Não-examinada No. 2001-245676) e assim pordiante podem ser mais preferivelmente usadas.Também é possível obter um nucleotídeo de purinafosforílando quimicamente um nucleosídeo de purina produzido usando omicroorganismo da presente invenção (Bulletin of the Chemical Society ofJapan, 42, 3505). Além disso, um método de obter GMP acoplando omicroorganismo tendo uma capacidade de produzir XMP da presenteinvenção e atividade de XMP aminase usando o sistema regenerante de ATPde um microorganismo, e um método de obter IMP acoplando inosina quinase(Biosci. Biotech. Biochem., 51, 840 (1997); Patente Japonesa Não-examinadaNo. 63-230094) também podem ser usados.

Nucleosídeo de inosina, guanosina ou purina preparado pelométodo da presente invenção usado para a preparação mencionada acima denucleotídeo de purina pode ser um produto purificado, ou caldo defermentação de nucleosídeo de purina, ou um produto bruto contendo umnucleosídeo de purina.

EXEMPLOS

Daqui para frente, a presente invenção será maisespecificamente explicada com referência a exemplos.Exemplo 1

<Construção de cepa bacteriana deficiente nos genes pupG e deoDcodificando nucleosídeo de purina fosforilases>

Uma cepa deficiente no gene de nucleosídeo de purinafosforilase (deoD) foi construída a partir da cepa recombinante KMBS310como descrito abaixo. A cepa KMBS310 (Pedido de Patente Japonesa No.2005-280186), que é derivada de Bacillus subtilis (cepa 168 Marburg de B.subtilis, ATCC 6051), é deficiente no gene de repressor de operon de purina(purR), gene de succinil-AMP sintase (purA) e gene de nucleosídeo de purinafosforilase (pupG), e tem gene de IMP desidrogenase {guaB) atenuado,caracterizado pelo fato de que a região promotora de operon de purina eseqüência SD do gene de PRPP sintetase(prí) foram modificadas. Expressãodo operon de purina e do gene de PRPP sintetase foram melhoradas pelasmodificações da região promotora e da seqüência SD, respectivamente.

Um DNA genômico preparado a partir da cepa KMBS16(purR::spc purA::erm deoD::kan, Patente Japonesa Não-examinada No. 2004-242610) pelo método de Fouet e Sonenshein (J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844) foi usado para transformar células competentes da cepas 168 Marburg deB. subtilis preparada pelo método de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol.Biol., 1971, 56, 209-221), e colônias cultivadas em uma placa de ágar LBcontendo 5 μg/ml de canamicina foram obtidas. Colônias que não se tornaramresistentes a espectinomicina nem resistentes a eritromicina foramselecionadas a partir das colônias obtidas, e uma cepa entre estas foidesignada KMBS5 (deoD::kan).

Um DNA genômico preparado a partir de KMBS5 pelométodo de Fouet e Sonenshein (J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844) foi usadopara transformar células competentes da cepa KMBS310 preparada pelométodo de Dubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), ecolônias cultivadas em uma placa de ágar LB contendo 5 μg/ml decanamicina e 20 μg/ml de guanina foram obtidas. Diversas colônias foramselecionadas a partir das colônias obtidas como descrito acima, e um dostransformantes para o qual pode ser confirmado que deoD::kan substituiu ogene deoD tipo selvagem, e todas as mutações derivadas de KMBS310 nãoforam substituídas pelas seqüências tipo selvagem foi designado KMBS321.

Exemplo 2

<Construção de cepa bacteriana deficiente em gene fbp codificando frutosebifosfatase, cultura e avaliação desta>

(1) Preparação de cepa deficiente de gene fbp

Uma cepa deficiente no gene de frutose bifosfatase (fbp) foiconstruída a partir da cepa recombinante KMBS321 mencionada acima comodescrito abaixo. A cepa KMBS321, que é derivada de Bacillus subtilis (cepas168 Marburg de Β. subtilis, ATCC 6051), é deficiente no gene de repressor deoperon de purina (purR), gene de succinil-AMP sintase (purA) e gene denucleosídeo de purina fosforilase {pupG), e tem gene de IMP desidrogenase(guaB) atenuado, caracterizado pelo fato de que região promotora de operonde purina e seqüência SD do gene de PRPP sintetase (prs) é modificada.

(i) Amplificação de região antes de fbp por PCR

Iniciadores de PCR 28-mer e 50-mer tendo as seguintesseqüências de nucleotídeos foram preparados baseados na informação de umbanco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 eV01277).

TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA (SEQ ID NO: 17)cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA (SEQ IDNO: 18, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem àregião antes de promotor do gene de resistência a cloranfenicol (cat) clonadoem pC 194)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o DNA cromossômico da cepas 168 Marburg de B.subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter um20 fragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 5' de genefòp e cerca de 1350 bp antes de região.

(ii) Amplificação de região depois de ft>p por PCR

Iniciadores de PCR 50-mer e 27-mer tendo as seguintesseqüências de nucleotídeos foram preparados baseados na informação de umbanco de dados de genes (Nos. de Acesso de GenBank NC_000964 eV01277).

acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG (SEQ ID NO: 19, os nucleotídeos indicados com letras minúsculascorrespondem a uma região posterior de gene estrutural do gene de resistênciaa cloranfenicol (cai) clonado em pC194)TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA (SEQ ID NO: 20)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o DNA cromossômico da cepas 168 Marburg de B.subtilis como um modelo e os iniciadores mencionados acima para obter umfragmento de amplificação contendo uma região de extremidade 3' de genefbp e cerca de 1770 bp depois de região.

(iii) Amplificação de gene cat por PCR

Iniciadores de PCR 50-mer tendo as seguintes seqüências denucleotídeos foram preparados baseados na informação de um banco de dadosde genes (Nos. de Acesso de GenBank VO1277 e NC_000964).

tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG (SEQ IDNO: 21, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem àseqüência de região de extremidade 5' do gene fbp, e eles foram designadoscomo sendo complementares à região de extremidade 3' de SEQ ID NO: 18)cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT (SEQ IDNO: 22, os nucleotídeos indicados com letras minúsculas correspondem àseqüência de região de extremidade 3' do gene fbp, e eles foram designadoscomo sendo complementares à região de extremidade 3' de SEQ ID NO: 19)

PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por1,5 minutos, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)foi realizado usando o plasmídeo pC194 carregando o gene de resistência acloranfenicol (cat) como um modelo e os iniciadores mencionados acima paraobter um fragmento de amplificação de cerca de 980 bp contendo o gene cat.

