BR102014019139A2 - bactéria, e, métodos para produzir uma substância de purina, e um nucleosídeo de purina - Google Patents

Abstract

bactéria, e, métodos para produzir uma substância de purina, e um nucleosídeo de purina um método para produzir uma substância de purina é fornecido. uma substância de purina é produzida pelo cultivo de uma bactéria escherichia, bactéria bacillus, ou corynebacterium ammoniagenes que têm uma capacidade de produzir a substância de purina e foi modificada de modo a abrigar um gene yggb mutante em um meio e coletar a substância de purina do meio.

Description

“BACTÉRIA, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA SUBSTÂNCIA DE PURINA, E UM NUCLEOSÍDEO DE PURINA” Campo Técnico [0001] A presente invenção refere-se a um método para produzir uma substância de purina pela fermentação usando uma bactéria. As substâncias de purina são industrialmente úteis como ingredientes ou matérias primas de temperos, medicamentos e assim por diante. Técnica Fundamental [0002] As substâncias de purina tais como nucleosídeos de purina e os nucleotídeos de purina são de modo usual industrialmente produzidas pela fermentação usando uma cepa auxotrófica em adenina. Para uma tal cepa, a resistência a um medicamento tal como análogos de purina e sulfaguanidina pode ser ainda conferida. Como cepas usadas para a produção de nucleosídeos de purina pela fermentação, são conhecidas, por exemplo, cepas que pertencem ao gênero Bacillus (Documentos de patente 1 a 8), cepas que pertencem ao gênero Brevibacterium (Corynebacterium) (Documentos de patente 9 e 10, Documento que não de patente 1) e cepas que pertencem ao gênero Escherichia (Documento de patente 11). [0003] As cepas mutantes tais como cepas auxotróficas e cepas resistentes a medicamento tipicamente podem ser obtidas pela indução de mutação com irradiação de UV ou tratamento com N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG) e seleção de um cepa mutante tendo um fenótipo desejado usando um meio de seleção apropriado. [0004] As cepas que produzem nucleosídeo de purina também são reproduzidas pelo uso de técnicas de engenharia genética. Por exemplo, para bactérias Bacillus (Documentos de patente 12 a 21), bactérias Brevibacterium (Corynebacterium) (Documento de patente 22) e bactérias Escherichia (Documento de patente 11), as capacidades de produzir nucleosídeo de purina são conferidas ou intensificadas pelas técnicas de engenharia genética.

Especificamente, as capacidades de produzir nucleosídeo de purina podem ser conferidas ou intensificadas, por exemplo, pelo a intensificação da atividade intracelular de uma enzima envolvida na biossíntese de um nucleosídeo de purina, ou redução da atividade de uma enzima que catalisa uma reação que ramifica o caminho biossintético de um nucleosídeo de purina para gerar um outro composto (Documento de patente 11). [0005] O gene YggB da bactéria corineforme é um homólogo do gene YggB da Escherichia coli (Documentos que não de patente 2 e 3) e codifica um canal mecanossensível (Documentos que não de patente 4 e 5). É conhecido que, na bactéria corineforme, a capacidade de produzir ácido glutâmico é melhorada pelo aumento da expressão do gene YggB ou pela fabricação de uma bactéria que abriga um gene YggB mutante tendo uma mutação específica (Documento de patente 23). [0006] Entretanto, a relação do gene YggB e a produção das substâncias de purina tais como nucleosídeos de purina e os nucleotídeos de purina não são conhecidas.

Referências da técnica anterior Documentos de patente [0007] Documento de patente 1: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 38-23039 (1963) [0008] Documento de patente 2: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 54-17033 (1979) [0009] Documento de patente 3: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 55-2956 (1980) [00010] Documento de patente 4: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 55-45199 (1980) [00011] Documento de patente 5: Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 56-162998 (1981) [00012] Documento de patente 6: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 57-14160 (1982) [00013] Documento de patente 7: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 57-41915 (1982) [00014] Documento de patente 8: Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 59-42895 (1984) [00015] Documento de patente 9: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 51-5075 (1976) [00016] Documento de patente 10: Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 58-17592 (1972) [00017] Documento de patente 11: Publicação de Patente Internacional WO 99/03988 [00018] Documento de patente 12: Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 58-158197 (1983) [00019] Documento de patente 13: Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 58-175493 (1983) [00020] Documento de patente 14: Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 59-28470 (1984) [00021] Documento de patente 15: Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 60-156388 (1985) [00022] Documento de patente 16: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada (KOKAI) No. 1-27477 (1989) [00023] Documento de patente 17: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada (KOKAI) No. 1-174385 (1989) [00024] Documento de patente 18: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada (KOKAI) No. 3-58787 (1991) [00025] Documento de patente 19: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada (KOKAI) No. 3-164185 (1991) [00026] Documento de patente 20: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada (KOKAI) No. 5-84067 (1993) [00027] Documento de patente 21: Publicação de Patente Japonesa Não Examinada (KOKAI) No. 5-192164 (1993) [00028] Documento de patente 22: Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 63-248394 (1988) [00029] Documento de patente 23: Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2007-097573 Documentos que não de patente [00030] Documento que não de patente 1: Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978) [00031] Documento que não de patente 2: FEMS Microbiol. Lett., 2003 Jan 28;218(2):305-9 [00032] Documento que não de patente 3: Mol. Microbiol., 2004 Oct; 54(2):420-38 [00033] Documento que não de patente 4: EMBO J., 1999, 18(7):1730-7 [00034] Documento que não de patente 5: Biosci. BiotechnoL Biochem., 74(12), 2546-2549, 2010 Sumário da Invenção Objetivo a ser Alcançado pela Invenção [00035] Um objetivo da presente invenção é desenvolver uma nova técnica para melhorar a capacidade de produzir a substância de purina a partir de bactérias e deste modo fornecer um método eficiente para produzir uma substância de purina.

Meios para Alcançar o Objetivo [00036] O inventor da presente invenção conduziu várias pesquisas de modo a alcançar o objetivo anteriormente mencionado, como um resultado, descobriu que pela modificação de uma bactéria de modo que a bactéria abrigasse um gene YggB mutante tendo uma mutação específica, a capacidade de produzir a substância de purina da bactéria seria melhorada e assim realizou a presente invenção. [00037] Isto é, a presente invenção pode ser expressada, por exemplo, como segue. [1] Uma bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância de purina, que é uma bactéria Escherichia, uma bactéria Bacillus, ou Corynebacterium ammoniagenes, e que foi modificada de modo a abrigar um gene YggB mutante, em que o gene YggB mutante é um gene YggB tendo uma mutação que melhore a capacidade de produzir a substância de purina a partir da bactéria. [2] A bactéria como mencionada acima, em que a mutação é selecionada a partir do grupo que consiste das mutações do (1) a (3) que seguem: (1) uma mutação na região que codifica os resíduos de aminoácido nas posições 419 a 533 de uma proteína YggB do tipo selvagem, (2) uma mutação na região que codifica uma região de transmembrana de uma proteína YggB do tipo selvagem, e (3) uma combinação das mutações de (1) e (2). [3] A bactéria como mencionada acima, em que a mutação (1) é a inserção de uma sequência de nucleotídeo na região que codifica os resíduos de aminoácido nas posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem. [4] A bactéria como mencionada acima, em que a mutação (1) é uma mutação para substituir um resíduo de prolina presente na região das posições 419a533 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido. [5] A bactéria como mencionada acima, em que a região de transmembrana é selecionada dos resíduos de aminoácido das posições 1 a 23, 25 a 47, 62 a 84, 86 a 108 e 110 a 132 da proteína YggB do tipo selvagem. [6] A bactéria como mencionada acima, em que a mutação (2) não inclui mutação de mudança de matriz ou mutação de sem sentido. [7] A bactéria como mencionada acima, em que a mutação (2) é selecionada dos grupo que consiste das mutações dos (2a) a (2d) que seguem: (2a) uma mutação para inserir um ou vários resíduos de aminoácido entre o resíduo de leucina na posição 14 e o resíduo de triptofano na posição 15 da proteína YggB do tipo selvagem, (2b) uma mutação para substituir o resíduo de alanina na posição 100 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido, (2c) uma mutação para substituir o resíduo de alanina na posição 111 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido, e (2d) uma combinação das mutações de (2a) a (2c). [8] A bactéria como mencionada acima, em que Cys-Ser-Leu é inserido entre o resíduo de leucina na posição 14 e o resíduo de triptofano na posição 15. [9] A bactéria como mencionada acima, em que o resíduo de alanina na posição 100 e/ou na posição 111 é substituída com um resíduo de treonina. [10] A bactéria como mencionada acima, em que a proteína YggB do tipo selvagem é uma proteína definida no (A) ou (B) que seguem: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, 11, 13, ou 15, (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, 11, 13, ou 15 que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e funcionando como um canal mecanossensível. [11] A bactéria como mencionada acima, que foi modificada de modo que a atividade de uma enzima envolvida na biossíntese de uma substância de purina seja aumentada. [12] A bactéria como mencionada acima, em que a substância de purina é selecionada do grupo que consiste de inosina, xantosina, guanosina e adenosina. [13] A bactéria como mencionada acima, em que a substância de purina é selecionada do grupo que consiste de ácido inosínico, ácido xantílico e ácido guanílico. [14] A bactéria como mencionada acima, isto é Escherichia coli. [15] A bactéria como mencionada acima, isto é Bacillus subtilis ou Bacillus amyloliquefaciens. [16] A bactéria como mencionada acima, isto é Corynebacterium ammoniagenes. [17] Um método para produzir uma substância de purina, que compreende cultivar a bactéria como mencionada acima em um meio para acumular a substância de purina no meio e coletar a substância de purina do meio. [18] Um método para produzir um nucleosídeo de purina, que compreende cultivar a bactéria como mencionada acima em um meio para acumular o nucleosídeo de purina no meio e coletar o nucleosídeo de purina do meio. [19] Um método para produzir um nucleotídeo de purina, que compreende cultivar a bactéria como mencionada acima em um meio para acumular o nucleotídeo de purina no meio e coletar o nucleotídeo de purina do meio. [20] Um método para produzir um nucleotídeo de purina, que compreende cultivar a bactéria como mencionada acima em um meio para acumular um nucleosídeo de purina no meio, fosforilar o nucleosídeo de purina para gerar o nucleotídeo de purina e coletar o nucleotídeo de purina. [00038] De acordo com a presente invenção, a capacidade de produzir a substância de purina a partir de uma bactéria pode ser melhorada e uma substância de purina pode ser eficientemente produzida.

Modos de Realizar a Invenção [00039] Daqui por diante, a presente invenção será explicada em detalhes. <1> Bactéria da presente invenção [00040] A bactéria da presente invenção é uma bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância de purina que foi modificada de modo que a bactéria abrigue um gene YggB mutante tendo uma “mutação específica”. A “mutação específica” será explicada mais tarde. <1 -1 > Bactéria tendo a capacidade de produzir a substância de purina [00041] Na presente invenção, a “bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância de purina” refere-se a uma bactéria tendo uma capacidade para produzir uma substância de purina objetiva e acumulá-la em um meio a um tal grau que a mesma possa ser coletada, quando a mesma é cultivada no meio. A bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância de purina pode ser uma bactéria que pode acumular uma substância de purina objetiva no meio em uma quantidade maior do que aquela obtenível com uma cepa não modificada. A “cepa não modificada” refere-se a uma cepa de controle que não abriga nenhum gene YggB mutante e pode ser, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa precursora. A bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância de purina pode ser uma bactéria que pode acumular uma substância de purina objetiva em um meio em uma quantidade de, por exemplo, 0,1 mM ou mais, 0,5 mM ou mais, 1 mM ou mais, ou 2 mM ou mais. [00042] Os exemplos da substância de purina include nucleosídeos de purina e os nucleotídeos de purina. Os exemplos do nucleosídeo de purina incluem inosina, guanosina, xantosina e adenosina. Os exemplos dos os nucleotídeos de purina incluem os ésteres do ácido 5’Mosfórico de nucleosídeos de purina. Os exemplos dos ésteres do ácido 5’-fosfórico de nucleosídeos de purina incluem ácido inosínico (inosina-5’-fosfato, IMP), ácido guanílico (guanosina-5’-fosfato, GMP), ácido xantílico (xantosina-5’-fosfato, XMP) e ácido adenílico (55-fosfato de adenosina, AMP). A bactéria da presente invenção pode ter uma capacidade para produzir um tipo da substância de purina, ou pode ter uma capacidade para produzir dois ou mais tipos das substâncias de purina. A bactéria da presente invenção pode ter, por exemplo, uma capacidade para produzir um ou mais tipos de nucleosídeos de purina. A bactéria da presente invenção pode ter, por exemplo, uma capacidade para produzir um ou mais tipos dos nucleotídeos de purina. [00043] A bactéria da presente invenção é uma bactéria Escherichia, uma bactéria Bacillus, ou Corynebacterium ammoniagenes. [00044] A bactéria Escherichia não é particularmente limitada e os seus exemplos incluem aquelas classificadas no gênero Escherichia de acordo com a taxonomia conhecidas por aqueles habilitados no campo da microbiologia. Os exemplos da bactéria Escherichia incluem aqueles descritos no trabalho de Neidhardt et al. (Rackmann B. J., 1996, Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, pp, 2460-2488, Tabela 1, Em F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Segunda Edição, American Society for Microbiology Press, Washington, D. C.). Os exemplos da bactéria Escherichia incluem, por exemplo, Escherichia coli. Os exemplos específicos da Escherichia coli incluem, por exemplo, Escherichia coli W3110 (ATCC 27325) e Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), que são derivados da cepa do tipo selvagem protótipo, Kl2 cepa. [00045] A bactéria Bacillus não é particularmente limitada e os seus exemplos incluem aquelas classificadas no gênero Bacillus de acordo com a taxonomia conhecidas por aqueles habilitados no campo da microbiologia. Os exemplos das bactérias Bacillus incluem, por exemplo, aquelas das espécies que seguem.

Bacillus subtilis Bacillus amyloliquefaciens Bacillus pumilus Bacillus licheniformis Bacillus megaterium Bacillus brevis Bacillus polymyxa Bacillus stearothermophilus [00046] Os exemplos específicos da Bacillus subtilis incluem a cepa 168 Marburg da Bacillus subtilis (ATCC 6051) e cepa PY79 da Bacillus subtilis (Plasmid, 1984, 12, 1-9). Os exemplos específicos da Bacillus amyloliquefaciens incluem a cepa T Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 23842) e cepa N da Bacillus amyloliquefaciens (ATCC 23845). [00047] A Corynebacterium ammoniagenes não é particularmente limitada e os seus exemplos incluem bactérias classificadas em Corynebacterium ammoniagenes de acordo com a taxonomia conhecidas por aqueles habilitados no campo da microbiologia. A Corynebacterium ammoniagenes inclui aquelas bactérias previamente classificadas em Brevibacterium ammoniagenes. Os exemplos específicos da Corynebacterium ammoniagenes incluem, por exemplo, as cepas que seguem. [00048] A Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 [00049] As cepas mutantes avariadas em adenina da Corynebacterium ammoniagenes (Agr. Bio. Chem., Vol. 47 (5), pp, 1035-1041, 1983 (KY13102, KY13171, KY13184)) [00050] Essas cepas estão disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P. O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, números de registro são dados para as respectivas cepas e as cepas podem ser encomendadas pelo uso destes números de registro (reportar-se ao http://www.atcc.org/). Os números de registro das cepas são listados no catálogo da American Type Culture Collection. [00051] A bactéria da presente invenção pode ser uma bactéria inerentemente tendo uma capacidade de produzir a substância de purina, ou pode ser uma bactéria modificada de modo a ter uma capacidade de produzir a substância de purina. Uma bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância de purina pode ser obtida, por exemplo, pela conferência de uma capacidade de produzir a substância de purina para tais bactérias como mencionado acima, ou aumentar a capacidade de produzir a substância de purina de tal bactérias como mencionado acima. [00052] A capacidade de produzir a substância de purina pode ser conferida ou intensificada pelos métodos convencionalmente utilizados na geração das bactérias que produzem substância de purina tais como aquelas das bactérias Bacíllus e bactérias Escherichia. [00053] A capacidade de produzir a substância de purina pode ser conferida ou intensificada, por exemplo, pela conferência de auxotrofia tal como auxotrofia de adenina, ou conferindo ainda a resistência a um medicamento tal como análogos de purina e sulfaguanidina (reportar-se à Publicações da Patente Japonesa (KOKOKU) Nos. 38-23099, 54-17033, 55-45199, 57-14160, 57-41915 e 59-42895 e Pedido de Patente U.S. Publicada No. 20040166575). Uma cepa mutante tendo uma capacidade de produzir a substância de purina, tal como uma cepa auxotrófica e uma cepa resistente ao medicamento, pode ser obtida pela submissão de uma cepa precursora ou cepa do tipo selvagem a um tratamento de mutagênese e seleção de um cepa mutante que mostra um fenótipo desejado usando um meio de seleção apropriado. Os exemplos do tratamento de mutagênese incluem, por exemplo, Irradiação de raio X, irradiação de ultravioleta e tratamento com um agente de mutação tal como N-metÍl-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS) e metanossulfonato de metila (MMS). [00054] A capacidade de produzir a substância de purina também pode ser conferida ou intensificada pelo aumento da atividade intracelular de uma enzima envolvida na biossíntese de uma substância de purina. A atividade de um tipo de enzima pode ser intensificada, ou as atividades de dois ou mais tipos de enzimas podem ser intensificadas. Os métodos para aumentar uma atividade enzimática serão explicados mais tarde. Uma atividade enzimática pode ser intensificada, por exemplo, pela modificação de uma bactéria de modo que a expressão de um gene que codifica a enzima seja intensificada. Os métodos para aumentar a expressão de gene são descritos na WO 00/18935, EP 1010755 A e assim por diante, [00055] Os nucleotídeos de purina biossintetizados por intermédio do pirofosfato de fosforribosila (PRPP) como um intermediário. Os nucleosídeos de purina biossintetizados pela desfosforilação dos nucleotídeos de purina. Os exemplos de enzimas envolvidas na biossíntese destas substâncias de purina incluem, por exemplo, PRPP sintetase (prs) e as proteínas codificadas pelo operon de purina. A abreviação do gene que codifica a enzima é mencionada nos parênteses (o mesmo deve se aplicar às descrições que seguem). Entretanto, o nome do gene (abreviação do nome do gene) é um exemplo e o nome do gene pode diferir dependendo das espécies de organismo, ou pode haver uma espécie que não tenha um gene correspondente. [00056] Os exemplos do operon da purina incluem, por exemplo, o operon purEKBCSQLFMNHD de Bacillus subtilis (Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor Chefe: A. L. Sonenshein, ASM Press, Washington D. C., 2002) e o regulonpur de Escherichia coli (.Escherichia and Salmonella, Segunda Edição, Editor Chefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C., 1996). Por exemplo, a expressão do operon de purina inteiro pode ser intensificada, ou a expressão de um ou mais genes selecionados dos genes contidos no operon de purina pode ser intensificado. [00057] Entre estes, por exemplo, a atividade ou atividades de um ou mais tipos de enzimas selecionados de PRPP sintetase (prs) e PRPP amidotransferase (purF) são preferivelmente intensificadas. [00058] Quando uma enzima envolvida na biossíntese de uma substância de purina é negativamente regulada pela inibição da retroalimentação, repressão da expressão, ou os seus semelhantes, por exemplo, a atividade enzimática pode ser intensificada pela redução ou eliminação da regulagem e a capacidade de produzir a substância de purina pode ser deste modo melhorada (WO 99/003988). [00059] A expressão do operon da purina é suprimida pelo repressor da purina codificado pelo gene purR. Portanto, a expressão do operon da purina pode ser intensificada, por exemplo, pela redução da atividade do repressor da purina (Patente U.S. No. 6.284.495). A atividade do repressor da purina pode ser reduzida, por exemplo, pelo rompimento do gene purR que codifica o repressor da purina (Patente U.S. No. 6.284.495). Além disso, a expressão do operon da purina é suprimida pela sequência de terminador-antiterminador (também é chamada de sequência atenuadora) localizada a jusante do promotor (Ebbole, D. J. e Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287; Ebbole, D. J. e Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894-10902; Ebbole, D. J. e Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141). Portanto, a expressão do operon da purina pode ser intensificada, por exemplo, pela deleção da sequência atenuadora. A deleção da sequência atenuadora pode ser atenuada pelo mesmo método como aquele usado para o rompimento de um gene explicado mais tarde. [00060] A PRPP sintetase sofre da inibição da retroalimentação pela ADP. Portanto, por exemplo, a atividade da PRPP sintetase pode ser intensificada pela fabricação de uma bactéria que abriga um gene mutante da PRPP sintetase que codifica uma PRPP sintetase do tipo dessensibilizada para a qual a inibição da retroalimentação pela ADP é reduzida ou eliminada e a capacidade de produzir a substância de purina pode ser deste modo melhorada (WO 99/003988). Os exemplos da PRPP sintetase do tipo dessensibilizada incluem uma PRPP sintetase tendo uma mutação para substituir Asp (D) da posição 128 de uma PRPP sintetase do tipo selvagem com Ala (A) (S. G. Bower et al., J. Biol. Chem., 264, 10287 (1989)). [00061] A PRPP amidotransferase sofre da inibição da retroalimentação pela AMP e GMP. Portanto, por exemplo, a atividade da PRPP amidotransferase pode ser intensificada pela fabricação de uma bactéria que abriga um gene mutante de PRPP amidotransferase que codifica uma PRPP amidotransferase do tipo dessensibilizado para a qual a inibição da retroalimentação pela AMP e/ou GMP é reduzida ou eliminada e a capacidade de produzir a substância de purína pode ser deste modo melhorada (WO 99/003988). Os exemplos da PRPP amidotransferase do tipo dessensibilizado incluem uma PRPP amidotransferase tendo uma mutação para substituir Lys (K) da posição 326 de uma PRPP amidotransferase do tipo selvagem com Gin (Q) e uma PRPP amidotransferase tendo uma mutação para substituir Lys (K) da posição 326 de uma PRPP amidotransferase do tipo selvagem com Gin (Q) e substituindo Pro (P) da posição 410 de uma PRPP amidotransferase do tipo selvagem com Trp (W) (G. Zhou et al., J. Biol. Chem., 269, 6784 (1994)). [00062] Além disso, uma capacidade de produzir a substância de purina podem ser conferidas ou intensificadas pela redução da atividade de uma enzima que catalisa uma reação que ramifica o caminho biossintético de uma substância de purina para gerar um outro composto (WO 99/003988). A atividade de um tipo de enzima pode ser reduzida, ou as atividades de dois ou mais tipos de enzimas podem ser reduzidas. A “enzima que catalisa uma reação que ramifica o caminho biossintético de uma substância de purina para gerar um outro composto” aqui aludida inclui uma enzima envolvida em decomposição de uma substância de purina. Os métodos para produzir uma atividade enzimática será explicada mais tarde. [00063] Os exemplos da enzima que catalisa uma reação que ramifica o caminho biossintético de uma substância de purina para gerar um outro composto incluem, por exemplo, purina nucleosídeo fosforilase (deoD, pupG), succinil-AMP sintase (purA), adenosina desaminase (add), inosina-guanosina cinase) (gsk), GMP reductase (giiaC), 6-fosfogliconato desidrase 0edd), fosfoglicose isomerase (pgi), adenina desaminase (yicP), xantosina fosforilase (xapA) e IMP desidrogenase (guaB). A enzima da qual a atividade deva ser reduzida pode ser escolhida de acordo com o tipo da substância de purina alvo e assim por diante. [00064] Uma capacidade de produzir a substância de purina também pode ser conferida ou intensificada pela redução da atividade da frutose bisfosfatase (frutose 1,6-bisfosfatase) (Jbp) (WO 2007/125782). [00065] Uma capacidade de produzir a substância de purina também pode ser conferida ou intensificada pela redução da atividade de uma proteína envolvida na incorporação de uma substância de purina (WO 99/003988). Os exemplos de uma tal proteína envolvida na incorporação de uma substância de purina incluem, por exemplo, nucleosídeo permease (nupG) (WO 99/003988). [00066] Uma capacidade de produzir a substância de purina também pode ser conferida ou intensificada pelo aumento da atividade de uma proteína envolvida na secreção de uma substância de purina. Os exemplos de uma tal proteína envolvida na secreção de uma substância de purina incluem, por exemplo, proteínas codificadas pelo gene rhtA (ybiF) (Patente Russa No. 2239656), gene yijE (Patente Russa No. 2244003), gene ydeD (Patente Russa No. 2244004), gene yicM (Patente Russa No. 2271391), gene ydhL (Patente Japonesa aberta ao Público (KOHYO) No. 2007-530011) e gene nepl (FEMS Microbiology Letters, Volume 250, Edição 1, páginas 39-47, setembro de 2005). [00067] Além disso, a capacidade de produzir o ácido inosínico pode ser conferida ou intensificada pela conferência da resistência a uma análogo de L-glutamina e resistência a um análogo de prolina a uma bactéria (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2004-516833). Os exemplos do análogo de L-glutamina incluem azasserina e 6-diazo-5-oxo-L-norleucina (DON). Os exemplos do análogo de prolina incluem 3,4-desidroprolina, ácido L-azetidina-2-carboxílico, ácido L-tiazolidina-4-carboxílico, ácido (S)-2,2-dimetil-4-oxazolidecarboxílico, ácido (S)-5,5-dimetil-4-tiazolidocarboxílico, ácido (4S,2RS)-2-etil-4-tiazolidino-carboxílico, ácido (2S,4S)-4-hidróxi-2- pirrolinocarboxílico, ácido 2-piperidinocarboxílico e 2,5-pirrolidinodiona. [00068] Além disso, a capacidade de produzir o ácido xantílico pode ser conferida ou intensificada pelos métodos usados para a geração das bactérias que produzem o ácido xantílico da bactéria corineforme, da qual um exemplo típico é Corynebacterium ammoniagenes. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, aumentar a atividade da PRPP amidotransferase (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 8-168383), que confere resistência a um aminoácido alifático (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 4-262790) e que confere resistência à desidroprolina (Patente Sul Coreana Aberta ao Público No. 2003-56490). [00069] Tais métodos para conferir ou aumentar a capacidade de produzir a substância de purina como mencionado acima podem ser usados independentemente, ou usados como uma combinação arbitrária deles. [00070] Os exemplos específicos da cepa que produz nucleosídeo que pertencem ao gênero Escherichia incluem, por exemplo, a cepa FADRaddedd/pKFpurFKQ da Escherichia coli (WO 99/003988). Esta cepa é um cepa obtida da cepa W3110 da Escherichia coli pelo rompimento do gene purF que codifica PRPP amidotransferase, o gene purR que codifica o repressor da purina, o gene deoD que codifica purina nucleosídeo fosforilase, o gene purA que codifica succinil-AMP sintase, o gene add que codifica adenosina desaminase e o gene edd que codifica 6-fosfogliconato desidrase e introduzindo o plasmídeo pKFpurFKQ que carrega o gene purFKQ que codifica uma PRPP amidotransferase do tipo dessensibilizado (K326Q), para a qual a inibição da retroalimentação pela GMP é reduzida (WO 99/003988). [00071] Os exemplos específicos das cepas que produzem inosina que pertencem ao gênero Bacillus incluem, por exemplo, as cepas que seguem. cepa KMBS16 da Bacillus subtilis (Pedido de Patente publicado U.S. No. 20040166575 cepa KMBS16-1 da Bacillus subtilis (Patente Russa No. 2239656) cepa KMBS310 da Bacülus subtilis (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2007-117078) cepa TABS133 da Bacülus subtilis (WO 2007/125782) cepa AJ12707 da Bacillus subtilis (FERM P-12951, Pedido de Patente Japonesa No. 61-13876) cepa AJ3772 da Bacillus subtilis (FERM P-2555, Pedido de Patente Japonesa No. 62-014794) cepa NA-6011 da Bacillus subtilis (FERM PARES DE BASE- 291, Patente U.S. No. 4.701.413) cepa NA-6012 da Bacillus subtilis (FERM PARES DE BASE- 292, Patente U.S. No. 4,701,413) cepa G1136 A da Bacillus subtilis (cepa AJ1991 da Bacillus amiloliquefaciens) (VKPM B-8994, Patente U.S. No. 3.575.809) cepa Gottheila 3218 da Bacillus pumilus (ATCC 21005, Patente U.S. No. 3.616.206) cepa NA-1102 da Bacillus pumilus (FERM PARES DE BASE-289) cepa AS 115-7 da Bacillus amiloliquefaciens (VKPM B-6134, Patente Russa No. 2003678) [00072] A cepa KMBS16 é uma cepa obtida da cepa trpC2 da Bacillus subtilis pelo rompimento do gene purA que codifica succinil-AMP sintase, o gene purR que codifica o repressor da purina e o gene deoD que codifica purina nucleosídeo fosforilase (purA::erm, purR::spc, deoD::kan, Pedido de Patente Publicado U.S. No. 20040166575). A cepa KMBS16-1 é uma cepa obtida da cepa KMBS16 pela substituição da mutação purA::erm com a mutação purAucat. A cepa KMBS310 é uma cepa obtida da cepa 168 Marburg da Bacillus subtilis (ATCC 6051) pelo rompimento do gene purA que codifica a succinil-AMP sintase, o gene purR que codifica o repressor da purina e o gene pupG que codifica a purina nucleosídeo fosforilase, reduzindo a atividade IMP desidrogenase (,guaB) e modificando a região promotora do operon da purina e a sequência SD do gene da PRPP sintetase (prs). [00073] Os exemplos específicos das cepas que produzem guanosina que pertencem ao gênero Bacillus incluem, por exemplo, a bactéria Bacillus da qual a atividade da IMP desidrogenase é intensificada (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 3-58787) e a bactéria Bacillus obtida pela introdução de um vetor que carrega um gene de resistência análogo à purina ou um gene de resistência à decoi-inina dentro de uma cepa mutante auxotrófica em adenina (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 4-28357). [00074] Além disso, os exemplos de bactérias tendo a capacidade de produzir nucleotídeo de purina incluem as bactérias que seguem. Os exemplos das bactérias que produzem ácido inosínico incluem, por exemplo, Corynebacterium ammoniagenes CJIP009 (KCCM-10226, Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2004-516833) e a cepa que produz inosina da Bacillus subtilis da qual a atividade da fosfatase é reduzida (Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805; Fujimoto, M., Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259). Os exemplos das bactérias que produzem ácido guanílico incluem, por exemplo, a bactéria Bacillus que produz o ácido guanílico que mostra auxotrofia em adenina e tendo resistência à decoi-inina ou sulfóxido de metionina (Publicação da Patente Japonesa (KOKOKU) No. 56-12438). [00075] Os genes anteriormente mencionados usados para a geração de bactérias que produzem substância de purina não são limitados aos genes exemplificados acima e aos genes tendo uma sequência de nucleosídeo conhecida, mas podem ser variantes dos mesmos, contanto que as funções das proteínas codificadas não sejam degradadas. Por exemplo, o gene usado para a geração de uma bactéria que produz substância de purina pode ser um gene que codifica uma proteína tendo uma sequência de aminoácido de uma proteína conhecida que inclui substituição, deleção, inserção ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições. Para as variantes de genes e proteínas, as descrições a cerca das variantes do gene YggB e da proteína YggB mencionados mais tarde podem ser aplicadas mutatis mutandis. <\-2> Métodos para aumentar a atividade de proteína [00076] Daqui por diante, os métodos para aumentar a atividade de uma proteína serão explicados. [00077] A expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” significa que a atividade da proteína por célula é aumentada comparada com aquela de uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem e cepa precursora. A expressão que “a atividade de uma proteína é aumentada” também é expressada como “a atividade de uma proteína é intensificada”. Especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” significa que o número de moléculas da proteína por célula é aumentado, e/ou a função de cada molécula da proteína é aumentada comparados com aqueles de uma cepa não modificada. Isto é, o termo “atividade” na expressão “a atividade de uma proteína é aumentada” não é limitada a atividade catalítica da proteína, mas pode significar a quantidade de transcrição de um gene (a quantidade de mRNA) que codifica a proteína, ou a quantidade de tradução do gene (a quantidade da proteína). Embora o grau do aumento na atividade de uma proteína não é particularmente limitada contanto que a atividade da proteína seja aumentada comparada com uma cepa não modificada, a atividade da proteína pode ser aumentada, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, comparada com aquela de uma cepa não modificada. Além disso, a expressão que “a atividade de uma proteína é aumentada” inclui não apenas uma menção de que a atividade de uma proteína objetiva é aumentada em uma cepa inerentemente tendo a atividade da proteína objetiva, mas também uma menção de que a atividade de uma proteína objetiva é conferida a uma cepa não inerentemente tendo a atividade da proteína objetiva. Além disso, contanto que a atividade da proteína seja eventualmente aumentada, a atividade da proteína objetiva inerentemente contida em um hospedeiro pode ser reduzida e depois um tipo apropriado da proteína pode ser introduzido neste ponto. [00078] A modificação que aumenta a atividade de uma proteína é obtida, por exemplo, pelo aumento da expressão de um gene que codifica a proteína. A expressão que “a expressão de um gene é aumentada” também é aludida como “a expressão de um gene é intensificada”. A expressão de um gene pode ser aumentada 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, comparada com aquela observada em uma cepa não modificada. Além disso, a expressão que “a expressão de um gene é aumentada” inclui não apenas uma menção de que a quantidade de expressão de um gene alvo é aumentada em uma cepa que inerentemente expresses o gene alvo, mas também uma menção de que o gene é introduzido em uma cepa que inerentemente não expressa o gene alvo e expressada neste ponto. Isto é, a frase “a expressão de um gene é aumentada” também significa, por exemplo, que o gene alvo é introduzido em uma cepa que não tem o gene e expressada neste ponto. [00079] A expressão de um gene pode ser aumentada, por exemplo, pelo aumento do número de cópia do gene. [00080] O número de cópia de um gene pode ser aumentado pela introdução gene dentro do cromossoma de uma bactéria hospedeira. Um gene pode ser introduzido dentro de um cromossoma, por exemplo, pelo uso de recombinação homóloga (Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory). Apenas uma cópia, ou duas ou mais cópias de um gene podem ser introduzidas. Por exemplo, pela realização de recombinação homóloga usando uma sequência que está presente em muitas cópias em um cromossoma como um alvo, muitas cópias de um.gene podem ser introduzidas dentro do cromossoma. Os exemplos de uma tal sequência que está presente em muitas cópias em um cromossoma incluem DNAs repetitivos e repetições invertidas localizadas em ambas as extremidades de um transposon. Alternativamente, a recombinação homóloga pode ser realizada pelo uso de uma sequência apropriada em um cromossoma tal como um gene desnecessário para a produção da substância de purina como um alvo. A recombinação homóloga pode ser realizada, por exemplo, por um método de uso de um DNA linear tal como integração dirigida por Red (Datsenko, K. A. e Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97:6640-6645 (2000)), um método de uso de um plasmídeo que inclui uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de uso de um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método de uso de um vetor suicida que não inclui uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro, ou um método de transdução usando um fago. Além disso, um gene também pode ser aleatoriamente introduzido dentro de um cromossoma pelo uso de um transposon ou Mini-Mu (Patente Japonesa aberta ao Público (Kokai) No. 2-109985, Patente U.S. No. 5.882.888, EP 805867 Bl). [00081] A introdução de um gene alvo dentro de um cromossoma pode ser confirmada pela hibridização de Southern usando uma sonda tendo uma sequência complementar ao gene inteiro ou uma parte do mesmo, PCR usando iniciadores preparados com base na sequência do gene, ou os seus semelhantes. [00082] Além disso, o número de cópia de um gene alvo também pode ser aumentado pela introdução de um vetor que inclui o gene dentro de uma bactéria hospedeira. Por exemplo, o número de cópia de um gene alvo pode ser aumentado pela ligação de um fragmento de DNA que inclui o gene alvo com um vetor que funciona em uma bactéria hospedeira para construir um vetor de expressão do gene e transformar o hospedeiro com o vetor de expressão. O fragmento de DNA que inclui o gene alvo pode ser obtido, por exemplo, pela PCR usando o DNA genômico de uma bactéria tendo o gene alvo como o padrão. Como o vetor, um vetor autonomamente replicável na célula do hospedeiro pode ser usado. O vetor é preferivelmente um vetor de cópia múltipla. Além disso, o vetor preferivelmente tem um marcador tal como um gene de resistência a antibiótico para a seleção de transformante. Além disso, o vetor pode ter um promotor e/ou terminador para expressar o gene introduzido. O vetor pode ser, por exemplo, um vetor derivado de um plasmídeo bacteriano, um vetor derivado de um plasmídeo de levedura, um vetor derivado de um bacteriófago, cosmídeo, fagomídeo, ou os seus semelhantes. Os exemplos específicos do vetor autonomamente replicável em bactérias Escherichia tais como Escherichia coli incluem, por exemplo, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184, pBR322, pSTV29 (todos estes estão disponíveis da Takara Bio), pMW219 (NIPPON GENE), pTrc99A (Pharmacia), vetores da série pPROK (Clontech), pKK233-2 (Clontech), vetores da série pET (Novagen), vetores da série pQE (QIAGEN) e vetor de faixa de hospedeiro ampla RSF1010. Os exemplos específicos do vetor autonomamente replicável em bactérias Bacillus tais como Bacillus subtilis incluem, por exemplo, pUBllO, pC194 e pE194. Os exemplos específicos do vetor autonomamente replicável na bactéria corineforme tal como Corynebacterium ammoniagenes incluem, por exemplo, pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); pAM330 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)); os plasmídeos obtidos pela melhora dos vetores precedentes e que incluem um gene de resistência a medicamento; o plasmídeo pCRY30 descrito na Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 3-210184; os plasmídeos pCRY21, pCRY2KE, pCRY2KX, pCRY31, pCRY3KE e pCRY3KX descritos na Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2-72876 e Patente U.S. No. 5.185.262; os plasmídeos pCRY2 e pCRY3 descritos na Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 1- 191686; pAJ655, pAJ611 e pAJ1844 descritos na Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 58-192900; pCGl descrito na Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 57-134500; pCG2 descrito na Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 58-35197; e pCG4 e pCGll descritos na Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 57-183799. [00083] Quando um gene é introduzido, é suficiente que o gene seja expressivamente abrigado pela bactéria da presente invenção. Especificamente, é suficiente que o gene seja introduzido de modo que o mesmo seja expressado sob controle de uma sequência promotora que funciona na bactéria da presente invenção. O promotor pode ser um promotor derivado do hospedeiro, ou um promotor heterogêneo. O promotor pode ser o promotor nativo do gene a ser introduzido, ou um promotor de um outro gene. Como o promotor, por exemplo, um tal promotor mais forte como mencionados mais tarde também pode ser usado. Além disso, por exemplo, um terminador para a terminação da transcrição do gene estar localizado a jusante do gene. O terminador não é particularmente limitado contanto que ele funcione na bactéria da presente invenção. O terminador pode ser um terminador derivado do hospedeiro, ou um terminador heterogêneo. O terminador pode ser o terminador nativo do gene a ser introduzido, ou um terminador de um outro gene. Os exemplos específicos do terminador incluem, por exemplo, terminador T7, terminador T4, terminador de fago fd, terminador tet e terminador trpA. Os vetores, promotores e terminadores disponíveis em vários microrganismos são divulgados em detalhes na “Fundamental Microbiology Vol. 8, Genetic Engineering, KYORITSU SHUPPAN CO., LTD, 1987” e estes podem ser usados. [00084] Além disso, quando dois ou mais dos genes são introduzidos, é suficiente que cada um dos genes sejam expressivamente abrigados pela bactéria da presente invenção. Por exemplo, todos os genes podem ser realizados por um único vetor de expressão ou um cromossoma. Além disso, os genes podem ser separadamente realizados por dois ou mais vetores de expressão, ou separadamente realizados por um único ou dois ou mais vetores de expressão e um cromossoma. Um operon constituído por dois ou mais genes também pode ser introduzido. [00085] O gene a ser introduzido não é particularmente limitado contanto que o mesmo codifique uma proteína que funcione no hospedeiro. O gene a ser introduzido pode ser um gene derivado do hospedeiro, ou pode ser um gene heterogêneo. O gene a ser introduzido pode ser obtido, por exemplo, pela PCR usando iniciadores designados com base na sequência de nucleotídeo do gene e o DNA genômico de um organismo tendo o gene ou um plasmídeo que carrega o gene como um padrão. O gene a ser introduzido também pode ser totalmente sintetizado, por exemplo, com base na sequência de nucleotídeo do gene. [00086] Além disso, a expressão de um gene pode ser aumentada pela melhora da eficiência da transcrição do gene. A eficiência da transcrição de um gene pode ser melhorada, por exemplo, pela substituição do promotor do gene em um cromossoma com um promotor mais forte. O “promotor mais forte” significa um promotor que fornece uma transcrição melhorada de um gene comparado com um promotor do tipo selvagem inerentemente existente do gene. Os exemplos dos promotores mais fortes incluem, por exemplo, os promotores de alta expressão conhecidos tais como promotor T7, promotor trp, promotor lac, promotor tac, promotor thr, promotor trc, promotor tet, promotor araBAD, promotor rpoH, promotor PR e promotor PL. Além disso, quando Corynebacterium ammoniagenes é usada, podem ser usados promotores tais como o promotor P54-6 artificialmente planejado (Appl. Microbiol. Biotechnolo., 53, 674-679 (2000)), promotores pta, aceA, aceB, adh e amyE indutíveis na bactéria corineforme com ácido acético, etanol, ácido pirúvico, ou os seus semelhantes, promotores cspB, SOD e tuf, que são promotores potentes que fornecem uma quantidade grande de expressão na bactéria corineforme (Journal of Biotechnology, 104 (2003) 311-323; Appl. Environ. Microbiol., Dez de 2005; 71 (12):8587-96). Além disso, como o promotor mais forte, um tipo altamente ativo de um promotor existente também pode ser obtido pelo uso de vários genes repórter. Por exemplo, pela fabricação as regiões -35 e -10 em uma região promotora mais próxima da sequência de consenso, a atividade do promotor pode ser intensificada (WO 00/18935). Os exemplos do promotor do tipo altamente ativo incluem vários promotores com tac (Katashkina JI et al., Pedido de Patente da Federação Russa No. 2006134574) e promotor pnlp8 (WO 2010/027045). Os métodos para avaliar a força dos promotores e os exemplos dos promotores fortes são descritos no documento de Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) e assim por diante. [00087] Além disso, a expressão de um gene também pode ser aumentada pela melhora pela eficiência da tradução do gene. A eficiência da tradução de um gene pode ser melhorada, por exemplo, pela substituição da sequência da Shina-Dargamo (SD) (também aludida como sítio de ligação de ribossoma (RBS)) para o gene em um cromossoma com uma sequência de SD mais forte. A “sequência de SD mais forte” significa uma sequência de SD que fornece uma tradução melhorada de mRNA comparada com a sequência de SD do tipo selvagem inerentemente existente do gene. Os exemplos das sequências de SD mais fortes incluem, por exemplo, RBS do gene 10 derivada do fago T7 (Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235). Além disso, é conhecido que a substituição, inserção, ou deleção de vários nucleotídeos em uma região espaçadora entre RBS e o códon de partida, especialmente em uma sequência imediatamente a montante do códon de partida (5’-UTR), significantemente afeta a estabilidade e a eficiência da tradução de mRNA e consequentemente, a eficiência da tradução de um gene também pode ser melhorada pela modificação da mesma. [00088] Na presente invenção, os sítios que afetam a expressão de gene, tais como um promotor, sequência de SD e região espaçadora entre RBS e o códon de partida, também são coletivamente chamados de “região de controle de expressão”. Uma região de controle de expressão pode ser identificada pelo uso de um software de análise de vetor ou gene de pesquisa de promotor tal como GENETYX. Uma tal região de controle de expressão pode ser modificada, por exemplo, por um método de uso de um vetor sensível a temperatura ou o método de integração dirigido por Red (WO 2005/010175). [00089] A eficiência da tradução de um gene também pode ser melhorada, por exemplo, pela modificação de códons. Na Escherichia coli etc., uma tendência de códon evidente existe ente os 61 códons de aminoácido encontrados dentro da população de moléculas de mRNA e o nível de tRNA cognato aparece diretamente proporcional à frequência do uso de códon (Kane, J. F., Curr. Opin. BiotechnoL, 6 (5), 494-500 (1995)). Isto é, se existe um quantidade grande de mRNA que contém uma quantidade em excesso de códons raros, um problema de tradução pode surgir. De acordo com as pesquisas recentes, é sugerido que grupos de códons AGG/AGA, CUA, AUA, CGA, ou CCC podem especialmente reduzir tanto a quantidade quanto a qualidade de uma proteína sintetizada. Um tal problema ocorre especialmente no tempo de expressão de um gene heterólogo. Portanto, no caso da expressão heterogênea de um gene ou os seus semelhantes, a eficiência da tradução do gene pode ser melhorada pela substituição de um códon raro presente no gene com um códon equivalente mais frequentemente usado. Os códons podem ser substituídos, por exemplo, pelo método da mutação específico de sítio para introduzir uma mutação objetiva dentro de um sítio objetivo de DNA. Os exemplos de método da mutação específico de sítio incluem o método utilizando o PCR (Higuchi, R., 61, in PCR Technology, Erlich, Η. A. Eds., Stockton Press (1989); Carter, P., Met. in Enzymol., 154, 382 (1987)) e o método que utiliza fago (Kramer, W. e Frits, H. J., Met. in Enzymol., 154, 350 (1987); Kunkel, T. A. et ah, Met. in Enzymol., 154, 367 (1987)). Altemativamente, um fragmento de gene em que os códons objetivos são substituídos pode ser totalmente sintetizado. As frequências de códons em vários organismos são divulgados no “Codon Usage Database” (http://www.kazusa.or.jp/c0don; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)). [00090] Além disso, a expressão de um gene também pode ser aumentada pela amplificação de um regulador que aumenta a expressão do gene, ou deletando ou atenuando um regulador que reduz a expressão do gene. [00091] Tais métodos para aumentar a expressão de gene como mencionado acima podem ser usados independentemente ou em uma combinação arbitrária. [00092] Além disso, a modificação que aumenta a atividade de uma proteína também pode ser obtida, por exemplo, pelo aumento da atividade da enzima específica. A intensificação da atividade específica também inclui redução ou eliminação da inibição da retroalimentação. Uma proteína que mostra uma atividade específica intensificada pode ser obtida, por exemplo, pesquisando-se vários organismos. Além disso, um tipo altamente ativo de uma proteína existente também pode ser obtida pela introdução de uma mutação dentro da proteína existente. A mutação a ser introduzido pode ser, por exemplo, substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições da proteína. A mutação pode ser introduzida, por exemplo, por um tal método de mutação específica de sítio como mencionado acima. A mutação também pode ser introduzida, por exemplo, por um tratamento de mutagênese. Os exemplos do tratamento de mutagênese incluem irradiação de raio X, irradiação de ultravioleta e um tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N’-nitro-N- nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS) e metanossulfonato de metila (MMS). Além disso, uma mutação aleatória pode ser introduzida tratando-se diretamente o DNA in vitro com hidroxilamina. A intensificação da atividade específica pode ser independentemente usada, ou pode ser usada em uma combinação arbitrária com tais métodos para aumentar a expressão de gene como mencionado acima. [00093] O método para a transformação não é particularmente limitado e os métodos convencionalmente conhecidos pode ser usados. Pode ser usado, por exemplo, um método de tratar células receptoras com cloreto de cálcio de modo a aumentar a sua permeabilidade ao DNA, que foi relatado para cepa K-12 da Escherichia coli (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol., 1970, 53, 159-162) e um método de preparar células competentes a partir das células que estão na fase de crescimento, seguidas pela transformação com DNA, que foi relatado para Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G. A. e Young, F. E., Gene, 1977, 1:153-167). Altemativamente, também pode ser usado um método de fabricar células receptoras de DNA em protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente absorver um DNA recombinante, seguido pela introdução de um DNA recombinante nas células receptoras de DNA, o que é conhecido ser aplicável à Bacillus subtilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S. N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. e Hopwood, O. A., 1978, Nature, 274:398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. e Fink, G. R., 1978, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:1929-1933). Além disso, o método de pulso elétrico relatado para bactérias corineformes (Patente Japonesa aberta ao Público (Kokai) No. 2-207791) também pode ser usada. [00094] Um aumento na atividade de uma proteína pode ser confirmado pela medição da atividade da proteína. [00095] Um aumento na atividade de uma proteína também pode ser confirmado pela confirmação de um aumento na expressão de um gene que codifica a proteína. Um aumento na expressão de um gene pode ser confirmado pela confirmação de um aumento na quantidade de transcrição do gene, ou pela confirmação de um aumento na quantidade de uma proteína expressada a partir do gene. [00096] Um aumento da quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmado pela comparação da quantidade de mRNA transcrita do gene com aquele observado em uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem ou cepa precursora. Os exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização de Northern, RT-PCR e assim por diante (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade de mRNA pode aumento, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais, comparada com aquela de uma cepa não modificada. [00097] Um aumento na quantidade de uma proteína pode ser confirmado pelos anticorpos usando Western blotting (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade da proteína pode aumento, por exemplo, 1,5 vezes ou mais, 2 vezes ou mais, ou 3 vezes ou mais comparada com aquela de uma cepa não modificada. [00098] Os métodos anteriormente mencionados para aumentar a atividade de uma proteína podem ser aplicados para a intensificação da atividade de uma proteína arbitrária tal como enzimas envolvidas na biossíntese de uma substância de purina e intensificação da expressão de um gene arbitrário tal como genes que codificam aquelas proteínas arbitrárias. <l-3> Método para produzir atividade de proteína [00099] Daqui por diante, os métodos para redução da atividade de uma proteína será explicada abaixo. [000100] A expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” significa que a atividade da proteína por célula é diminuída comparada com aquela de uma cepa não modificada tal como uma cepa do tipo selvagem ou cepa precursora e inclui uma menção de que a atividade desapareceu completamente. Especificamente, a expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” significa que o número de moléculas da proteína por célula é reduzido, e/ou a função de cada molécula da proteína é reduzida comparada com aqueles de uma cepa não modificada. Isto é, o termo “atividade” na expressão “a atividade de uma proteína é reduzida” não é limitada a atividade catalítica da proteína, mas pode significar a quantidade de transcrição de um gene (a quantidade de mRNA) que codifica a proteína ou a quantidade de tradução do gene (a quantidade da proteína). A expressão que “o número de moléculas da proteína por célula é reduzida” inclui uma menção de que a proteína não existe de modo algum. A expressão que “a função de cada molécula da proteína é reduzida” inclui uma menção de que a função de cada molécula da proteína desapareceu completamente. Embora o grau da redução na atividade de uma proteína não é particularmente limitada contanto que a atividade seja reduzida comparada com aquela de uma cepa não modificada, a mesma pode ser reduzida, por exemplo, a 50 % ou menos, 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 0 % daquela de uma cepa não modificada. [000101] A modificação para a redução da atividade de uma proteína pode ser obtida, por exemplo, pela redução da expressão de um gene que codifica a proteína. A expressão que “a expressão de um gene é reduzida” inclui uma menção de que o gene não é expressada de modo algum. A expressão que “a expressão de um gene é reduzida” também é aludida como “a expressão de um gene é atenuada”. A expressão de um gene pode ser reduzida a 50 % ou menos, 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 0 % daquela de uma cepa não modificada. [000102] A redução na expressão de gene pode ser devido a, por exemplo, uma redução na eficiência da transcrição, uma redução na eficiência da tradução, ou uma combinação deles. A expressão de um gene pode ser reduzida pela modificação de sequência de controle de expressão do gene tal como um promotor e sequência de Shina-Dalgamo (SD). Quando a sequência de controle de expressão é modificada, preferivelmente um ou mais nucleotídeos, mais preferivelmente dois ou mais nucleotídeos, de modo particularmente preferível três ou mais nucleotídeos, da sequência de controle de expressão são modificados. Além disso, uma parte ou o total de sequência de controle de expressão podem ser deletados. A expressão de um gene também pode ser reduzida, por exemplo, pela manipulação de um fator responsável para o controle de expressão. Os exemplos do fator responsável para o controle de expressão incluem moléculas baixas responsáveis pelo controle da transcrição ou tradução (induzidores, inibidores, etc.), as proteínas responsáveis pelo controle da transcrição ou tradução (fatores de transcrição etc.), ácidos nucleicos responsáveis pelo controle da transcrição ou tradução (siRNA etc.) e assim por diante. [000103] A modificação por redução da atividade de uma proteína também pode ser obtida, por exemplo, pelo rompimento um gene que codifica a proteína. O rompimento de um gene pode ser obtido, por exemplo, pela deleção de uma parte ou o total da região codificadora do gene em um cromossoma. Além disso, o total de um gene que inclui sequências a montante e a jusante do gene em um cromossoma podem ser deletados. A região a ser deletada pode ser qualquer região tal como uma região de terminal N, uma região interna, ou uma região de terminal C, contanto que a atividade da proteína possa ser reduzida. A deleção de uma região mais longa pode usualmente mais seguramente inativar o gene. Além disso, é preferido que as matrizes de leitura das sequências a montante e a jusante da região a ser deletada não sejam as mesmas. [000104] O rompimento de um gene também pode ser obtido, por exemplo, pela introdução de uma mutação para uma substituição de aminoácido (mutação de sentido errado), um códon de parada (mutação de sem sentido), uma mutação de mudança de matriz que adiciona ou deleta um ou dois resíduos de nucleotídeo, ou os seus semelhantes dentro da região codificadora do gene em um cromossoma (Journal of Biological Chemistry, 272:8611-8617 (1997); Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 95 5511-5515 (1998); Journal of Biological Chemistry, 26 116, 20833-20839 (1991)). [000105] O rompimento de um gene também pode ser obtido, por exemplo, pela inserção de uma outra sequência dentro de uma região codificadora do gene em um cromossoma. O sítio da inserção pode ser em qualquer região do gene e a inserção de uma região mais longa pode usualmente mais seguramente inativar o gene. É preferido que as matrizes de leitura das sequências a montante e a jusante do sítio de inserção não sejam as mesmas. A outra sequência não é particularmente limitada contanto que uma sequência que reduz ou elimina a atividade das proteínas codificadas é escolhida e os seus exemplos incluem, por exemplo, um marcador gene tal como gene de resistência a antibióticos e um gene útil para a produção da substância de purina. [000106] Tal modificação de um gene em um cromossoma como descrito acima pode ser obtida, por exemplo, pela preparação de um gene tipo deficiente em que uma sequência parcial do gene é deletada de modo que a mesma não possa produzir uma proteína que pode funcionar normalmente e transformar uma bactéria com um DNA recombinante que inclui o gene tipo deficiente para causar a recombinação homóloga entre o gene tipo deficiente e o gene do tipo selvagem em um cromossoma e deste modo substitui o gene tipo deficiente no lugar do gene do tipo selvagem no cromossoma. Neste procedimento, se um gene marcador selecionado de acordo com as características do hospedeiro tal como auxotrofia é incluída no DNA recombinante, a operação toma-se. A proteína codificada pelo gene tipo deficiente tem uma conformação diferente daquela da proteína tipo selvagem, mesmo se a mesma é produzida e assim a sua função é reduzida ou eliminada. Tal rompimento de gene com base na substituição do gene que utiliza a recombinação homóloga já foi estabelecido e existem métodos de uso de um DNA linear tal como um método chamado “integração dirigida por Red” (DatsenJko, K. Ae Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97: 6640-6645 (2000)) e um método que utiliza a integração dirigida por Red em combinação com um sistema de excisão derivado do fago λ (Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F., J. Bacteriol., 184: 5200-5203 (2002)) (reportar-se à WO 2005/010175), um método de uso de um plasmídeo que inclui uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de uso de um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método de utilizar um vetor suicida que não inclui uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro (Patente U.S. No. 6.303.383, Patente Japonesa aberta ao Público (Kokai) No. 05-007491) e assim por diante. [000107] A modificação para a redução da atividade de uma proteína também pode ser obtida, por exemplo, por um tratamento de mutagênese. Os exemplos do tratamento de mutagênese incluem irradiação de raio X, irradiação de ultravioleta e tratamento com um agente de mutação tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), metanossulfonato de etila (EMS) e metanossulfonato de metila (MMS). [000108] Uma redução na atividade de uma proteína pode ser confirmada pela medição da atividade da proteína. [000109] Uma redução na atividade de uma proteína também pode ser confirmada pela confirmação de uma redução na expressão de um gene que codifica a proteína. Uma redução na expressão de um gene pode ser confirmada pela confirmação de uma redução na quantidade de transcrição do gene ou uma redução na quantidade da proteína expressada a partir do gene. [000110] Uma redução na quantidade de transcrição de um gene pode ser confirmada pela comparação da quantidade de mRNA transcrita do gene com aquela observada em uma cepa não modificada. Os exemplos do método para avaliar a quantidade de mRNA incluem hibridização de Northern, RT-PCR e assim por diante (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001). A quantidade de mRNA pode ser diminuída, por exemplo, para 50 % ou menos, 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 0 %, daquela observada em uma cepa não modificada. [000111] Uma redução na quantidade de uma proteína pode ser confirmada pelos anticorpos usando Western blotting (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA) 2001). A quantidade da proteína pode ser diminuída, por exemplo, para 50 % ou menos, 20 % ou menos, 10 % ou menos, 5 % ou menos, ou 0 %, daquela observada em uma cepa não modificada. [000112] O rompimento de um gene pode ser confirmado pela determinação da sequência de nucleotídeo de uma parte ou o total do gene, mapa da enzima de restrição, tamanho natural, ou os seus semelhantes do gene que depende do meio usado para o rompimento. [000113] Os métodos anteriormente mencionados para redução da atividade de uma proteína podem ser aplicados para a redução na atividade de uma proteína arbitrária tal como enzimas que catalisam uma reação de ramificação fora do caminho biossintético de uma substância de purina para gerar um outro composto e redução na expressão de um gene arbitrário tal como genes que codificam estas proteínas arbitrárias. <l-4> A introdução do gene YggB mutante [000114] A bactéria da presente invenção foi modificada de modo a abrigar um gene YggB mutante. A bactéria da presente invenção pode ser obtida pela modificação de uma bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância de purina de modo que a mesma abrigue um gene YggB mutante. A bactéria da presente invenção também pode ser obtida pela modificação de uma bactéria de modo que a mesma abrigue um gene YggB mutante e depois conferindo uma capacidade de produzir a substância de purina. Na presente invenção, as modificações para construir a bactéria da presente invenção pode ser realizada em uma ordem arbitrária. [000115] Daqui por diante, o gene YggB e a proteína YggB serão explicados. O gene YggB é um gene que codifica um canal mecanossensível. Na presente invenção, um gene YggB tendo a “mutação específica” explicada mais tarde também é aludido como “gene YggB mutante” e uma proteína codificada deste modo também é aludida como “proteína YggB mutante”. Além disso, na presente invenção, um gene YggB que não tenha a “mutação específica” explicado mais tarde também é aludido como “gene YggB” do tipo selvagem e uma proteína codificada deste modo também é aludida como uYggB proteína do tipo selvagem”, além disso, como para a proteína YggB, a mudança da sequência do aminoácido causada pela “mutação específica” no gene YggB também é aludida como “mutação específica”. [000116] Os exemplos do gene YggB do tipo selvagem incluem, por exemplo, gene YggBs da bactéria corineforme. Os exemplos específicos do gene YggB da bactéria corineforme incluem, por exemplo, os genes YggB da cepa ATCC 13869 da Corynebacterium glutamicum, cepa ATCC 13032 da Corynebacterium glutamicum, cepa ATCC 14967 da Corynebacterium glutamicum e cepa ATCC 17965 da Coiynebacterium melassecola. O gene YggB da cepa ATCC 13032 da Corynebacterium glutamicum corresponde à sequência complementar da sequência das posições 1336092 a 1337693 na sequência do genoma registrado na base de dados NCBI como acesso do GenBank NC_003450 (VERSÃO NC_003450,3 GI: 58036263). O gene YggB da cepa ATCC 13032 Corynebacterium glutamicum é equivalente com Cgll270. Além disso, a proteína YggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 é registrada como acesso do GenBank NP_600492 (versão NP_600492,1 GI: 19552490, lacal_rótulo “NCgll221”). As sequências de nucleotídeo destes genes YggBs são mostrados como SEQ ID NOS: 8, 10, 12 e 14, respectivamente. A sequência do aminoácidos das proteínas YggB codificadas por estes genes YggB são mostrados como SEQ ID NOS: 9, 11, 13 e 15, respectivamente. Além disso, a sequência conservada destas proteínas YggB é mostrada como SEQ ID NO: 16. [000117] A proteína YggB do tipo selvagem pode ser uma variante da proteína YggB mencionada acima, contanto que a mesma não tenha a “mutação específica” explicada mais tarde e tem a função como a proteína YggB. Uma tal variante também pode ser aludida como “variante conservativa”. Os exemplos de uma tal variante conservativa incluem, por exemplo, homólogos e variantes artificialmente modificadas da proteína YggB mencionada acima. Na presente invenção, a expressão de “tendo a função como a proteína YggB” pode significar que, por exemplo, as funções da proteína como um canal mecanossensível. A expressão de “tendo a função como a proteína YggB” também pode significar que, por exemplo, a proteína tem uma função de melhorar a capacidade de produzir ácido L-glutâmico de uma bactéria corineforme, quando a sua expressão é aumentada na bactéria corineforme (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2007-097573). [000118] Além disso, o gene YggB do tipo selvagem pode ser uma variante do gene YggB anteriormente mencionado, contanto que o mesmo codifique a proteína YggB anteriormente mencionada ou uma variante conservativa da mesma. [000119] Um gene que codifica um homólogo da proteína YggB anteriormente mencionada é facilmente obtido a partir de um base de dados pública, por exemplo, Pela pesquisa de BLAST ou Pesquisa de FASTA usando qualquer um dos genes YggB anteriormente mencionados da bactéria corineforme (SEQ ID NO: 8, 10, 12, ou 14) como uma sequência dúvida.

Além disso, um gene que codifica um homólogo da proteína YggB anteriormente mencionada pode ser obtida, por exemplo, Pela PCR usando o cromossoma de uma bactéria corineforme como o padrão e oligonucleotídeos preparados com base em qualquer uma destas sequências de gene conhecidas como iniciadores. [000120] A proteína YggB do tipo selvagem pode ser uma proteína tendo sequência do aminoácido anteriormente mencionada mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em uma ou várias posições, contanto que a mesma não tenha a “mutação específica” explicada mais tarde e tenha a função como a proteína YggB. Embora o número de “um ou vários” mencionado acima possa diferir dependendo das posições na estrutura tridimensional da proteína ou de tipos de resíduos de aminoácido, especificamente, o mesmo é preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5. [000121] A substituição, deleção, inserção, ou adição anteriormente mencionadas de um ou vários resíduos de aminoácido é uma mutação conservativa que mantém função normal da proteína. Os exemplos típicos da mutação conservativa são substituições conservativas. A substituição conservativa é uma mutação em que a substituição ocorre mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o sítio da substituição é um aminoácido aromático; entre Leu, Ile e Vai, se o mesmo é um aminoácido hidrofóbico; entre Gin e Asn, se o mesmo é um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se o mesmo é um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se o mesmo é um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se o mesmo é um aminoácido tendo um grupo hidroxila. Os exemplos das substituições consideradas como substituições conservativas incluem, especificamente, a substituição de Ser ou Thr para ala, a substituição de Gin, His, ou Lys para Arg, substituição de Glu, Gin, Lys, His, ou Asp para Asn, a substituição de Asn, Glu, ou Gin para Asp, a substituição de Ser ou Ala para Cys, a substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp, ou Arg para Gin, a substituição de Gly, Asn, Gin, Lys, ou Asp para Glu, a substituição de Pro para Gly, a substituição de Asn, Lys, Gin, Arg, ou Tyr para His, a substituição de Leu, Met, Vai, ou Phe para Ile, a substituição de Ile, Met, Vai, ou Phe para Leu, a substituição de Asn, Glu, Gin, His, ou Arg para Lys, a substituição de Ile, Leu, Vai, ou Phe para Met, a substituição de Trp, Tyr, Met, Ile, ou Leu para Phe, a substituição de Thr ou Ala para Ser, a substituição de Ser ou Ala para Thr, a substituição de Phe ou Tyr para Trp, a substituição de His, Phe, ou Trp para Tyr e substituição de Met, Ile, ou Leu para Vai. Além disso, tal substituição, deleção, inserção, adição, inversão, ou os seus semelhantes dos resíduos de aminoácido como mencionado acima inclui uma mutação que ocorre naturalmente devido a uma diferença individual, ou uma diferença de espécies de uma bactéria da qual o gene é derivado (mutante ou variante). [000122] Além disso, a proteína YggB do tipo selvagem pode ser uma proteína que mostra uma homologia de 80 % ou mais, preferivelmente de 90 % ou mais, mais preferivelmente de 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente de 97 % ou mais, de modo particularmente preferível de 99 % ou mais, para a sequência total do aminoácido mencionado acima, contanto que a mesma não tenha a “mutação específica” explicada mais tarde e tem a função como a proteína YggB. Neste relatório descritivo, “homologia” significa “identidade”. [000123] A proteína YggB do tipo selvagem preferivelmente tem, por exemplo, a sequência conservada da proteína YggB anteriormente mencionada da bactéria corineforme. Portanto, a mutação conservativa preferivelmente ocorre, por exemplo, em um resíduo de aminoácido não conservado nas proteínas YggB anteriormente mencionadas da bactéria corineforme. Especificamente, por exemplo, a mutação conservativa pode ocorrer em um ou mais resíduos de aminoácido selecionados dos resíduos de aminoácido que seguem da proteína YggB do tipo selvagem. As posições dos resíduos de aminoácido na proteína YggB do tipo selvagem são posições relativas como explicado mais tarde.

Glu na posição 48 (preferivelmente substituída com Arg) Asp na posição 275 (preferivelmente substituída com Ser) Glu na posição 298 (preferivelmente substituída com Ala) Ala na posição 343 (preferivelmente substituída com Vai) Phe na posição 396 (preferivelmente substituída com IIe) Ser na posição 43 8 (preferivelmente substituída com Gly) Vai na posição 445 (preferivelmente substituída com Ala) Ala na posição 454 (preferivelmente substituída com Vai) Pro na posição 457 (preferivelmente substituída com Ser) Ser na posição 474 (preferivelmente substituída com Asp) Vai na posição 517 (preferivelmente deleção) Glu na posição 518 (preferivelmente deleção) Ala na posição 519 (preferivelmente deleção) Pro na posição 520 (preferivelmente deleção) [000124] Além disso, o gene YggB do tipo selvagem pode ser um DNA isto é capaz de hibridizar com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência de gene conhecida, tal como uma sequência complementar a uma parte ou o total de qualquer uma das sequências de nucleotídeos anteriormente mencionadas, sob condições severas, contanto que a mesma não tenha a “mutação específica” explicada mais tarde e codifique uma proteína tendo a função como a proteína YggB. As “condições severas” referem-se às condições sobre as quais um chamado híbrido específico é formado e um híbrido não específico não é formado. Os exemplos das condições severas incluem aquelas sob as quais os DNAs altamente homólogos hibridizam-se entre si, por exemplo, os DNAs não menos do que 80 % homólogos, preferivelmente não menos do que 90 % homólogos, mais preferivelmente não menos do que 95 % homólogos, ainda mais preferivelmente não menos do que 97 % homólogos, de modo particularmente preferível não menos do que 99 % homólogos, hibridizam-se entre si e DNAs menos homólogos do que os acima não hibridizam entre si, ou condições de lavagem da hibridização de Southern típica, isto é, condições de lavagem uma vez, preferivelmente 2 ou 3 vezes, em uma concentração salina e temperatura que corresponde a 1 x SSC, 0,1 % de SDS a 60°C, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS a 60°C, mais preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1 % de SDS a 68°C. [000125] A sonda usada para a hibridização anteriormente mencionada pode ser uma parte de uma sequência isto é complementar ao gene como descrito acima. Uma tal sonda pode ser preparada pela PCR usando oligonucleotídeos preparados com base de uma sequência de gene conhecida como iniciadores e um fragmento de DNA que contém a sequência de nucleotídeos como um padrão. Como a sonda, por exemplo, um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 pares de base pode ser usado. Quando um fragmento de DNA tendo um comprimento de cerca de 300 pares de base é usado como a sonda, as condições de lavagem da hibridização pode ser, por exemplo, de 50°C, 2 x SSC e de 0,1 % de SDS. [000126] Além disso, o gene YggB do tipo selvagem pode ser um gene em que um códon arbitrário é substituído com um códon equivalente, contanto que o gene codifica uma tal proteína YggB do tipo selvagem como mencionado acima. Por exemplo, o gene YggB do tipo selvagem pode ser modificado de modo que o mesmo tem códons ótimos de acordo com frequências de códon em um hospedeiro a ser usado. [000127] As descrições acima concernentes às variantes dos genes e proteínas também podem ser aplicadas mutatis mutandis às proteínas arbitrárias tais como enzima envolvida na biossíntese de uma substância de purina e genes que codificam a mesma. [000128] A proteína YggB mutante tem a “mutação específica” explicada mais tarde na sequência do aminoácido da proteína YggB do tipo selvagem mencionado acima. [000129] Isto é, em outras palavras, a proteína YggB mutante pode ser idêntica à proteína YggB das bactérias corineformes mencionada acima ou uma variante conservativa da mesma exceto tendo a “mutação específica” explicada mais tarde. [000130] Especificamente, a proteína YggB mutante pode ser, por exemplo, uma proteína tendo a sequência do aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9, 11, 13, ou 15 exceto tendo a “mutação específica” explicada mais tarde. [000131] Especificamente, a proteína YggB mutante também pode ser, por exemplo, uma proteína tendo a sequência do aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9, 11, 13, ou 15 mas que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido, exceto tendo a “mutação específica” explicada mais tarde. [000132] Especificamente, a proteína YggB mutante também pode ser, por exemplo, uma proteína que mostra uma homologia de 80 % ou mais, preferivelmente de 90 % ou mais, mais preferivelmente de 95 % ou mais, ainda mais preferivelmente de 97 % ou mais, de modo particularmente preferível de 99 % ou mais, à sequência do aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9, 11, 13, ou 15 exceto tendo a “mutação específica” explicada mais tarde. [000133] Além disso, em outras palavras, a proteína YggB mutante pode ser uma variante que corresponde a YggB proteína das bactérias corineformes mencionadas acima tendo a “mutação específica” explicada mais tarde e incluindo ainda uma mutação conservativa em um sítio outro que não aquele da “mutação específica”. [000134] Especificamente, a proteína YggB mutante pode ser, por exemplo, uma proteína tendo a sequência do aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 9, 11, 13, ou 15 mas tendo a “mutação específica” explicada mais tarde e incluindo ainda substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido em um sítio outro que não aquele da “mutação específica”. [000135] O gene YggB mutante não sé particularmente limitado contanto que o mesmo codifique tal uma proteína YggB mutante como mencionado acima. [000136] Daqui por diante, a “mutação específica” do gene YggB mutante será explicada. [000137] A “mutação específica” não é particularmente limitada, contanto que a mesma seja uma mutação que muda a sequência do aminoácido da proteína YggB do tipo selvagem explicada acima e melhora a capacidade de produzir a substância de purina a partir de uma bactéria. A expressão “para melhorar a capacidade de produzir a substância de purina a partir de uma bactéria” significa que uma bactéria Escherichia, bactéria Bacillus, ou Corynebacterium ammoniagenes modificadas de modo a abrigar um gene YggB mutante podem produzir a substância de purina em uma quantidade maior do que aquela obtenível com uma cepa não modificada. A “cepa não modificada” refere-se a uma cepa de controle que não abriga nenhum gene YggB mutante e o mesmo pode ser, por exemplo, uma cepa do tipo selvagem ou uma cepa precursora. Embora o grau de aumento pretendido pela expressão “para produzir a substância de purina em uma quantidade maior do que aquela obtenível com uma cepa não modificada” não seja particularmente limitado contanto que a quantidade de produção da substância de purina seja aumentada comparada com aquela obtenível com uma cepa não modificada, a expressão pode significar que, por exemplo, 1,05 vezes ou mais, preferivelmente 1,1 vezes ou mais, mais preferivelmente 1,2 vezes ou mais, de modo particularmente preferível 1,3 vezes ou mais, a substância de purina é produzida comparada com a quantidade de produção da substância de purina obtenível com uma cepa não modificada. [000138] Se uma certa mutação é uma mutação que melhora a capacidade de produzir a substância de purina a partir de uma bactéria pode ser confirmada, por exemplo, pela preparação de uma cepa modificada de modo a abrigar um gene que codifica a proteína YggB tendo a certa mutação de um cepa que pertence ao gênero Escherichia, o gênero Bacillus, ou Corynebacterium ammoniagenes, que quantifica a quantidade da substância de purina produzida quándo a cepa é cultivada em um meio e comparando-a com a quantidade da substância de purina produzida quando a cepa antes da modificação (cepa não modificada) é cultivada no meio. [000139] Os exemplos específicos da “mutação específica” incluem, por exemplo, as mutações que seguem (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2007-097573).

(1) Mutação no lado do terminal C [000140] A mutação no lado do terminal C é uma mutação introduzida na região do gene YggB do tipo selvagem que codifica os resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem (posições 419 a 529 na SEQ ID NO: 13). A mutação no lado do terminal C pode ser introduzida em um ou mais sítios na região. O tipo da mutação da sequência do aminoácido induzido pela mutação no lado do terminal C não é particularmente limitada. A mutação no lado do terminal C pode ser uma mutação que causa a substituição do aminoácido (mutação de sentido errado), inserção do resíduo de aminoácido, deleção do resíduo de aminoácido, a introdução do códon de parada (mutação de sem sentido), mutação de mudança de matriz, ou uma combinação destes. A mutação no lado do terminal C é preferivelmente, por exemplo, uma mutação para inserir uma sequência de nucleotídeo tal como uma sequência de inserção (daqui em diante também aludida como “É”) ou transposon. (1-1) Inserção da sequência de nucleotídeo [000141] Os exemplos da mutação no lado do terminal C incluem, por exemplo, uma mutação que insere uma sequência de nucleotídeo no sítio que codifica o resíduo de valina na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem (mutação do tipo 2A-1). A mutação do tipo 2A-1 pode ser, por exemplo, uma mutação que causa a deleção ou substituição por uma parte ou toda dos resíduos de aminoácido das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem. Os exemplos específicos do gene YggB mutante tendo a mutação do tipo 2A-1 incluem, por exemplo, o gene YggB que inclui inserção do IS no contíguo de “G” na posição 1255 na SEQ ID NO: 8 e deste modo codificando uma proteína YggB mutante tendo um tamanho natural de 423 resíduos de amino, que é mais curta do que a proteína YggB do tipo selvagem original (SEQ ID NO: 9) (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2007-222163). (1-2) Substituição por resíduos de prolina [000142] Os exemplos da mutação no lado do terminal C também incluem, por exemplo, uma mutação que substitui um resíduo de prolina presente nas posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido. Os exemplos de uma tal resíduo de prolina incluem os resíduos de prolina nas posições 424, 437, 453, 457, 462, 469, 484, 489, 497, 515, 529 (posição 525 na SEQ ID NO: 13) e 533 (posição 529 na SEQ ID NO: 13) da proteína YggB do tipo selvagem. É especialmente preferível substituir o(s) resíduo(s) de prolina da(s) posição(s) 424 e/ou 437 com outro(s) resíduo(s) de aminoácido. [000143] O “outro aminoácido” não é particularmente limitado contanto que um aminoácido que ocorre naturalmente outro que não prolina é escolhido. Os exemplos do “outro aminoácido” incluem Lys, Glu, Thr, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Gin, Arg, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Gly, Ala e His. [000144] Por exemplo, o resíduo de prolina na posição 424 pode ser substituído com preferivelmente um resíduo de aminoácido hidrofóbico (Ala, Gly, Vai, Leu, ou Ile), mais preferivelmente um resíduo do aminoácido de cadeia ramificada (Leu, Vai, ou Ile). Os exemplos da mutação para substituir o resíduo de prolina na posição 424 com resíduo de leucina incluem uma mutação para substituir “C” na posição 1271 na SEQ ID NO: 14 com “T” (mutação do tipo 66). [000145] Além disso, por exemplo, o resíduo de prolina na posição 437 pode ser substituído preferivelmente com um resíduo de um aminoácido tendo grupo hidroxila na cadeia lateral (Thr, Ser, ou Tyr), mais preferivelmente com um resíduo de Ser. Os exemplos da mutação para substituir o resíduo de prolina na posição 437 com resíduo Ser incluem uma mutação substituindo “C” na posição 1309 na SEQ ID NO: 8 com “T” (mutação do tipo 22). A mutação do tipo 22 pode ser acompanhada, por exemplo, por uma mutação para substituir “C” na posição 1624 na SEQ ID NO: 8 com “T”. (2) Mutação na região de transmembrana [000146] A proteína YggB é estimada ter cinco regiões de transmembrana. As regiões de transmembrana correspondem aos resíduos de aminoácido das posições 1 a 23 (primeira região de transmembrana), as posições 25 a 47 (segunda região de transmembrana), as posições 62 a 84 (terceira região de transmembrana), as posições 86 a 108 (quarta região de transmembrana) e as posições 110 a 132 (quinta região de transmembrana) da proteína YggB do tipo selvagem. A mutação na região de transmembrana é uma mutação nas regiões que codificam estas regiões de transmembrana do gene YggB do tipo selvagem. A mutação na região de transmembrana pode ser introduzida em um ou mais sítios nas regiões. A mutação na região de transmembrana é preferivelmente uma mutação que induz substituição, deleção, adição, inserção, ou inversão de um ou vários resíduos de aminoácido e não inclui qualquer mutação de mudança de matriz ou mutação de sem sentido. Que o número de “um ou vários” é preferivelmente de 1 a 20, mais preferivelmente de 1 a 10, ainda mais preferivelmente de 1 a 5, de modo particularmente preferível de 1 a 3. (2-1) Mutação na primeira região de transmembrana [000147] Os exemplos da mutação na primeira região de transmembrana incluem uma mutação que insere um ou vários resíduos de aminoácido entre o resíduo de leucina na posição 14 e o resíduo de triptofano na posição 15 na proteína YggB do tipo selvagem. Os exemplos de um ou vários resíduos de aminoácido incluem, por exemplo, Cys-Ser-Leu. Os exemplos específicos do gene YggB mutante tendo uma tal mutação incluem, por exemplo, o gene YggB inserido com TTCATTGTG no contíguo de “G” na posição 44 na SEQ ID NO: 8 (mutação do tipo Al). A sequência de nucleotídeo deste gene YggB mutante e a sequência de aminoácido da proteína YggB mutante codificadas por este gene são mostradas na SEQ ID NOS: 6 e 7, respectivamente. (2-2) Mutação in quarta região de transmembrana [000148] Os exemplos da mutação na quarta região de transmembrana incluem uma mutação que substitui o resíduo de alanina na posição 100 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido. O “outro aminoácido” não é particularmente limitado contanto que o mesmo seja um aminoácido do tipo que ocorre naturalmente outro que não alanina. Os exemplos do “outro aminoácido” incluem Lys, Glu, Thr, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Gin, Arg, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Gly, His e Pro. O resíduo de alanina na posição 100 pode ser preferivelmente substituído com um resíduo de um aminoácido tendo grupo hidroxila na cadeia lateral (Thr, Ser, ou Tyr), mais preferivelmente o resíduo Thr. Os exemplos específicos do gene YggB mutante tendo uma tal mutação incluem, por exemplo, o gene YggB em que “G” na posição 298 na SEQ ID NO: 8 é substituído com “A” (mutação do tipo 19). (2-3) Mutação na quinta região de transmembrana [000149] Os exemplos da mutação na quinta região de transmembrana incluem uma mutação que substitui o resíduo de alanina na posição 111 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido. O “outro aminoácido” não é particularmente limitada contanto que o mesmo é um aminoácido do tipo que ocorre naturalmente outro que não alanina. Os exemplos do “outro aminoácido” incluem Lys, Glu, Thr, Vai, Leu, Ile, Ser, Asp, Asn, Gin, Arg, Cys, Met, Phe, Trp, Tyr, Gly, His e Pro. O resíduo de alanina na posição 111 pode ser preferivelmente substituído com um resíduo de um aminoácido tendo o grupo hidroxila na cadeia lateral (Thr, Ser, ou Tyr), mais preferivelmente o resíduo Thr. Os exemplos específicos do gene YggB mutante tendo uma tal mutação incluem, por exemplo, o gene YggB in que “C” na posição 332 na SEQ ID NO: 8 é substituído com “T” (Mutação do tipo L30) e o gene YggB no que “G” na posição 331 na SEQ ID NO: 12 é substituído com “A” (mutação do tipo 8). A sequência de nucleotídeo do gene YggB mutante (mutação do tipo L30) e a sequência de aminoácido da proteína YggB do tipo mutante codificadas por este gene são mostradas na SEQ ID NOS: 4 e 5, respectivamente.

