KR100642971B1

KR100642971B1 - 핵산 물질 생산 방법

Info

Publication number: KR100642971B1
Application number: KR1019990021717A
Authority: KR
Inventors: 사토가쓰아키; 우스다요시히로
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2006-11-13
Also published as: ID22863A; CN1239143A; US6284495B1; CN1150333C; JPH11346778A; JP4913929B2; KR20000006105A

Abstract

퓨린 오페론에 대한 리프레서 단백질이 정상적으로 기능하지 않는 미생물, 바람직하게는 염색체 상에서 리프레서 단백질을 암호화하는 유전자(purR)가 파괴된 균주를 배양 배지에서 배양하여, 결과적으로 핵산 물질이 배양 배지 내에 축적되고, 이를 배양 배지로부터 수거함으로써 핵산 물질이 효과적으로 생산된다.

핵산 물질, 핵산 염기, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 퓨린 오페론, 리프레서 단백질, 바실러스 서브틸리스, 상동 재조합

Description

핵산 물질 생산 방법 {Method for producing nucleic acid substances}

도 1은 플라스미드 pHSG398BSPR의 구조를 나타낸다. 굵은 선은 바실러스 서브틸리스 SB112로부터 유도된 purR 유전자를 나타낸다. 괄호안의 수는 개시 위치가 1로 정의된 경우 암호화 영역내의 위치를 나타낸다. 보통 선은 플라스미드 pHSG398을 나타낸다.

도 2는 제한 효소 HincII 및 EcoRV를 사용하여 pHSG398BSPR을 완전히 절단하여 수득한 단편들을 나타낸다.

도 3은 pruR 유전자 파괴용 플라스미드 pHSG398△BSPR:Sp^r의 구조를 나타낸다. 굵은 선은 바실러스 서브틸리스 SB112의 파괴된 purR 유전자(△purR)를 나타낸다. 괄호안의 수는 개시 위치가 1로 정의된 경우 암호화 영역내의 위치를 나타낸다. 보통 선은 스펙티노마이신 내성 유전자를 나타내며, 점선은 플라스미드 pHSG398을 나타낸다.

본 발명은 발효에 의한 핵산 물질의 생산 방법에 관한 것이다. 핵산 물질은 산업적으로 조미료 등의 물질로서 유용하다.

발효에 의한 이노신, 구아노신 및 이의 염기들(히포크산틴 및 구아닌 등) 같은 핵산 물질의 생산에 있어서, 통상적으로는 배양 배지내에 제한적인 양의 아데닌 물질을 함유하는, 아데닌 요구성이고 핵산 동족체 내성을 갖는 돌연변이 균주를 사용해 왔다[일본 특허 공보(KOKOKU) 제Sho 55-2956호 및 제Sho 55-45199호].

통상적인 돌연변이 유발 방법에 의해 수득되는 돌연변이 균주는 표적 유전자 보다 자신의 유전자들내에 돌연변이가 종종 도입된다. 부가적으로, 복잡한 조절 메카니즘이 핵산 물질의 생합성 경로에 관여하기 때문에, 유의한 양의 핵산 물질을 생산하는 미생물을 수득하는 것이 어렵다. 따라서, 통상적인 육종 방법으로 수득한 돌연변이 균주는 필연적인 결과로서 만족할 만한 균주가 되지 못했다.

한편, 퓨린 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자 서열(퓨린 오페론)을 변형시킴으로써 수득되는 강화된 퓨린 오페론 발현을 나타내는 바실러스 속에 속하는 세균을 이용하여 이노신 또는 구아노신을 생산하는 방법이 기술되어 왔다[미심사된 일본 특허 공개 공보(KOKAI) 제Hei 3-164185호]. 이러한 방법은 퓨린 오페론의 프로모터 또는 오퍼레이터가 변형되어 오페론의 발현율이 증가하여, 이노신 또는 구아노신의 생산이 증가하는 것이 특징이다.

