CN103243042A

CN103243042A - 具有增强的l-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物以及使用所述微生物生产l-赖氨酸的方法

Info

Publication number: CN103243042A
Application number: CN2013100926388A
Authority: CN
Inventors: 具贤敏; 梁荣烈; 金孝珍; 文准玉; 林相曹; 崔宗秀; 朴英薰
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2027-12-28
Also published as: ES2369022T3; DK2102337T3; EP2102337A1; US8048650B2; US20100028957A1; ATE518951T1; KR100838038B1; WO2008082181A1; PL2102337T3; CN101605886B; CN101605886A; CN103243042B; EP2102337A4; EP2102337B1

Abstract

本发明涉及具有增强的L-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物以及使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。更具体地说，本发明涉及具有通过使具有含有重复天冬氨酸残基的氨基酸序列的内源NCg11090基因失活的增强的L-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物，以及使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。

Description

具有增强的L-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物以及使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法

技术领域

本发明涉及具有增强的L-赖氨酸产率的棒状杆菌（Corynebacterium）属微生物以及使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。更具体地说，本发明涉及具有通过使具有含有重复天冬氨酸残基的氨基酸序列的内源NCg11090基因失活的增强的L-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物，以及使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法。

背景技术

L-氨基酸，特别是L-赖氨酸已经被广泛用于动物饲料添加剂、食品添加剂、作为药物的原料，并且通过棒状杆菌属微生物发酵来生产。

棒状杆菌属微生物特别是谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是被广泛用于L-氨基酸生产的革兰氏阳性微生物。使用棒状杆菌属微生物生产L-氨基酸的方法非常重要。因此，已经进行了许多尝试来改进所述方法。

一种尝试是通过使用重组DNA技术特定基因的断裂或者特定基因的衰减表达来改进产生L-氨基酸的棒状杆菌属微生物。例如，美国专利US6,872,553公开了一种通过棒状杆菌属微生物发酵产生L-赖氨酸的方法，所述方法包括下列步骤：a）通过一种突变方法培养具有衰减的编码磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧激酶（PCK）的DNA的棒状杆菌属微生物，所述突变方法为选自由在DNA中插入一个或多个碱基对，在DNA中缺失一个或多个碱基对和通过在DNA中引入无义密码子的碱基对转换或颠换或者与没有被衰减的棒状杆菌属微生物相比具有减少的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧激酶（PCK）所组成的组中的一种；b）在培养基或细胞中浓缩所需的L-氨基酸产物；和c)分离L-氨基酸。

另外，已经进行了关于在L-氨基酸生物合成中涉及的各个基因如何通过扩增基因来发展棒状杆菌属微生物以影响L-氨基酸的产率的许多研究（Eggeling,Amino Acids6,261-272(1994)）。而且，可通过从其他细菌中引入外源基因来发展棒状杆菌属微生物。例如，日本早期公开专利平7-121228公开了通过培养棒状杆菌属或短杆菌（Brevibacterium）属微生物生产L-谷氨酸和L-脯氨酸的方法，所述微生物在具有涉及柠檬酸合成酶合成的遗传信息的DNA片段和DNA载体之间含有重组构建体，并通过培养物产生L-谷氨酸和L-脯氨酸。

但是，尽管进行了上述试验，仍然需要生产具有增强的L-赖氨酸产率的菌株。

技术问题

本发明的发明人进行了研究以在棒状杆菌属微生物中发展能够高产量生产L-赖氨酸的菌株，所述菌株具有在氨基酸顺序中具有重复的天冬氨酸残基的目标内源NCg11090基因。并且本发明的发明人通过使上述目标基因失活尝试以降低的不必要的赖氨酸生物合成的中间体天冬氨酸的细胞内消耗来增加L-赖氨酸的产率。

本发明的目的在于提供具有增强的L-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物。

本发明的另一目的在于提供使用上述微生物生产L-赖氨酸的方法。

技术方案

本发明的上述目的和其他目的可通过本发明的下列实施方式来实现。

下面详细描述本发明。

为了实现上述目的，本发明提供了具有L-赖氨酸产率的微生物，更优选通过使其中的NCg11090基因失活而具有增强的L-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物。

在本发明中，具有L-赖氨酸产率的微生物可选自由谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032,热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)FERM BP-1539,谷氨酸棒状杆菌KFCC 10881和谷氨酸棒状杆菌KFCC11001，但不完全限于这些。

天冬氨酸是赖氨酸生物合成途径的中间体，其起到细胞成分或者蛋白质合成的单元或调节子的作用。作为细胞组分单元，天冬氨酸被用于核酸、氨基酸或脂肪合成。作为蛋白质合成单元，天冬氨酸被用作蛋白结构或者作为主要功能基团。特别是，对于蛋白质合成单元来说，被翻译成蛋白质的基因被分成两组：一组是细胞生长、维持和调节所必需的基因，另一组是对于那些过程来说非必需的基因。非必须基因被分成如下类型：根据具有等同功能的其他基因而不再被需要的基因；从外部被引入的外源基因诸如病毒基因；特定情况下必须但对于其他条件诸如赖氨酸生产时非必需的基因；和其功能还没有得到解释的基因。

细胞大量消耗天冬氨酸以构成非必需基因的蛋白质。

因此，如果非必需基因被剔除，认为用于非必需基因的大量天冬氨酸消耗被减少，有助于非必需赖氨酸消耗的减少，并且还有利于在相同条件下赖氨酸的产生。

为了开发具有提高的L-赖氨酸产率的微生物，本发明的发明人从谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的完全分析的序列的基因组序列数据库（NCBI GI:19552361,SEQ.ID.NO:1）中寻找了含有天冬氨酸残基基因，也就是赖氨酸生物合成的中间体的基因，其氨基酸序列编码的蛋白质比任何其他基因都多。结果，确定重复的天冬氨酸残基在具有由SEQ.ID.NO:3表示的氨基酸序列的NCg11090蛋白的C-末端中存在。但是，在赖氨酸产生菌中氨基酸序列上这些重复天冬氨酸残基如何参与赖氨酸生物的合成还没有得到解释。

在本发明中，NCg11090基因是在棒状杆菌属微生物中内源存在的基因，并已知其为编码功能未知的假想蛋白的基因。基因的活性通过谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的基因组的全序列分析来预测，并确认在其C-末端具有重复天冬氨酸残基并优选具有由SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列。本发明的棒状杆菌属微生物的内源NCg11090基因优选与由SEQ.ID.NO:1表示的序列具有高度同源性。

在本发明中，“失活”可通过本领域已知的任何失活方法来诱导。这里术语“失活”指的是与野生型菌株相比NCg11090基因的表达被降低到很低的水平，或者指产生不表达的基因和尽管表达但表达产物不具有活性或具有降低的活性的基因。

在本发明中，“失活”可通过选自下组的一种或多种突变方法来诱导，该组由在NCg11090基因中插入一个或多个碱基对、或者在该基因中缺失一个或多个碱基对、通过在该基因中插入无义密码子的碱基对转换或颠换所组成。

在本发明的优选实施方式中，含有失活的内源NCg11090基因的微生物可通过在抗生素存在下培养使用含有一部分NCg11090和抗生素标记物的载体转化的棒状杆菌属微生物得到。优选地，载体为含有SEQ.ID.NO:2的NCg11090基因片段的pCR-1090载体。微生物使用含有一部分基因序列的载体转化，接着在选择性标记物的存在下培养。然后，在基因的一部分与微生物的内源基因之间发生同源重组。通过同源重组，微生物的内源基因被重组并且含有标记物的重组基因仅仅由选择标记物来选择。结果，可获得其内源NCg11090基因失活的棒状杆菌属微生物。但是，产生根据本发明的棒状杆菌属微生物的方法不限于同源重组，本领域已知的任何方法均可使用。

本发明的具有提高的L-赖氨酸产率的转化微生物可以是谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CO01-0018(保藏号:KCCM10810P)。

本发明还提供了使用转化微生物生产L-赖氨酸的方法。更具体地说，本发明提供了生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括下列步骤：通过棒状杆菌属微生物的培养在培养物或细胞中产生L-赖氨酸；并从培养物中收集L-赖氨酸。

在本发明的方法中，棒状杆菌属微生物的培养可通过本领域已知的任何培养方法和培养条件来进行。

用于棒状杆菌属微生物培养的培养基可选自由American Society for Bacteriology在Manual of Methods for General Bacteriology(Washington D.C.,USA,1981)中描述的那些中选择。

所述培养基包括各种碳源、氮源和微量元素。碳源以糖或者碳水化合物为例，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素；油和脂，诸如豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，诸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类诸如甘油和乙醇；和有机酸，诸如醋酸。这些化合物的一种或其混合物可被用作碳源。

氮源以有机氮源和无机氮源为例，所述有机氮源包括诸如蛋白胨、酵母膏、肉汤、麦芽膏提取物、谷物浸泡液（CSL）和豆类面粉，所述无机氮源为诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些化合物的一种或其混合物可被用作氮源。