(iv) Amplificação de fragmento compreendendo região de fbp inserida comgene cat por PCR recombinante

Os fragmentos de DNA amplificados em (i) a (iii) descritosacima foram purificados usando Coluna MicroSpin S-400 (AmershamPharmacia Biotech), e então uma mistura destes em quantidades apropriadasfoi usada como um modelo junto com as seqüências de SEQ ED NOS: 17 e 20para realizar PCR (98°C por 10 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por4,5 minuto, 30 ciclos, Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer) ecom isso obter um fragmento compreendendo a região de fbp inserida com ogene cat.

(v) Preparação de cepa produtora de inosina com fbp rompido

O fragmento de DNA compreendendo a região de fbp na qualo gene cat (fbp::caí) obtido em(iv) foi inserido foi sujeito a eletroforese emgel de agarose, e o fragmento alvo foi extraído do gel. O fragmento de DNApurificado como descrito acima foi usado para transformar célulascompetentes da cepa KMBS321 de B. subtilis preparada pelo método deDubnau e Davidoff-Abelson (J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221), e colôniascultivadas em uma placa de ágar LB contendo 2,5 μg/ml de cloranfenicol e 20μg/ml de guanina foram obtidas. DNAs cromossômicos foram preparados apartir destas colônias, cepas nas quais região de fbp em um cromossomo foisubstituída pela região de fbp cuja seqüência interna foi substituída pelo genede resistência a cloranfenicol (fbp::caí) por dupla recombinação foramidentificadas pelo método de PCR descrito em (iv), e uma destas cepas foidesignada TABS133.

(2) Produção de nucleosídeo de purina por cepa produtora de inosinadeficiente em gene fbp.

A cepa TABS133 deficiente em gene fbp e uma cepa decontrole KMBS321 foram cada uniformemente aplicadas em uma placa demeio LB contendo 20 mg/l de guanina, e cultivadas durante a noite a 34°C.As células correspondendo a 1/8 da placa foram inoculadas em 20 ml de meiode fermentação contido em um frasco Sakaguchi com volume de 500-ml,então 50 g/l de carbonato de cálcio foi adicionado ao meio, e as células foramcultivadas a 34°C com agitação. Setenta e duas horas depois do início dacultura, o meio foi amostrado, e quantidades de inosina e hipoxantina contidasno meio foram medidas por métodos conhecidos. A quantidade de inosinaacumulada observada com a cepa TABS133 deficiente de gene ftψ foi maiordo que aquela observada com a cepa KMBS321 como uma cepa de controle.

[Composição de meio de fermentação]

Glicose 30 g/lKH2PO4 1 g/lNH4Cl 32 g/lMameno (T-N)* 1,35 g/lDL-Metionina 0,4 g/lL-Triptofano 0,02 g/lAdenina 0,1 g/lGuanosina 0,075 g/l MgSO4 0,4 g/lFeSO4 0,01 g/lMnSO4 0,01 g/lAdecanol (antiespuma) 0,5 ml/l

(ajustado para pH 7,0 com KOH)Carbonato de Cálcio 50 g/l

*: Hidrolisado de proteína de soja

Tabela 1

<table>table see original document page 37</column></row><table>

[Explicação de Listagem de Seqüências]

SEQ ID NO: 1: Seqüência de nucleotídeos de gene fl>p

SEQ ID NO: 2: Seqüência de aminoácidos de frutose bifosfatase

SEQ ID NO: 3: Seqüência de nucleotídeos de geneprs

SEQ ID NO: 4: Seqüência de aminoácidos de fosforribosil pirofosfatosintetase

SEQ ID NO: 5: Seqüência de nucleotídeos de gene purRSEQ ID NO: 6: Seqüência de aminoácidos de repressor de purinaSEQ ED NO: 7: Seqüência de nucleotídeos de gene deoDSEQ ID NO: 8: Seqüência de aminoácidos de produto de gene deoD(nucleosídeo de purina fosforilase)SEQ ID NO: 9: Seqüência de nucleotídeos de genepupGSEQ ED NO: 10: Seqüência de aminoácidos de produto de gene pupG(nucleosídeo de purina fosforilase)

SEQ ID NO 11: Seqüência de nucleotídeos de gene purA SEQ ID NO 12: Seqüência de aminoácidos de succinil-AMP sintase SEQ ID NO 13: Seqüência de nucleotídeos de gene guaB SEQ ID NO 14: Seqüência de aminoácidos de EMP desidrogenase SEQ ID NO 15: Iniciador para amplificação de gene purR SEQ ID NO 16: Iniciador para amplificação de gene purR SEQ ID NO 17: Iniciador para amplificação de região antes de gene ftψ SEQ ID NO 18: Iniciador para amplificação de região antes de gene fbp SEQ ID NO 19: Iniciador para amplificação de região depois de gene fbp SEQ ID NO 20: Iniciador para amplificação de região depois de gene ftψ SEQ ID NO 21: Iniciador para amplificação de gene cat SEQ ID NO 22: Iniciador para amplificação de gene cat

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Usando a bactéria Bacillus da presente invenção, eficiência deprodução de um nucleosídeo de purina e/ou um nucleotídeo de purina podeser melhorada.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Ajinomoto Co., Inc.