바실러스 서브틸리스의 퓨린 오페론의 발현(purEKBC(ORF)OLFMNHD, 이때 ORF는 비공지된 기능의 전사 해독 프레임을 나타낸다)은 과량의 아데닌에 의해 억제되며, 또한 구아닌에 의해 야기되는 감쇠화(attenuation)에 의해 조절된다. 추가로, 퓨린 오페론의 5' 플랭킹(flanking) 영역에 결합하는 리프레서 단백질 및 상기 단백질을 암호화하는 유전자(purR)가 분리되었으며, purR 유전자가 파괴된 바실러스 서브틸리스 균주에서, 퓨린 오페론내로 통합된 purC-lacZ 융합 유전자의 발현에 있어서와 같이 아데닌에 의한 억제는 약 1/10 정도로 감소한다는 보고가 있었다[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 7455-7549(1995)].

바실러스 서브틸리스에서, 리프레서 단백질은 퓨린 오페론의 유전자의 발현에 부가하여, 아데닌의 생합성에 관련된 purA 유전자 및 피리미딘 생합성에 관련된 피리미딘 오페론의 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 공지되어 왔다[1997, J. Bacteriol. 179, 7394-7402, H. Zalkin).

한편, 에스케리치아 콜라이에서, 퓨린 오페론의 리프레서는 퓨린 오페론의 유전자들에 부가하여, 5'-IMP(이노신산) 생합성의 기질이 되는 글리신의 생합성에 관련된 glyA 유전자의 발현[1990, J. Bacteriol. 172, 3799-3803, H. Zalkin et al.], 및 글리신으로부터 공급되는 C₁ 및 CO₂의 생산에 관련된 gcv 오페론 유전자들의 발현에도 또한 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다[1993, J. Bacteriol. 175, 5129-5134, G. V. Stauffer et al.].

상기한 바와 같이, 퓨린 오페론 및 이노신 또는 구아노신 생산 사이의 관련성에 관한 수차례의 연구 보고가 있었다. 그러나, purR 유전자와 관련된 다양한 생합성 경로들이 존재한다. 추가로, 바실러스 서브틸리스의 퓨린 오페론은 10개의 효소를 암호화하며, 수많은 반응에 관여한다. 따라서, 핵산 물질의 생합성 경로는 매우 복잡하며, purR 유전자 및 핵산 물질의 축적 사이의 관련성은 거의 공지되지 않았다.

본 발명의 목적은 핵산 물질의 산업적 중요성의 견지에서 통상적인 방법과 비교해 볼때 보다 유리하게 핵산 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기한 목적을 달성하고자 성실히 purR 유전자의 기능에 대한 연구를 수행하였고, 결과로서, purR 유전자가 파괴된 바실러스 서브틸리스 균주가 핵산 물질을 축적한다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 본 발명이 달성되었다.

즉, 본 발명은,

(1) 퓨린 오페론에 대한 리프레서 단백질이 정상적으로 기능하지 않는 미생물을 배양 배지에서 배양하여, 핵산 물질을 배양 배지 내에서 생산하고 축적시켜, 이를 배양 배지로부터 수거하는 단계를 포함하는 핵산 물질의 생산 방법;

(2) 미생물의 염색체 상에서 리프레서 단백질을 암호화하는 유전자가 파괴되었기 때문에, 리프레서 단백질이 정상적으로 기능하지 않는, 상기 (1)에서 정의된 방법;

(3) 리프레서 단백질이 서열 6에서 나타낸 아미노산 서열을 갖는 상기 (1)에서 정의된 방법;

(4) 미생물이 바실러스 속에 속하는 세균인, 상기 (1)에서 정의된 방법;

(5) 미생물이 바실러스 서브틸리스인, 상기 (4)에서 정의된 방법;

(6) 핵산 물질이 핵산 염기, 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드인, 상기 (1) 에서 정의된 방법; 및

(7) 핵산 물질이 히포크산틴, 우라실, 구아닌 및 아데닌으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 상기 (6)에서 정의된 방법을 제공한다.

본 발명의 목적상, "퓨린 오페론의 리프레서 단백질이 정상적으로 기능하지 않는다"라는 표현은 리프레서 단백질이 퓨린 오페론의 5' 플랭킹 영역에 결합하고, 이에 따라 오페론의 전사를 억제하는 기능이 정상 수준에 비해 감소되거나, 실질적으로 기능이 제거되는 것을 의미한다.