这里培养基可另外包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和相应的含钠的盐作为磷酸源。培养基还可包括金属盐诸如硫酸镁或者硫酸铁。另外，氨基酸、维他命和适当的前体也可被加入。培养基或前体可通过分批型或者连续型加入到培养物中。

在培养期间培养物的pH可使用碱性化合物诸如氢氧化钠、氢氧化钾或者氨水来控制，或者使用酸性化合物诸如磷酸或硫酸来控制。在培养期间气泡的产生可通过使用消泡剂诸如脂肪酸多甘油酯来抑制。为了保持培养物的有氧条件，氧气或者含氧气体（例如，空气）可被注入到培养物中。培养物的温度优选20-45℃，更优选25-40℃培养可继续直到L-氨基酸的产生达到所需水平，优选的培养时间为10-160小时。

在该方法中，培养以连续培养或分批培养的方法进行，诸如分批、分批供给和重复分批供给培养。本领域技术人员很容易理解的是，培养方法可适当选择。

L-氨基酸可通过例子交换色谱然后进行茚三酮衍生化分离并分析。

除了基因鉴定之外，本发明的发明人进一步失活了棒状杆菌属微生物的内源基因NCg11090基因以测定赖氨酸生产率。结果，可以确定赖氨酸产率得到提高。

附图说明

参照附图更好地理解本发明的优选实施方式的应用，其中：

图1是显示401bp的NCg11090基因被克隆到pCR-1090载体中的示意图。

具体实施方式

本发明的实践和当前的优选实施方式如下列实施例中所述来说明。

但是，本领域技术人员可以理解，在本发明公开的考虑下，在本发明的精神和范围内可进行修改和改进。

在下列实施例中，为了确定在其氨基酸序列中具有重复天冬氨酸残基的NCg11090基因对赖氨酸产生的影响，谷氨酸棒状杆菌KFCC10881的内源基因NCg11090被失活。并且含有失活的NCg11090基因的微生物被培养并且赖氨酸产率被测定。

实施例1：用于失活棒状杆菌属微生物的内源基因NCg11090的载体的构建

在该实施例中，401bp的NCg11090基因片段(SEQ.ID.NO:2)(由表示SEQ.ID.NO:1的第160-560核苷酸序列)使用谷氨酸棒状杆菌(ATCC13032)的染色体DNA作为模板以SEQ.ID.NO:4和NO:5表示的寡核苷酸引物通过PCR进行扩增，以构建含有一部分内源NCg11090基因和和抗生素标记物的NCg11090断裂载体。PCR按如下方式进行：96℃变性30秒，52℃下退火30秒以及72℃下聚合30秒（30个循环）。通过使用TOPO克隆试剂盒(Invitrogen,USA)将扩增的NCg11090基因片段克隆到大肠杆菌质粒pCR.2.1中。结果，pCR-1090载体被构建。图1是显示500bp的NCg11090基因被克隆到pCR-1090载体中的示意图。

实施例2：具有失活谷氨酸棒状杆菌KFCC10881内源基因NCg11090基因的产L-赖氨酸微生物的构建

使用在实施例1中构建的pCR-1090载体通过根据在Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52:541-545中描述的电脉冲方法来转化产L-赖氨酸微生物谷氨酸棒状杆菌KFCC10881。在培养第2天进行PCR以确认在转化微生物中NCg11090的断裂。特别是，使用转化微生物的染色体DNA作为模板以由SEQ.ID.NO:6和NO:7表示的寡核苷酸引物进行PCR。结果，大约5030bp(由SEQ.ID.NO:1表示的第1-804核苷酸)的含有pCR-1090质粒的NCg11090基因片段被扩增。通过PCR，可以确定NCg11090基因通过同源重组通过交叉（cross-over）将pCR-1090质粒插入到染色体DNA上的内源NCg11090基因的中间而断裂。

得到的微生物被命名为“谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CO01-0018”，其于2006年12月7日被保藏在位于361-221,Hongje-1-Dong,Seodaemungu-Gu,Seoul,Korea的国际保藏单位KFCC(Korean Federation of Culture Collection)的KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms)，(保藏号:KCCM 10810P)。

实施例3:使用谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CO01-0018生产赖氨酸

培养在实施例2中制备的转化体谷氨酸棒状杆菌KFCC 10881-CO01-0018(KCCM10810P)以生产L-赖氨酸。

首先，将谷氨酸棒状杆菌母菌KFCC 10881和转化体KFCC 10881-CO01-0018(KCCM10810P)接种在含有25ml具有下面列出的成分的种子培养基的250ml带有角挡板的烧瓶（corner-baffled flask）中，然后在200rpm搅拌下30℃下培养20小时。将1mL种子培养基接种在含有24ml具有下面列出的成分的生产培养基的250ml带有角挡板的烧瓶中，接着在200rpm搅拌下30℃下培养120小时。当培养完成时，通过HPLC(Waters2457)测定L-赖氨酸的产生。

结果，谷氨酸棒状杆菌母菌KFCC 10881和谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CO01-0018(KCCM10810P)在它们的培养基中分别产生45g/1和52g/1的L-赖氨酸作为L-赖氨酸的盐酸盐。

种子培养基（pH7.0):

粗糖20g,蛋白胨10g，酵母膏5g,尿素1.5g,KH₂PO₄4g,K₂HPO₄8g，MgSO₄7H₂O0.5g,生物素100μg,硫胺HCl1000μg，钙-泛酸2000μg,烟碱2000μg(溶于1升生产用水中)。

生产培养基(pH7.0):

粗糖100g,(NH)₄SO₂40g,大豆蛋白2.5g,谷物浸出固体5g,尿素3g,KH₂PO₄1g,MgSO₄7H₂O0.5g,生物素100μg,硫胺HCl1000μg,钙-泛酸2000μg,烟碱3000μg,CaCO₃30g(溶于1升生产用水中)

实施例4:从谷氨酸棒状杆菌KFCC 10881-CO01-0018培养物中收集L-赖氨酸

在含有糖蜜和粗糖的培养基中培养谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CO01-0018。使用HCl将1L得到的赖氨酸培养物的pH调节到2.0，然后Ca离子被转化成CaSO₄或者CaCl₂形式。将培养物向上充满在由铵离子再生的阳离子交换树脂（Diaion SK-L10）上，然后吸附。树脂层中保留的细胞通过脱盐水洗涤除去，接着使用2N氢氧化铵洗脱。结果，赖氨酸被高浓度收集。收集的含赖氨酸溶液被浓缩，并使用HCl将溶液的pH条件到5.0，接着在20℃下冷却结晶。结晶后，将得到的结晶浆液离心以得到初级湿产品。母液通过分批浓缩，然后结晶以得到次级湿产品。将初级和次级湿产品混合并干燥以得到47.5g干赖氨酸产品（赖氨酸含量；98.5%）。

工业实用性

如上所述，根据本发明，L-赖氨酸产率可通过使谷氨酸棒状杆菌KFCC10881-CO01-0019(KCCM 10810P)的内源基因NCg11090基因失活而增加。本发明的方法有利于高浓度生产L-赖氨酸，导致L-赖氨酸产率增加。

本领域技术人员将会理解，在前述说明书中公开的构思和特定实施方式可以很用以被用作修改或设计的基础以便实现本发明的相同目的的实施方式。本领域技术人员还会理解，这些等同实施方式不偏离在所附的权利要求书中阐明的本发明的精神和范围。

<110> CJ第一制糖株式会社

<120> 具有增强的L-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物以及

使用所述微生物生产L-赖氨酸的方法

<130> FP13KR1811

<150> KR 10-2006-137652

<151> 2006-12-29

<160> 7

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 804

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

atgagctttt ttgaggacat cgcggctgga cttgatagtg acggtatcga gtcccgcgta 60

aacggcgaca caatgttcgt tccgatcacc tctgacttgg aaatccagtt cgtggagatc 120

gattccctcc tacctgcagc aaacgtttat atcgctgcag ccaatgttga tgaagacgat 180

gatgagttcg aggcagttct cgtttcggtg gtgttctctg ttgaggatgc tgtcgctgct 240

gtcgcaaagc atgttgctac tgatcaggtg gtgactgtgc tgcgtgatct acttgaagga 300

actgatgaac gcatccagga tttggagttt ttccaggatg cagtgaatgc aaatttggtt 360

cgtgcggaag tcggccagaa ttctgagctt caggttttgg tcgaggttga agacggcgtc 420

ccaaccgcaa cggtcaattt catcgcgatc ggtgagtcct ttgaagatct gattgatcag 480

gccattgaag aattgtggga atccgacggc gacgcagttc tatcggatga agatcgccaa 540

cgcatgttcg ctgatttgac ctccgagttg gaatttgtca ctgatgaagt cctcgacttg 600

ggtaccttca ctgattttga tcgacttttc gatatccttt ccctcgccga tgaccaggct 660

gaggattggg aagcacagct cgttcctttt gaggacgagg aatttgatga gccggatgtt 720

tatgaccttt tcgtcgatga ctctgaagaa gatgacgacg acctcgatga tgacgaggac 780

gatgaggatg atgacgaaga ctag 804

<210> 2

<211> 401

<212> DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 2

gccaatgttg atgaagacga tgatgagttc gaggcagttc tcgtttcggt ggtgttctct 60

gttgaggatg ctgtcgctgc tgtcgcaaag catgttgcta ctgatcaggt ggtgactgtg 120

ctgcgtgatc tacttgaagg aactgatgaa cgcatccagg atttggagtt tttccaggat 180

gcagtgaatg caaatttggt tcgtgcggaa gtcggccaga attctgagct tcaggttttg 240

gtcgaggttg aagacggcgt cccaaccgca acggtcaatt tcatcgcgat cggtgagtcc 300

tttgaagatc tgattgatca ggccattgaa gaattgtggg aatccgacgg cgacgcagtt 360

ctatcggatg aagatcgcca acgcatgttc gctgatttga c 401

<210> 3

<211> 267

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> NCg11090 amino acid sequences encoding a hypothetical protein

<400> 3

Met Ser Phe Phe Glu Asp Ile Ala Ala Gly Leu Asp Ser Asp Gly Ile

1 5 10 15

Glu Ser Arg Val Asn Gly Asp Thr Met Phe Val Pro Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Leu Glu Ile Gln Phe Val Glu Ile Asp Ser Leu Leu Pro Ala Ala Asn

35 40 45

Val Tyr Ile Ala Ala Ala Asn Val Asp Glu Asp Asp Asp Glu Phe Glu

50 55 60

Ala Val Leu Val Ser Val Val Phe Ser Val Glu Asp Ala Val Ala Ala

65 70 75 80

Val Ala Lys His Val Ala Thr Asp Gln Val Val Thr Val Leu Arg Asp

85 90 95

Leu Leu Glu Gly Thr Asp Glu Arg Ile Gln Asp Leu Glu Phe Phe Gln

100 105 110

Asp Ala Val Asn Ala Asn Leu Val Arg Ala Glu Val Gly Gln Asn Ser

115 120 125

Glu Leu Gln Val Leu Val Glu Val Glu Asp Gly Val Pro Thr Ala Thr

130 135 140

Val Asn Phe Ile Ala Ile Gly Glu Ser Phe Glu Asp Leu Ile Asp Gln

145 150 155 160

Ala Ile Glu Glu Leu Trp Glu Ser Asp Gly Asp Ala Val Leu Ser Asp

165 170 175

Glu Asp Arg Gln Arg Met Phe Ala Asp Leu Thr Ser Glu Leu Glu Phe

180 185 190

Val Thr Asp Glu Val Leu Asp Leu Gly Thr Phe Thr Asp Phe Asp Arg

195 200 205

Leu Phe Asp Ile Leu Ser Leu Ala Asp Asp Gln Ala Glu Asp Trp Glu

210 215 220

Ala Gln Leu Val Pro Phe Glu Asp Glu Glu Phe Asp Glu Pro Asp Val

225 230 235 240

Tyr Asp Leu Phe Val Asp Asp Ser Glu Glu Asp Asp Asp Asp Leu Asp

245 250 255

Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Asp Asp Glu Asp

260 265

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 1 for amplifying a partial region (160-560nt) of NCg11090

<400> 4

gccaatgttg atgaagacga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 2 for amplifying a partial region (160-560nt) of NCg11090

<400> 5

gtcaaatcag cgaacatgcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 3 for amplifying NCg11090 entire gene

<400> 6

atgagctttt ttgaggacat 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer 4 for amplifying NCg11090 entire gene

<400> 7

ctagtcttcg tcatcatcct 20

Claims

1.一种将具有由SEQ.ID.NO:1表示的核苷酸序列的内源NCg11090基因失活而具有提高的L-赖氨酸产率的棒状杆菌属微生物。

2.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，所述棒状杆菌属微生物为谷氨酸棒状杆菌。

3.根据权利要求1所述的棒状杆菌属微生物，其特征在于，失活可通过选自下组的一种或多种突变方法来诱导，该组由在内源NCg11090基因中插入一个或多个碱基对，或者在该基因中缺失一个或多个碱基对，通过在该基因中插入无义密码子的碱基对转换或颠换所组成。

4.一种生产L-赖氨酸的方法，所述方法包括下列步骤：通过培养权利要求1至3中任一项所述的棒状杆菌属微生物在培养物或细胞中产生L-赖氨酸；并从培养物中收集L-赖氨酸。