CN102267906A - 一种绿原酸的提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种绿原酸的提取方法，包括以下步骤：提取、离心膜分离、反渗透膜、酸沉、离心、上柱、洗脱、回收洗脱液、干燥、包装。本发明提取的绿原酸纯度高，性能好。
Description
技术领域
本发明涉及药材加工领域，具体为一种绿原酸的提取方法。
背景技术
绿原酸（chlorogenic acid）是一种从双子叶植物（如忍冬叶、咖啡豆、向日葵等）的叶和果实分离得到的酚类,也是许多中草药（如杜仲、金银花、茵陈等）及中药复方制剂抗菌消炎、清热解毒的主要活性成分，目前已成为中草药制剂质量控制的主要指标之一。中草药是中华民族几千年文明的瑰宝，是我们炎黄子孙的骄傲。千百年来，我们的祖先运用中草药及其复方制剂在防病治病方面取得了异常丰富的临床经验，留下了一大批医药名著。近些年，由于西药的泛滥，病原微生物的变异及抗药性也取得了长足的“进步”，于是，人们重新将目光投向了中草药。特别是在人们日益崇尚天然、无污染食品的“后抗生素”时代，中草药以其独到的优势逐渐受到人们前所未有的青睐，中草药中有效成分的提取工艺、作用机理、应用研究也重新成为医药界追逐的热点，并逐渐成为动物营养界研究的一大方向。 绿原酸是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。它是一种由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸,quinic acid,即1-羟基六氢没食子酸)缩合而成的缩酚酸,异名咖啡鞣酸,化学名3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinic acid),分子式为C16H18O9,分子量：345.30，半水合物为针状晶体，110℃时变为无水化合物，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常温下呈淡黄色固体。
植物中绿原酸的生物合成包括了一系列的酶促反应。在酶的催化下,葡萄糖转化成莽草酸(shikimic acid),后者再转化成苯丙氨酸,最后经合成酶作用得绿原酸。其可能的生物合成途径如下： 绿原酸在植物中分布广泛,从高等双子叶植物到蕨类植物均有报道，但含量较高的植物不多，主要存在于忍冬科忍冬属(Lonicera)、菊科蒿属(Artemisia)植物中，其中包括杜仲、金银花、向日葵、咖啡、可可树。 植物的不同品种、发育阶段、同一植株的不同部位、存放时间、生长环境等均能影响植物中绿原酸的含量。以杜仲为例：杜仲叶中绿原酸的含量高于皮中含量数倍之多；用不同干燥方法对绿原酸含量的影响研究中,用阴干、晒干、直接烘干所测绿原酸含量分别是2.21%、2.17%和2.24%；鲜叶中含绿原酸3.52%,放置1年后,叶色棕绿,绿原酸含量为2.47%。
由于绿原酸是极性较强的有机酸，易溶于醇、水，难溶于氯仿、乙醚,因此绿原酸的提取方法较多，有醇（甲醇、乙醇）溶法、水提醇沉、醇提铅沉、石灰乳沉淀法及聚酰胺柱层析法等。下面介绍几种已在被工业化批量生产使用的提取方法。
醇溶法：先用氯仿进行连续提取至流出液呈无色,再改用95%工业乙醇提取,提尽绿原酸；将所得乙醇提取液减压浓缩成浸膏,与干净的细沙拌合后,用热水提取数次,使绿原酸转溶于水中,弃去残渣；所得水溶液用乙醚萃取,进一步除去脂溶性杂质；向脱脂后的水溶液中加入饱和无机盐溶液,至沉淀完全,并稍有过量为止。此时,水中的绿原酸与金属离子结合生成不溶性盐;用离心分离法分离出沉淀并除去沉淀中的金属离子后,将所得滤液用有机溶剂萃取数次,回收溶剂,得绿原酸粗品,经分步结晶和重结晶等方法精制,即得绿原酸纯品,收得率约为0.5%。 这种方法的弊端：工业用酒精（甚至用甲醇代替）都不是安全的提取溶媒；溶剂残留会影响产品质量，很难达到行业标准；会有大量的脂溶性杂质，影响产品纯度。
水提醇沉法：采用水为溶剂,加热煮沸提取,但相应地增加其他水溶性成分如蛋白质、多糖、鞣质等杂质,可用传统的醇沉法除去。醇沉过程中伴随吸附和包夹，致使绿原酸有不同程度的损失。提取水提液中绿原酸时,分次醇沉比一次醇沉所得产品纯度高；当乙醇浓度最终为90%时，一次醇沉的损失率比分次醇沉较大。
水提石灰乳沉淀法：在待测物水溶液中,加石灰乳使绿原酸生成钙盐沉淀,用稀酸分解,提取物中绿原酸收得率较低,可能因为绿原酸是酯类，被强碱水解所致。