본 발명에서, 핵산 물질은 히포크산틴, 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민 및 시토신 같은 핵산 염기, 이노신, 아데노신, 구아노신, 우리딘, 티미딘 및 시티딘 같은 뉴클레오사이드, 이노신산, 아데닐산, 구아닐산, 우리딜산, 티미딜산 및 시티딜산 같은 뉴클레오타이드, 및 상기 뉴클레오사이드 또는 리보오스가 데옥시리보오스로 교체된 상기 뉴클레오타이드 중 임의의 하나로 이루어지는 화합물을 포함한다. 이들 중에, 핵산 염기가 바람직하다. 본 발명에서, 핵산 물질은 퓨린 화합물 및 피리미딘 화합물 모두를 포함한다. 이러한 퓨린 화합물은 퓨린 염기, 및 퓨린 염기를 갖는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 피리미딘 화합물은 피리미딘 염기, 및 피리미딘 염기를 갖는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명에서, 퓨린 화합물로서 히포크산틴, 아데닌 및 구아닌이 바람직하며, 피리미딘 화합물로서 우라실이 바람직하다.

본 발명은 하기에서 상세히 기술된다.

본 발명의 방법에 사용되는 미생물은 퓨린 오페론의 리프레서 단백질(하기에서 또한 단순히 "리프레서"로 인용됨)이 정상적인 방법으로 기능하지 않는 미생물이다. 미생물은, 퓨린 화합물의 생합성 효소에 대한 미생물의 유전자들이 오페론을 형성하고, 미생물이 오페론의 조절에 관여하는 리프레서(purR)를 암호화하는 유전자를 갖는 한, 특별히 제한되지 않는다. 이러한 미생물의 예는 바실러스 속 등에 속하는 세균을 포함한다. 바실러스 속의 세균의 특정 예는 예를 들어, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 아밀로리퀘패시언스(Bacillus amyloliquefaciens) 등을 포함한다.

리프레서가 정상적으로 기능하지 않는 미생물은 미생물의 purR 유전자를 변형시킴으로써 수득할 수 있으며 결과적으로 리프레서의 활성은 감소하거나 제거되거나, 또는 purR 유전자의 전사는 감소하거나 제거되어야 한다. 이러한 미생물은 예를 들어, 유전자 재조합 기술에 기초하여 상동성 재조합을 통해, 예를 들어 염색체성 purR 유전자를 정상적으로 기능하지 않는 purR 유전자(하기에서 종종 "파괴된 purR 유전자"로 인용됨)로 대체함으로써, 수득할 수 있다[Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)].

상동성 재조합에서, 염색체성 서열 등과 상동성을 나타내는 서열을 갖는 플라스미드가 상응하는 세균 세포내로 도입되는 경우, 재조합은 상동성 서열 부위에서 특정한 빈도로 나타나며, 결과적으로 도입된 플라스미드 전부가 염색체 상에 통합된다. 이후, 염색체에서 상동성 서열 부위에서 다시 재조합을 일으킴으로써, 플라스미드는 염색체로부터 제거될 수 있다. 그러나, 재조합이 일어나는 부위에 따라서, 파괴된 유전자는 염색체 상에 잔류할 수 있는 반면, 원래의 정상 유전자는 플라스미드와 함께 염색체로부터 제거될 수 있다. 이러한 세균 균주를 선택함으로써, 정상 purR 유전자가 파괴된 purR 유전자로 대체된 세균 균주를 수득할 수 있다.

상동 재조합에 기초한 이러한 유전자 파괴 기술은 이미 확립되어 있으며, 그 대용으로, 선형 DNA를 사용하는 방법, 온도 민감성 플라스미드를 사용하는 방법 등을 사용할 수 있다. purR 유전자는 또한 약제 내성 유전자 같은 표지(marker) 유전자를 삽입한 purR 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용하여 파괴할 수 있으며, 표적 미생물 세포내에서 복제할 수 없다. 즉, 이러한 플라스미드로 형질전환되어 후천적으로 약제 내성을 갖는 형질전환체에서, 표지 유전자는 염색체성 DNA내로 통합된다. 이러한 표지 유전자는 표지의 양쪽에 존재하는 purR 유전자를 염색체 상의 purR 유전자와의 상동 재조합에 의해 통합되며, 따라서 유전자-파괴된 균주는 효과적으로 선택될 수 있다.

