CN116333096A - 重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人三型胶原蛋白技术领域，具体重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用。通过构建重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株，通过该菌株诱导表达可得到该重组人三型胶原蛋白，不仅表达量可达到5g/L，而于菌株胞外表达，诱导表达条件宽泛，易于分离纯化；得到的重组人三型胶原蛋白能够作用医用美容产品的原料，前景可观。

Description

重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用
技术领域
本发明涉及人三型胶原蛋白技术领域，具体重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用。
背景技术
胶原蛋白由原胶原组成，每个原胶原都有一种特殊的三重螺旋结构，由3条α螺旋的肽链缠绕而成，长度约为1000个氨基酸残基；每条α肽链通过左手螺旋缠绕，3条肽链一起形成一个大的右手螺旋结构。Nokelainen等构建了两株杆状病毒表达系统，其中一株编码人Ⅲ型原胶原α1链，另一株编码人P4H的α和β亚基，通过共感染昆虫细胞，成功表达了人胶原蛋白，并具有稳定三螺旋结构，表达量达50mg/L。由于动、植物细胞的培养难度大，成本高，想要大规模生产不太理想。因此，采用微生物作为宿主仍然是较为理想的选择。
Vuorela等于1997年成功利用毕赤酵母表达了人Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白全序列。大量研究表明胶原蛋白与关键酶P4H在宿主细胞的共表达是一个较好的策略。使用α-MF信号肽也只能够极少量地提高其分泌量，同时又会减少Ⅰ型胶原蛋白的表达总量。重组酵母表达得到的胶原分子其结构、性质等都接近于天然的胶原蛋白，同样也能在体外组装成胶原纤维，仅四基因的单拷贝重组子的胶原蛋白表达量就高达0.5g/L，比在同样条件下表达Ⅰ型胶原蛋白提高了1.5～3倍。
发明内容
本发明人利用人源胶原蛋白III型a1链目的基因的两端目的基因M1和M2与一段目的序列M3融合构建了重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株，不仅表达量可达到5g/L，而于菌株胞外表达，诱导表达条件宽泛，易于分离纯化；得到的重组人三型胶原蛋白能够作用医用美容产品的原料，前景可观。
第一方面，本发明提供了一种重组人三型胶原蛋白的制备方法，包括：
构建重组人三型胶原蛋白的重组表达质粒；
将所述重组质粒转入毕赤酵母，得到重组菌株；以及
对所述重组菌株进行诱导表达，收集发酵液，纯化即可得到所述重组人三型胶原蛋白；
其中，所述重组表达质粒的构建包括：
构建质粒pUC57-M3；
依据所述质粒pUC57-M3构建质粒pUC57-M3-M1；
依据质粒pUC57-M3-M1构建质粒pUC57-M3-M1-M2；
依据质粒pUC57-M3-M1-M2构建重组表达质粒pPICZαA-M3-M1-M2；
其中，M1、M2、M3的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示。
其中，构建质粒pUC57-M3的步骤包括：
对M3序列进行PCR扩增，得到携带pUC57同源臂的M3序列；
对pUC57采用SacI和BSP681进行使用的双酶切反应，得到pUC57的线性化序列；
将携带pUC57同源臂的M3序列与pUC57的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒pUC57-M3。
在M3序列进行PCR扩增过程中，采用M3-F和M3-R为引物对，M3-F和M3-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～5所示。
其中，“依据所述质粒pUC57-M3构建质粒pUC57-M3-M1”的步骤包括：
对M1序列进行PCR扩增，得到携带pUC57-M3同源臂的M1序列；
采用Mpln103I和BamH1对pUC57-M3进行双酶切，得到pUC57-M3的线性化序列；
将携带pUC57-M3同源臂的M1序列与pUC57-M3的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒pUC57-M3-M1。
在M1序列进行PCR扩增过程中，采用M1-F和M1-R为引物对，M1-F和M1-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.6～7所示。
其中，“依据质粒pUC57-M3-M1构建质粒pUC57-M3-M1-M2”的步骤包括：
对M2序列进行PCR扩增，得到携带pUC57-M3-M1同源臂的M2序列；
采用ApaI和PstI对pUC57-M3-M1进行双酶切，得到pUC57-M3-M1的线性化序列；
将携带pUC57-M3-M1同源臂的M2序列与pUC57-M3-M1的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒pUC57-M3-M1-M2。
在M2序列进行PCR扩增过程中，采用M2-F和M2-R为引物对，M1-F和M1-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8～9所示。
第二方面，本发明提供了一种注射剂，包含第一方面所述的制备方法制得的重组人三型胶原蛋白和不完全弗氏佐剂。
进一步地，所述注射剂还包含人重组音猬因子蛋白和透明质酸钠。
第三方面，本发明提供了第一方面所述的制备方法制得的重组人三型胶原蛋白在制备医学美容产品中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明利用人源胶原蛋白III型a1链目的基因的两端目的基因M1和M2与一段目的序列M3融合构建了重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株。并且通过对其发酵上清液进行提取，制得了一种注射剂。经细胞试验证实，该注射剂无细胞毒性，能够促进人成纤维细胞和角质形成细胞的增值和迁移，并且能够调节其胶原合成和降解相关基因的表达。经动物实验表明，该注射剂能够对光老化小鼠皮肤皱纹进行改善，皮肤屏障功能进行修复，是皮肤光老化治疗的一种较佳选择。
附图说明
图1为本发明实施例提供的质粒pUC57-M3-M1-M2(泳道3)和质粒pUC57-M1-M2(泳道4)的HindIII酶切线性化序列的电泳图，泳道2为pUC57。
图2为本发明实施例提供的质粒pPICZαA-M3-M1-M2(泳道3)和质粒pPICZαA-M1-M2(泳道4)的XhoI酶切线性化序列的电泳图，泳道2为pPICZαA。
图3为本发明实施例提供的重组质粒pPICZαA-M3-M1-M2和质粒pPICZαA-M1-M2分别电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞所得菌株的菌落PCR产物的电泳图，从左至右第二泳道为GS115原始菌的电泳条带，第3泳道为转入了重组质粒pPICZαA-M3-M1-M2的GS115的电泳条带，第4泳道为转入了重组质粒pPICZαA-M1-M2的GS115的电泳条带，第5泳道为转入了重组质粒pPICZαA的GS115的电泳条带。
图4为本发明实施例提供的以GS115/pPICZαA、GS115/pPICZαA-M3-M1-M2和GS115/pPICZαA-M1-M2的分泌表达的类人胶原蛋白凝胶成像系统图。
图5为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂对人成纤维细胞有增殖效果图。
图6为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂对角质形成细胞有增殖效果图。
图7为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂处理成纤维细胞后的胶原合成基因表达结果图。
图8为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂处理成纤维细胞后的胶原降解相关基因表达结果图。
图9为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂处理角质形成细胞的皮肤屏障功能基因表达结果图。
图10为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂处理各组小鼠后皮肤的平均皱纹深度和宽度结果图。
图11为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂处理各组小鼠后皮肤组织胶原蛋白密度结果图。
图12为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂处理各组小鼠后皮肤组织真皮厚度结果图。
图13为本发明实施例1～4和对比例1～2提供的注射剂处理各组小鼠后皮肤表皮水分含量和油脂含量结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
1、人源胶原蛋白III型a1链目的基因
在GenBank上检索Human Collagen Type III型，得到人源胶原蛋白III型a1链的全长mRNA序列(NM_000090.4)，从中选取两段编码a1链核心结构域的中的序列，并进行毕赤酵母的密码子偏好优化，并分别在两端设置了同尾酶DraIII和Van91I的识别位点，得到目的序列M1(SEQ ID NO.1所示)和目的序列M2(SEQ ID NO.2所示)。另外还提供了一段目的序列M3(SEQ ID NO.3所示)。
目的序列M1：
gtcggtggtctcgcaggctatccaggtccagctggccccccaggcccacccggtcccccaggtccatctggtcatccaggttccccaggttctccaggttaccaaggtcccccaggtgaaccagggcaagctggtccatcaggcccaccaggtccaccaggtgctataggtccatctggtccagctggtaaagatggtgaatcaggtcgacccggtcgaccaggtgagcgaggtttgccaggtccaccaggtctcaaaggtccagctgggttaccaggtttcccaggtctgaaaggtcacagaggcttcgatggtcgaaatggtgaaaagggtgaaacaggtgctccaggtttaaagggtgaaaatggtcttccaggcgaaaatggtgctccaggtcccatgggtccaagaggggctccaggtgagcgaggtcggccaggtcttccaggggctgcaggtgctcggggtcatgacggtgctcgaggcagtgatggtcaaccaggcccaccaggtccaccaggtactgccggtttcccaggttccccaggtgctaagggtgaagttggtccagcagggtctccaggttcaaatggtgccccaggtcaaagaggtgaaccaggtccacagggtcacgctggtgctcaaggtccaccaggcccaccagggtttaatggtcgtcca,SEQ ID NO.1所示。
目的序列M2：
ggtcccgctggcattccaggtgctccaggtctgatgggtgcccggggtccaccaggtccagccggtgctaatggtgctccaggtctgcgaggtggtgcaggtgagccaggtcagaatggtgccaaaggtgagcccggtccacgtggtgaacgcggtgaggctggtcttccaggtgttccaggtgctaaaggcgaagatggcaaggttggttcaccaggtgaaccaggtgcaaatgggcttccaggtgctgcaggtgaaaggggtgccccagggttccgaggtccagctggtccaaatggcatcccaggtgaaaagggtccagctggtgagcgtggtgctccaggcccagcagggcccagaggtgctgctggtgaaccaggcagagatggcgtcccaggtggtccaggtatgaggggcatgcccggtagtccaggtggtccaggtagtgatgggtaaccagggccacccggtagtcaaggtgaaagtggtcgaccaggtccaccagggccatctggtccccgaggtcagccaggtgtcatgggcttcccc,SEQ ID NO.2所示。
目的序列M3：
atgagatttccatctatttttactgctgttttgtttgctgcttgttctgcttcggtggtccagtcaacactgaacagaagatgaaact ggtgaaattggaggtgaagctgttattcgttactctgatttggaaggtcattttgatgttgctgttttgccattttctaactctactaacaac gctttgttgtttattaacactattgcttctattcctgctaaggaagaaggtgtttctttggaaaagagaga，SEQ ID NO.3所示。
2、pUC57-M3质粒的构建
设计引物M3-F：CAGTGAATTCatgagatttc(大写序列为同源臂，为SacI识别位点上游序列)，SEQ ID NO.4所示；M3-R：tctctcttttccATGCATCTAGA大写序列为同源臂，为BSP681识别位点下游序列)，SEQ ID NO.5所示。
采用M3-F和M3-R为引物对，对M3序列进行PCR扩增，得到携带pUC57同源臂的M3序列。PCR扩增反应体系包括：14μL ddH2O、2μL 10×Taqbuffer、1μL 10μMdNTP、0.5μL 10μMprimerF、0.5μL 10μMprimerR、1μL pUC57、1μLTaq酶。PCR反应程序包括：(1)95℃：5min(2)35cycle95℃：30s55℃：30s(72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃保持后，通过胶回收方式获得纯化的PCR产物。
对pUC57采用SacI和BSP681进行使用的双酶切反应体系以60μL计，包含1μLSacI、1μLBSP681、6μL Buffer G(10×)和2μL双蒸水，反应体系于37℃反应2h,取1μL电泳检测，确定双酶切完全，酶切产物进行大孔琼脂糖凝胶电泳，用Takara公司胶回收试剂盒回收pUC57的线性化序列。
将携带pUC57同源臂的M3序列与线性载体进行重组反应。在一个同源重组反应体系中，包括4μl 5×CE II Buffer、100ng pUC57的线性化序、50ng携带pUC57同源臂的M3序列、2μl ExnaseII和ddH2O 15μL。在冰水浴中配制，配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a)，涂板，培养过夜。后用Takara公司提供的质粒提取试剂盒分别提取质粒pUC57-M3。4、pUC57-M3-M1质粒的构建
设计M1-F和M1-R为引物对，对M1序列进行PCR扩增，得到携带pUC57-M3同源臂的M1序列。M1-F：AGAGAGAgtcggtggtctcg(大写序列为同源臂，为M3下游末端序列)，SEQ ID NO.6所示；M1-R：tggacgacCGGGCCCG大写序列为同源臂，为BamH1识别位点下游序列)，SEQ IDNO.7所示。实施例中使用的pUC57质粒为GenScript Corporation公司提供。
采用Mpln103I和BamH1对pUC57-M3进行双酶切，双酶切反应体系同上，酶切产物进行大孔琼脂糖凝胶电泳，用Takara公司胶回收试剂盒回收pUC57-M3的线性化序列。
采用上述相同的同源重组反应体系反应连接携带同源臂的M1序列和pUC57-M3的线性化序列，将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a)，涂板，培养过夜。后用Takara公司提供的质粒提取试剂盒分别提取质粒pUC57-M3-M1。
5、pUC57-M3-M1-M2质粒的构建
设计引物M2-F和M2-R为引物对，对M2序列进行PCR扩增，得到携带pUC57-M3-M1同源臂的M2序列。M2-F：CGGTCGTCCAggtcccgctgg(大写序列为同源臂，为M1下游末端序列)，SEQ ID NO.8所示；M2-R：gggaagcAGGCCTGC大写序列为同源臂，为PstI识别位点下游序列)，SEQ ID NO.9所示。
利用M2-F和M2-R作为引物对，采用上述相同的PCR反应体系和PCR反应扩增程序，通过胶回收方式获得纯化的PCR产物，即可得到携带同源臂的M2序列。
采用ApaI和PstI对pUC57-M3-M1进行双酶切，双酶切反应体系同上，酶切产物进行大孔琼脂糖凝胶电泳，用Takara公司胶回收试剂盒回收pUC57-M3-M1的线性化序列。
采用上述相同的同源重组反应体系反应连接携带同源臂的M2序列和pUC57-M3-M1的线性化序列，将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a)，涂板，培养过夜。后用Takara公司提供的质粒提取试剂盒分别提取质粒pUC57-M3-M1-M2。
在一个对比例中，采用上述相同的方式先利用M1-F和M1-R为引物对进行PCR扩增得携带pUC57同源臂的M1序列，再将其与双酶切的pUC57质粒连接，得到质粒对pUC57-M1；再利用上述相同的方式利用M2-F和M2-R为引物对对pUC57-M1进行PCR扩增得到携带pUC57-M1同源臂的M2序列，再将其与双酶切的pUC57-M1质粒连接，得到质粒对pUC57-M1-M2序列。如图1所示，质粒pUC57-M3-M1-M2和质粒pUC57-M1-M2的HindIII酶切线性化序列电泳条带大于pUC57-M1-M2，说明其连接的目的序列更大。
6、毕赤酵母表达质粒的构建
接种含有质粒pUC57-M3-M1-M2的大肠杆菌DH5a至含氨苄青霉素标记的LB培养基中，接种量为1％，37℃、250rpm过夜培养，后用Takara公司提供的质粒提取试剂盒分别提取质粒pUC57-M3-M1-M2，电泳确定其浓度。其中使用的双酶切反应体系以60μL计，包含1μLEcoRI、1μLHindIII、6μL Buffer G(10×)和2μL双蒸水，反应体系于37℃反应2h,取1μL电泳检测，确定双酶切完全，酶切产物进行大孔琼脂糖凝胶电泳，用Takara公司胶回收试剂盒回收M3-M1-M2片段。
将购自Invitrogen公司的毕赤酵母穿梭质粒pPICZαA(InvitrogenTM)进行EcoRI和HindIII双酶切，以65μL计，包含1.5μLEcoRI、1.5μLHindIII、6.5μL Buffer G(10×)、45μLpPICZαA、6.5μL0.1％BSA和4μL双蒸水，反应体系于37℃反应1h，取1μL电泳检测，确定双酶切完全，酶切产物进行大孔琼脂糖凝胶电泳，用Takara公司胶回收试剂盒回收pPICZαA的线性化序列。
将pPICZαA线性化序列与M3-M1-M2片段在T4连接酶作用下进行反应，反应体系以40μL计包括：15μL pPICZαA线性化序列、19μL M3-M1-M2片段、1μL T4连接酶、4μL ligationBuffer(10×)和1μL双蒸水。将反应体系混匀，置于4℃反应过夜。将连接产物转化到受体菌中(一般为DH5a)，涂板，培养过夜。后用Takara公司提供的质粒提取试剂盒分别提取质粒pPICZαA-M3-M1-M2。
同样地，将含有质粒pUC57-M1-M2的大肠杆菌DH5a中，提交阳性质粒回收M1-M2片段，并将其插入至pPICZαA质粒中，得到表达质粒pPICZαA-M1-M2。如图2所示，质粒pPICZαA-M3-M1-M2和质粒pPICZαA-M1-M2的XhoI酶切线性化序列电泳条带大于pPICZαA-M1-M2，说明其连接的目的序列更大。
7、重组毕赤酵母的构建
将重组质粒pPICZαA-M3-M1-M2和质粒pPICZαA-M1-M2分别电转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布MD平板，得到数百株转化子。随机挑取转化子单菌落，用引物AOX1-F(gactggttccaattgacaagc，SEQ ID NO.10所示)和AOX1-R(gcaaatggcattctgacatcc，SEQ ID NO.11所示)进行菌落PCR鉴定，同时以转入pPICZαA的GS115毕赤酵母转化子以及GS115原始菌作为对照进行菌落PCR，结果如图3所示。
图3中，从左至右第二泳道为GS115原始菌的电泳条带(2200kbp)。第3泳道为转入了重组质粒pPICZαA-M3-M1-M2的GS115的电泳条带，包括2200kbp和质粒的5.0bp条带。第4泳道为转入了重组质粒pPICZαA-M1-M2的GS115的电泳条带，包括2200kbp和质粒的4.8bp条带。第5泳道为转入了重组质粒pPICZαA的GS115的电泳条带，包括2200kbp和质粒的3.6bp条带。
8、重组人三型胶原蛋白的发酵及诱导表达
利用上述构建的重组菌株(携带重组质粒pPICZαA-M3-M1-M2的GS115)和(携带重组质粒pPICZαA-M1-M2的GS115)进行发酵和诱导表达，期望分别得到重组人三型胶原蛋白。具体过程包括：
(1)转化后经筛选得到的重组酵母是甲醇利用快型(Mut+)，一下述的诱导表达的方法是适用于Mut+型。
(2)接种筛选得到的重组菌株于装有25mL BMG液体培养基的锥形瓶中，摇床250rpm，30℃培养20h，使OD600达到2以上；室温下进行5000rpm离心5min，弃上清培养基，收集菌体，注意无菌操作；以适量BMM液体培养基重新悬浮菌体，使得最终菌浓达到OD600 1.0左右。转移100mL BMM液体培养基重悬的菌体至1L的锥形瓶中，以四层灭菌纱布封口，放回摇床继续培养，250rpm、30℃诱导培养3d，每隔24h添加甲醇至终浓度0.5％(质量百分比)，也可将每24h添加的甲醇量分两半，每12h加入培养物中。诱导2d后，发酵液于40℃、8000rpm离心5min，分别收集上清和菌体。用于SDS-PAGE分别分析上清和菌体中蛋白质含量测定。
样品上清液进行SDS-PAGE电泳分析，同时以GS115/pPICZαA空载体转化子作为阴性对照，同步诱导时间为50h，电泳结果如图4所示。图中箭头所指为分泌表达的类人胶原蛋白，凝胶成像系统分析出其分子量为37kDa。图5中，从左至右依次为GS115/pPICZαA-M1-M2的上清液、GS115/pPICZαA-M3-M1-M2的上清液、GS115/pPICZαA-M1-M2的菌体、GS115/pPICZαA-M3-M1-M2的菌体、GS115/pPICZαA上清液。由此可知，GS115/pPICZαA-M3-M1-M2的上清液中目的蛋白含量高于GS115/pPICZαA-M1-M2的上清液。
同时，通过凝胶成像系统分析表达的类人胶原蛋白的含量(50h)，以Marker为参照，GS115/pPICZαA-M3-M1-M2的上清液中目的条带蛋白质含量约为54.52μg，GS115/pPICZαA-M1-M2的上清液中目的条带蛋白质含量约为1.31μg。换算可知，GS115/pPICZαA-M3-M1-M2和GS115/pPICZαA-M1-M2得到发酵液中重组三型人胶原蛋白表达量依次约为5.45g/L和13.1mg/L。也即，GS115/pPICZαA-M3-M1-M2的重组三型人胶原蛋白发酵表达量显著高于GS115/pPICZαA-M1-M2。
9、重组人三型胶原蛋白的注射剂制备
(1)重组人三型胶原蛋白的纯化
取50mL收集的发酵上清液(GS115/pPICZαA-M3-M1-M2和GS115/pPICZαA-M1-M2)，缓慢加入硫酸铵固体，伴随轻微搅拌使其溶解，直至饱和度达到20％，静置于4℃冰箱上层3h，10000rpm离心15min；取将上清液，缓慢加入硫酸铵固体，直到饱和度达55％，静置于4℃冰箱上层3h，10000rpm离心15min，取沉淀物，即为纯化的重组人三型胶原蛋白。
(2)注射剂制备
在一个实施例1中，将纯化的重组人三型胶原蛋白(GS115/pPICZαA-M3-M1-M2发酵制得的)与IFA(不完全弗氏佐剂，购买于美国Chondrex公司)在4℃(冰浴)无菌的条件下充分混匀乳化，其中重组人三型胶原蛋白浓度为1g/L。
在一个实施例2中，将纯化的重组人三型胶原蛋白(GS115/pPICZαA-M3-M1-M2发酵制得的)与IFA、人重组音猬因子蛋白(简称为SHH，编号GF174，购自Sigma-Aldrich)于4℃冰浴无菌的条件下充分混匀乳化，其中重组人三型胶原蛋白浓度为1g/L，SHH浓度为20mg/L，制得注射剂。
在一个实施例3中，将纯化的重组人三型胶原蛋白(GS115/pPICZαA-M3-M1-M2发酵制得的)与IFA、SHH、透明质酸钠(编号S0780000，购自Sigma-Aldrich)于4℃冰浴无菌的条件下充分混匀乳化，其中重组人三型胶原蛋白浓度为1g/L，SHH浓度为20mg/L，透明质酸钠浓度为50mg/L，制得注射剂。
在一个实施例4中，将纯化的重组人三型胶原蛋白(GS115/pPICZαA-M3-M1-M2发酵制得的)与IFA、SHH、透明质酸钠(编号S0780000，购自Sigma-Aldrich)于4℃冰浴无菌的条件下充分混匀乳化，其中重组人三型胶原蛋白浓度为1g/L，SHH浓度为45mg/L，透明质酸钠浓度为80mg/L，制得注射剂。
在一个对比例1中，将纯化的重组人三型胶原蛋白(GS115/pPICZαA-M1-M2发酵制得的)与IFA于4℃冰浴无菌的条件下充分混匀乳化，其中重组人三型胶原蛋白浓度为1g/L，制得注射剂。
在一个对比例2中，将纯化的重组人三型胶原蛋白(GS115/pPICZαA-M3-M1-M2发酵制得的)与IFA、SHH于4℃冰浴无菌的条件下充分混匀乳化，其中重组人三型胶原蛋白浓度为1g/L，SHH浓度为20mg/L，制得注射剂。
10、细胞实验
(1)细胞培养
将L-929小鼠胚胎成纤维细胞在MEM培养基(含10％FBS，1％青链霉素)、人皮肤成纤维细胞和角质形成细胞在DMEM培养基(含10％FBS，1％青链霉素)中于37℃、5％CO2培养箱中培养。当细胞生长至培养瓶的80％～90％时消化细胞，消化后转移至离心管，1000r/min离心5min，弃上清，加人1mL培养基重悬，L-929细胞以1×104/孔、人成纤维细胞以4×103/孔、角质形成细胞以8×103/孔进行细胞接种。
(2)细胞毒性实验
设置空白对照组与实验组。实验组每孔加入实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂，每孔100μL 10μg/μL(重组人三型胶原蛋白)，设置3个重复孔，对照组添加相同体积的0.85％的生理盐水。将L-929细胞接种至％孔板，37℃、5％CO2培养24h后换液加样，继续培养24h。弃上清，每孔加入50μL、1mg/mLMTT溶液，继续孵育2h。孵育结束后弃上清，每孔加人100μLDMSO，振荡10min，使蓝紫色结晶完全溶解。酶标仪在570nm处读取OD值，计算细胞存活率。细胞存活率＝OD实验/OD空白×100％。结果实施例1～4提供的注射剂处理L-929细胞后，细胞存活率维持在102.3％、102.1％、103.0％和113.1％，对比例1～2处理的细胞存活率维持在100.9％和101.4％。
(3)细胞增殖和迁移实验
设置空白对照组与实验组。实验组每孔加入实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂，每孔100μL 10μg/μL(重组人三型胶原蛋白)，设置3个重复孔，对照组添加相同体积的0.85％的生理盐水。将人成纤维细胞和角质形成细胞分别接种至96孔板，37℃、5％CO2培养24h后换液加样，继续培养48h。弃上清，每孔加人50μL、1mg/mLMTT溶液，继续孵育4h。孵育结束后弃上清，每孔加人100μLDMSO，振荡10min，使蓝紫色结晶完全溶解。酶标仪在490nm处读取OD值计算细胞活力。细胞活性＝OD实验/OD空白×100％。
设置空白对照组与实验组。实验组每孔加入实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂，每孔100μL 10μg/μL(重组人三型胶原蛋白)，设置3个重复孔。将人成纤维细胞和角质形成细胞分别接种至6孔板中，每孔2mL，放置37℃、5％CO2培养箱中孵育24h，至达到95％～100％汇合状态。孵育完成后用200μLPBS清洗3次，实验组加入2mL无血清培养基配制的供试品，对照组只加人无血清培养基，于37℃、5％CO2中培养。分别于0h和24h后取样拍照，用ImageJ软件测量划痕面积并计算细胞迁移速率。细胞迁移速率＝(0h划痕区面积一24h划痕区面积)/0h划痕区面积×100％。
如图5所示，实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂对人成纤维细胞有增殖效果，且实施例1～4的促进增殖效果强于对比例1～2。实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂促进人成纤维细胞的迁移，且实施例1～4的促进迁移效果强于对比例1～2。
如图6所示，实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂对角质形成细胞有增殖效果，且实施例1～4的促进增殖效果强于对比例1～2。实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂促进角质形成细胞的迁移，且实施例1～4的促进迁移效果强于对比例1～2。
(4)胶原合成和降解相关基因
将成纤维细胞别接种至6孔板，于37℃、5％CO2孵育24h，待细胞铺板率达到50％～60％时，换液加样，每孔2mL，每组设3个复孔，于37℃、5％CO2中孵育培养24h。胶原合成相关基因检测设置空白对照组与样品组，样品组(实施例1～4和对比例1～2的分别提供的注射剂，其中对应的重组人三型胶原蛋白含量均为5mg/mL)，除空白对照组外，其他各组均进行UVA辐照，辐照剂量为30J/cm2。辐照结束后，放置于培养箱37℃、5％CO2中继续培养24h。每孔用2mL的PBS清洗两次，加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后收样。依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR，检测胶原合成相关基因(Collagen I，Collagen III，Collagen 1V，Collagen，TGFββ,Smad3，Smad7)的表达量和胶原降解相关基因(MMP-1，MMP-3，c-fos，c-jun)的表达量，采用2-ΔΔCT方法进行计算。相关基因的检测方法参见“HaoYuanyuan,Xu Man,An Hongrun,et al.Effects of miR-200c on migration,invasion,and EMT of human chorionic trophohlast cells[J].Shandong Medical Journal,2021,61(35):31-34.”和“Yu Lei,Liu Jianping,Zhuang Zhixiong,et al.Quantitativeanalysis of real-time PCR expression production by
Figure BDA0004120524570000121
and 2-ΔΔCT[J].Journalof Tropical of Medicine,2007(10):956-958”。
人皮肤中的胶原蛋白主要是由成纤维细胞合成分泌的，其分泌合成机制主要是TGFβ-Smad信号通路介导。CollagenI、III、IV和VII基因位于真表皮连接处，含量增加则可以达到一定抵抗皱纹产生的作用，在皮肤衰老过程中起着重要的作用。TGFβ1为转化生长因子，在细胞增殖、分化、凋亡等过程中起着关键的调节作用，同时通过激活Smad来调节胶原蛋白的转录合成。Smad家族蛋白在将TGFβ信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，其中Smad3在TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起关键性作用，Smad7则抑制TGFβ1-Smad介导的胶原的合成。在紫外线影响下，细胞会分泌大量的胶原降解相关酶，如基质金属蛋白酶MMP从而加速胶原蛋白的降解，使得胶原含量降低。TGFβ/Smad信号通路对胶原积累起重要作用，可抑制UV刺激下诱导的MMP和c-jun/c-fos基因的低用表达量。
如图7所示，与空白组相比，样品组中实施例1～4提供的注射剂处理成纤维细胞后，其胶原合成基因CollagenI、CollagenIII、CollagenIV、CollagenVII和TGFβ1基因表达量均显著上升，而Smad7基因含量显著下降。而对比例1～2分别提供的注射剂处理成纤维细胞后，仅CollagenIII基因表达量有显著身高，其他基因表达量无显著变化。由此说明，样品组中实施例1～4提供的注射剂对成纤维细胞的TGFβ-Smad信号通路具有调节作用，促进了胶原蛋白的表达和分泌。
如图8所示，UVA刺激后，与空白组相比，阴性组的MMP-1、MMP-3、c-jun、c-fos基因表达量显著上升。与阴性组相比，样品组中实施例的1～4提供的注射剂处理成纤维细胞后，其MMP-1、MMP-3、c-jun和c-fos基因表达量显著下降。
由此说明，实施例1～4提供的注射剂能够促进人皮肤成纤维细胞胶原合成相关基因表达，还能显抑制UVA刺激的胶原降解相关基因表达，表明该注射剂具有抗皱功效。
(5)屏障和保湿相关基因
将角质形成细胞分别接种至6孔板，于37℃、5％CO2孵育24h，待细胞铺板率达到50％～60％时，换液加样，每孔2mL，每组设3个复孔，于37℃、5％CO2中孵育培养24h。设置空白对照组与样品组(实施例1～4和对比例1～2的分别提供的注射剂，其中对应的重组人三型胶原蛋白含量均为5mg/mL)，加样培养24h后，每孔用2mL的PBS清洗两次，加人1mL RNAisoPlus，吹打裂解细胞后收样。依据试剂盒说明书，开展RNA提取、反转录及荧光定量PCR，检测屏障及保湿相关基因(LOR，TGM1，IVL，OCLN1，DSG1，FLG，Caspasel4，K1)的表达量，采用2-ΔΔCT方法进行计算。
皮肤的屏障功能主要由砖灰结构以及细胞间连接作用构成，其中脂质是组成灰质的主要成分，末端分化蛋白是组织砖结构的主要成分，另外胞间连接主要有紧密连接、桥粒连接，这些相关成分在皮肤屏障和保湿功能方向具有重要的作用。如图9所示，与空白组相比，样品组中实施例的1～4提供的注射剂处理成纤维细胞后，皮肤屏障功能基因LOR、TGM1、IVL、OCLN1、DSG1和保湿功能基因FLG、Caspasel4、K1的表达均含量显著上升。而对比例1～2分别提供的注射剂处理成纤维细胞后对其皮肤屏障功能基因和保湿功能基因的表达无促进作用。结果表明，实施例1～4提供的注射剂能够促进角质形成细胞皮肤屏障功能基因和保湿功能基因表达，皮肤修护、保湿功效。
10、动物实验
(1)实验动物
雄性BALB/c裸鼠，4～6周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，实验动物生产许可证编号：SCXK(鲁)2019 0003。
(2)光老化模型鼠的建立
雄性BALB/c裸鼠圈养在具有12小时光照/黑暗周期的单独笼子中，并为裸鼠提供标准食物和水。未经任何处理的小鼠作为对照组，剩余小鼠分别在UVB灯(Philip，311nm，20w/01，德国)下照射8周，次数为每周四次，将灯放置在小鼠上方10cm处。通过UV照射(UV-340A)测量辐照度。照射剂量为第一周的一个最小红斑剂量(MED)，为160mJ/cm2。从第二周到第四周，照射剂量逐渐增加到210、280和370mJ/cm2，然后在第5～8周增加到370mJ/cm2。在第8周处死裸鼠以确认存在光老化(N＝3)。
(3)分组实验
将经UVB照射过的小鼠随机分为：PBS处理组：UVB照射+PBS注射(N＝15)。维A酸治疗组：UVB照射+维A酸(N＝15)，0.05％维A酸(Renova；Ortho-McNei1制药,新泽西州,美国)。实验组：UVB辐射+实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂注射(N＝15)。维A酸的用法为：每周涂抹5次，每次0.1ml于背部，共涂抹12周。通过29G锐针在裸鼠背部皮肤的两侧真皮内注射0.1mL PBS或实施例1～4和对比例1～2分别提供的注射剂。注射后的第12周处死小鼠，并收集实验部位的皮肤。
(4)指标检测
在治疗前和治疗后第12周分别使用AntsciSkin-SPR(Callegari S.p.A，Parma,Italy)对裸鼠进行皮肤表面轮廓测定。AntsciSkin-SPR是一种多功能的仪器，用于显微摄影和精确测量与皮肤粗糙度有关的多个参数，包括皱纹的深度，长度和宽度。
制作各组小鼠皮肤组织切片分别进行Masson染色。
皮肤屏障功能测定：皮肤屏障功能评价采用皮肤表皮水分含量和油脂含量进行量化，FC1502菲斯·凯尔皮肤分析仪进行测定，具体按照仪器说明书进行操作，采用点触式测量，测3次取平均值。
(5)结果
如图10所示，在第12周时，对比例1～2提供的注射剂处理小鼠后，其皮肤的平均皱纹深度和宽度均与PBS组无显著差异，而维A酸处理组均显著低于PBS组。同样地，实验组中实施例1～4分别提供的注射剂处理小鼠后，其皮肤的平均皱纹深度和宽度均显著低于PBS组。由此说明，实施例1～4提供的注射剂具有有抗皱效果，是皮肤光老化治疗的一种较佳选择。
Masson Trichrome染色可以用来显示皮肤胶原纤维的排列及密度。如图11所示，PBS组、对比例1组和对比例2组，其中，实施例1组的胶原蛋白密度增加较明显。如图12所示，相对于PBS组，实施例1～4组处理小鼠后，皮肤真皮厚度显著升高，且高于对比例1～2，说明本发明实施例提供的注射剂能够促使光老化小鼠皮肤真皮增长和再生。如图13所示，相对于PBS组，实施例1～4组处理小鼠后，皮肤表皮水分含量和油脂含量均显著升高，且高于对比例1～2，说明本发明实施例提供的注射剂能够促使光老化小鼠皮肤屏障功能修复。
综上所述，本发明利用人源胶原蛋白III型α1链目的基因的两端目的基因M1和M2与一段目的序列M3融合构建了重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株。并且通过对其发酵上清液进行提取，制得了一种注射剂。经细胞试验证实，该注射剂无细胞毒性，能够促进人成纤维细胞和角质形成细胞的增值和迁移，并且能够调节其胶原合成和降解相关基因的表达。经动物实验表明，该注射剂能够对光老化小鼠皮肤皱纹进行改善，皮肤屏障功能进行修复，是皮肤光老化治疗的一种较佳选择。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组人三型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括：
构建重组人三型胶原蛋白的重组表达质粒；
将所述重组质粒转入毕赤酵母，得到重组菌株；以及
对所述重组菌株进行诱导表达，收集发酵液，纯化即可得到所述重组人三型胶原蛋白；
其中，所述重组表达质粒的构建包括：
构建质粒pUC57-M3；
依据所述质粒pUC57-M3构建质粒pUC57-M3-M1；
依据质粒pUC57-M3-M1构建质粒pUC57-M3-M1-M2；
依据质粒pUC57-M3-M1-M2构建重组表达质粒pPICZαA-M3-M1-M2；
其中，M1、M2、M3的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～3所示。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，构建质粒pUC57-M3的步骤包括：
对M3序列进行PCR扩增，得到携带pUC57同源臂的M3序列；
对pUC57采用SacI和BSP681进行使用的双酶切反应，得到pUC57的线性化序列；
将携带pUC57同源臂的M3序列与pUC57的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒pUC57-M3。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，M3序列进行PCR扩增过程中，采用M3-F和M3-R为引物对，M3-F和M3-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4～5所示。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，“依据所述质粒pUC57-M3构建质粒pUC57-M3-M1”的步骤包括：
对M1序列进行PCR扩增，得到携带pUC57-M3同源臂的M1序列；
采用Mpln103I和BamH1对pUC57-M3进行双酶切，得到pUC57-M3的线性化序列；
将携带pUC57-M3同源臂的M1序列与pUC57-M3的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒pUC57-M3-M1。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，M1序列进行PCR扩增过程中，采用M1-F和M1-R为引物对，M1-F和M1-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.6～7所示。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，“依据质粒pUC57-M3-M1构建质粒pUC57-M3-M1-M2”的步骤包括：
对M2序列进行PCR扩增，得到携带pUC57-M3-M1同源臂的M2序列；
采用ApaI和PstI对pUC57-M3-M1进行双酶切，得到pUC57-M3-M1的线性化序列；
将携带pUC57-M3-M1同源臂的M2序列与pUC57-M3-M1的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒pUC57-M3-M1-M2。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，M2序列进行PCR扩增过程中，采用M2-F和M2-R为引物对，M1-F和M1-R的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8～9所示。
8.一种注射剂，包含权利要求1～7任一所述的制备方法制得的重组人三型胶原蛋白和不完全弗氏佐剂。
9.根据权利要求8所述的注射剂，其特征在于，还包含人重组音猬因子蛋白和透明质酸钠。
10.权利要求1～7任一所述的制备方法制得的重组人三型胶原蛋白在制备医学美容产品中的应用。
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