CN112725325A - 一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 - Google Patents
一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112725325A CN112725325A CN202110142291.8A CN202110142291A CN112725325A CN 112725325 A CN112725325 A CN 112725325A CN 202110142291 A CN202110142291 A CN 202110142291A CN 112725325 A CN112725325 A CN 112725325A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- alpha
- hydroxylase
- hydroxyprogesterone
- immobilized
- conversion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/084—Polymers containing vinyl alcohol units
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P33/00—Preparation of steroids
- C12P33/06—Hydroxylating
- C12P33/08—Hydroxylating at 11 position
- C12P33/10—Hydroxylating at 11 position at 11 alpha-position
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α‑羟基黄体酮的方法,其特征在于,以17α‑羟基黄体酮为底物,利用固定化羟化酶转化制备11α,17α‑羟基黄体酮,包括配制培养基,在培养基中培养赭曲霉,羟化酶诱导,制备固定化羟化酶,配制转化体系,底物转化,产物提取精制等步骤。本发明具有投料浓度高、底物转化率高、转化周期短、产物易于分离和固定化羟化酶可反复多次使用的优点。单次酶反应17α‑羟基黄体酮的投料浓度为40g/L,摩尔转化率可达到93%,同时固定化羟化酶可反复循环使用3次以上。本发明操作工艺简单,生产成本较低,具有较高的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,属于甾体中间体的制备技术领域。
背景技术
甾体化合物(Steroids)又称类固醇,是一类含有环戊烷多氢菲母核的化合物。其基本结构由三个六元环和一个五元环组成,分别称为A、B、C、D环,一般在甾体母核的第10和13位上有角甲基(-CH3),第3、11位可能有羟基(-OH)或酮基(-C=O),A环或B环存在部分双键,第17位上有长短不同的侧链。由于甾体母核上取代基、双键位置或立体构型等的不同,形成了一系列具有独特生理功能的化合物。甾体类药物是医药行业中产量仅次于抗生素的第二大类药物,甾体类药物被广泛用于治疗支气管哮喘、风湿性关节炎、湿疹、贫血以及促进骨折、伤口的愈合和治疗艾迪森氏等内分泌疾病。
11α,17α-羟基黄体酮是合成甾体类药物醋酸泼尼松龙的重要中间体,目前主要利用发酵法生产11α,17α-羟基黄体酮来生产,主要的做法为以17α-羟基黄体酮为底物,利用霉菌的11α位羟基化能力对其进行羟化来获得。然而由于17α-羟基黄体酮极低的水溶性,成为限制17α-羟基黄体酮羟基化反应速率的主要制约因素。
目前采用较多的方法是在发酵液中加入有机溶剂或表面活性剂对底物进行有效分散,来提高甾体底料与菌体细胞的接触面积,从而提高羟基化反应速率。现有发酵方法也存在如下不足之处:①投料浓度较低。由于菌体细胞对高浓度有机溶剂及表面活性剂的低耐受性,导致投料浓度提升空间受限,据现有报道,17α-羟基黄体酮的投料浓度均在30g/L以下。②发酵废水量较大,对环境污染严重,且废水处理成本高。③产物提取纯化工艺复杂,产品终收率较低。发酵法中产物11α,17α-羟基黄体酮主要被菌体吸附,需要对菌体进行全细胞反复萃取来提取产物,而大量菌体富含的杂质如色素、脂类和蛋白也被同时萃取出来,使后续需要较为复杂的提取精制工艺,才能获得纯度较高的11α,17α-羟基黄体酮。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:现有发酵制备11α,17α-羟基黄体酮的方法投料浓度较低,发酵废水量较大,产物提取纯化工艺复杂,产品终收率较低等问题。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,以17α-羟基黄体酮为底物,利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮,包括如下步骤:
步骤1):配制培养基;
步骤2):在培养基中培养赭曲霉;
步骤3):羟化酶诱导;
步骤4):制备固定化羟化酶;
步骤5):配制转化体系;
步骤6):底物转化;
步骤7):产物提取精制。
优选地,所述步骤1)包括一级和二级培养基的配制,所述一级培养基包括以重量份数计的葡萄糖5-10份,酵母膏2-8份,K2HPO4 1.0-2.0份,NaCl 0.1-1.0份,水1000份,并调节pH至5.0-6.8;所述二级培养基包括以重量份数计的蔗糖20.0-40.0份,酵母膏10.0-30.0份,玉米浆20.0-40.0份,K2HPO4 1.0-2.0份,MgSO4·7H2O 1.0-3.0份,水1000份,并调节pH至5.0-6.8。
优选地,所述步骤2)包括一级发酵和二级发酵,先将赭曲霉的斜面菌种接种于一级培养基中,培养12-36h,后再按照体积分数为10%的接种量将一级发酵液接入二级培养基中,发酵时间12-24h,得二级培养液;所述赭曲霉的培养条件为温度25-30℃,培养时控制摇床转速180-250rpm。
优选地,所述步骤2)中的赭曲霉,拉丁文名为Aspergillus ochraceus,保藏号为CCTCC NO:M 2019186,保藏日期为2019年3月21日,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
优选地,所述步骤3)具体为:在步骤2)所得的二级培养液中加入质量浓度为0.1-1.0g/L的17α-羟基黄体酮,继续培养6-12h后,停止发酵,过滤取菌体,并用质量浓度0.9%的生理盐水反复清洗菌体3次。
优选地,所述步骤4)具体为:将步骤3)获得的菌体重悬于无菌水中,菌体与水的比例为(0.5-1)g:1mL,搅拌均匀后,用高速均质机对菌悬液进行细胞破碎,然后过滤,获得的上清液即为羟化酶粗酶液,继续向羟化酶粗酶液中加入包埋剂,混合均匀后,再滴入质量浓度0.6%的氯化钙饱和硼砂溶液中,搅拌固定1.0-3.0h,过滤,获得固定化羟化酶;所述的包埋剂为海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液,海藻酸钠、聚乙烯醇的质量浓度分别为30-50g/L、80-120g/L,海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液与羟化酶粗酶液的体积比为1:1。
更优选地,所述高速均质机的转速为1.0×104-2.0×104r/min,处理时间为15-25min,均质过程中用低温循环器控制体系温度为4-10℃。
优选地,所述步骤5)中的转化体系包括以重量份数计的葡萄糖0.1-1.0份,KH2PO40.1-0.5份,氯化苄基三乙基铵3.0-10.0份,异戊醇700.0-900.0份,MgSO4·7H2O 0.1-0.3份,17α-羟基黄体酮40.0份,乳化剂10.0-30.0份,水100.0-300.0份,pH值为4.5-5.5;配制方法为将葡萄糖、K2HPO4、氯化苄基三乙基铵和乳化剂溶解于无菌水中,获得A相,17α-羟基黄体酮溶解于异戊醇中,获得B相,在搅拌状态下,将B相加入到A相中,后用高速均质机于2.0×104r/min条件下均质30min,获得转化体系。
优选地,所述步骤6)具体为:将步骤4)获得的固定化羟化酶加入到步骤5)获得的转化体系中,固定化羟化酶与转化体系的比例为1g:100-200mL,控制反应温度25-30℃,转速180-250r/min,转化时间12-24h。
优选地,所述步骤7)具体为:转化结束后,过滤去除固定化羟化酶,滤液离心分相,取有机相,再经过脱色、蒸馏、精制,得到11α,17α-羟基黄体酮。过滤所得的固定化羟化酶可以反复使用3次以上。
本发明提供了一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,利用羟化酶固定化技术与非水相反应体系技术,实现17α-羟基黄体酮在高浓度有机溶剂体系中的11α-羟基化反应,能较好的解决当前本领域存在的问题。
与现有技术相比,本发明的有益效果如下:
(1)投料浓度较高。由于反应体系中有机溶剂占比很高,底物与产物均能较好的溶解于反应体系中,利用相转移催化剂的两相转运机制,可有效的提升羟基化反应速率。单次酶反应17α-羟基黄体酮的投料浓度可达到40g/L,摩尔转化率可达到93%,且转化时间可缩短至24h以内。
(2)废水量少。与传统发酵法相比,本发明所使用的转化体系的用水量仅为传统方法的10-30%,这就使后期废水量大幅减少。
(3)固定化酶可循环使用多次。固定化羟化酶可反复循环进行羟基化反应3次以上,使生产成本大幅降低。
(4)提取纯化过程较简单。由于本发明采用酶催化,且反应体系成分简单明确,同时产物主要分布于有机相中,所以产物的后续分离纯化工艺在一定程度上得到简化。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂,兹以优选实施例,作详细说明如下。
HPLC检测条件:安捷伦1260高效液相色谱仪;安捷伦XDB-C18柱(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相:水/甲醇/(20/80);流速:1.0mL/min;波长:243nm。