<120> Bactéria capaz de produzir substância de purina e processo para

produção de substância de purina.<130> C756-C7063<150> JP2006-119315<151> 2006-04-24<160> 22

<170> PatentIn version 3.3<210> 1<211> 2013<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2013)

<400> 1

atg ttt aaa aat aat gtc ata ctt tta aat tca cct tat cat gca cat 48

Met Phe Lys Asn Asn Val Ile Leu Leu Asn Ser Pro Tyr His Ala His1 5 10 15

gct cat aaa gag ggg ttt att cta aaa agg gga tgg acg gtt ttg gaa 96

Ala His Lys Glu Gly Phe Ile Leu Lys Arg Gly Trp Thr Val Leu Glu

20 25 30

age aag tac cta gat cta ctc gca caa aaa tac gat tgt gaa gaa aaa 144

Ser Lys Tyr Leu Asp Leu Leu Ala Gln Lys Tyr Asp Cys Glu Glu Lys

35 40 45

gtg gta aca gaa ate ate aat ttg aaa gcg ata ttg aac ctg cca aaa 192

Val Val Thr Glu Ile Ile Asn Leu Lys Ala Ile Leu Asn Leu Pro Lys

50 55 60

ggc acc gag cat ttt gtc agt gat ctg cac gga gag tat cag gca ttc 240

Gly Thr Glu His Phe Val Ser Asp Leu His Gly Glu Tyr Gln Ala Phe65 70 75 80

cag cac gtg ttg cgc aat ggt tca gga cga gtc aaa gag aag ata cgc 288

Gln His Val Leu Arg Asn Gly Ser Gly Arg Val Lys Glu Lys Ile Arg

85 90 95

gac ate ttc age ggt gtc att tac gat aga gaa att gat gaa tta gca 336

Asp Ile Phe Ser Gly Val Ile Tyr Asp Arg Glu Ile Asp Glu Leu Ala

100 105 110

gca ttg gtc tat tat ccg gaa gac aaa ctg aaa tta ate aaa cat gac 384

Ala Leu Val Tyr Tyr Pro Glu Asp Lys Leu Lys Leu Ile Lys His Asp

115 120 125

ttt gat gcg aaa gaa gcg tta aac gag tgg tat aaa gaa acg att cat 432Phe Asp Ala Lys Glu Ala130

