JP2015171380A - ５’−キサンチル酸及び５’−グアニル酸の生産能が向上した微生物、及びこれを用いた５’−キサンチル酸及び５’−グアニル酸の生産方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は５’−キサンチル酸生産能及び５’−グアニル酸生産能が増加した微生物に関するものである。
【解決手段】具体的には、プロリンデヒドロゲナーゼ活性が内在的活性より増加したコリネバクテリウム属微生物、前記形質転換されて製造された微生物を培養し、その培養液から５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産する方法、及び５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産するための前記微生物の用途に関するものである。
【選択図】図１

Description

本発明は、プロリンデヒドロゲナーゼ活性が内在的活性より増加したコリネバクテリウム属微生物、前記形質転換されて製造された微生物を培養し、その培養液から５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産する方法、及び５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産するための前記微生物の用途に関する。

５’−グアニル酸(5’-guanine monophosphate：ＧＭＰ)は、イノシン酸（inosine monophosphate：ＩＭＰ）と共に、食品調味添加剤として広く用いられている物質である。ＧＭＰは、それ自体で茸のうま味を出すものと知られているが、主にグルタミン酸一ナトリウム（monosodium glutamate：ＭＳＧ）の風味を強化するものと知られている。このような性質は特にＩＭＰと共に使われたときに強く現れる。

今まで知られているＧＭＰの製造方法としては、（１）酵母細胞から抽出したリボ核酸（ＲＮＡ）を酵素学的に分解する方法、（２）微生物発酵法でＧＭＰを直接発酵させる方法、（３）微生物発酵法で生産したグアノシンを化学的にリン酸化させる方法、（４）微生物発酵法で生産したグアノシンを酵素的方法でリン酸化させる方法、（５）微生物発酵法で生産した５’−キサンチル酸（5’-xanthosine monophosphate：ＸＭＰ）をコリネ型微生物を用いてＧＭＰに転換する方法、及び（６）微生物発酵法で生産したＸＭＰを大腸菌(Escherichia coli)を用いてＧＭＰに転換する方法を挙げることができる。これらの中でも、（１）の方法は、原料需給及び経済性において問題があり、（２）の方法はＧＭＰの細胞膜透過性の問題により収率が低いという欠点があるから、その他の方法が工業的に主に用いられている。

前述した方法のうち、ＸＭＰを生産してＧＭＰに転換する方法を用いてＧＭＰを生産する場合、ＸＭＰの生産性を強化する戦略、又はＧＭＰ転換反応中に助酵素として用いられるＡＴＰの持続的な供給が必要である。よって、ＸＭＰ生産を強化するために、従来は変異処理を介してグアノシン又はＸＭＰへの耐性を有する微生物を生産した。例えば、特許文献１は、ＸＭＰの収率を高めるためのアデニンとグアニン半栄養要求性型のキサンチル酸アミナーゼ不活性菌株であって、グアノシン類似体に耐性を持っており、細胞壁分解酵素としてのリゾチームに対して感受性が非常に高い菌株を開示している。また、特許文献２は、ＸＭＰを生産するコリネバクテリウムアンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)を親株として紫外線を照射し、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異誘発剤を通常の方法によって処理することにより、親株の形質を変化させて、ＸＭＰの生合成に影響を与えるバリン(valine)に対する類似体(analoge)と
してのノルバリン(norvaline)耐性株を選別し、その結果、ＸＭＰを高収率、高濃度で培
養液中に直接蓄積させる微生物を用いたＸＭＰ生産方法を開示している。特許文献３では、ＸＭＰの生合成に関連する生合成経路の遺伝子であるｐｕｒＮ、ｐｕｒＨを強化してＸＭＰの収率を向上させた例もある。

前述したようにＸＭＰを用いてＧＭＰに転換するためには、ＧＭＰ生産過程中で助酵素として用いられるＡＴＰの供給が重要であるが、前記ＡＴＰ生産の大部分は、ＸＭＰを生産するＸＭＰ生産菌株内で行われる。転換反応は、細胞のＡＴＰとＸＭＰに対する膜透過性を増加させるキシレンなどの物質を培地中に添加し、ＡＴＰとＸＭＰがＧＭＰ生産菌株内によく流入するようにした後、ＸＭＰをＧＭＰに転換することにより行われ得る。よって、ＧＭＰの生産収率を高めるためにはＡＴＰの生産を強化する戦略が必要である。