虽然许多研究者对绿原酸含量的测定方法进行了研究或评述,在分析、测定过程中不乏采用层析方法,但各种方法均有其不完善之处，难以分离出全部绿原酸并得到纯品。
总的来说，这些方法的弊端：
1、工业用酒精（甚至用甲醇代替）都不是安全的提取溶媒；
2、溶剂残留会影响产品质量，很难达到行业标准；
3、会有大量的脂溶性杂质，影响产品纯度。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种绿原酸的提取方法，以解决上述背景技术中的缺点。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种绿原酸的提取方法，包括以下步骤：
第一步：提取：称取1-2千克的杜仲，纯水提取三次，第一次：加入的纯水为杜仲质量的8倍，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至30℃以下，第二次：加入的纯水为杜仲质量的6倍，加温到60℃，动态提取1小时放料液出液时用板框冷却至30℃以下，第三次：加入的纯水为杜仲质量的8倍，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至30℃以下，本次料液作为下一批的第一次提取料液；
第二步：离心：用高速管式离心机离心提取后的杜仲，去除机械性杂质，流速不超过1000/h；
第三步：膜分离：40℃以下，用0.4微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；
第四步：反渗透膜：40℃以下，用反渗透膜回收水，浓缩到杜仲质量的4倍；
第五步：酸沉：将3%的稀盐酸加入到浓缩液中，调至PH值3，沉淀1小时；
第六步：离心：用三足沉降离心机离心，流速控制在800/h；
第七步：上柱：树脂型号为LSA-21大孔吸附，上柱流速为柱体的0.6/h，进完上柱液后用PH值3的酸水清洗，酸水用量为柱体的1.5倍，流速为柱体的0.6倍/h；
第八步：洗脱：用为柱体的2倍量的10%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液，用为柱体的3倍量40%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液；
第九步：回收洗脱液：用真空减浓缩回收，10%洗脱液，40%洗脱液单独回收，回收乙醇浓缩到10婆美出液；
第十步：干燥：喷雾干燥，进汽温度控制在145℃—155℃，出汽温度控制在75℃进行喷雾；
第十一步：包装：过80目筛，控制好微生物，纸板桶包装。
本发明中，所述树脂再生方法为：新树脂用95%乙醇浸泡24小时能浸泡到树脂为准，新树脂用95%乙醇渗透清洗，流速为柱体的0.1倍，以流出液加入流出液2倍量的水没有乳白色为准，再用5%NaOH为柱体的两倍进行处理，用纯水洗至PH值7，再用3%HCLI为柱体的两倍量进行处理，用纯水洗至PH值5处理完成。
有益效果
1、将现代分离纯化技术及工艺，从实验室水平提高到了工业化生产水平，实现了植物提取物生产从传统工艺向现代工艺的过度。本项目采用的应用萃取分离、反渗透、离子交换色谱、柱色谱、膜分离等技术手段有机结合的工艺路线。目前在国内少有工业化生产的先例，在国内尚属首例，达到国际先进水平，改变我国生产绿原酸的水或酒精提取、浓缩、萃取分离、结晶分离的传统工艺；
2、首次运用高通量筛选技术，对杜仲植物提取物（绿原酸）抗菌、抗病毒、抗氧化活性成分进行筛选，这为从分子水平研究杜仲仲提取物（绿原酸）的抗菌、抗病毒、抗氧化功能提供了科学依据，实现了绿原酸抗菌、抗病毒、抗氧化活性成分及其部位的快速识别和提取。
3、将膜分离技术成功应用于天然产物纯化技术领域，研制筛选了绿原酸的高效分离体系与介质，创立了高纯度绿原酸制备的体系，使得超纯度的绿原酸与生物合成的绿原酸具有相近的含量和价格，填补了高纯度绿原酸产业化的空白，突破了产品色泽鲜亮稳定已经溶解性好、得率低、纯度高等难题。首次采用膜分离技术对大孔树脂进行预处理，解决了应用大孔树脂分离纯化植物成分中的树脂残留问题，有效的去除了树脂单体、聚合体、胶联体、致孔剂等残留物，确保大孔吸附树脂制备绿原酸符合国际标准和中国SFDA的要求，成功解决了绿原酸因为热稳定不好而容易被氧化的问题。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
称取1千克的杜仲，纯水提取三次，第一次：加入8千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至30℃，第二次：加入6千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时放料液出液时用板框冷却至28℃，第三次：加入8千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至25℃，本次料液作为下一批的第一次提取料液；用高速管式离心机离心提取后的杜仲，去除机械性杂质，流速不超过1000/h；40℃时，用0.4微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；反渗透膜：38℃时用反渗透膜回收水，浓缩到4千克；将3%的稀盐酸加入到浓缩液中，调至PH值3，沉淀1小时；用三足沉降离心机离心，流速控制在800/h；用树脂型号为LSA-21大孔吸附，上柱流速为柱体的0.6/h，进完上柱液后用PH值3的酸水清洗，酸水用量为柱体的1.5倍，流速为柱体的0.6倍/h；用为柱体的2倍量的10%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液，用为柱体的3倍量40%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液；回收洗脱液：用真空减浓缩回收，10%洗脱液，40%洗脱液单独回收，回收乙醇浓缩到10婆美出液；喷雾干燥，进汽温度控制在145℃，出汽温度控制在75℃进行喷雾；过80目筛，控制好微生物，纸板桶包装。
实施例2
称取1.5千克的杜仲，纯水提取三次，第一次：加入12千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至30℃，第二次：加入9千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时放料液出液时用板框冷却至29℃，第三次：加入12千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至25℃，本次料液作为下一批的第一次提取料液；用高速管式离心机离心提取后的杜仲，去除机械性杂质，流速不超过1000/h；40℃时，用0.4微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；反渗透膜：38℃时用反渗透膜回收水，浓缩到6千克；将3%的稀盐酸加入到浓缩液中，调至PH值3，沉淀1小时；用三足沉降离心机离心，流速控制在800/h；用树脂型号为LSA-21大孔吸附，上柱流速为柱体的0.6/h，进完上柱液后用PH值3的酸水清洗，酸水用量为柱体的1.5倍，流速为柱体的0.6倍/h；用为柱体的2倍量的10%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液，用为柱体的3倍量40%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液；回收洗脱液：用真空减浓缩回收，10%洗脱液，40%洗脱液单独回收，回收乙醇浓缩到10婆美出液；喷雾干燥，进汽温度控制在150℃，出汽温度控制在75℃进行喷雾；过80目筛，控制好微生物，纸板桶包装。
实施例3
称取2千克的杜仲，纯水提取三次，第一次：加入16千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至30℃，第二次：加入12千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时放料液出液时用板框冷却至28℃，第三次：加入16千克的纯水，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至25℃，本次料液作为下一批的第一次提取料液；用高速管式离心机离心提取后的杜仲，去除机械性杂质，流速不超过1000/h；40℃时，用0.4微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；反渗透膜：38℃时用反渗透膜回收水，浓缩到8千克；将3%的稀盐酸加入到浓缩液中，调至PH值3，沉淀1小时；用三足沉降离心机离心，流速控制在800/h；用树脂型号为LSA-21大孔吸附，上柱流速为柱体的0.6/h，进完上柱液后用PH值3的酸水清洗，酸水用量为柱体的1.5倍，流速为柱体的0.6倍/h；用为柱体的2倍量的10%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液，用为柱体的3倍量40%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液；回收洗脱液：用真空减浓缩回收，10%洗脱液，40%洗脱液单独回收，回收乙醇浓缩到10婆美出液；喷雾干燥，进汽温度控制在145℃，出汽温度控制在75℃进行喷雾；过80目筛，控制好微生物，纸板桶包装。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (2)