[000150] Na presente invenção, um “resíduo de aminoácido na posição X da proteína YggB do tipo selvagem” significa o resíduo de aminoácido que corresponde a aquele da posição X na SEQ ID NO: 9, a menos que de outro modo estabelecido. A “posição X” em uma sequência de aminoácido é a Xo posição contada a partir do terminal N da sequência do aminoácido e o resíduo de aminoácido do terminal N é o resíduo de aminoácido da posição 1. Isto é, as posições anteriormente mencionadas dos resíduos de aminoácido indicam as posições relativas e as suas posições absolutas podem mudar devido a deleção, inserção, adição, ou os seus semelhantes de um resíduo de aminoácido ou resíduos. Por exemplo, o “resíduo de aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem” significa o resíduo de aminoácido que corresponde a aquele da posição 419 na SEQ ID NO: 9 e quando um resíduo de aminoácido é deletado no lado do terminal N da posição 419, o 418o resíduo de aminoácido a partir do terminal N é “o resíduo de aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem”. Além disso, quando um resíduo de aminoácido é inserido dentro de uma região no lado do terminal N da posição 419, o 420° resíduo de aminoácido a partir do terminal N é “o resíduo de aminoácido na posição 419 da proteína YggB do tipo selvagem”. [000151] qual resíduo de aminoácido é “o resíduo de aminoácido que corresponde a aquele da posição X na SEQ ID NO: 9” em uma sequência do aminoácido arbitrária pode ser determinada pelo alinhamento entre a sequência do aminoácido arbitrária e a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9. o alinhamento pode ser realizado, por exemplo, pelo uso do software de análise de gene conhecido. Os exemplos específicos da tal software incluem DNASIS produzido pela Hitachi Solutions, GENETYX produzido pela Genetyx e assim por diante (Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24 (1) 72-96, 1991; Barton GJ et al, Journal of Molecular Biology, 198 (2), 327-37, 1987). [000152] O gene YggB mutante pode ser obtido pela modificação de um gene YggB do tipo selvagem de modo a ter a “mutação específica” anteriormente mencionada. A modificação de DNA pode ser realizada por um método conhecido. Por exemplo, uma mutação objetiva pode ser introduzida dentro de um sítio objetivo de DNA pelo método de mutagênese específica de sítio. Os exemplos específicos do método de mutagênese específico de sítio incluem, por exemplo, um método de usar PCR (Higuchi, R., 61, in PCR Technology, Erlich, Η. A. Eds., Stockton Press, 1989; Carter P., Met. In Enzymol., 154, 382, 1987) e um método de uso de um fago (Kramer, W. e Frits, H. J., Met. in Enzymol., 154, 350, 1987; Kunkel, T. A. et al., Met. in Enzymol., 154, 367, 1987). Além disso, o gene YggB mutante também pode ser obtido pela síntese química. [000153] Daqui por diante, os métodos para modificar uma bactéria de modo a ter um gene YggB mutante será explicado. [000154] Tal modificação de uma bactéria para que a bactéria tenha um gene YggB mutante pode ser obtida pela introdução do gene YggB mutante dento da bactéria. Tal modificação de uma bactéria para que a bactéria tenha um gene YggB mutante também pode ser obtida pela introdução de uma mutação dentro do gene YggB da bactéria através da mutação natural ou um tratamento com um mutagêneo. [000155] O método para introduzir um gene YggB mutante dentro de uma bactéria não é particularmente limitada. Na bactéria da presente invenção, é suficiente que o gene YggB mutante seja abrigado pela bactéria de modo que o mesmo possa ser expressado sob o controle de um promotor que funciona na bactéria. O promotor pode ser um promotor derivado do hospedeiro, ou um promotor heterogêneo. O promotor pode ser o promotor nativo do gene YggB, ou um promotor de um outro gene. Por exemplo, o promotor de um gene YggB da bactéria corineforme pode ser usado. Os exemplos específicos do promotor que funciona nas bactérias Escherichia tais como Escherichia coli incluem, por exemplo, promotor T7, promotor trp, promotor trc, promotor lac, promotor tac, promotor tet, promotor araBAD, promotor rpoH, promotor PR e promotor PL. Os exemplos específicos do promotor que funciona nas bactérias Bacillus tais como Bacillus subtilis incluem, por exemplo, promotor spac, promotor xyl, promotor glv, promotor P43 e promotor P2. Além disso, como um promotor, um tipo altamente ativo de um promotor existente também pode ser obtido pelo uso de vários genes repórter e usado. Por exemplo, pela fabricação as regiões -35 e -10 em uma região promotora mais próxima da sequência de consenso, a atividade do promotor pode ser intensificada (WO 00/18935). Os métodos para avaliar a força dos promotores e os exemplos dos promotores fortes são descritos no documento da Goldstein et al. (Prokaryotic Promoters in Biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)) e assim por diante. Na bactéria da presente invenção, o gene YggB mutante pode estar presente em um vetor que autonomamente replica fora do cromossoma, tal como plasmídeo, ou pode ser incorporado dentro do cromossoma. A bactéria da presente invenção pode ter apenas uma cópia do gene YggB mutante, ou duas ou mais cópias do gene YggB mutante. A bactéria da presente invenção pode ter um tipo do gene YggB mutante, ou dois ou mais tipos do gene YggB mutante. O gene YggB mutante pode ser introduzido, por exemplo, na mesma maneira como aquela do método anteriormente mencionado para aumentar o número de cópia de um gene. [000156] A bactéria da presente invenção pode ter ou não o gene YggB do tipo selvagem. O gene YggB também é aludido como, por exemplo, gene mscS na Escherichia coli, ou gene yflcC na Bacillus subtilis. [000157] Uma bactéria que não tenha o gene YggB tipo selvagem pode ser obtida pelo rompimento do gene YggB tipo selvagem no cromossoma. O gene YggB do tipo selvagem pode ser rompido, por exemplo, pelos métodos anteriormente mencionados para rompimento de um gene. Especificamente, o gene YggB tipo selvagem pode ser rompido, por exemplo, pela deleção uma parte ou o total da região codificadora do gene YggB do tipo selvagem. [000158] Além disso, uma bactéria modificada de modo que a mesma não tenha o gene YggB do tipo selvagem e tem um gene YggB mutante também pode ser obtida pela substituição do gene YggB do tipo selvagem no cromossoma com o gene YggB mutante. Como os métodos para realização de tal substituição de gene, existem, por exemplo, métodos de uso de um DNA linear tal como um método chamado de “integração dirigida por Red” (Datsenko, K.Ae Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97: 6640-6645 (2000)) e um método que utiliza a integração dirigida por Red em combinação com um sistema de excisão derivado do fago λ (Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F., J. Bacteriol., 184: 5200-5203 (2002)) (reportar-se ao WO 2005/010175), um método de uso de um plasmídeo que inclui uma origem de replicação sensível à temperatura, um método de uso de um plasmídeo capaz de transferência conjugativa, um método de utilizar um vetor suicida que não inclui uma origem de replicação que funciona em um hospedeiro (Patente U.S. No. 6.303.383, Patente Japonesa aberta ao Público (Kokai) No. 05- 007491) e assim por diante. <2> Método para produzir a substância de purina [000159] Pelo uso da bactéria da presente invenção, uma substância de purina pode ser produzida pela fermentação. Isto é, a presente invenção fornece um método para produzir uma substância de purina que compreende cultivar a bactéria da presente invenção em um meio para acumular uma substância de purina no meio e coletar as substâncias de purina do meio. No método da presente invenção, um tipo de substância de purina pode ser produzido, ou dois ou mais tipos das substâncias de purina pode ser produzidas. No método da presente invenção, por exemplo, um ou mais tipos dos nucleosídeos de purina podem ser produzidos. No método da presente invenção, por exemplo, um ou mais tipos dos nucleotídeos de purina pode ser produzidos. [000160] O meio a ser usado não é particularmente limitado, contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar nele e uma substância de purina objetiva pode ser produzida. Como o meio, por exemplo, um meio habitual usado para a cultura de bactérias pode ser usado. Como o meio, por exemplo, um meio que contém fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fonte de fósforo e fonte de enxofre, assim como os componentes selecionados de outros vários componentes orgânicos e inorgânicos os componentes como requeridos podem ser usados. Os tipos e concentrações do meio dos componentes podem ser apropriadamente determinados de acordo com várias condições tais como o tipo de bactéria a ser usada e o tipo de substância de purina a ser produzida. [000161] Os exemplos específicos da fonte de carbono incluem, por exemplo, sacarídeos tais como glicose, frutose, sacarose, lactose, galactose, xilose, arabinose, melaços brutos, hidrolisados de amido e hidrolisados de biomassa, ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido fórmico, ácido cítrico e ácido succínico, álcoois tais como glicerol, glicerol bruto e etanol e ácidos alifáticos. Como a fonte de carbono, um único tipo de fonte de carbono pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de carbono pode ser usados em combinação. [000162] Os exemplos específicos da fonte de nitrogênio incluem, por exemplo, sais de amônio tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio, fontes do nitrogênio orgânico tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne e produtos da decomposição da proteína de soja, amônia e uréia. O gás de amônia ou amônia aquosa usados para ajustar o pH também podem ser usados como a fonte de nitrogênio. Como a fonte de nitrogênio, um único tipo de fonte de nitrogênio pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de nitrogênio podem ser usados em combinação. [000163] Os exemplos específicos de fonte de fosfato incluem, por exemplo, sais do ácido fosfórico tais como hidrogeno fosfato de dipotássio e hidrogeno fosfato de dipotássio e polímeros do ácido fosfórico tal como pirofosfórico. Como a fonte de fosfato, um único tipo da fonte de fosfato pode ser usado, ou dois ou mais tipos das fontes de fosfato podem ser usados em combinação. [000164] Os exemplos específicos da fonte de enxofre incluem, por exemplo, compostos de enxofre inorgânico tais como sulfatos, tiossulfatos e sulfatos e aminoácidos que contêm enxofre tais como cisterna, cistina e glutationa. Como a fonte de enxofre, um único tipo de fonte de enxofre pode ser usado, ou dois ou mais tipos de fontes de enxofre podem ser usados em combinação. [000165] Os exemplos específicos de outros vários componentes orgânicos e inorgânicos os componentes incluem, por exemplo, sais inorgânicos tais como cloreto de sódio e cloreto de potássio; os metais traço tais como ferro, manganês, magnésio e cálcio; vitaminas tais como vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, ácido nicotínico, nicotinamida e vitamina BI2; aminoácidos; ácidos nucleicos; e os componentes orgânicos contendo estes tais como peptona, ácido casamino, extrato de levedura e produto da decomposição da proteína de soja. Como outros vários componentes orgânicos e componentes inorgânicos, um único tipo de componente pode ser usado, ou dois ou mais tipos dos componentes podem ser usados em combinação. [000166] Além disso, quando uma cepa mutante auxotrófica que requer um ácido nucleico ou os seus semelhantes para o seu crescimento é usada, é preferível suplementar um nutriente requerido para o meio. Por exemplo, para cultivar uma cepa mutante auxotrófica em adenina tal como cepa deficiente no gene da succinil AMP sintase (purA), adenina ou um componente orgânico que contém adenina pode ser usado. [000167] As condições de cultura não são particularmente limitadas contanto que a bactéria da presente invenção possa proliferar e uma substância de purina objetiva pode ser produzida. A cultura pode ser realizada, por exemplo, sob condições habituais usadas para cultivar bactérias. As condições de cultura podem ser apropriadamente ajustadas de acordo com várias condições tais como o tipo de bactéria a ser usado e o tipo de substância de purina a ser produzida. [000168] A cultura pode ser aerobicamente realizada pelo uso de um meio líquido. Especificamente, a cultura pode ser realizada com aeração ou agitação. A temperatura da cultura pode ser, por exemplo, de 20 a 45° C, preferivelmente de 25 a 37° C. O pH do meio pode ser ajustado, por exemplo, para 5 a 8. Para ajustar o pH, substâncias inorgânicas ou orgânicas ácidas ou alcalinas, tais como gás de amônia e assim por diante, pode ser usado. A o período da cultura pode ser, por exemplo, de 15 a 90 horas. A cultura pode ser realizada como cultura por batelada, cultura por lote alimentado, cultura contínua, ou uma combinação destes. Além disso, a cultura pode ser realizada como duas etapas de uma cultura de semente e uma cultura principal. Em um tal caso, as condições de cultura da cultura de semente e da cultura principal podem ser as mesmas ou não. Por exemplo, tanto a cultura de semente quanto a cultura principal podem ser realizadas como cultura por batelada. Altemativamente, por exemplo, a cultura de semente pode ser realizada como cultura por batelada e a cultura principal pode ser realizada como cultura por lote alimentado ou cultura contínua. Pelo cultivo da bactéria da presente invenção sob tais condições, uma substância de purina é acumulada no meio. [000169] A produção da substância de purina pode ser confirmado pelos métodos conhecidos usados para a detecção ou identificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, HPLC, LC/MS, GC/MS e RMN. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada. [000170] A substância de purina produzida pode ser coletada pelos métodos conhecidos usados para a separação e purificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, método da resina de troca de íon, método de tratamento de membrana, precipitação e cristalização. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada. Quando um nucleotídeo de purina é produzido, o nucleotídeo de purina coletado pode ser um composto livre, um sal do mesmo, ou uma mistura dos mesmos. Isto é, na presente invenção, o termo “nucleotídeo de purina” pode significar um nucleotídeo de purina em uma forma livre, um sal do mesmo, ou uma mistura dos mesmos. Os exemplos do sal incluem, por exemplo, sal de sódio e sal de potássio. Os exemplos específicos do sal do ácido inosínico incluem, por exemplo, sal dissódico de 5’-IMP. Os exemplos específicos do sal de ácido guanílico incluem, por exemplo, sal dissódico de 5’-GMP. A substância de purina coletada pode conter tais componentes como células bacterianas, os componentes do meio, umidade e subprodutos do metabolismo da bactéria, além da substância de purina. A substância de purina pode ser purificada em um grau desejado. A pureza da substância de purina pode ser, por exemplo, de 30 % (w/w) ou mais alta, de 50 % (w/w) ou mais alta, de 70 % (w/w) ou mais alta, de 80 % (w/w) ou mais alta, de 90 % (w/w) ou mais alta, ou de 95 % (w/w) ou mais alta. <3> Método para produzir nucleotídeo de purina [000171] Quando um nucleosídeo de purina é produzido pela bactéria da presente invenção, um nucleotídeo de purina pode ser produzido pelo uso do nucleosídeo de purina. Isto é, a presente invenção fornece um método para produzir um nucleotídeo de purina que compreende cultivar a bactéria da presente invenção tendo uma capacidade de produzir nucleotídeos de purina em um meio para acumular um nucleosídeo de purina no meio, fosforilar o nucleosídeo de purina para gerar um nucleotídeo de purina e coletar o nucleotídeo de purina. [000172] Os exemplos do nucleotídeo de purina incluem ésteres do ácido 5’-fosfórico dos nucleosídeos de purina. Os exemplos dos ésteres do ácido 5’-fosfórico dos nucleosídeos de purina incluem ácido inosínico (5’-fosfato de inosina, IMP), ácido guanílico (5’-fosfato de guanosina, GMP), ácido xantílico (5’-fosfato de xantosina, XMP) e ácido adenílico (5’-fosfato de adenosina, AMP). Neste método, um nucleotídeo de purina que corresponde a o nucleosídeo de purina usado é produzido. Isto é, por exemplo, pode ter produzido ácido inosínico a partir da inosina, ácido guanílico a partir da guanosina, ácido xantílico a partir da xantosina e ácido adenílico a partir da adenosina. No método da presente invenção, um tipo de nucleotídeo de purina pode ser produzido, ou dois ou mais tipos dos nucleotídeos de purina podem ser produzidos. [000173] O nucleosídeo de purina pode ser fosforilado em um estado em que o mesmo está contido no meio, ou fosforilado depois que o mesmo é coletado do meio. O nucleosídeo de purina também pode ser fosforilado depois sendo submetido a um pré-tratamento apropriado. Os exemplos do pré-tratamento incluem, por exemplo, purificação, diluição, concentração, cristalização, dessecação, moagem, dissolução e assim por diante. Estes pré-tratamentos podem ser realizados em uma combinação apropriada. Por exemplo, um meio de cultura que contém um nucleosídeo de purina pode ser usado para a fosforilação como tal ou depois da purificação a um grau desejado. [000174] O método para fosforilar o nucleosídeo de purina não é particularmente limitado. A fosforilação pode ser realizada, por exemplo, pelos métodos conhecidos. [000175] O nucleosídeo de purina pode ser, por exemplo, quimicamente fosforilado. Tal fosforilação química pode ser realizada pelo uso de um agente de fosforilação tal como cloreto de fosforila (POCl3) (Yoshikawa et al., Studies of phosphorylation, III, Selective phosphorylation of unprotected nucleosides, Bull. Chem. Soc. Jpn., 1969, 42: 3505-3508). [000176] A fosforilação também pode ser realizada pelo uso, por exemplo, de um microrganismo ou enzima. Isto é, permitindo-se que um microrganismo tendo uma capacidade de produzir nucleosídeo-5’-fosfato atue em um nucleosídeo de purina e um doador de fosfato, um nucleotídeo de purina pode ser produzido (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 07-231793). Além disso, permitindo-se que uma enzima de fosforilação atue em um nucleosídeo de purina e um doador de fosfato, um nucleotídeo de purina pode ser produzido. [000177] Os exemplos específicos dos microrganismos tendo uma capacidade de produzir nucleosídeo-S^fosfato incluem, por exemplo, tais cepas como mencionado abaixo (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 07-231793).

Escherichia blattae JCM 1650 Serratia ficaria ATCC 33105 Klebsiellaplanticola IFO 14939 (ATCC 33531) Klebsiellapneumoniae IFO 3318 (ATCC 8724) Klebsiella terrigenaWO 14941 (ATCC 33257) Morganella morganii IFO 3168 Enterobacter aerogenes IFO 12010 Enterobacter aerogenes IFO 13534 (ATCC 13048) Chromobactéria fluviatile IAM 13652 Chromobactéria violaceum IFO 12614 Cedecea lapagei JCM 1684 Cedecea davisiae JCM 1685 Cedecea neteri JCM 5909 [000178] Os exemplos da enzima de fosforilação incluem, por exemplo, fosfatase, nucleosídeo cinase e nucleosídeo fosfotransferase. A enzima de fosforilação pode ser ou não uma enzima purificada. Por exemplo, uma fração que contém uma enzima de fosforilação, tal como cultura de um microrganismo que produz uma enzima de fosforilação, sobrenadante de cultura separado da cultura, células separadas da cultura, produto separado das células do microrganismo e produtos parcialmente purificados destes, podem ser usados como a enzima de fosforilação. [000179] Os exemplos do nucleosídeo cinase incluem, por exemplo, inosina-guanosina cinase. Os exemplos específicos do método de usar inosina-guanosina cinase incluem, por exemplo, o método para produzir um nucleotídeo de purina usando uma bactéria Escherichia introduzida com o gene que codifica a inosina-guanosina cinase da Escherichia coli (WO 91/08286) e o método para produzir um nucleotídeo de purina usando Cojynebacterium ammoniagenes introduzida com o gene que codifica a inosina-guanosina cinase da Exiguobacterium acetilicum (WO 96/30501). [000180] Os exemplos da fosfatase incluem, por exemplo, fosfatase ácida. Os exemplos da fosfatase ácida incluem, por exemplo, as fosfatases ácidas divulgadas na Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2002-000289. Os exemplos preferidos da fosfatase ácida incluem, por exemplo, a fosfatase ácida mutante que mostra afinidade aumentada para os nucleosídeos (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 10-201481), a fosfatase ácida mutante que mostra uma atividade do nucleosídeo reduzida (WO 96/37603) e a fosfatase ácida mutante que mostra uma atividade de hidrólise do éster do ácido fosfórico reduzida (Patente Japonesa aberta ao Público (KOKAI) No. 2001-245676). [000181] Os exemplos do doador de fosfato incluem, por exemplo, ácido polifosfórico, fosfato de fenila, fosfato de acetila, fosfato de carbamila, ATP e dATP (desóxi-ATP). Os exemplos de ácido polifosfórico incluem, por exemplo, ácido pirofosfórico, ácido tripolifosfórico, ácido trimetafosfórico, ácido tetrametafosfórico e ácido hexametafosfórico. Os doadores de fosfato podem ser um composto livre, um sal do mesmo, ou uma mistura dos mesmos. Os exemplos do sal incluem, por exemplo, sais de sódio e sais de potássio. O doador de fosfato pode ser apropriadamente escolhido dependendo dos tipos de microrganismo e enzima de fosforilação a serem usados, etc. Além disso, quando ATP ou dATP é usado como o doador de fosfato, um sistema de reciclagem para tal também pode ser usado em combinação (WO91/08286, W096/30501). [000182] A produção do nucleotídeo de purina pode ser confirmado pelos métodos conhecidos usados para a detecção ou identificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, HPLC, LC/MS, GC/MS e RMN. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada. [000183] O nucleotídeo de purina produzido pode ser coletado pelos métodos conhecidos usados para a separação e purificação de compostos. Os exemplos de tais métodos incluem, por exemplo, método da resina de troca de íon, método de tratamento de membrana, precipitação e cristalização. Estes métodos podem ser usados em uma combinação apropriada. O nucleotídeo de purina coletado pode ser um composto livre, um sal do mesmo, ou uma mistura dos mesmos. Os exemplos do sal incluem, por exemplo, sal de sódio e sal de potássio. Os exemplos específicos do sal de ácido inosínico incluem, por exemplo, sal de dissódio de 5’-IMP. Os exemplos específicos do sal do ácido guanílico incluem, por exemplo, sal dissódico de 5’-GMP. O nucleotídeo de purina coletado pode conter tais componentes como enzima de fosforilação, doador de fosfato, células bacterianas, os componentes do meio, umidade e subprodutos do metabolismo da bactéria, além do nucleotídeo de purina. O nucleotídeo de purina pode ser purificado em um grau desejado. A pureza do nucleotídeo de purina pode ser, por exemplo, 30 % (p/p) ou mais alta, 50 % (p/p) ou mais alta, 70 % (p/p) ou mais alta, 80 % (p/p) ou mais alta, 90 % (p/p) ou mais alta, ou 95 % (p/p) ou mais alta.

Exemplo [000184] Daqui por diante, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência a um exemplo. [000185] Exemplo: Produção de inosina usando a cepa introduzida no gene YggB mutante [000186] Neste exemplo, a inosina foi produzida pelo uso de uma cepa que produz inosina da E. coli introduzida com um gene YggB mutante e a influência do gene YggB mutante sobre a produção de inosina foi avaliada.

<1> Construção da cepa que produz inosina da E. coli, cepa FADRaddedd/pMWpurFKQ [000187] Pelo uso da cepa FADRaddedd da E. coli (WO99/003988) como uma cepa precursora, um cepa que produz inosina foi construída. A cepa FADRaddedd é uma cepa obtida da cepa W3110 da E, coli pelo rompimento dos genes purF (amidofosforribosiltransferase), purA (adenilssuccinato sintetase), deoD (purina nucleosídeo fosforilase), purR (repressor da biossíntese de purina), add (adenosina desaminase) e edd (fosfogliconato desidratase). Pela introdução de um gene mutante purF que codifica um tipo dessensibilizado da amidofosforibosiltransferase do qual a inibição da retroalimentação é dessensibilizada na cepa FADRaddedd e expressando-a, uma cepa que de modo altamente eficiente produz inosina pode ser construída (WO99/003988). Portanto, o plasmídeo pMWpurFKQ que expressa um gene mutante purF (descrito na EP 1170370 A) foi introduzido dentro da cepa FADRaddedd pela eletroporação (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)). Um dos transformantes obtidos foi designado como FADRaddedd/ pMWpurFKQ. <2> Construção do gene YggB mutante que expressa plasmídeo [000188] Os plasmídeos para expressar genes YggB mutantes das bactérias corineformes em bactérias Escherichia, pSTV-Fgg-R(BL2) e pSTV-YggBÇBL3\ foram construídos como segue. [000189] O DNA cromossômico foi extraído de cada cepa que abriga um gene YggB tendo a mutação do tipo L30 e uma cepa que abriga um gene YggB tendo a mutação do tipo Al construída a partir da cepa Brevibacteriwn lactofermentum 2256 (Corynebacterium glutamicum ATCC 13869) (Patente Japonesa Aberta ao Público (KOKAI) No. 2007-97573). Pela PCR usando cada DNA cromossômico extraído como o padrão e os iniciadores mostrados na SEQ ID NO: 1 (iniciador A, 5’-gctaagcttctaaggaggtcttggctcatg-3’) e SEQ ID NO: 2 (iniciador B, 5’-gtaggatcctgggacacgtctgtaatcagc-3’) (desnaturação a 98°C por 10 segundos, recozendo a 60°C por 15 segundos e extensão a 68°C por 78 segundos, 30 ciclos, TaKaRa PCR Thermal Cycler PERSONAL (Takara Bio)), um fragmento de DNA de cerca de 1,6 kb contendo cada gene YggB mutante foi amplificado. Para a PCR, GXL Polymerase (Takara Bio) foi usado. Os iniciadores foram planejados de modo que uma região que contém a sequencia de ligação de ribossoma (sequência SD) a montante do códon de início de tradução do gene YggB mutante foi amplificado. A sequência de nucleotídeo de um fragmento amplificado que inclui o gene YggB e a sequência SD obtida pela PCR usando estes iniciadores é mostrada na SEQ ID NO: 3, contanto que o gene YggB contido nesta sequência seja o gene do tipo selvagem. Depois que cada fragmento amplificado foi purificado, os sítios de restrição de enzima formados em ambas as extremidades foram digeridos com BamHl e Hindlll. Cada fragmento amplificado digerido e um fragmento do vetor pSTV29 de cerca de 3,0 kbs (Takara Bio) similarmente digerido com as enzimas de restrição BamHl e Hindlll foram ligados pelo uso do Kit de Ligação de DNA ver. 2.1 (Takara Bio). Escherichia coli (células competentes de E. coli JM109, Takara Bio) foi transformada com esta solução de ligação, aplicada sobre o meio de LB ágar contendo 50 mg/L de cloranfenicol e incubados durante a noite a 37° C. Cada colônia que emergiu no meio de ágar foi inoculada no meio líquido LB que contém 50 mg/L de cloranfenicol e cultivada durante a noite a 37° C com agitação. O DNA plasmídico foi extraído de cada caldo de cultura pelo método do álcali-SDS. A estrutura do plasmídeo foi confirmada pela digestão com enzimas de restrição e determinação da sequência de nucleotídeo, para obter pSTV-YggB{BL2) e pSTV-T^5(BL3). O plasmídeo pSTV-f%g£(BL2) é um plasmídeo de expressão no lugar do gene YggB mutante tendo a mutação do tipo L30 e o plasmídeo pSTV-Tggi?(BL3) é um plasmídeo de expressão no lugar do gene YggB mutante tendo a mutação do tipo Al. O gene YggB mutante tendo a mutação do tipo L30 é um gene YggB em que “C” na posição 332 na SEQ ID NO: 8 foi substituído com “T” e codifica uma proteína YggB na qual o resíduo de alanina na posição 111 na SEQ ID NO: 9 foi substituída com um resíduo de valina. A sequência de nucleotídeo do gene YggB mutante (mutação do tipo L30) e a sequência de aminoácido da proteína YggB mutante codificada por este gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 4 e 5, respectivamente. O gene YggB mutante tendo a mutação do tipo Al é um gene YggB em que TTCATTGTG foi inserido no contíguo de “G” na posição 44 na SEQ ID NO: 8 e codifica uma proteína YggB em que Cys-Ser-Leu foi inserido entre o resíduo de leucina na posição 14 e o resíduo de triptofano na posição 15 na SEQ ID NO: 9. A sequência de nucleotídeo do gene YggB mutante (mutação do tipo Al) e a sequência de aminoácido da proteína YggB mutante codificadas por este gene são mostradas nas SEQ ID NOS: 6 e 7, respectivamente. Em ambos os plasmídeos, o gene YggB mutante é disposto de modo que a sua direção de transcrição é a mesma como a direção de transcrição do promotor lac do vetor pSTV29.

<3> A introdução de p S TV- YggB (B L 2) e p S TV - YggBÇB L3 ) dentro da cepa da E. coli que produz inosina, FADRaddedd/pMWpurFKQ [000190] pSTV-TggR(BL2) e pSTV-Fggi?(BL3) obtidas como descrito acima, assim como o vetor pSTV29 como um controle foram cada um introduzidos dentro da cepa da E. coli que produz inosina, FADRaddedd/pMWpurFKQ, pelo método 2xTSS (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, 2172 (1989)). Um transformante foi selecionado de cada um dos conjuntos de transformante obtidos e os transformantes selecionados foram designados como FADRaddedd/pMWpurFKQ/pSTV-7ggR(BL2), FADRaddedd/pMWpurFKQ/pSTV-FggR(BL3) e FADRaddedd/ pMWpurFKQ/pSTV29, respectivamente. <4> Produção de inosina [000191] Cada uma das cepas obtidas como descrito acima foi uniformemente aplicada em uma placa do meio LB que contém antibióticos (10 g/L de triptona, 10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl, 25 mg/L de canamicina e 50 mg/L de cloranfenicol) e cultivadas durante a noite a 37° C. As células que correspondem a 1/6 da placa foram inoculadas em 20 ml de um meio de fermentação contido em um frasco de Sakaguchi de 500 ml de volume e cultivadas a 37° C por 24 horas (cultura de semente). Uma parte do caldo da cultura de semente foi adicionado a 20 ml do meio de fermentação fresco de modo que a absorbância da mistura em um comprimento de onda de 660 nm tomasse 1,0 e a cultura principal foi realizada a 37° C. Depois do início da cultura principal, o caldo da cultura foi amostrado a cada 3 horas em 24 horas e as quantidades de açúcar residual, inosina e hipoxantina contidas no caldo de cultura foram medidas pelos métodos conhecidos. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Melhora significante da quantidade de produção de inosina foi observada para a cepa introduzida em pSTV-Tgg-i?(BL2) e a cepa introduzida em pSTV-Fggi?(BL3) comparadas com a cepa introduzida no vetor pSTV29 como o controle. [Composição do meio de fermentação] Glicose 40 g/L

(NH4)2S04 16 g/L

KH2P04 1 g/L

MgS04-7H20 1 g/L

FeS04*7H20 0,01 g/L

MnS04*5H20 0,01 g/L

Extrato de levedura 8 g/L

Canamicina 25 mg/L

Cloranfenicol 50 mg/L

Isopropil-P-D-galactopiranosídeo 0,1 M Carbonato de cálcio 30 g/L [Tabela 1] Tabela 1: Quantidades de produção de inosina e hipoxantina, quantidade de açúcar consumida e crescimento observado depois da cultura em 24 horas (todas foram médias de resultados de cultivo em duplicata) [000192] Explicação da Listagem de Sequência [000193] SEQ ID NOS: 1 e 2, Iniciadores [000194] SEQ ID NO: 3, Sequência de nucleotídeo do gene YggB que contém fragmento e sequência SD

Claims (20)

1. Bactéria tendo uma capacidade de produzir a substância de purina, a bactéria caracterizada pelo fato de que é uma bactéria de Escherichia, uma bactéria de Bacilliis, ou Corynebacterium ammoniagenes, e que foi modificada de modo a abrigar um gene YggB mutante, em que o gene YggB mutante é um gene YggB tendo uma mutação que melhora a capacidade de produzir a substância de purina da bactéria.

2. Bactéria de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mutação é selecionada do grupo que consiste das mutações de (1) a (3) que seguem: (1) uma mutação na região que codifica os resíduos de aminoácido nas posições 419 a 533 de uma proteína YggB do tipo selvagem, (2) uma mutação na região que codifica uma região de transmembrana de uma proteína YggB do tipo selvagem, e (3) uma combinação das mutações de (1) e (2).

3. Bactéria de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mutação (1) é a inserção de uma sequência de nucleotídeo na região que codifica os resíduos de aminoácido nas posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem.

4. Bactéria de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mutação (1) é uma mutação para substituir um resíduo de prolina presente na região das posições 419 a 533 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido.

5. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 4, caracterizada pelo fato de que a região de transmembrana é selecionada dos resíduos de aminoácido das posições 1 a 23, 25 a 47, 62 a 84, 86 a 108 e 110a 132 da proteína YggB do tipo selvagem.

6. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 5, caracterizada pelo fato de que a mutação (2) não inclui a mutação de mudança de matriz ou mutação sem sentido.

7. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 2 a 6, caracterizada pelo fato de que a mutação (2) é selecionada do grupo que consiste das mutações de (2a) a (2d) que seguem: (2a) uma mutação para inserir um ou vários resíduos de aminoácido entre o resíduo de leucina na posição 14 e o resíduo de triptofano na posição 15 da proteína YggB do tipo selvagem, (2b) uma mutação para substituir o resíduo de alanina na posição 100 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido, (2c) uma mutação para substituir o resíduo de alanina na posição 111 da proteína YggB do tipo selvagem com um outro resíduo de aminoácido, e (2d) uma combinação das mutações de (2a) a (2c).

8. Bactéria de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que Cys-Ser-Leu é inserido entre o resíduo de leucina na posição 14 e o resíduo de triptofano na posição 15.

9. Bactéria de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o resíduo de alanina na posição 100 e/ou na posição 111 é substituído com um resíduo de treonina.

10. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a proteína YggB do tipo selvagem é uma proteína definida em (A) ou (B) que seguem: (A) uma proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, 11, 13, ou 15, (B) uma proteína tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, 11, 13, ou 15 que inclui substituição, deleção, inserção, ou adição de um ou vários resíduos de aminoácido e funcionando como um canal mecanossensível.

11. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizada pelo fato de que foi modificada de modo que a atividade de uma enzima envolvida na biossíntese de uma substância de purina seja aumentada.

12. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a substância de purina é selecionada do grupo que consiste de inosina, xantosina, guanosina e adenosina.

13. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a substância de purina é selecionada do grupo que consiste de ácido inosínico, ácido xantílico e ácido guanílico.

14. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é Escherichia coli.

15. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é Bacillus subtilis ou Bacillus amiloliquefaciens.

16. Bactéria de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é Corynebacterium ammoniagenes.

17. Método para produzir uma substância de purina, o método caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a bactéria como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16 em um meio para acumular a substância de purina no meio e coletar a substância de purina do meio.

18. Método para produzir um nucleosídeo de purina, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a bactéria como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16 em um meio para acumular o nucleosídeo de purina no meio e coletar o nucleosídeo de purina do meio.

19. Método para produzir um nucleotídeo de purina, o método caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a bactéria como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16 em um meio para acumular o nucleotídeo de purina no meio e coletar o nucleotídeo de purina do meio.

20. Método para produzir um nucleotídeo de purina, o método caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a bactéria como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 16 em um meio para acumular um nucleosídeo de purina no meio, fosforilar o nucleosídeo de purina para gerar o nucleotídeo de purina e coletar o nucleotídeo de purina. A requerente apresenta novas vias das páginas 14/65, 36/65, 64/65 e 65/65 do relatório descritivo para melhor esclarecer e definir o presente pedido. de inosina foi observada para a cepa introduzida em pSTV-Fggi?(BL2) e a cepa introduzida em pSTV- YggBÇSL3) comparadas com a cepa introduzida no vetor pSTV29 como o controle. [Composição do meio de fermentação] Glicose 40 g/L (NH4)2S04 16 g/L KH2P04 1 g/L MgS04*7H20 1 g/L FeS04-7H20 0,01 g/L MnS04*5H20 0,01 g/L Extrato de levedura 8 g/L Canamicina 25 mg/L Cloranfenicol 50 mg/L Isopropil-P-D-galactopiranosídeo 0,1 mM Carbonato de cálcio 30 g/L [Tabela 1] Tabela 1: Quantidades de produção de inosina e hipoxantina, quantidade de açúcar consumida e crescimento observado depois da cultura em 24 horas (todas foram médias de resultados de cultivo em duplicata) [000192] Explicação da Listagem de Sequência [000193] SEQ ID NOS: 1 e 2, Iniciadores [000194] SEQ ID NO: 3, Sequência de nucleotídeo do gene YggB que contém fragmento e sequência SD [000195] SEQ ID NO: 4, Sequência de nucleotídeo do gene YggB mutante (BL2) de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) [000196] SEQ ID NO: 5, Sequencia de aminoácido de proteínas codificadas pelo gene YggB mutante (BL2) de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) [000197] SEQ ID NO: 6, Sequência de nucleotídeo do gene YggB mutante (BL3) de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) [000198] SEQ ID NO: 7, Sequência de aminoácido de proteína codificada pelo gene YggB mutante (BL3) de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) [000199] SEQ ID NO: 8, Sequência de nucleotídeo do gene YggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) [000200] SEQ ID NO: 9, Sequência de aminoácido da proteína YggB de Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC 13869) [000201] SEQ ID NO: 10, Sequência de nucleotídeo do gene YggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 [000202] SEQ ID NO: 11, Sequência de aminoácido da proteína YggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 [000203] SEQ ID NO: 12, Sequência de nucleotídeo do gene YggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 [000204] SEQ ID NO: 13, Sequência de aminoácido da proteína YggB de Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 [000205] SEQ ID NO: 14, Sequência de nucleotídeo do gene YggB de Corynebacterium melassecola ATCC 17965 [000206] SEQ ID NO: 15, Sequência de aminoácido da proteína YggB de Corynebacterium melassecola ATCC 17965 . - [000207] SEQ ID NO: 16, Sequência conservada de proteínas YggB do tipo selvagem da bactéria corineforme