实施例1
赭曲霉(Aspergillus ochraceus)通过斜面培养,得到发酵所需要的菌种。
一、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)斜面菌种及种子液制备
(1)斜面培养
斜面培养基:去皮马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,自然pH,121℃湿热灭菌30min。
将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下吸取一定量菌液均匀涂布于斜面培养基中,28℃恒温培养4-6天。
(2)种子培养
一级培养基的重量份组成包括(g):葡萄糖5,酵母膏2,K2HPO4 1.0,NaCl 0.1,水1000,并调节pH至5.0,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
将步骤(1)培养的菌株,在无菌条件下用接种环挑取6环孢子于装有100mL种子培养基中,按照同样方式接种4瓶,并于25℃条件下,180r/min培养12h,制得种子液。
二、二级培养及诱导
二级培养基的重量份组成包括(g):蔗糖20.0,酵母膏10.0,玉米浆20.0,K2HPO41.0,MgSO4·7H2O 1.0,水1000,并调节pH至5.0,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
使用250mL摇瓶进行二级发酵,装液量100mL,将种子液按照10%接种量转接入二级培养基中,温度25℃,转速180r/min。当培养时间为12h时,加入17α-羟基黄体酮0.1g/L,继续培养6h,停止发酵,过滤取菌体,并用质量分数为0.9%的生理盐水反复清洗菌体3次。
三、固定化羟化酶的制备
将获得的菌体重悬于无菌水中,菌体与水的质量体积比为0.5g:1mL,搅拌均匀后,用高速均质机对菌悬液进行细胞破碎,高速均质机的转速为1.0×104r/min,处理时间为15min,均质过程中用低温循环器控制体系温度为4℃。后过滤,获得的上清液即为羟化酶粗酶液,继续向粗酶液中加入包埋剂,包埋剂为海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液,海藻酸钠与聚乙烯醇的质量浓度分别为30g/L和80g/L,海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液与羟化酶粗酶液的体积比为1:1。混合均匀后,再缓慢滴入质量分数为0.6%的氯化钙饱和硼砂溶液中,缓慢搅拌固定1.0h,过滤,获得固定化羟化酶。
四、配制转化体系
转化体系的重量份组成包括(g):葡萄糖0.1,KH2PO4 0.1,氯化苄基三乙基铵3.0,异戊醇700.0,MgSO4·7H2O 0.1,17α-羟基黄体酮40.0,乳化剂30.0,水300.0,pH为4.5。
具体的配制方法为:将0.1g的葡萄糖、0.1g的K2HPO4、3.0g的氯化苄基三乙基铵和30g的乳化剂溶解于300g的无菌水中,获得A相;将40g的17α-羟基黄体酮溶解于700mL的异戊醇中,获得B相;在搅拌状态下,将B相缓慢加入A相中,后用高速均质机于2.0×104r/min条件下均质30min,获得转化体系。
五、转化
将上述步骤(4)获得的固定化酶加入到步骤(5)获得的转化体系中,固定化酶与转化体系的质量体积比为1g:100mL,控制反应温度25℃,转速180r/min,转化时间24h,经HPLC检测,摩尔转化率为90%。
六、产物提取精制
待转化结束后,过滤去除固定化酶,滤液离心分相,取上层有机相,经过活性炭脱色和减压蒸馏等步骤,得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制,最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品32.1g,收率为80.3%,HPLC纯度为98.6%。
实施例2
赭曲霉(Aspergillus ochraceus)通过斜面培养,得到发酵所需要的菌种。
一、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)斜面菌种及种子液制备
(1)斜面培养
斜面培养基:去皮马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,自然pH,121℃湿热灭菌30min。
将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下吸取一定量菌液均匀涂布于斜面培养基中,28℃恒温培养4-6天。
(2)种子培养
一级培养基的重量份组成包括(g):葡萄糖7,酵母膏5,K2HPO4 1.5,NaCl 0.4,水1000,并调节pH至5.5,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
将步骤(1)培养的菌株,在无菌条件下用接种环挑取6环孢子于装有100mL种子培养基中,按照同样方式接种4瓶,并于28℃条件下,200r/min培养24h,制得种子液。
二、二级培养及诱导
二级培养基的重量份组成包括(g):蔗糖30.0,酵母膏25.0,玉米浆35.0,K2HPO41.5,MgSO4·7H2O 2.0,水1000,并调节pH至5.5,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
使用250mL摇瓶进行二级发酵,装液量100mL,将种子液按照10%接种量转接入二级培养基中,温度28℃,转速200r/min。当培养时间为18h时,加入17α-羟基黄体酮0.6g/L,继续培养10h,停止发酵,过滤取菌体,并用质量分数为0.9%的生理盐水反复清洗菌体3次。
三、固定化羟化酶的制备
将获得的菌体重悬于无菌水中,菌体与水的质量体积比为0.8g:1mL,搅拌均匀后,用高速均质机对菌悬液进行细胞破碎,高速均质机的转速为1.5×104r/min,处理时间为20min,均质过程中用低温循环器控制体系温度为8℃。后过滤,获得的上清液即为羟化酶粗酶液,继续向粗酶液中加入包埋剂,包埋剂为海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液,海藻酸钠与聚乙烯醇的质量浓度分别为40g/L和100g/L,海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液与羟化酶粗酶液的体积比为1:1。混合均匀后,再缓慢滴入质量分数为0.6%的氯化钙饱和硼砂溶液中,缓慢搅拌固定2.5h,过滤,获得固定化羟化酶。
四、配制转化体系
转化体系的重量份组成包括(g):葡萄糖0.6,KH2PO4 0.3,氯化苄基三乙基铵7.0,异戊醇800.0,MgSO4·7H2O 0.2,17α-羟基黄体酮40.0,乳化剂25.0,水200.0,pH为5.5。
具体的配制方法为:将0.6g的葡萄糖、0.3g的K2HPO4、7.0g的氯化苄基三乙基铵和25g的乳化剂溶解于200g的无菌水中,获得A相;将40g的17α-羟基黄体酮溶解于800mL的异戊醇中,获得B相;在搅拌状态下,将B相缓慢加入A相中,后用高速均质机于2.0×104r/min条件下均质30min,获得转化体系。
七、转化
将上述步骤(4)获得的固定化酶加入到步骤(5)获得的转化体系中,固定化酶与转化体系的质量体积比为1g:150mL,控制反应温度28℃,转速200r/min,转化时间18h,经HPLC检测,摩尔转化率为93%。
八、产物提取精制
待转化结束后,过滤去除固定化酶,滤液离心分相,取上层有机相,经过活性炭脱色和油浴减压蒸馏等步骤,得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制,最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品34.4g,质量收率为86%,HPLC纯度为99.1%。
实施例3
赭曲霉(Aspergillus ochraceus)通过斜面培养,得到发酵所需要的菌种。
一、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)斜面菌种及种子液制备
(1)斜面培养
斜面培养基:去皮马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,自然pH,121℃湿热灭菌30min。
将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下吸取一定量菌液均匀涂布于斜面培养基中,28℃恒温培养4-6天。
(2)种子培养
一级培养基的重量份组成包括(g):葡萄糖10,酵母膏8,K2HPO4 2.0,NaCl 1.0,水1000,并调节pH至6.8,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
将步骤(1)培养的菌株,在无菌条件下用接种环挑取6环孢子于装有100mL种子培养基中,按照同样方式接种4瓶,并于30℃条件下,250r/min培养36h,制得种子液。
二、二级培养及诱导
二级培养基的重量份组成包括(g):蔗糖40.0,酵母膏30.0,玉米浆40.0,K2HPO42.0,MgSO4·7H2O 3.0,水1000,并调节pH至6.8,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
使用250mL摇瓶进行二级发酵,装液量100mL,将种子液按照10%接种量转接入二级培养基中,温度30℃,转速250r/min。当培养时间为位24h时,加入17α-羟基黄体酮1.0g/L,继续培养12h,停止发酵,过滤取菌体,并用质量分数为0.9%的生理盐水反复清洗菌体3次。
三、固定化羟化酶的制备
将获得的菌体重悬于无菌水中,菌体与水的质量体积比为1g:1mL,搅拌均匀后,用高速均质机对菌悬液进行细胞破碎,高速均质机的转速为2.0×104r/min,处理时间为25min,均质过程中用低温循环器控制体系温度为10℃。后过滤,获得的上清液即为羟化酶粗酶液,继续向粗酶液中加入包埋剂,包埋剂为海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液,海藻酸钠与聚乙烯醇的质量浓度分别为50g/L和120g/L,海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液与羟化酶粗酶液的体积比为1:1。混合均匀后,再缓慢滴入质量分数为0.6%的氯化钙饱和硼砂溶液中,缓慢搅拌固定3.0h,过滤,获得固定化羟化酶。
四、配制转化体系
转化体系的重量份组成包括(g):葡萄糖1.0,KH2PO4 0.5,氯化苄基三乙基铵10.0,异戊醇900.0,MgSO4·7H2O 0.3,17α-羟基黄体酮40.0,乳化剂10.0,水100.0,pH5.5。
具体的配制方法为:将1.0g的葡萄糖、0.5g的K2HPO4、10g的氯化苄基三乙基铵和30g的乳化剂溶解于100g的无菌水中,获得A相;将40g的17α-羟基黄体酮溶解于900mL的异戊醇中,获得B相;在搅拌状态下,将B相缓慢加入A相中,后用高速均质机于2.0×104r/min条件下均质30min,获得转化体系。
九、转化
将上述步骤(4)获得的固定化酶加入到步骤(5)获得的转化体系中,固定化酶与转化体系的质量体积比为1g:200mL,控制反应温度30℃,转速250r/min,转化时间12h,经HPLC检测,摩尔转化率为91%。
十、产物提取精制
待转化结束后,过滤去除固定化酶,滤液离心分相,取上层有机相,经过活性炭脱色和油浴减压蒸馏等步骤,得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制,最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品32.9g,质量收率为82%,HPLC纯度为98.3%。
对比例1
赭曲霉(Aspergillus ochraceus)通过斜面培养,得到发酵所需要的菌种。
一、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)斜面菌种及种子液制备
(1)斜面培养
斜面培养基:去皮马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,自然pH,121℃湿热灭菌30min。
将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下吸取一定量菌液均匀涂布于斜面培养基中,28℃恒温培养4-6天。
(2)种子培养
一级培养基的重量份组成包括(g):葡萄糖7,酵母膏5,K2HPO4 1.5,NaCl 0.4,水1000,并调节pH至5.5,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
将步骤(1)培养的菌株,在无菌条件下用接种环挑取6环孢子于装有100mL种子培养基中,按照同样方式接种4瓶,并于28℃条件下,200r/min培养18h,制得种子液。
二、二级培养
二级培养基的重量份组成包括(g):蔗糖30.0,酵母膏25.0,玉米浆35.0,K2HPO41.5,MgSO4·7H2O 2.0,水1000,并调节pH至5.5,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
使用250mL摇瓶进行二级发酵,装液量100mL,将种子液按照10%接种量转接入二级培养基中,温度28℃,转速200r/min。当培养时间为18h时,加入17α-羟基黄体酮20.0g/L,继续转化90h,终止发酵。在发酵90h后,17α-羟基黄体酮的的摩尔转化率为76%。
发酵结束后,将发酵液90℃灭活,冷却至25℃后,过滤,滤饼用三氯甲烷萃取,再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制,最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品12.4g,总收率为62%,纯度为97.1%。
对比例2
赭曲霉(Aspergillus ochraceus)通过斜面培养,得到发酵所需要的菌种。
一、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)斜面菌种及种子液制备
(1)斜面培养
斜面培养基:去皮马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,自然pH,121℃湿热灭菌30min。
将甘油管中保藏的菌种于无菌操作下吸取一定量菌液均匀涂布于斜面培养基中,28℃恒温培养4-6天。
(2)种子培养
一级培养基的重量份组成包括(g):葡萄糖7,酵母膏5,K2HPO4 1.5,NaCl 0.4,水1000,并调节pH至5.5,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
将步骤(1)培养的菌株,在无菌条件下用接种环挑取6环孢子于装有100mL种子培养基中,按照同样方式接种4瓶,并于28℃条件下,200r/min培养18h,制得种子液。
二、二级培养
二级培养基的重量份组成包括(g):蔗糖30.0,酵母膏25.0,玉米浆35.0,K2HPO41.5,MgSO4·7H2O 2.0,水1000,并调节pH至5.5,121℃高压蒸汽灭菌30min,冷却待用。
使用250mL摇瓶进行二级发酵,装液量100mL,将种子液按照10%接种量转接入二级培养基中,温度28℃,转速200r/min。当培养时间为18h时,加入17α-羟基黄体酮20.0g/L,5g/L的二甲基甲酰胺(DMF),继续转化90h,终止发酵。在发酵90h后,17α-羟基黄体酮的的摩尔转化率为79%。
发酵结束后,将发酵液90℃灭活,冷却至25℃后,过滤,滤饼用三氯甲烷萃取,再经过滤、脱色及蒸馏等工序得到11α,17α-羟基黄体酮粗品。
上述粗品再用氯仿-甲苯打浆精制,最终得到11α,17α-羟基黄体酮精品13.4g,总收率为67%,纯度为97.9%。
通过实施例可知,具有以下优点:
1、有助于提高17α-羟基黄体酮的摩尔转化率、缩短转化周期及提高产品的总收率。如实施例所述,实施例1、2、3利用固定化羟化酶及低水相的反应体系,在投料浓度为40g/L的情况下,底物摩尔转化率均能达到90%以上,最优可达93%,转化时间均在24h以内,产品总收率均在80%以上;而对比例1,2中利用传统的转化方法,在投料仅为20g/L的情况下,底物的摩尔转化率仅为76%及79%,转化时间超过90h,且总收率菌低于70%。
2、有助于降低生产成本。固定化羟化酶的可重复使用3次以上。反应体系中有机溶剂可以回收循环使用,有助于降低产品的生产成本。
Claims (10)
1.一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,以17α-羟基黄体酮为底物,利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮,包括如下步骤:
步骤1):配制培养基;
步骤2):在培养基中培养赭曲霉;
步骤3):羟化酶诱导;
步骤4):制备固定化羟化酶;
步骤5):配制转化体系;
步骤6):底物转化;
步骤7):产物提取精制。
2.如权利要求1所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述步骤1)包括一级和二级培养基的配制,所述一级培养基包括以重量份数计的葡萄糖5-10份,酵母膏2-8份,K2HPO4 1.0-2.0份,NaCl 0.1-1.0份,水1000份,并调节pH至5.0-6.8;所述二级培养基包括以重量份数计的蔗糖20.0-40.0份,酵母膏10.0-30.0份,玉米浆20.0-40.0份,K2HPO4 1.0-2.0份,MgSO4·7H2O 1.0-3.0份,水1000份,并调节pH至5.0-6.8。
3.如权利要求2所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述步骤2)包括一级发酵和二级发酵,先将赭曲霉的斜面菌种接种于一级培养基中,培养12-36h,后再按照体积分数为10%的接种量将一级发酵液接入二级培养基中,发酵时间12-24h,得二级培养液;所述赭曲霉的培养条件为温度25-30℃,培养时控制摇床转速180-250rpm。
4.如权利要求1或3所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述步骤2)中的赭曲霉,拉丁文名为Aspergillus ochraceus,保藏号为CCTCCNO:M 2019186,保藏日期为2019年3月21日,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
5.如权利要求3所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述步骤3)具体为:在步骤2)所得的二级培养液中加入质量浓度为0.1-1.0g/L的17α-羟基黄体酮,继续培养6-12h后,停止发酵,过滤取菌体,并用质量浓度0.9%的生理盐水反复清洗菌体3次。
6.如权利要求5所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述步骤4)具体为:将步骤3)获得的菌体重悬于无菌水中,菌体与水的比例为(0.5-1)g:1mL,搅拌均匀后,用高速均质机对菌悬液进行细胞破碎,然后过滤,获得的上清液即为羟化酶粗酶液,继续向羟化酶粗酶液中加入包埋剂,混合均匀后,再滴入质量浓度0.6%的氯化钙饱和硼砂溶液中,搅拌固定1.0-3.0h,过滤,获得固定化羟化酶;所述的包埋剂为海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液,海藻酸钠、聚乙烯醇的质量浓度分别为30-50g/L、80-120g/L,海藻酸钠与聚乙烯醇的水溶液与羟化酶粗酶液的体积比为1:1。