1.一种绿原酸的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：提取：称取1-2千克的杜仲，纯水提取三次，第一次：加入的纯水为杜仲质量的8倍，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至30℃以下，第二次：加入的纯水为杜仲质量的6倍，加温到60℃，动态提取1小时放料液出液时用板框冷却至30℃以下，第三次：加入的纯水为杜仲质量的8倍，加温到60℃，动态提取1小时，放料液，出液时用板框冷却至30℃以下，本次料液作为下一批的第一次提取料液；
第二步：离心：用高速管式离心机离心提取后的杜仲，去除机械性杂质，流速不超过1000/h；
第三步：膜分离：40℃以下，用0.4微米的陶瓷膜分离出杜仲叶中的蛋白质、多糖、鞣质；
第四步：反渗透膜：40℃以下，用反渗透膜回收水，浓缩到杜仲质量的4倍；
第五步：酸沉：将3%的稀盐酸加入到浓缩液中，调至PH值3，沉淀1小时；
第六步：离心：用三足沉降离心机离心，流速控制在800/h；
第七步：上柱：树脂型号为LSA-21大孔吸附，上柱流速为柱体的0.6/h，进完上柱液后用PH值3的酸水清洗，酸水用量为柱体的1.5倍，流速为柱体的0.6倍/h；
第八步：洗脱：用为柱体的2倍量的10%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液，用为柱体的3倍量40%乙醇洗脱，流速控制在柱体的0.6倍量，收集洗脱液；
第九步：回收洗脱液：用真空减浓缩回收，10%洗脱液，40%洗脱液单独回收，回收乙醇浓缩到10婆美出液；
第十步：干燥：喷雾干燥，进汽温度控制在145℃—155℃，出汽温度控制在75℃进行喷雾；
第十一步：包装：过80目筛，控制好微生物，纸板桶包装。
2.根据权利要求1所述的一种绿原酸的提取方法，其特征在于，所述树脂再生方法为：新树脂用95%乙醇浸泡24小时能浸泡到树脂为准，新树脂用95%乙醇渗透清洗，流速为柱体的0.1倍，以流出液加入流出液2倍量的水没有乳白色为准，再用5%NaOH为柱体的两倍进行处理，用纯水洗至PH值7，再用3%HCLI为柱体的两倍量进行处理，用纯水洗至PH值5处理完成。
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Owner name: XIANG HANG Effective date: 20140106 Owner name: WANG KEMING Free format text: FORMER OWNER: HUNAN CHANGSHA YUANHANG BIOLOGY PRODUCT CO., LTD. Effective date: 20140106 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20140106 Address after: 30 dormitory building 1, Nongda Road, Furong district, Hunan, Changsha 410000 Patentee after: Wang Keming Patentee after: Xiang Hang Address before: Taiwanese investment zone gaotangling 410000 Hunan province Changsha County of Wangcheng City Patentee before: Hunan Changsha Yuanhang Biology Product Co., Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140115 Termination date: 20200623 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |