CN1371993A - 一种超氧化物歧化酶结合物及其制备方法 - Google Patents

一种超氧化物歧化酶结合物及其制备方法 Download PDF

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本发明属于生物医药领域,特别是涉及一种超氧化物歧化酶结合物及其制备方法。该结合物上的超氧化物歧化酶自由氨基的修饰率为11.1%～88.8%。其制备方法是采用高碘酸钠活化低分子肝素来修饰超氧化物歧化酶上的自由氨基。制成的结合物具有抗原性低、半衰期长、稳定性高等特性,还能充分发挥低分子肝素特有的抗血栓、抗炎、促进微循环等特性,对于防治缺血性脑卒中再灌流损伤有重要作用,并可作为化妆品添加剂应用。

Description

一种超氧化物歧化酶结合物及其制备方法
1.技术领域
本发明属于生物医药领域，特别是涉及一种超氧化物歧化酶结合物及其制备方法。
2.背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是超氧阴离子自由基的清除剂，可用于由过量超氧阴离子自由基引起的疾病或机体损伤的防治，如类风湿性关节炎、放射性损伤、血液再灌流损伤等。但天然来源超氧化物歧化酶存在有一定的抗原性、体内半衰期短和稳定性差等缺点，限制了其应用。克服超氧化物歧化酶缺点的方法主要是用大分子物质对其分子进行化学修饰，采用的修饰剂有聚乙二醇(PEG)、右旋糖苷、淀粉、同源白蛋白以及聚烯属羟基化合物等。如塞佛(saifer)等人在《医学生物实验进展杂志》[Adv Exp MedBiol，1994，366：377～387]发表的采用聚乙二醇对超氧化物歧化酶进行化学修饰所得超氧化物歧化酶结合物(PEG-SOD)，其免疫原性降低、体内半衰期延长、稳定性增加。但这些结合物对于治疗与超氧阴离子自由基有关的疾病，如缺血性脑卒中再灌流损伤，疗效并不十分理想。
3.发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，采用低分子肝素(LMWH)来修饰超氧化物歧化酶，提供一种新的超氧化物歧化酶结合物(LMWH-SOD)及其制备方法。
本发明是通过以下途径实现的：
一种超氧化物歧化酶结合物，其特征是：超氧化物歧化酶上的自由氨基结合低分子肝素，自由氨基的修饰率为11.1％～88.8％，一个超氧化物歧化酶分子可以结合不多于8个平均分子量小于8000的低分子肝素分子。
一种制备上述超氧化物歧化酶结合物的方法，其特征在于以下步骤：
1.低分子肝素的活化：活化剂采用高碘酸钠、溴化氰、氰脲酰氯中的一种，低分
  子肝素浓度为1％～10％，活化剂的浓度为1％～5％，反应在pH4.0～7.0和温度
  0～4℃下进行，连续搅拌反应15-20小时，并用2％～10％的亚硫酸氢钠溶液滴定
  至变色；
2.修饰反应：反应在pH8～10和温度0～4℃下进行，搅拌反应20-30小时，然后采用超滤法或凝胶层析法分离低分子肝素-超氧化物歧化酶结合物，再经冷冻干燥制得粉末状低分子肝素-超氧化物歧化酶结合物。
本发明制得的低分子肝素-超氧化物歧化酶结合物与天然超氧化物歧化酶相比不仅具有抗原性低、半衰期长、稳定性高等特性，而且能充分发挥低分子肝素特有的抗血栓、抗炎、促进微循环等特性，并且结合物通过血脑屏障能力大为增加，在防治缺血性脑卒中再灌流损伤方面，将会比天然超氧化物歧化酶及其其它结合物有更好的作用。此外，用作化妆品添加剂，也比天然超氧化物歧化酶更具优越性，如稳定性明显增加，从而能在化妆品中较长时间地保持较高活性，且有低分子肝素促进皮肤微循环的作用。
4.具体实施方式
低分子肝素-超氧化物歧化酶结合物制备的关键是低分子肝素的活化。低分子肝素活化的方法有多种，如高碘酸钠活化法、溴化氰活化法、氰脲酰氯活化法等。在此仅举以高碘酸钠活化低分子肝素、进一步制备低分子肝素-超氧化物歧化酶结合物的例子。
(1)低分子肝素的活化：称取低分子肝素0.6g溶于蒸馏水10ml中，加12％的高碘酸钠溶液1ml，调pH4.0～6.0，4℃下搅拌反应20h，滴加5％的亚硫酸氢钠溶液至变色，得活化的低分子肝素溶液。
(2)修饰反应：称取超氧化物歧化酶100mg，溶于0.3mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液3ml中，加活化的低分子肝素溶液3ml，4℃下电磁搅拌反应24h。反应液过滤后经葡聚糖凝胶G-100柱分离，收集活性洗脱液，冷冻干燥，得粉末状低分子肝素-超氧化物歧化酶结合物。

Claims (2)

1.一种超氧化物歧化酶结合物，其特征是：超氧化物歧化酶上的自由氨基结合低分子肝素，自由氨基的修饰率为11.1％～88.8％，一个超氧化物歧化酶分子可以结合不多于8个平均分子量小于8000的低分子肝素分子。
2.一种制备上述超氧化物歧化酶结合物的方法，其特征在于以下步骤：
(1)低分子肝素的活化：活化剂采用高碘酸钠、溴化氰、氰脲酰氯中的一种，低分子肝素浓度为5％～10％，活化剂的浓度为1％～5％，反应在pH4.0～7.0和温度0～4℃进行下，连续搅拌反应15-20小时，并用5％～10％的亚硫酸氢钠溶液滴定至变色；
(2)修饰反应：反应在pH8～10和温度0～4℃下进行，搅拌反应20-30小时，然后采用超滤法或凝胶层析法分离低分子肝素-超氧化物歧化酶结合物，再经冷冻干燥制得粉末状低分子肝素-超氧化物歧化酶结合物。
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