특이적으로, 유전자 파괴에 사용되는 파괴된 purR 유전자는 제한 효소(들)를 사용한 절단 및 재-결합을 수단으로 하여 purR 유전자의 특정 영역을 결실시킴으로써; 부위-특이적인 돌연변이 유발[Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)] 또는 차아황산나트륨 및 하이드록실아민 같은 화학제를 사용한 처리[Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)]를 수단으로 하여 purR 유전자의 암호화 영역, 이의 프로모터 영역 등의 뉴클레오타이드 서열 중에 하나 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 도입시킴으로써, purR 유전자내로 다른 DNA 단편(표지 유전자 등)을 삽입하여 수득할 수 있으며, 결과적으로 암호화된 리프레서의 활성은 감소하거나 제거되며, 또는 purR 유전자의 전사는 감소하거나 제거되어야 한다. 이러한 양태 중에서, 제한 효소에 의한 절단 및 재-결합에 의한 purR 유전자의 특정 영역의 결실 또는 다른 DNA 단편의 purR 유전자내로의 삽입을 사용한 방법이 신뢰성 및 안정성의 견지에서 바람직하다.

purR 유전자는 프라이머로서 purR 유전자의 공지된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 PCR에 의해 퓨린 오페론을 갖는 미생물의 염색체성 DNA로부터 수득할 수 있다. purR 유전자는 또한 프로브로서 purR 유전자의 공지된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 하이브리드화 기술에 의해 퓨린 오페론을 갖는 미생물의 염색체성 DNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. purR 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 바실러스 서브틸리스 168 마르부르그 균주[진뱅크 접근 번호 제D26185호(암호화 영역은 뉴클레오타이드 118041 내지 118898에 상응한다), DDBB 접근 번호 제Z99104호(암호화 영역은 뉴클레오타이드 54439 내지 55296에 상응한다)]에 대해 보고되어 있다. purR 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 상기 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 서열 목록에서 서열 5 및 6으로 나타낸다. 본 발명의 목적상, purR 유전자는 파괴된 purR 유전자를 제조하기 위해서 사용하기 때문에, 완전한 길이를 함유할 필요는 없으며, 이는 유전자 파괴를 유발하는데 필요한 길이를 함유할 수 있다.

purR 유전자를 수득하기 위해 사용된 미생물은, 미생물의 purR 유전자가 유전자-파괴된 균주를 제조하는데 사용되는 미생물의 purR 유전자와 상동성 재조합이 가능한 정도의 상동성을 갖는한, 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 일반적으로 동일한 미생물을 사용하는 것이 바람직하다.

PCR을 위해 사용되는 프라이머는 purR 유전자를 증폭할 수 있는 임의의 하나일 수 있으며, 이의 특정 예는 서열 1 또는 서열 2에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

표지 유전자의 예는 예를 들어, 스펙티노마이신 내성 유전자 같은 약제 내성 유전자를 포함한다. 스펙티노마이신 내성 유전자는 바실러스 제네틱 스톡 센터(Bacillus Genetic Stock Center, BGSC)로부터 상업적으로 구입 가능한 에스케리치아 콜라이 ECE101 균주로부터 플라스미드 pDG1726을 작제하고, 상기 플라스미드로부터 카셋트로서 상기 유전자를 절단해 냄으로써 수득할 수 있다.

약제 내성 유전자를 마커 유전자로서 사용하는 경우, purR 유전자-파괴된 균주는, 약제 내성 유전자를 플라스미드내에 포함된 purR 유전자의 적합한 위치에 삽입하고, 상기 플라스미드로 미생물을 형질전환시키고, 약제 내성 형질전환체를 선택함으로써 수득할 수 있다. 염색체 상의 purR 유전자의 파괴는 서던 블롯팅, PCR 등에 의해 염색체 상의 purR 유전자 또는 마커 유전자를 분석함으로써 확인할 수 있다. 스펙티노마이신 내성 유전자의 염색체상 DNA내로의 통합은 스펙티노마이신 내성 유전자(예를 들어, 서열 3 및 서열 4에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드)의 증폭을 가능하게 하는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 확인할 수 있다.

상기에서 기술된 바와 같이 수득된, 리프레서가 정상적으로 기능하지 않는 미생물을 적합한 배양 배지에서 배양함으로써, 핵산 물질을 생산하고 배양 배지에 축적시킬 수 있다.

본 발명에 사용되는 배양 배지로서, 탄소원, 질소원, 무기 염 및, 필요에 따라 아미노산 및 비타민 같은 유기 극미량 영양분을 함유하는 통상의 영양 배지가 사용될 수 있으며, 배양은 통상적인 방법으로 수행할 수 있다. 합성 배양 배지 또는 천연 배지가 사용될 수 있다. 배양 배지에 사용되는 탄소원 및 질소원은 이들이 세균 균주에 의해 사용되어 배양될 수 있는 한 모든 종류일 수 있다.

탄소원으로서, 글루코스, 글리세롤, 프럭토스, 수크로즈, 말토즈, 만노스, 갈락토스, 전분 가수분해물 및 당밀 같은 당류를 사용할 수 있으며, 아세트산 및 시트르산 같은 유기산을 그 자체로 또는 기타 탄소원과 혼합하여 사용할 수 있다.

질소원으로서, 암모니아, 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄 및 아세트산 암모늄 같은 암모늄염 및 질산염 등을 사용할 수 있다.

극미량 영양분으로서, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산 뿐만 아니라 전술한 물질들을 함유하는 펩톤, 카스아미노산(casamino acid), 효모 추출물 및 대두 단백질 분해 산물 등을 사용할 수 있다. 성장을 위해 아미노산 등을 필요로 하는 성장 인자 요구성 돌연변이체를 사용하는 경우, 필요한 영양분을 공급하는 것이 필요하다.

무기염으로서, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염 및 망간염 등을 사용할 수 있다.

배양 조건은 사용되는 미생물의 종류에 의존한다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스는 발효 온도 20 내지 25℃ 및 pH 4 내지 9로 조절하면서 호기성 배양으로 배양한다. pH가 배양 동안 낮아지는 경우, 배지는 암모니아 가스 같은 알칼리로 중화시킬 수 있다. 핵산 물질은 상기한 바와 같이 약 40시간 내지 3일 동안 배양을 수행함으로써 배양 배지내에 축적된다.

배양을 완결한 후, 배양 배지내에 축적된 핵산 물질을 공지된 방법으로 회수할 수 있다. 예를 들어, 침전, 이온 교환 크로마토그래피 등으로 분리할 수 있다.

본 발명에 사용되는 미생물이 뉴클레오시다제 또는 뉴클레오티다제를 암호화하는 유전자 결핍이 되는 경우, 상응하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드가 축적될 수 있다. 미생물이 아데닌 또는 구아닌 요구성인 경우, 이러한 물질 및 관련 물질의 생합성 경로에서 전구체들이 축적될 수 있다.

추가로, 본 발명의 방법에 의해 생산된 핵산 염기를 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 또는 포스포리보실트랜스퍼라제를 사용하여 처리함으로써, 당해 염기에 상응하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 수득할 수 있다.

본 발명은 하기 실시예들을 참조로하여 보다 구체적으로 기술된다.

<1> purR 유전자의 클로닝

바실러스 서브틸리스 168 마르부르그 균주(ATCC 6051)의 purR 유전자를 함유하는 DNA 단편은 상기 세균의 염색체성 DNA를 주형으로서 사용하여 PCR에 의해 수득하였다.

염색체성 DNA는 하기와 같이 제조하였다. 바실러스 서브틸리스 ATCC 6051 균주를 LB 배지 50㎖에 접종하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 회수하여 리소자임 1㎎/㎖를 함유하는 용해액을 사용하여 용해시켰다. 용해물을 페놀로 처리한 후 DNA를 통상적인 방법으로 에탄올 침전법으로 침전시켰다. 생성된 DNA 침전물을 유리막대로 감아 올려 세척한 후 PCR에 사용하였다.

PCR용 프라이머로서, 서열 1 및 2(이들의 합성은 재팬 바이오서비스사(Japan Bioservice Co., Ltd.)에 위탁되었다)에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드는 바실러스 서브틸리스 168 마르부르그 균주[진뱅크 접근 번호 제D26185호(암호화 영역은 뉴클레오타이드 118041 내지 118898에 상응한다), DDBB 접근 번호 제Z99104호(암호화 영역은 뉴클레오타이드 54439 내지 55296에 상응한다)]의 purR 유전자의 공지된 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 디자인되었다. 이러한 프라이머는 5' 및 3' 말단 근처에 각각 HindIII 및 PstI 제한 효소 인식 서열을 갖는다.

PCR은 염색체성 DNA 6ng/μl 및 프라이머 3μM을 함유하는 PCR 반응 용액 0.1㎖ 중에서, 94℃에서 1분 동안 변성, 45℃에서 1분 동안 어닐링 및 72℃에서 1분 동안 연장 반응하는 반응 주기를 30회 반복하여 수행하였다.

반응 생성물 및 플라스미드 pHSG398(제조원: 다카라 슈조사)을 HindIII 및 PstI으로 절단하고, 라이게이션 키트(ligation kit, 제조원: 다카라 슈조사)를 사용하여 결합하였다. 생성된 재조합 플라스미드를 사용하여, 에스케리치아 콜라이 JM109를 형질전환시켰다. 형질전환체를 30μ/㎖ 클로람페니콜(Cm) 및 X-Gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-B-D-갈락토시드)을 함유하는 LB 아가 배지에서 배양하여 클로람페니콜 내성 형질전환체의 백색 콜로니를 수득하였다. 플라스미드를 상기와 같이 수득된 형질전환체로부터 추출하고, 표적 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 pHSG398BSPR(도 1)이라고 명명하였다.

<2> 파괴된 purR 유전자(△purR)를 함유하는 플라스미드의 작제

플라스미드 pDG1726을 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 상업적으로 구입 가능한 에스케리치아 콜라이 ECE101 균주로부터 제조하였다. 플라스미드로부터, 스펙티노마이신 내성(Sp^r) 유전자를 카셋트로서 절단해 낼 수 있다.

<1>에서 수득한 플라스미드 pDG1726 및 pHSG398BSPR을 제한 효소 HincII 및 EcoRV를 사용하여 각각 완전히(도 2) 및 부분적으로 절단하고, 페놀로 처리하였다. 각각의 DNA를 라이게이션 키트를 사용하여 결합하고, 라이게이션 용액을 사용하여 에스케리치아 콜라이 JM109내로 형질전환시키고, 클로람페니콜 50㎍/㎖ 및 스펙티노마이신 100㎍/㎖을 함유하는 LB 아가 배지상에서 배양하였다. 플라스미드를 생성된 형질전환체로부터 추출하여 스펙티노마이신 내성 유전자의 삽입으로 이의 purR 유전자가 파괴된 플라스미드 pHSG398△BSPR:Sp^r을 수득하였다(도 3).

<3> purR 유전자 파괴된 균주의 제조

바실러스 서브틸리스 SB112(BGSC 1A227)를 전술한 <2>에서 수득한 플라스미드 pHSG398△BSPR:Sp^r을 사용하여 형질전환시켰다. 형질전환은 이시와의 방법[Ishiwa H. et al., 1986, Jpn. J. Genet. 61 515-528]에 따라 제조된 컴피턴트 세포(competent cell)를 사용하여 수행하였다. 플라스미드 pHSG398△BSPR:Sp^r는 바실러스 서브틸리스 세포에서 DNA를 복제할 수 없다. 그러나, 플라스미드는 스펙티노마이신 내성 유전자의 5' 및 3' 말단 부위에서 염색체성 purR 유전자에 상동성인 영역을 갖기 때문에, 이는 이중 교차 재조합에 의해 염색체성 purR 유전자와 유전자 치환을 진행할 수 있다.

전술한 형질전환체를 스펙티노마이신 100㎍/㎖을 함유하는 LB 아가 배지에서 배양하고, 성장한 균주를 선택하여 염색체성 purR 유전자가 △BSPR:Sp^r 유전자로 교체된 균주를 수득하였다. 주형으로서 후보 균주의 염색체성 DNA, purR 유전자를 위한 프라이머(서열 1 및 2), 및 서열 3 및 4에서 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 Sp^r 유전자를 위한 프라이머(이들의 합성은 재팬 바이오서비스사에 위탁되었다)를 사용하여 PCR을 수행함으로써, 의도된 유전자 치환이 △BSPR:Sp^r 부분의 크기 및 스펙티노마이신 유전자의 삽입에 기초하여 일어났음을 확인하였다. 상기한 바와 같이 수득된 유전자 치환된 균주 중 하나는 바실러스 서브틸리스 SB112K로 명명되었다.

<4> purR 결손 균주에 의한 핵산의 생산

전술한 <3>에서 제조된 바실러스 서브틸리스 SB112K 및 모 균주인 바실러스 서브틸리스 SB112를 37℃에서 스펙티노마이신 100㎍/㎖을 함유하는 LB 및 LB 아가 배지에서 밤새 배양하고, 상기 세포를 표 1에서 나타낸 생산 배지 20㎖내로 백금이로 3회 접종하고, 72시간 동안 32℃에서 배양하였다.

발효 배지의 조성

배지 성분	농도
글루코스	100g/L
NH₄Cl	20g/L
KH₂PO₄	0.5/L
MgSO₄·7H₂O	0.4g/L
FeSO₄·7H₂O	2ppm
MnSO₄·5H₂O	2ppm
L-트립토판	300㎎/L
L-페닐알라닌	300㎎/L
L-글루타민산	15.0g/L
DL-메티오닌	0.3g/L
콩 농축액(T-N)	1.5g/L
소포제(GD-113)	0.05㎖/ㅣ
pH 조절제(KOH)	7.2g/L

배양을 완결한 후, 배양 배지 중의 히포크산틴, 우라실, 구아노신, 구아닌, 아데노신 및 아데닌의 축적량을 고성능 액체 크로마토그래피로 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. purR 결함 균주 SB112K에서, 현저한 양의 히포크산틴, 즉, 약 600㎎/L가 축적되며, 결과적으로 모 균주와 비교해서 약 20배의 증가된 축적을 나타내었다. 우라실에 있어서, 축적은 모 균주와 비교해서 5배 정도 증가하였다. 추가로, 모 균주에서는 확인되지 않는 아데닌 및 구아닌의 축적이 또한 purR 결함 균주에서 확인되었다.

발효 평가

균주	생성물(㎎/L)
균주	히포크산틴	우라실	구아닌	아데닌
SB112K	585	166	20	127
SB112(모 균주)	30	30	0	0

본 발명의 방법은 핵산 물질의 산업적 중요성의 견지에서 통상적인 방법과 비교해 볼때 보다 유리하게 핵산 물질을 생산하는 방법을 제공한다.

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Method for producing nucleic acid substances <130> OP853 <150> JP 10-165704 <151> 1998-06-12 <160> 6 <170> KOPATIN 1.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 1 ctcaagcttg aagttgcgat gatcaaaa 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 2 ctcctgcaga catattgttg acgataat 28 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 3 gtgaggagga tatatttgaa t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer for PCR <400> 4 ttataatttt tttaatctgt t 21 <210> 5 <211> 1200 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (259)..(1113) <400> 5 atatgcatcc tgaagttgcg atgatcaaaa accagatgaa acgctttggt gcagatgccg 60 tgttaatgag cgggagcggc ccgacagtgt ttggactggt tcagtatgag tcgaaggtgc 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Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg 20 25 30 Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys 35 40 45 Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly 50 55 60 Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala 65 70 75 80 Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg 85 90 95 Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro 100 105 110 Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu 115 120 125 Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu 130 135 140 Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg 145 150 155 160 Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val 165 170 175 Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser 180 185 190 Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala 195 200 205 Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala 210 215 220 Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu 225 230 235 240 Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn 245 250 255 Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe 260 265 270 Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser 275 280 285

Claims

purR 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성이 감소되거나 제거된 미생물을 배양 배지에서 배양하여, 배양 배지 내에 핵산 물질을 생성시켜 축적시킨 후, 이를 배양 배지로부터 수득하는 단계를 포함하는, 핵산 물질의 생산 방법.
제1항에 있어서, 미생물의 염색체상에서 purR 유전자가 파괴된 핵산 물질의 생산 방법.
제1항에 있어서, 단백질이 서열 6에서 나타낸 아미노산 서열을 갖는 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 바실러스 속에 속하는 세균인 방법.
제4항에 있어서, 미생물이 바실러스 서브틸리스인 방법.
제1항에 있어서, 핵산 물질이 핵산 염기, 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드인 방법.
제6항에 있어서, 핵산 물질이 히포크산틴, 우라실, 구아닌 및 아데닌으로 이 루어지는 그룹으로부터 선택되는 방법.