7.如权利要求6所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述高速均质机的转速为1.0×104-2.0×104r/min,处理时间为15-25min,均质过程中用低温循环器控制体系温度为4-10℃。
8.如权利要求1所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述步骤5)中的转化体系包括以重量份数计的葡萄糖0.1-1.0份,KH2PO4 0.1-0.5份,氯化苄基三乙基铵3.0-10.0份,异戊醇700.0-900.0份,MgSO4·7H2O 0.1-0.3份,17α-羟基黄体酮40.0份,乳化剂10.0-30.0份,水100.0-300.0份,pH值为4.5-5.5;配制方法为将葡萄糖、K2HPO4、氯化苄基三乙基铵和乳化剂溶解于无菌水中,获得A相,17α-羟基黄体酮溶解于异戊醇中,获得B相,在搅拌状态下,将B相加入到A相中,后用高速均质机于2.0×104r/min条件下均质30min,获得转化体系。
9.如权利要求1所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述步骤6)具体为:将步骤4)获得的固定化羟化酶加入到步骤5)获得的转化体系中,固定化羟化酶与转化体系的比例为1g:(100-200)mL,控制反应温度25-30℃,转速180-250r/min,转化时间12-24h。
10.如权利要求9所述的利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法,其特征在于,所述步骤7)具体为:转化结束后,过滤去除固定化羟化酶,滤液离心分相,取有机相,再经过脱色、蒸馏、精制,得到11α,17α-羟基黄体酮。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110142291.8A CN112725325B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110142291.8A CN112725325B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112725325A true CN112725325A (zh) | 2021-04-30 |
CN112725325B CN112725325B (zh) | 2021-11-19 |
Family
ID=75595501
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110142291.8A Active CN112725325B (zh) | 2021-02-02 | 2021-02-02 | 一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112725325B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105713883A (zh) * | 2014-12-05 | 2016-06-29 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种l-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用 |
CN106319016A (zh) * | 2016-09-20 | 2017-01-11 | 上海应用技术大学 | 一种制备11α,17α‑羟基黄体酮的方法 |
CN106831919A (zh) * | 2015-12-04 | 2017-06-13 | 上海市农药研究所有限公司 | 生物转化17α-羟基黄体酮生产11α,17α-双羟基黄体酮的提取工艺 |
CN106916872A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-07-04 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高效生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法 |
-
2021
- 2021-02-02 CN CN202110142291.8A patent/CN112725325B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105713883A (zh) * | 2014-12-05 | 2016-06-29 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种l-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用 |
CN106831919A (zh) * | 2015-12-04 | 2017-06-13 | 上海市农药研究所有限公司 | 生物转化17α-羟基黄体酮生产11α,17α-双羟基黄体酮的提取工艺 |