ＸＭＰからＧＭＰに転換する化学方式は、次のとおりである。
ＸＭＰ＋ＡＴＰ＋ＮＨ_３ → ＧＭＰ＋ＡＭＰ＋ＰＰｉ
ＸＭＰアミナーゼ

すなわち、１次的にＸＭＰを生産し、ＸＭＰ及び微生物を含む培養液にＸＭＰアミナーゼ(XMP aminase)活性を有する酵素又は微生物を添加し、２次的に転換反応を行ってＧＭ
Ｐを生産する工法の核心は、転換反応過程中に持続的に助酵素としてのＡＴＰを供給することである。よって、ＸＭＰ生産菌株のＡＴＰ生成能を強化することが非常に重要であるといえる。転換反応の結果として生成したＡＭＰはＡＴＰの生成のための基質としてさらに使用され、アデニン(adenine)系の核酸ヌクレオチドは転換反応系で持続的にＡＴＰ生
成のために再生される。

韓国特許出願第１０−１９９１−０１８０６１号明細書 韓国特許出願第１０−２００１−０００５１３号明細書 韓国特許出願第１０−２００８−００６５３７号明細書

このように、高収率でＧＭＰを生産するためにはＸＭＰ生産率の向上が必要であり、ＸＭＰの生産増加のためにはＡＴＰ生産を増大させなければならないところ、前述した背景技術の下で、本発明者らは、ＡＴＰ生産の増大のための方法を開発するために鋭意努力した結果、プロリンデヒドロゲナーゼ(proline dehydrogenase)の活性を強化する場合、Ａ
ＴＰ生産増大を介してＸＭＰ及びＧＭＰの収率を向上させることができることを見出した。

そこで、本発明者らは、ＸＭＰの収率を向上させることが可能な遺伝子を解明し、前記遺伝子を含むベクターをデザインする一方、前記ベクターで形質転換されたコリネバクテリウム属微生物を製造することにより、前記微生物からＸＭＰ又はＧＭＰを高収率で収得することができることを見出し、本発明を完成した。

本発明の目的は、プロリンデヒドロゲナーゼ活性が内在的活性より増加した、５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸生産コリネバクテリウム属微生物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記微生物を培養し、その培養液から５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産する方法を提供することにある。

本発明の別の目的は、５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産するための前記微生物の用途を提供することにある。

本発明のコリネバクテリウム属由来の微生物を用いると、プロリンデヒドロゲナーゼの増大した活性により、既存のＸＭＰ及びＧＭＰ生産微生物に比べて顕著に高い収得率でＸＭＰ又はＧＭＰを生産することができる。よって、本発明の微生物を使用すると、高収率でＸＭＰ又はＧＭＰを収得することができる。

ｐＤＺベクターにｐｕｔＡ遺伝子をクローニングしたｐＤＺ−ｐｕｔＡベクターの構造を示す。

上記目的を達成するための一つの態様として、本発明は、プロリンデヒドロゲナーゼ活性が内在的活性より増加した、コリネバクテリウム属由来の微生物に関する。

好ましくは、本発明は、プロリンデヒドロゲナーゼ活性を内在的活性より増加させることにより、５’−キサンチル酸（ＸＭＰ）生産能及び５’−グアニル酸（ＧＭＰ)生産能
が向上したコリネバクテリウム属微生物を提供することができる。

本発明で使用される用語「プロリンデヒドロゲナーゼ(proline dehydrogenase)」とは
、プロリンデヒドロゲナーゼ／デルタ−１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ(proline dehydrogenase/delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase)であ
って、前記酵素は、アラニン、アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩代謝経路、アルギニン及びプロリン代謝経路に関与するものとして知られている。本発明は、当該酵素の活性を増加させることにより、ＸＭＰだけでなくＧＭＰの生産収率が向上した微生物に関するものである。

本発明で使用される用語「内在的活性」とは、本来微生物が天然の状態で持っている酵素の活性状態を意味し、「内在的活性が増加している」とは、天然状態の酵素活性と比較して活性がさらに向上したことを意味する。本発明の酵素活性増加とは、酵素自体の活性が増大して本来の機能以上の効果を導出することを含むうえ、内在的遺伝子活性の増加、内部又は外部要因からの内在的遺伝子の増幅、遺伝子コピー数の増加、又は外部からの遺伝子の取り込みなどによりその活性が増加することを含む。また、前記増加した酵素の活性は、例えば、遺伝子コピー数の増加、プロモーターの取替え又は変形、及び突然変異による酵素活性の増加など当業界における公知の方法が制限なく使用された結果によって達成でき、これらの例に酵素活性増加方法が限定されるのではない。

本発明によって活性が増加する酵素としてのプロリンデヒドロゲナーゼは、コリネバクテリアのｐｕｔＡ遺伝子によって暗号化でき、前記遺伝子と生物学的に同じ又は相応する活性を有する限り、その変異体、類似体などをいずれも含むことができる。好ましくは、前記ｐｕｔＡ遺伝子はそれと実質的に同一又は類似の生物学的活性を示し、ｐｕｔＡ配列と７０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、よりさらに好ましくは９５％以上の相同性、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する遺伝子を含む。好ましくは、本発明のｐｕｔＡ遺伝子は配列番号７のヌクレオチド配列によって暗号化できる。また、内部又は外部的要因によって遺伝子コピー数が増加する場合、増加させることが可能なコピー数は公知の方法によって当業者の必要に応じて目的に合わせて選択することができる。内在的遺伝子の増幅は当業界における公知の方法、例えば適当な選択圧の下で培養する方法などによって容易に行われ得るが、これらの例に内在的遺伝子増幅方法が限定されるのではない。

本発明の好適な実施例では、コリネバクテリウム属微生物に、前記プロリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含むベクターを取り込むことにより、その内在的活性より顕著に増加した形質転換微生物を生産した。

本発明の「コリネバクテリウム属微生物」は、当業界で使用されるコリネバクテリウム属微生物であればいずれでも制限なく使用できる。好ましくは、コリネバクテリウムアンモニアゲネス、コリネバクテリウムグルタミカム、ブレビバクテリウムフラバム、ブレビ
バクテリウムラクトファーメンタムなどが使用できるが、本発明で使用できるコリネバクテリウム属微生物の種類はこれらの例に制限されるものではない。具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物には、コリネバクテリウムアンモニアゲネスＡＴＣＣ６８７２(Corynebacterium ammoniagenes ATCC6872)、コリネバクテリウムサーモアミノゲネスＦＥ
ＲＭ ＢＰ−１５３９(C.thermoaminogenes FERM BP-1539)、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２(C.glutamicum ATCC13032)、コリネバクテリウムグルタミカムＲ(C.glutamicum R)、ブレビバクテリウムフラバムＡＴＣＣ１４０６７(Brevibacterium flavum ATCC14067)、ブレビバクテリウムラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９(B. lactofermentum ATCC13869)、及びこれらから製造された菌株を含む。好ましくは、コリネバクテリウムアンモニアゲネスＫＣＣＭ１０５３０から形質転換されたコリネバクテリウムアンモニアゲネスＫＣＪ−１３４６であってもよい。具体的には、本発明の菌株は、受託番号ＫＣＣＭ１０５３０のコリネバクテリウムアンモニアゲネスに、図１の切断地図を有するベクターを導入する一方、前記ベクターが導入された形質転換微生物を培地で培養して２コピー以上のｐｕｔＡ遺伝子を相同組み換えによって内在的遺伝子と置換した結果、２以上のコピーを有するｐｕｔＡ遺伝子が染色体内に組み込まれた菌株を製造することができた。

本発明で使用される用語「５’−キサンチル酸（ＸＭＰ）」とは、核酸生合成代謝系の中間物質であって、動植物の体内で生理的に重要な意味を有するうえ、食品、医薬品及び各種医療用途など多方面で使われている。グルタミン酸ナトリウムと共に使用すると、味の上昇効果が大きくて呈味性調味料として脚光を浴びている核酸系調味料中の一つである。ＸＭＰは、プリンヌクレオチド(purine nucleotide)生合成代謝系の中間生成物であっ
て、５’−グアニル酸（ＧＭＰ）の製造原料として重要な物質である。好ましくは、本発明は、このようなＸＭＰの生産能が向上した形質転換微生物を製造し、該微生物を培養し、その培養液からＸＭＰを生産した結果、従前の微生物より約４．５％向上したＸＭＰ生産能を有する形質転換微生物菌株を収得することができ、これによりＸＭＰの生産量を増加させることができることを確認した。

また、本発明で使用される用語「５’−グアニル酸（ＧＭＰ）」とは、グアノシンとリン酸が結合したヌクレオチドの一つであって、核酸を構成し、その位置により５’−体、３’−体及び２’−体の３種類に分けられる。本発明で生産される５’−グアニル酸は、無色の針状結晶であって、生体内に遊離状態で存在する。分子式はＣ_１０Ｈ_１４Ｎ_５Ｏ_８Ｐであり、ナトリウム塩には椎茸のうま味があって化学調味料として使用される物質である。ＧＭＰは松茸のうま味を出し、呈味性調味料として脚光を浴びている、核酸系調味料の中の一つである。好ましくは、本発明は、形質転換微生物を用いてこのような５’−グアニル酸を高収率で得ることが可能な方法を解明し、従前の微生物を用いた方法よりＧＭＰの濃度が約７％増加したことを確認した。

本発明は、ｐｕｔＡ遺伝子を含むベクターを導入してプロリンデヒドロゲナーゼ活性が増加した微生物を製造することができる。本発明の目的上、前記ベクターはｐｕｔＡ遺伝子と実質的に同一の生物学的活性を有する遺伝子を含むベクターを含み、形質転換される微生物の種類及び特性により、ｐｕｔＡ遺伝子と実質的に同一又は類似の生物学的機能を行う遺伝子の配列に差異が存在し得ることは当業者には自明である。好ましくは、本発明は、配列番号７の遺伝子を含む図１の切断地図を有する組み換えベクターに関するものである。本発明の配列番号７の遺伝子はコリネバクテリアのｐｕｔＡ遺伝子の天然型配列である。前記「ｐｕｔＡ遺伝子」は、プロリンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を意味する。コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の場合、前記機能を行う遺伝子はａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＣ＿００６９５８として配列が知られており、ｍＲＮＡ配列はＹＰ＿２２４３９６．１として公知になっている。

好ましい態様として、本発明は、配列番号７で表されるｐｕｔＡ遺伝子を含む組み換えベクターを提供することができる。本発明のベクターは、ｐｕｔＡ遺伝子を含むことが可能なベクターであれば、当業界で通常使用されるベクターを制限なく使用することができ、使用される宿主の特性に応じて最適のベクターを選択して使用することが好ましい。好ましくは、前記ベクターはｐＤＺ−ｐｕｔＡである。本発明の好適な実施例では、ｐＤＺに、配列番号７を含むｐｕｔＡ遺伝子を導入することにより、ｐＤＺ−ｐｕｔＡベクターを製造した（図１）。

本発明の形質転換微生物は、ｐｕｔＡ遺伝子を宿主微生物に導入することにより製造することができる。ｐｕｔＡ遺伝子はベクターにクローニングされて細胞に形質転換されることが好ましい。

形質転換方法は、任意の形質転換方法が制限なく使用でき、当業界における通常の方法によって容易に行うことができる。「形質転換」とは、ＤＮＡを宿主に導入してＤＮＡが染色体の因子として染色体統合の完成によって複製可能になるものであって、外部のＤＮＡを細胞内に導入して人為的に遺伝的な変化を起こす現象を意味する。一般に、形質転換方法にはＣａＣｌ_２沈殿法、ＣａＣｌ_２法にＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)という還元物質を使用することにより効率を高めたＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション法(electroporation)、リン酸カルシウム沈殿法、原形質融合法、炭化ケイ素繊維を用いた攪拌
法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、ＰＥＧ(polyethylene glycol)を用いた形質転
換法、硫酸デキストラン、リポフェクタミン及び乾燥／抑制媒介形質転換方法などがある。本発明のｐＤＺ−ｐｕｔＡを形質転換するための方法は、これらの例に限定されず、当業界で通常使用される形質転換方法が制限なく使用できる。

本発明において、用語「ベクター」とは、適当な宿主細胞において目的タンパク質を伝達することが可能な組み換えベクターであって、遺伝子挿入物が宿主の染色体内に組み換えできるように必須の調節要素を含む遺伝子作製物をいう。好ましくは、本発明のｐｕｔＡ遺伝子を含む組み換えベクターは、図１の切断地図を含む組み換えベクターであってもよい。本発明の好適な実施例では、形質転換の方法で前記ベクターを受託番号ＫＣＣＭ１０５３０のコリネバクテリウムアンモニアゲネスに導入した後、選択培地で培養して２コピーのｐｕｔＡ遺伝子を内在的遺伝子の位置に相同組み換え方法によって置換させることにより、２コピーを有するｐｕｔＡ遺伝子が染色体内に挿入されるように製造した。その結果、コリネバクテリウムアンモニアゲネスの形質転換によって、ＫＣＪ−１３４６と命名した新規な形質転換微生物を収得し、これを２０１０年２月２４日に国際寄託機関としての韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms：ＫＣＣＭ、
韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１ユリムビル）に受託番号ＫＣＣＭ１１０６８Ｐで寄託した。

本発明は、上述した形質転換微生物を用いて直接発酵法によって培養液内に高収率でＸＭＰ又はＧＭＰを収得することができる。好ましくは、前記方法で使用される微生物はプロリンデヒドロゲナーゼの活性が増加した微生物であり、また、前記微生物である宿主の染色体内にベクターのｐｕｔＡ遺伝子が組み込まれることによりＸＭＰ及びＧＭＰの生産量を増加させることができる。このような生産方法に使用される微生物は、好ましくは受託番号ＫＣＣＭ１１０６８Ｐであってもよい。

他の態様として、本発明は、本発明に係る微生物を培養し、その培養液から５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産する方法に関するものである。

好ましくは、本発明は、ｐｕｔＡ遺伝子を含むベクターで形質転換された菌株を培養してＸＭＰを収得する方法を含むＸＭＰ生産方法を提供し、また、（ａ）ｐｕｔＡ遺伝子を
含むベクターで形質転換された菌株を培養する段階、（ｂ）前記（ａ）段階で培養された菌株にＸＭＰアミナーゼを添加する段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階の培養液からＧＭＰを収得する段階とを含む、ＧＭＰの生産方法を提供する。より好ましくは、前記寄託された微生物を用いて直接発酵法によって培養液中に高収率でＸＭＰを直接蓄積して生産する方法を提供する。また、さらに前記ＸＭＰ及び前記形質転換された微生物を含む培養液に、ＸＭＰアミナーゼ活性を有する酵素又は微生物、好ましくは大腸菌を添加し、転換反応を行わせた後、前記培養液中のＧＭＰを分離精製することにより、ＧＭＰを収得することができる。

本発明で培養液として使用される培地は、当業界で通常使用される培地が制限なく使用できる。好ましくは、培地はブドウ糖を炭素源として使用し、その他の適量の炭素源を多様に利用できる。培養に使用される培地は、適切な方式で特定菌株の要件を満たさなければならない。コリネバクテリウム菌株に対する培養培地は公知になっている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981）。使用できる糖源としては、グルコース、ガラクトース、サ
ッカロース、アラビノース、麦芽糖、キシロース、トレハロース、リボース、ラクトース、フラクトース、マルトース、澱粉、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などのオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセロール、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が含まれる。これらの物質は単独で又は組み合わせて使用できる。使用できる窒素源としてはペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミールなどの有機窒素源、及び尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源が含まれる。これらの窒素源も単独で又は組み合わせて使用できる。前記培地に使用できるリン源としては、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩が含まれる。また、培養培地は成長に必要な硫酸マグネシウム又は硫酸鉄などの金属塩を含有することができる。その他に、前記物質に加えてアミノ酸、ビタミンなどの必須成長物質又は適切な前駆体などがさらに含まれてもよい。前記原料は培養過程で培養物に適切な方式によって回分式又は連続的に添加できる。

培養中に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの塩基性化合物、又はリン酸、硫酸などの酸性化合物を適切な方式で用いて培養物のｐＨを調節することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡の生成を抑えることができる。好気状態を維持するために培養物内に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入するか、嫌気又は微好気状態を維持するために該気体の注入なしで窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入することができる。培養物の温度は通常２０℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜３５℃、又は３５℃〜３７℃である。培養は所望の目的物質の生成量が最大に得られるまで行い続けることができ、好ましくは１０〜１６０時間内で達成することができる。

ＸＭＰ又はＧＭＰは培養培地中に排出されてもよく、細胞中に含まれていてもよい。本発明のＸＭＰ又はＧＭＰを生産する方法は、細胞又は培養培地からＸＭＰ又はＧＭＰを回収する段階を含む。細胞又は培養培地からＸＭＰ又はＧＭＰを回収する方法は当業界に広く知られている。前記ＸＭＰ又はＧＭＰ回収方法には濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用できるが、これらの例に限定されない。

別の態様として、本発明は、５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産するための本発明に係る微生物の用途に関するものである。

本発明のプロリンデヒドロゲナーゼ活性が内在的活性より増加した５’−キサンチル酸
又は５’−グアニル酸生産コリネバクテリウム属微生物は、プロリンデヒドロゲナーゼの増大した活性により高収率でＸＭＰ又はＧＭＰを生産することができるので、５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産するために有用に使用することができる。

以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示的に実施するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。

実施例１：ＸＭＰ生産菌株コリネバクテリウムアンモニアゲネスＫＣＣＭ１０５３０由来のｐｕｔＡクローニング及び染色体挿入用組み換えベクター（ｐＤＺ−ｐｕｔＡ）の作製
本実施例では、韓国公開特許第１０−２００７−９４４３３号に開示されたベクターｐＤＺを用いて遺伝子の染色体挿入を行った。ｐＤＺベクターを用いてコリネバクテリウムの染色体ヌクレオチドを挿入するためには、染色体上の挿入される部位と相同性を有する配列が、挿入されるｐＤＺベクター内に含まれなければならないので、挿入しようとする配列を両隣に含んでいるｐＤＺベクターを作製した。

本実施例では、ｐｕｔＡ遺伝子の増幅のために、ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋに基づいてｐ
ｕｔＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ ＩＤ＿３３４４４９６）を確保し、これに基づ
いて２対のプライマー（配列番号１〜４）を合成した。

コリネバクテリウムＫＣＣＭ１０５３０を鋳型とし、前記配列番号１〜4のオリゴヌク
レオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。重合酵素としてＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を使用した。ＰＣＲは、変性９５℃３０秒、アニーリング５５℃３０秒、及び重合反応６８℃２分で、２５サイクル繰り返し行った。その結果、４．４ｋｂのｐｕｔＡ遺伝子２対（ｐｕｔＡ−Ａ、ｐｕｔＡ−Ｂ）を得た。ｐｕｔＡ−Ａは配列番号１と２をプライマーとして用いて増幅されたものであり、ｐｕｔＡ−Ｂは配列番号３及び４をプライマーとして増幅されたものである。

配列番号１：ＣＣＣＡＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＧＣＧＴＣＧＧＴＣＡＣＴＣＡＡＣＴＡ
配列番号２：ＣＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＧＣＡＧＣＣＡＡ
配列番号３：ＴＧＡＧＣＧＴＣＧＧＴＣＡＣＴＣＡＡＣＴＡ
配列番号４：ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＡＴＣＴＴＧＣＡＧＴＣＣＡＡ

前記増幅産物ｐｕｔＡ−Ａ、ｐｕｔＡ−Ｂの各末端に含まれた制限酵素（ｐｕｔＡ−Ａ：ＨｉｎｄＩＩＩ、ｐｕｔＡ−Ｂ：ＢａｍＨＩ）を処理し、次に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩの処理されたｐＤＺベクターに３断片を結合することにより、最終的にｐｕｔＡ２コピーが連続的にクローニングされたｐＤＺ−ｐｕｔＡ組み換えベクターを得た。図１はコリネバクテリウム染色体挿入用ｐＤＺ−ｐｕｔＡを示す図である。

実施例２：ｐｕｔＡ挿入菌株の開発
作製されたｐＤＺ−ｐｕｔＡベクターをＫＣＣＭ１０５３０菌株に形質転換し、実施例１で記述したように２次組み換え過程を経て染色体上でｐｕｔＡ遺伝子の直ぐ隣に１コピーのｐｕｔＡ遺伝子をさらに挿入してコピー数を２個に増加させたＸＭＰ生産菌株コリネバクテリウムアンモニアゲネスＫＣＪ−１３４６を得た。前記ＫＣＪ−１３４６と命名した新規な微生物を、２０１０年２月２４日に国際寄託機関としての韓国微生物保存センター（Korean Culture Center of Microorganisms：ＫＣＣＭ、韓国ソウル市西大門区弘済
１洞３６１−２２１ユリムビル）に受託番号ＫＣＣＭ１１０６８Ｐで寄託した。連続的に挿入されたｐｕｔＡ遺伝子は２コピーのｐｕｔＡの上流(upstream)と下流(downstream)の塩基配列部位を増幅することが可能なプライマー（配列番号５及び配列番号６）を用いた
ＰＣＲで最終確認した。

配列番号５：ＣＧＡＡＣＴＡＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＴＴＴＧ
配列番号６：ＡＧＣＡＧＧＣＣＡＴＴＡＡＡＡＣＧＡＣＣ

実施例３：ｐｕｔＡ挿入菌株のＸＭＰ生産
実施例２で最終的に作製されたＸＭＰ生産菌株としてのコリネバクテリウムアンモニアゲネスＫＣＪ−１３４６をＸＭＰ生産のために下記の方法で培養した。下記種培地３ｍＬを含有する１４ｍＬのチューブにコリネバクテリウムアンモニアゲンス母菌株ＫＣＣＭ１０５３０とＫＣＪ−１３４６を接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍにて振盪培養した。下記の生産培地３２ｍＬ（本培地２４ｍＬ＋別殺培地８ｍＬ）を含んでいる２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに０．４ｍＬの種培養液を接種し、３０℃で９６時間２３０ｒｐｍにて振盪培養した。培養終了の後、ＨＰＬＣを用いた方法によって５’−キサンチル酸の生産量を測定した。コリネバクテリウムアンモニアゲネスＫＣＣＭ１０５３０とＫＣＪ−１３４６に対する培養液中のＸＭＰは、下記表１のとおりである。

種培地：ブドウ糖３０ｇ／Ｌ、ペプトン１５ｇ／Ｌ、酵母エキス１５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２．５ｇ／Ｌ、尿素３ｇ／Ｌ、アデニン１５０ｍｇ／Ｌ、グアニン１５０ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）

生産培地（本培地）：ブドウ糖８０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１０ｇ／Ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、アデニン３０ｍｇ／Ｌ、グアニン３０ｍｇ／Ｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム１０ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）

生産培地（別殺培地）：リン酸第一カリウム１０ｇ／Ｌ、リン酸第二カリウム１０ｇ／Ｌ、尿素７ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ

前記表１に示すように、ＫＣＪ−１３４６は、母菌株ＫＣＣＭ１０５３０に比べてＸＭＰの生産が１．３ｇ／Ｌ増加したことを確認することができた。これは４．５％の生産増加を意味する。

実施例４：ｐｕｔＡ挿入菌株のプロリンデヒドロゲナーゼ活性
実施例２で最終的に作製されたＸＭＰ生産菌株としてのコリネバクテリウムアンモニアゲネスＫＣＪ−１３４６のプロリンデヒドロゲナーゼ活性を確認するために、下記の方法で酵素活性を測定した。バクトペプトン１０ｇ／Ｌ、バクトビーフ抽出物５ｇ／Ｌ、バクト酵母抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ２．５ｇ／Ｌ、アデニン５０ｍｇ／Ｌ、グアニン５０ｍｇ／Ｌの培地に菌株を接種し、３０℃で１２時間培養してＯＤ１０まで培養させた。培養の後、１０ｍＬの細胞を培養液から回収して５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ_２、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２バッファで２回洗浄して１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．５）１ｍＬに浮遊させた。

細胞粉砕機(sonicator)を用いて細胞を破壊した後、遠心分離機を用いて上澄液を分離
した。分離された上澄液をさらに遠心分離してペレットのみを取って１００μＬのバッフ
ァに溶かした。この中の１０μＬを酵素液として用いた。反応液を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）と５０μＭ ２，６−ジクロロインドルフェノール（2,6-dichloroindolphenol、Ｃｌ_２Ｉｎｄ）の混合物で作った。Ｃｌ_２Ｉｎｄは冷凍させてから反応直前に混ぜ込んだ。作っておいた反応混合物９８０μＬに基質(substrate)としての１００
ｍＭプロリン１０μＬ、酵素液１０μＬを添加して３０℃で１５分間混ぜながら反応させた。反応の後、酵素の活性は還元されたＣｌ_２Ｉｎｄの濃度で確認することができる。Ｃｌ_２Ｉｎｄの６００ｎｍにおける吸収係数(absorption coefficient)は２２ｃｍ^−１ｍＭ^−１であった。

前記表２に示すように、ＫＣＪ−１３４６は、母菌株ＫＣＣＭ１０５３０に比べてプロリンデヒドロゲナーゼ酵素活性が２２％増加したことを確認することができた。

実施例５：ｐｕｔＡ挿入菌株のＡＴＰ濃度の測定
実施例２で最終的に作製されたＸＭＰ生産菌株としてのコリネバクテリウムアンモニアゲネスＫＣＪ−１３４６の細胞内ＡＴＰ濃度測定のために、次の方法で培養した。

下記種培地３ｍＬを含有する１４ｍＬのチューブにコリネバクテリウムアンモニアゲネス母菌株ＫＣＣＭ１０５３０と変異株ＫＣＪ−１３４６を接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍにて振盪培養した。下記の種培地２５ｍＬを含んでいる２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに０．４ｍＬの種培養液を接種し、３０℃で２０時間２３０ｒｐｍにて振盪培養した。培養完了の後、培養液の最終的な細胞ＯＤと細胞内のＡＴＰ濃度を測定した。

前記実験の結果、母菌株ＫＣＣＭ１０５３０に比べて、本発明の変異株ＫＣＪ−１３４６の単位ＯＤ当たりの生成したＡＴＰ濃度が高いことを確認することができた。これは結果的に既存の菌株に比べてＸＭＰ及びＧＭＰの生成収率が高くなる可能性を示唆する。結果は表３に示す。

前記表３に示すように、ＫＣＪ−１３４６は母菌株ＫＣＣＭ１０５３０に比べて単位ＯＤ当たりの生成したＡＴＰ濃度が約６０％増加したことを確認することができた。

実施例６：ｐｕｔＡ挿入菌株のＸＭＰ発酵及びＧＭＰ生産
実施例２で最終的に作製されたＸＭＰ生産菌株としてのコリネバクテリウムアンモニア
ゲネスＫＣＪ−１３４６をＧＭＰ生産のために、次の方法で培養した。

下記種培地３ｍＬを含有する１４ｍＬのチューブにコリネバクテリウムアンモニアゲネス母菌株ＫＣＣＭ１０５３０と変異株ＫＣＪ−１３４６を接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍにて振盪培養した。下記の生産培地３２ｍＬ（本培地２４ｍＬ＋別殺培地８ｍＬ）を含んでいる２５０ｍＬのコーナーバッフルフラスコに０．４ｍＬの種培養液を接種し、３０℃で９６時間２３０ｒｐｍにて振盪培養した。生成したＸＭＰのＧＭＰ転換反応を行うために三角フラスコ中の発酵液に下記の転換反応添加物と大腸菌のＸＭＰアミナーゼを添加し、４０℃で２．５時間転換反応を行った。

前記実験の結果、母菌株ＫＣＣＭ１０５３０に比べて、本発明の変異株ＫＣＪ−１３４６のＸＭＰ消費量に対するＧＭＰ生成量を意味する転換率が向上したことを確認することができた。結果的に、既存の菌株に比べてＧＭＰの生成収率が高くなった菌株を獲得することができた。結果は表４に示す。

前記表４に示すように、ＫＣＪ−１３４６は、母菌株ＫＣＣＭ１０５３０に比べて転換率が１．４％、ＧＭＰ濃度が６．９％増加したことを確認することができた。

種培地：ブドウ糖３０ｇ／Ｌ、ペプトン１５ｇ／Ｌ、酵母エキス１５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム２．５ｇ／Ｌ、尿素３ｇ／Ｌ、アデニン１５０ｍｇ／Ｌ、グアニン１５０ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）

生産培地（本培地）：ブドウ糖８０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１０ｇ／Ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／Ｌ、アデニン３０ｍｇ／Ｌ、グアニン３０ｍｇ／Ｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩５ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム１０ｍｇ／Ｌ（ｐＨ７．２）

生産培地（別殺培地）：リン酸第一カリウム１０ｇ／Ｌ、リン酸第二カリウム１０ｇ／Ｌ、尿素７ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ
転換反応添加物：フィチン酸(phytic acid)１．８ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４４．８ｇ／Ｌ、
ナイミーン(nymeen)３ｍＬ／Ｌ、キシレン(xylene)２％、アデニン１００ｍｇ／Ｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４７．７ｇ／Ｌ、グルコース４６ｇ／Ｌ

Claims (10)

1. プロリンデヒドロゲナーゼ活性が内在的活性より増加した、５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸生産コリネバクテリウム属微生物。
2. 前記微生物はコリネ型バクテリアのｐｕｔＡ遺伝子の発現量の増加によりプロリンデヒドロゲナーゼ活性が増加したことを特徴とする、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
3. 前記ｐｕｔＡ遺伝子は配列番号７の塩基配列を有するものである、請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。
4. ｐｕｔＡ遺伝子を含むベクターが導入されて形質転換された、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
5. 図１の切断地図を有する組み換えベクターが導入されて形質転換された、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
6. 前記微生物はＡＴＰ生産能が増加した微生物である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
7. 前記微生物はコリネバクテリウムアンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
8. 前記微生物は受託番号がＫＣＣＭ１１０６８Ｐであることを特徴とする、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物を培養し、培養液から５’−キサンチル酸又は５’−グアニル酸を生産する方法。
10. （ａ）ｐｕｔＡ遺伝子を含むベクターで形質転換された菌株を培養する段階と、
    （ｂ）前記（ａ）段階で培養された菌株に５’−キサンチル酸アミナーゼを添加する段階と、
    （ｃ）前記（ｂ）段階の培養液から５’−グアニル酸（ＧＭＰ）を収得する段階とを含んでなる、５’−グアニル酸の生産方法。

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