cga atg att aag ctc gttArg Met Ile Lys Leu Val145 150

aaa tta cgc aaa gca ctgLys Leu Arg Lys Ala Leu165

ctg tta tac aaa aca gaaLeu Leu Tyr Lys Thr Glu180

gaa ate att gat cag ateGlu Ile Ile Asp Gln Ile195

acc ggc ctt gct tac ageThr Gly Leu Ala Tyr Ser210

gtg gtc ggc gat att tatVal Val Gly Asp Ile Tyr225 230

gaa gaa ctg ate aac tatGlu Glu Leu Ile Asn Tyr245

gat gtc ctt tgg ate ggcAsp Val Leu Trp Ile Gly260

aat att ate cgc ate tgtAsn Ile Ile Arg Ile Cys275

gac gtg tac ggc ate aacAsp Val Tyr Gly Ile Asn290

tat tat gat gat aat ccaTyr Tyr Asp Asp Asn Pro305 310

cca gag gat gag att aagPro Glu Asp Glu Ile Lys325

atg ate caa ttc aag cttMet Ile Gln Phe Lys Leu340

ttt aat atg gaa gag cgg

Leu Asn Glu Trp Tyr Lys135 140

tca tat tgc tcc tet aagSer Tyr Cys Ser Ser Lys155

cct gcc caa ttt gct tatPro Ala Gln Phe Ala Tyr170

caa gct ggc aac aag gagGln Ala Gly Asn Lys Glu185

att gaa ctt ggc caa gccIle Glu Leu Gly Gln Ala200

gtt cag cga ttg gtg gtcVal Gln Arg Leu Val Val215 220

gac cgc ggc ccg cag ccgAsp Arg Gly Pro Gln Pro235

cat tet gtc gat att cagHis Ser Val Asp Ile Gln250

gcc tat tcc ggt tcc aaaAla Tyr Ser Gly Ser Lys265

gcc cgc tac gac aac ctgAla Arg Tyr Asp Asn Leu280

ctg aga ccg ctg ctg aacLeu Arg Pro Leu Leu Asn295 300

gcg ttc cgt cca aaa gcaAla Phe Arg Pro Lys Ala315

caa ate aca aaa ate catGln Ile Thr Lys Ile His330

gag age ccg att ate aagGlu Ser Pro Ile Ile Lys345

ctg tta tta gag aaa ata

Glu Thr Ile His

tat acc cgc tcc 480

Tyr Thr Arg Ser160

att acg gag gag 528

Ile Thr Glu Glu175

caa tat tac tcc 576

Gln Tyr Tyr Ser190

gat aag ctg ate 624

Asp Lys Leu Ile

205

gac cat ctg cat 672

Asp His Leu His

gat aga att atg 720

Asp Arg Ile Met240

tgg gga aat cac 768

Trp Gly Asn His255

gtg tgc ctg gcc 816

Val Cys Leu Ala270

gat att att gag 864

Asp Ile Ile Glu

285

ctg gcc gaa aaa 912

Leu Ala Glu Lys

gac gaa aac agg 960

Asp Glu Asn Arg320

caa gcg att gcc 1008

Gln Ala Ile Ala335

aga cgg ccg aac 1056

Arg Arg Pro Asn350

gac tat gac aaa 1104Phe Asn Met Glu Glu Arg355

aat gaa ate acg ctg aacAsn Glu Ile Thr Leu Asn370

ttt gcg acg att aat ccgPhe Ala Thr Ile Asn Pro385 390

gea gaa gtc ata gac aagAla Glu Val Ile Asp Lys405

ctg ggc cgc cat atg aatLeu Gly Arg His Met Asn420

aaa tat aac ggc aac ctgLys Tyr Asn Gly Asn Leu435

aac ggc aat atg gaa acgAsn Gly Asn Met Glu Thr450

cgt gag ctg ctc gat gtaArg Glu Leu Leu Asp Val465 470

cac ccg gaa gaa acc gatHis Pro Glu Glu Thr Asp485

tgg aca ggc gaa tac tccTrp Thr Gly Glu Tyr Ser500

ttt gag cgc tat ttc atePhe Glu Arg Tyr Phe Ile515

aac ccg tat tat tat ttaAsn Pro Tyr Tyr Tyr Leu530

ctg gea gaa ttc ggc ctcLeu Ala Glu Phe Gly Leu545 550

cat aca cct gta aaa gaaHis Thr Pro Val Lys Glu565

gga aaa atg ate gtc ate

Leu Leu Leu Glu Lys Ile360

gga aaa aca tat caa ctgGly Lys Thr Tyr Gln Leu375 380

gag cag cca gat cag ctaGlu Gln Pro Asp Gln Leu395

ctg cta ttc tet gtc cagLeu Leu Phe Ser Val Gln410

ttt atg atg aaa aaa ggcPhe Met Met Lys Lys Gly425

ttg att cac ggc tgt attLeu Ile His Gly Cys Ile440

atg atg att gag gat aaaMet Met Ile Glu Asp Lys455 460

ttt gaa cga ttc ttg cggPhe Glu Arg Phe Leu Arg475

gac ctg gcg aca gat atgAsp Leu Ala Thr Asp Met490

tcc ctc ttc gga aaa cgcSer Leu Phe Gly Lys Arg505

aaa gag aag gaa acg catLys Glu Lys Glu Thr His520

cga gaa gac gag gea accArg Glu Asp Glu Ala Thr535 540

aat cca gat cac ggc catAsn Pro Asp His Gly His555

ate gaa gga gaa gac ccaIle Glu Gly Glu Asp Pro570

gac ggc ggc ttc tcc aaa

Asp Tyr Asp Lys365

gaa aac acc tgc1152

Glu Asn Thr Cys

tta gaa gaa gaa 1200

Leu Glu Glu Glu400

cat tcc gaa aag 1248

His Ser Glu Lys415

age ctt tat tta 1296

Ser Leu Tyr Leu430

cca gtt gat gaa 1344

Pro Val Asp Glu

445

ccg tat gcg ggc 1392

Pro Tyr Ala Gly

gaa gcc ttt gcc 1440

Glu Ala Phe Ala480

gct tgg tat tta 1488

Ala Trp Tyr Leu495

gcc atg acg aca 1536

Ala Met Thr Thr510

aaa gag aag aaa 1584

Lys Glu Lys Lys

525

tgc cga aac ate 1632

Cys Arg Asn Ile

ate ate aac ggc 1680

Ile Ile Asn Gly560

ate aaa gea aac 1728

Ile Lys Ala Asn575

gcc tac caa tcc 1776Gly Lys Met Ile Val Ile Asp Gly Gly Phe Ser Lys Ala Tyr Gln Ser

580 585 590

aca aca ggc ate gcc ggc tac acg ctg cta tac aac tcc tac ggc atg 1824

Thr Thr Gly Ile Ala Gly Tyr Thr Leu Leu Tyr Asn Ser Tyr Gly Met

595 600 605

cag ctc gtc gcc cat aaa cac ttc aat tcc aag gea gaa gtc cta age 1872

Gln Leu Val Ala His Lys His Phe Asn Ser Lys Ala Glu Val Leu Ser

610 615 620

acc gga acc gac gtc tta acg gtc aaa cg a tta gtg gac aaa gag ctt 1920

Thr Gly Thr Asp Val Leu Thr Val Lys Arg Leu Val Asp Lys Glu Leu625 630 635 640

gag cgg aag aaa gtg aag gaa acg aat gtg ggt gag gaa ttg ttg cag 1968

Glu Arg Lys Lys Val Lys Glu Thr Asn Val Gly Glu Glu Leu Leu Gln

645 650 655

gaa gtt gcg att tta gag agt ttg cgg gag tat cgg tat atg aag 2013

Glu Val Ala Ile Leu Glu Ser Leu Arg Glu Tyr Arg Tyr Met Lys660 665 670

<210> 2<211> 671<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<400> 2

Met Phe Lys Asn Asn Val Ile Leu Leu Asn Ser Pro Tyr His Ala His1 5 10 15

Ala His Lys Glu Gly Phe Ile Leu Lys Arg Gly Trp Thr Val Leu Glu

20 25 30

Ser Lys Tyr Leu Asp Leu Leu Ala Gln Lys Tyr Asp Cys Glu Glu Lys

35 40 45

Val Val Thr Glu Ile Ile Asn Leu Lys Ala Ile Leu Asn Leu Pro Lys

50 55 60

Gly Thr Glu His Phe Val Ser Asp Leu His Gly Glu Tyr Gln Ala Phe65 70 75 80

Gln His Val Leu Arg Asn Gly Ser Gly Arg Val Lys Glu Lys Ile Arg

85 90 95

Asp Ile Phe Ser Gly Val Ile Tyr Asp Arg Glu Ile Asp Glu Leu Ala

100 105 110

Ala Leu Val Tyr Tyr Pro Glu Asp Lys Leu Lys Leu Ile Lys His Asp

115 120 125

Phe Asp Ala Lys Glu Ala Leu Asn Glu Trp Tyr Lys Glu Thr Ile His

130 135 140

Arg Met Ile Lys Leu Val Ser Tyr Cys Ser Ser Lys Tyr Thr Arg Ser145 150 155 160Lys Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ala Gln Phe Ala Tyr Ile Thr Glu Glu

165 170 175

Leu Leu Tyr Lys Thr Glu Gln Ala Gly Asn Lys Glu Gln Tyr Tyr Ser

180 185 190

Glu Ile Ile Asp Gln Ile Ile Glu Leu Gly Gln Ala Asp Lys Leu Ile

195 200 205

Thr Gly Leu Ala Tyr Ser Val Gln Arg Leu Val Val Asp His Leu His

210 215 220

Val Val Gly Asp Ile Tyr Asp Arg Gly Pro Gln Pro Asp Arg Ile Met225 230 235 240

Glu Glu Leu Ile Asn Tyr His Ser Val Asp Ile Gln Trp Gly Asn His

245 250 255

Asp Val Leu Trp Ile Gly Ala Tyr Ser Gly Ser Lys Val Cys Leu Ala

260 265 270

Asn Ile Ile Arg Ile Cys Ala Arg Tyr Asp Asn Leu Asp Ile Ile Glu

275 280 285

Asp Val Tyr Gly Ile Asn Leu Arg Pro Leu Leu Asn Leu Ala Glu Lys

290 295 300

Tyr Tyr Asp Asp Asn Pro Ala Phe Arg Pro Lys Ala Asp Glu Asn Arg305 310 315 320

Pro Glu Asp Glu Ile Lys Gln Ile Thr Lys Ile His Gln Ala Ile Ala

325 330 335

Met Ile Gln Phe Lys Leu Glu Ser Pro Ile Ile Lys Arg Arg Pro Asn

340 345 350

Phe Asn Met Glu Glu Arg Leu Leu Leu Glu Lys Ile Asp Tyr Asp Lys

355 360 365

Asn Glu Ile Thr Leu Asn Gly Lys Thr Tyr Gln Leu Glu Asn Thr Cys

370 375 380

Phe Ala Thr Ile Asn Pro Glu Gln Pro Asp Gln Leu Leu Glu Glu Glu

385 390 395 400

Ala Glu Val Ile Asp Lys Leu Leu Phe Ser Val Gln His Ser Glu Lys

405 410 415

Leu Gly Arg His Met Asn Phe Met Met Lys Lys Gly Ser Leu Tyr Leu

420 425 430

Lys Tyr Asn Gly Asn Leu Leu Ile His Gly Cys Ile Pro Val Asp Glu

435 440 445

Asn Gly Asn Met Glu Thr Met Met Ile Glu Asp Lys Pro Tyr Ala Gly

450 455 460

Arg Glu Leu Leu Asp Val Phe Glu Arg Phe Leu Arg Glu Ala Phe Ala465 470 475 480

His Pro Glu Glu Thr Asp Asp Leu Ala Thr Asp Met Ala Trp Tyr Leu485 490 495Trp Thr Gly Glu Tyr Ser Ser Leu Phe Gly Lys Arg Ala Met Thr Thr

500 505 510

Phe Glu Arg Tyr Phe Ile Lys Glu Lys Glu Thr His Lys Glu Lys Lys

515 520 525

Asn Pro Tyr Tyr Tyr Leu Arg Glu Asp Glu Ala Thr Cys Arg Asn Ile

530 535 540

Leu Ala Glu Phe Gly Leu Asn Pro Asp His Gly His Ile Ile Asn Gly545 550 555 560

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565 570 575

Gly Lys Met Ile Val Ile Asp Gly Gly Phe Ser Lys Ala Tyr Gln Ser

580 585 590

Thr Thr Gly Ile Ala Gly Tyr Thr Leu Leu Tyr Asn Ser Tyr Gly Met

595 600 605

Gln Leu Val Ala His Lys His Phe Asn Ser Lys Ala Glu Val Leu Ser

610 615 620

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Glu Arg Lys Lys Val Lys Glu Thr Asn Val Gly Glu Glu Leu Leu Gln

645 650 655

Glu Val Ala Ile Leu Glu Ser Leu Arg Glu Tyr Arg Tyr Met Lys660 665 670

<210> 3<211> 954<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(954)

<400> 3

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20 25 30

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35 40 45

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125

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205

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290 295 300

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<210> 4<211> 317<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<400> 4

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe

130 135 140

Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly Glu Tyr145 150 155 160

Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His

165 170 175

Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro

180 185 190

Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val

195 200 205

Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp

210 215 220

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260 265 270

Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu

275 280 285

Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile

290 295 300

Arg Val His Glu Gln Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser

305 310 315

<210> 5<211> 858<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(858)

<400> 5

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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245 250 255

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260 265 270

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<210> 6<211> 285<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<400> 6

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20 25 30

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35 40 45

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn

245 250 255

Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe

260 265 270

Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser275 280 285

<210> 7<211> 702<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (702)

<400> 7

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85 90 95

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100 105 110

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

Glu Val Ala Leu His Ser Val Ser Gln225 230

<210> 9<211> 816<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(816)

<400> 9

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205

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<213> Bacillus subtilis<400> 10

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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Asp Leu Ser Ser Leu Ala Glu Lys Ile Ala Lys Asp Leu Asn Ile Pro

165 170 175

Ile Gln Lys Gly Val Tyr Thr Ala Val Thr Gly Pro Ser Tyr Glu Thr

180 185 190

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195 200 205

Met Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala Asn His Ala Gly Met Arg

210 215 220

Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn Ala Ala Ala Gly Ile Leu Asp225 230 235 240Gln Pro Leu Ser His Asp Glu Val Met Glu Val Thr Glu Lys Val Lys

245 250 255

Ala Gly Phe Leu Lys Leu Val Lys Ala Ile Val Ala Gln Tyr Glu260 265 270

<210> 11<211> 1293<212> DNA

<213> Bacillus subtilis<2.2 0><221> CDS<222> (1)..(1293)<4 00> 11

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100 105 110

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115 120 125

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att cgc ate gcg gat ctg tta gac cgt gac gcg ttt gcg gaa aag ctt 480

Ile Arg Ile Ala Asp Leu Leu Asp Arg Asp Ala Phe Ala Glu Lys Leu145 150 155 160gag cgc aat ctt gaa gaa aaa aac cgt ctt ctc gag aaa atg tac gag 528

Glu Arg Asn Leu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Leu Glu Lys Met Tyr Glu

165 170 175

aca gaa ggg ttt aaa ctt gag gat ate tta gac gaa tat tat gag tac 576

Thr Glu Gly Phe Lys Leu Glu Asp Ile Leu Asp Glu Tyr Tyr Glu Tyr

180 185 190

gga cag cag att aaa aag tat gtt tgc gat aca tet gtt gtc tta aac 624

Gly Gln Gln Ile Lys Lys Tyr Val Cys Asp Thr Ser Val Val Leu Asn

195 200 205

gat gct ctt gat gaa ggg cgc cgt gta tta ttt gaa ggc gea caa ggg 672

Asp Ala Leu Asp Glu Gly Arg Arg Val Leu Phe Glu Gly Ala Gln Gly

210 215 220

gtt atg ctc gat ate gac caa gga aca tac ccg ttt gtt acg tca tet 720

Val Met Leu Asp Ile Asp Gln Gly Thr Tyr Pro Phe Val Thr Ser Ser

225 230 235 240

aac ccg gtt gcc ggc ggt gtc acg ate ggt tet ggt gtc ggc ccg acc 768

Asn Pro Val Ala Gly Gly Val Thr Ile Gly Ser Gly Val Gly Pro Thr

245 250 255

aaa ate aag cac gtt gtc ggt gta tca aaa gea tat acg act cgt gtc 816

Lys Ile Lys His Val Val Gly Val Ser Lys Ala Tyr Thr Thr Arg Val

260 265 270

ggc gac ggt cct ttt ccg act gag ctg aaa gat gaa ate ggc gat caa 864

Gly Asp Gly Pro Phe Pro Thr Glu Leu Lys Asp Glu Ile Gly Asp Gln

275 280 285

ate cgt gaa gtc gga cgc gaa tat gga aca aca aca ggc cgc ccg cgc 912

Ile Arg Glu Val Gly Arg Glu Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Arg Pro Arg

290 295 300

cgt gtc ggc tgg ttt gac age gtt gtt gtc cgc cac gcc cgc cgt gtg 960

Arg Val Gly Trp Phe Asp Ser Val Val Val Arg His Ala Arg Arg Val

305 310 315 320

age gga att aca gat ctt tet ctg aac tca att gac gtc cta gea gga 1008

Ser Gly Ile Thr Asp Leu Ser Leu Asn Ser Ile Asp Val Leu Ala Gly

325 330 335

att gaa acg ttg aaa ate tgt gtg gcg tac cgc tac aaa ggc gaa ate 1056

Ile Glu Thr Leu Lys Ile Cys Val Ala Tyr Arg Tyr Lys Gly Glu Ile

340 345 350

att gaa gaa ttc cca gea agt ctt aag gea ctt gct gaa tgt gag ccg 1104

Ile Glu Glu Phe Pro Ala Ser Leu Lys Ala Leu Ala Glu Cys Glu Pro

355 360 365

gta tat gaa gaa atg ccg ggc tgg act gag gat att aca ggt gcg aag 1152

Val Tyr Glu Glu Met Pro Gly Trp Thr Glu Asp Ile Thr Gly Ala Lys

370 375 380age ttg age gag ctt ccg gaa aat gcg cgc cat tat ctt gag cgt gtg 1200

Ser Leu Ser Glu Leu Pro Glu Asn Ala Arg His Tyr Leu Glu Arg Val

385 390 395 400

tet cag ctg aca ggc att ccg ctt tet att ttc tet gtc ggt cca gac 1248

Ser Gln Leu Thr Gly Ile Pro Leu Ser Ile Phe Ser Val Gly Pro Asp

405 410 415cgc tca caa aca aat gtc ctt cgc agt gtg tac cgt gcg aac taa 1293

Arg Ser Gln Thr Asn Val Leu Arg Ser Val Tyr Arg Ala Asn420 425 .......... 430.

<210> 12<211> 430<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<4 00> 12

Met Ser Ser Val Val Val Val Gly Thr Gln Trp Gly Asp Glu Gly Lys15 10 15

Gly Lys Ile Thr Asp Phe Leu Ser Glu Asn Ala Glu Val Ile Ala Arg

20 25 30

Tyr Gln Gly Gly Asn Asn Ala Gly His Thr Ile Lys Phe Asp Gly Ile

35 40 45

Thr Tyr Lys Leu His Leu Ile Pro Ser Gly Ile Phe Tyr Lys Asp Lys

50 55 60

Thr Cys Val Ile Gly Asn Gly Met Val Val Asp Pro Lys Ala Leu Val65 70 75 80

Thr Glu Leu Ala Tyr Leu His Glu Arg Asn Val Ser Thr Asp Asn Leu

85 90 95

Arg Ile Ser Asn Arg Ala His Val Ile Leu Pro Tyr His Leu Lys Leu

100 105 110

Asp Glu Val Glu Glu Glu Arg Lys Gly Ala Asn Lys Ile Gly Thr Thr

115 120 125

Lys Lys Gly Ile Gly Pro Ala Tyr Met Asp Lys Ala Ala Arg Ile Gly

130 135 140

Ile Arg Ile Ala Asp Leu Leu Asp Arg Asp Ala Phe Ala Glu Lys Leu145 150 155 160

Glu Arg Asn Leu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Leu Glu Lys Met Tyr Glu

165 170 175

Thr Glu Gly Phe Lys Leu Glu Asp Ile Leu Asp Glu Tyr Tyr Glu Tyr

180 185 190

Gly Gln Gln Ile Lys Lys Tyr Val Cys Asp Thr Ser Val Val Leu Asn

195 200 205

Asp Ala Leu Asp Glu Gly Arg Arg Val Leu Phe Glu Gly Ala Gln Gly210 215 220Val Met Leu Asp Ile Asp Gln Gly Thr Tyr Pro Phe Val Thr Ser Ser225 230 235 240

Asn Pro Val Ala Gly Gly Val Thr Ile Gly Ser Gly Val Gly Pro Thr

245 250 255

Lys Ile Lys His Val Val Gly Val Ser Lys Ala Tyr Thr Thr Arg Val

260 265 270

Gly Asp Gly Pro Phe Pro Thr Glu Leu Lys Asp Glu Ile Gly Asp Gln

275 280 285

Ile Arg Glu Val Gly Arg Glu Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Arg Pro Arg-

290 295 300

Arg Val Gly Trp Phe Asp Ser Val Val Val Arg His Ala Arg Arg Val305 310 315 320

Ser Gly Ile Thr Asp Leu Ser Leu Asn Ser Ile Asp Val Leu Ala Gly

325 330 335

Ile Glu Thr Leu Lys Ile Cys Val Ala Tyr Arg Tyr Lys Gly Glu Ile

340 345 350

Ile Glu Glu Phe Pro Ala Ser Leu Lys Ala Leu Ala Glu Cys Glu Pro

355 360 365

Val Tyr Glu Glu Met Pro Gly Trp Thr Glu Asp Ile Thr Gly Ala Lys

370 375 380

Ser Leu Ser Glu Leu Pro Glu Asn Ala Arg His Tyr Leu Glu Arg Val385 390 395 400

Ser Gln Leu Thr Gly Ile Pro Leu Ser Ile Phe Ser Val Gly Pro Asp

405 410 415

Arg Ser Gln Thr Asn Val Leu Arg Ser Val Tyr Arg Ala Asn420 425 430

<210> 13<211> 1542<212> DNA

<213> Bacillus subtilis<220><221> CDS<222> (1) .. (1542)<4 00> 13

atg tgg gaa agt aaa ttt tca aaa gaa ggc tta acg ttc gac gat gtgMet Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val15 10 15

ctg ctt gtg cca gca aag tct gag gta ctt ccg cat gat gtg gat ttaLeu Leu Val Pro Ala Lys Ser Glu Val Leu Pro His Asp Val Asp Leu

20 25 30

tct gta gaa ctt aca aaa acg tta aag cta aat att cct gtc ate ageSer Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser35

gca ggt atg gacAla Gly Met Asp50

aga cag ggc ggcArg Gln Gly Gly65

cag gct gaa caaGln Ala Glu Gln

aca aat ccc ttcThr Asn Pro Phe100

cat ttg atg gggHis Leu Met Gly115

gaa gaa gac cagGlu Glu Asp Gln130

ttt att tct gacPhe Ile Ser Asp145

gag cta gtt actGlu Leu Val Thr

att ttg caa aaaIle Leu Gln Lys180

aat aaa tta aaaAsn Lys Leu Lys195

gag ttc ccg aacGlu Phe Pro Asn210

gcg gca gtt ggtAla Ala Val Gly225

gtt gaa gcc aatVal Glu Ala Asn

tct caa ggc gttSer Gln Gly Val

40

act gta aca gaaThr Val Thr Glu55

ttg ggc ate attLeu Gly Ile Ile70

gtt gat aaa gtaVal Asp Lys Val85

ttt tta act cctPhe Leu Thr Pro

aaa tac aga attLys Tyr Arg Ile120

aag ctt gtt ggaLys Leu Val Gly135

tac tca atg aaaTyr Ser Met Lys150

gca tct gta ggaAla Ser Val Gly165

cat aaa att gaaHis Lys Ile Glu

ggt ctt ate acaGly Leu Ile Thr200

tca tct aaa gacSer Ser Lys Asp215

gta act ggc gatVal Thr Gly Asp230

gtt gat gtg attVal Asp Val Ile245

tta aac aca gttLeu Asn Thr Val

tca gca atg gcaSer Ala Met Ala60

cac aaa aat atgHis Lys Asn Met75

aag cgt tct gagLys Arg Ser Glu90

gat cac caa gtaAsp His Gln Val105

tcc ggt gtt ccgSer Gly Val Pro

att att aca aacIle Ile Thr Asn140

ate age gac gtcIle Ser Asp Val155

act act ctg gatThr Thr Leu Asp170

aag ctt cct ctcLys Leu Pro Leu185

att aaa gac attIle Lys Asp Ile

att cac ggc cgcIle His Gly Arg220

aca atg act cgcThr Met Thr Arg235

gtt ate gat acaVal Ile Asp Thr250

aca aaa ate cgtThr Lys Ile Arg

45

att gca atg gcaIle Ala Met Ala

tcc att gaa cagSer Ile Glu Gln80

cgc ggc gtt ateArg Gly Val Ile95

ttt gat gcg gagPhe Asp Ala Glu110

att gta aat aacIle Val Asn Asn125

cgt gac ctt cgtArg Asp Leu Arg

atg acg aaa gaaMet Thr Lys Glu160

gaa gct gaa aagGlu Ala Glu Lys175

gta gat gac cagVal Asp Asp Gln190

gaa aaa gtc attGlu Lys Val Ile205

ctg ate gtt ggcLeu Ile Val Gly

gtc aaa aag cttVal Lys Lys Leu240

gct cac gga cacAla His Gly His255

gaa acg tat cccGlu Thr Tyr Pro260

gaa tta aac att att gctGlu Leu Asn Ile Ile Ala275

gcg ctt ate gaa gct ggaAla Leu Ile Glu Ala Gly290

ggt tca att tgt act acaGly Ser Ile Cys Thr Thr305 310

att aca gea att tat gatIle Thr Ala Ile Tyr Asp325

aca ate ate gcc gac ggtThr Ile Ile Ala Asp Gly340

gea ttg gea gcc ggc ggaAla Leu Ala Ala Gly Gly355

ggc aca tca gaa age cctGly Thr Ser Glu Ser Pro370

ttt aag gta tac cgc ggcPhe Lys Val Tyr Arg Gly385 390

agt aaa gac cgt tac ttcSer Lys Asp Arg Tyr Phe405

gga att gaa gga cgc acaGly Ile Glu Gly Arg Thr420

tat cag cta gtc gga ggcTyr Gln Leu Val Gly Gly435

aaa gat ctg cgt gcg ctaLys Asp Leu Arg Ala Leu450

ggc gea gga ctt cgc gaaGly Ala Gly Leu Arg Glu465 470

cat cgt aat aag gcg cttHis Arg Asn Lys Ala Leu

265

gga aac gtg gea aca gctGly Asn Val Ala Thr Ala280

gea gac gtt gtc aaa gttAla Asp Val Val Lys Val295 300

cgt gtt gta gcc ggg gtgArg Val Val Ala Gly Val315

tgt gcg act gaa gea agaCys Ala Thr Glu Ala Arg330

ggg att aaa ttc tet ggcGly Ile Lys Phe Ser Gly345

cat gct gtt atg etc ggaHis Ala Val Met Leu Gly360

ggt gaa act gaa ate tacGly Glu Thr Glu Ile Tyr375 380

atg gga tca gtt gct geaMet Gly Ser Val Ala Ala395

caa gaa gaa aac aaa aaaGln Glu Glu Asn Lys Lys410

cct tac aaa ggg cca gttPro Tyr Lys Gly Pro Val425

ctt cgt tet ggt atg gggLeu Arg Ser Gly Met Gly440

aga gaa gaa gct cag ttcArg Glu Glu Ala Gln Phe455 460

age cat ccg cat gac gtaSer His Pro His Asp Val475

cct ggt cta ttt ggt tetPro Gly Leu Phe Gly Ser

270

gaa gcg aca aga 8 64

Glu Ala Thr Arg

285

gga ata ggg cct 912

Gly Ile Gly Pro

ggt gtt ccg caa 960

Gly Val Pro Gln320

aaa cac ggc aaa 1008

Lys His Gly Lys335

gat ate act aaa 1056

Asp Ile Thr Lys350

age ttg ctt gea 1104

Ser Leu Leu Ala

365

caa ggc aga aga 1152

Gln Gly Arg Arg

atg gaa aaa gga 1200

Met Glu Lys Gly400

ttt gtt cct gaa 1248

Phe Val Pro Glu415

gaa gaa acc gtt 1296

Glu Glu Thr Val430

tat tgc ggg tcc 1344

Tyr Cys Gly Ser

445

att cgc atg act 1392

Ile Arg Met Thr

cag att aca gtg 1440

Gln Ile Thr Val480

cat cag aaa aaa 1488

His Gln Lys Lys485 490 495

aca gga ttt gtg tat gat gaa tgt tgt caa tcc ggc ttt ttt tca tcg 1536

Thr Gly Phe Val Tyr Asp Glu Cys Cys Gln Ser Gly Phe Phe Ser Ser

500 505 510

gat tga 1542

Asp

<210> 14<211> 513<212> PRT

<213> Bacillus subtilis<4 00> 14

Met Trp Glu Ser Lys Phe Ser Lys Glu Gly Leu Thr Phe Asp Asp Val1 5 10 15

Leu Leu Val Pro Ala Lys Ser Glu Val Leu Pro His Asp Val Asp Leu

20 25 30

Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser

35 40 45

Ala Gly Met Asp Thr Val Thr Glu Ser Ala Met Ala Ile Ala Met Ala

50 55 60

Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln65 70 75 80

Gln Ala Glu Gln Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile

85 90 95

Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu

100 105 110

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115 120 125

Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg

130 135 140

Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu145 150 155 160

Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys

165 170 175

Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln

180 185 190

Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile

195 200 205

Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Ile His Gly Arg Leu Ile Val Gly

210 215 220

Ala Ala Val Gly Val Thr Gly Asp Thr Met Thr Arg Val Lys Lys Leu225 230 235 240Val Glu Ala Asn Val Asp Val Ile Val Ile Asp Thr Ala His Gly His

245 250 255

Ser Gln Gly Val Leu Asn Thr Val Thr Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Pro

260 265 270

Glu Leu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Val Ala Thr Ala Glu Ala Thr Arg

275 280 285

Ala Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Val Val Lys Val Gly Ile Gly Pro

290 295 300

Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Giy Val Gly Val Pro Gln305 310 315 320

Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Lys

325 330 335

Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys

340 345 350

Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala

355 360 365

Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg

370 375 380

Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly385 390 395 400

Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu

405 410 415

Gly Ile Glu Gly Arg Thr Pro Tyr Lys Gly Pro Val Glu Glu Thr Val

420 425 430

Tyr Gln Leu Val Gly Gly Leu Arg Ser Gly Met Gly Tyr Cys Gly Ser

435 440 445

Lys Asp Leu Arg Ala Leu Arg Glu Glu Ala Gln Phe Ile Arg Met Thr

450 455 460

Gly Ala Gly Leu Arg Glu Ser His Pro His Asp Val Gln Ile Thr Val465 470 475 480

His Arg Asn Lys Ala Leu Pro Gly Leu Phe Gly Ser His Gln Lys Lys

485 490 495

Thr Gly Phe Val Tyr Asp Glu Cys Cys Gln Ser Gly Phe Phe Ser Ser500 505 510

Asp

<210> 15<211> 17<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciador<4 00> 15gaagttgatg atcaaaa 17

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador<4 00> 16

acatattgtt gacgataat 19

<210> 17<211> 28<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciador<4 00> 17

ttcccttagg gttattttcg tttcaaaa 28

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador<4 00> 18

cgtttgttga actaatgggt gcttttatga gcatgtgcat gataaggtga 50

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador<4 00> 19

acagctccag atccatatcc ttctttttta gagagtttgc gggagtatcg 50

<210> 20<211> 27<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciador<400> 20

taaaggtttt tcgggataag attgaaa 27

<210> 21<211> 50<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> iniciador<400> 21

tcaccttatc atgcacatgc tcataaaagc acccattagt tcaacaaacg

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador<400> 22

cgatactccc gcaaactctc taaaaaagaa ggatatggat ctggagctgt

Claims (16)

1. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus, caracterizada pelofato de que tem uma capacidade de produzir uma substância derivada depurina, em que a bactéria foi modificada de forma que atividade enzimáticade fruto se bifosfatase é diminuída.

2. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comreivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a substância derivada de purinaé um nucleosídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo deinosina, xantosina, guanosina e adenosina.

3. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comreivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a substância derivada de purinaé um nucleotídeo de purina selecionado a partir do grupo consistindo de ácidoinosínico, ácido xantílico, ácido guanílico e ácido adenílico.

4. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que aatividade de frutose bifosfatase é diminuída por ruptura de um genecodificando frutose bifosfatase, ou diminuindo quantidade de expressão dogene codificando frutose bifosfatase.

5. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comreivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o gene codificando frutosebifosfatase é um gene codificando uma proteína das seguintes (A) ou (B):(A) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 1,(B) uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidosde SEQ ID NO: 1 o que inclui substituições, deleções, inserções, adições ouinversões de um ou diversos resíduos de aminoácidos e tem atividade defrutose bifosfatase.

6. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que foi2adicionalmente modificada de forma que atividade de fosforribosil pirofosfatosintetase é aumentada.

7. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que foiadicionalmente modificada de forma que quantidade de expressão do operonde purina é aumentada.

8. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comreivindicação 7, caracterizada pelo fato de que quantidade de expressão dooperon de purina é aumentada por ruptura do gene purR, que é um genecodificando um repressor do operon de purina.

9. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que foiadicionalmente modificada de forma que atividade de fosforilase denucleosídeo de purina é diminuída.

10. Bactéria pertencendo ao gênero Baeillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ter sidoadicionalmente modificada de forma que atividade de IMP desidrogenase édiminuída.

11. Bactéria pertencendo ao gênero Bacillus de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que éBacillus subtilis.

12. Método para produzir uma substância derivada de purina,caracterizado pelo fato de compreender:cultivar a bactéria pertencendo ao gênero Bacillus comodefinida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 em um meio para causaracúmulo de uma substância derivada de purina em células da bactéria ou nomeio, ecoletar a substância derivada de purina das células ou meio.

13. Método de acordo com reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purinaou um nucleotídeo de purina.

14. Método de acordo com reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleosídeo de purinaselecionado a partir do grupo consistindo de inosina, xantosina, guanosina eadenosina.

15. Método de acordo com reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a substância derivada de purina é um nucleotídeo de purinaselecionado a partir do grupo consistindo de ácido inosínico, ácido xantílico,ácido guanílico e ácido adenílico.

16. Método para produzir um nucleotídeo de purina,caracterizado pelo fato de compreender:produzir um nucleosídeo de purina pelo método como definidona reivindicação 14,reagir o nucleosídeo de purina com um doador de fosfatoselecionado a partir do grupo consistindo de ácido polifosfórico, fenil fosfatoe carbamil fosfato, e um microorganismo tendo uma capacidade de produzirum éster de 5'-ácido fosfórico de nucleosídeo ou fosfatase ácida para produzirum nucleotídeo de purina, ecoletar o nucleotídeo de purina.