CN106916872A (zh) * | 2015-12-28 | 2017-07-04 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种高效生物转化制备11α,17α-二羟基黄体酮的方法 |
CN106319016A (zh) * | 2016-09-20 | 2017-01-11 | 上海应用技术大学 | 一种制备11α,17α‑羟基黄体酮的方法 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
KUO-CHENGCHEN等: "11α-hydroxylation of progesterone using modified alginate-immobilized cells", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 * |
徐玉华等: "微生物甾体C11羟化反应的研究现状", 《发酵科技通讯》 * |
李存会等: "脯氨酸羟化酶固定化酶与固定化细胞催化转化L-脯氨酸的研究", 《产业与科技论坛》 * |
王人悦: "固定化细胞技术及其应用前景", 《食品研究与开发》 * |
荣绍丰等: "赭曲霉生物催化17α-羟基黄体酮11α-羟基化的工艺优化", 《中国医药工业杂志》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN112725325B (zh) | 2021-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102268490B (zh) | 农林废弃物为原料联产木糖、木糖醇和阿拉伯糖清洁工艺 | |
JP2013079224A (ja) | 長鎖ジカルボン酸を純化精製する方法及びその製品 | |
CN101481714A (zh) | 一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法 | |
CN105294790A (zh) | 一种从甜叶菊中提取高纯度甜叶菊糖苷的方法 | |
CN106636288B (zh) | 一种发酵提取剑麻皂素的方法 | |
CN107418995A (zh) | 一种石榴皮单宁液态发酵制备的鞣花酸及其制备方法 | |
CN111778307A (zh) | 静息细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法 | |
CN103255191A (zh) | 双液相系统发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮 | |
CN111808906A (zh) | 生长细胞法制备孕甾-5-烯-3β,21-二醇的方法 | |
CN116426596A (zh) | 一种生物转化制备红参Rg3的方法 | |
CN110951815A (zh) | 采用静息细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法 | |
CN102267906A (zh) | 一种绿原酸的提取方法 | |
CN109929896A (zh) | 一种熊去氧胆酸的生产工艺 | |
CN112725325B (zh) | 一种利用固定化羟化酶转化制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 | |
CN103627769A (zh) | 双液相系统发酵法降解植物甾醇制备雄烯二酮 | |
CN112608969A (zh) | 一种醋酸泼尼松的制备方法 | |
CN110846370A (zh) | 采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法 | |
CN113045618B (zh) | 从青霉素发酵菌丝体中提取麦角甾醇、制备微生态的工艺 | |
CN103361394A (zh) | 利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法 | |
CN110628860A (zh) | 植物甾醇转化分离9α-OH-AD和甲酯物的方法 | |
CN106319016B (zh) | 一种制备11α,17α-羟基黄体酮的方法 | |
CN112479799B (zh) | 一种从发酵液中分离提取番茄红素的方法 | |
CN104357527A (zh) | 一种微生物发酵法从茶籽粕中提取茶皂素的方法 | |
CN110713509A (zh) | 采用生长细胞生物发酵麦角固醇醚化物制备中间体的方法 | |
CN102180781B (zh) | 从二氧化碳萃取酒花残渣中提取生产高纯度黄腐酚的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |