KR0179409B1 - 니켈을 함유하는 과산화물 디스뮤타아제 - Google Patents

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Abstract

외양적으로 동종인 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1과 스트렙토마이세스 코엘리콜롤 A3(2)에서 각각 정제한 새로운 형태의 니켈을 함유한 과산화물 디스뮤타아제는 4개의 동일한 13.4kDa의 소단위로 구성되어 있으며 흡수 스펙트럼, 원자 흡수 스펙트럼, EPR 스펙트럼의 분광학적인 성질과 면역학적인 성질이 동일하다. 이들 효소는 구리아연, 철, 망간을 함유한 기존의 과산화물 디스뮤타아제와 성질이 다른 이제까지는 발견되지 않았던 새로운 특징을 지닌 효소이다.

Description

니켈을 함유하는 과산화물 디스뮤타아제
제1도는 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1로부터 추출한 과산화물 디스뮤타아제의 세포 추출액(a)과 정제액(b)의 PAGE 결과를 나타낸 사진이고,
제2도는 네이티브 과산화물 디스뮤타아제와 교차결합된 과산화물 디스뮤타아제의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이고,
제3도는 스트렙토마이세스 에스피.로부터 추출한 네이티브 과산화물 디스뮤타아제(A)와 아포엔자임(B)의 흡수 스펙트럼이고,
제4도는 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1로부터 추출한 네이티브 과산화물 디스뮤타아제(A)와 아포엔자임(B)의 X-band EPR스펙트럼이고,
제5도는 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1로부터 추출한 과산화물 디스뮤타아제의 EPR 신호에 대한 마이크로파 전력의 포화도를 나타낸 스펙트럼이고,
제6도는 다른 균주에서 추출한 과산화물 디스뮤타아제의 웨스턴 이뮤노블롯에 의한 면역학적인 비교를 나타낸 SDS-PAGE 결과를 나타낸 사진이고,
제7도는 수개의 과산화물 디스뮤타아제사이의 N 말단 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.
[산업상 이용 분야]
본 발명은 신규한 과산화물 디스뮤타아제(superoxide dismutase: SOD)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 활성금속(active metal)으로 철(Fe), 망간(Mn), 구리·아연(Cu ·Zn)을 함유한 종래의 과산화물 디스뮤타아제와 달리 니켈(Ni)을 활성부위(active site)에 함유한 효소로, 기존의 과산화물 디스뮤타아제와는 면역학적, 분광학적으로 다른 새로운 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제에 관한 것이다.
[종래기술]
균사를 만드는 세포로 형태분화를 진행하는, 그람양성균에 속하는 악티노마이세트(actinomycete)의 대표적인 속(屬)에 속하는 스트렙토마이세스는 호기성 토양 박테리아로 세포분화 연구에 널리 쓰이고 있으며 특히 항생물질 생산균으로 알려져 있다. 또한 공업적으로도 중요한 작용을 하고 있다. 1944년 스트렙토마이세스 그리세스(Streptomyces griseus)에서 Waksmann이 스트렙토마이신(Streptomycin: 결핵에 유효)을 발견한 것을 계기로 스트렙토마이세스의 연구가 활발해졌다. 최근에는 항생물질 생산에 관여하고 있는 플라즈마도 발견되어 유전자 조작으로 항생물질의 생산성 향상이나 신규 항생물질의 제작 등의 연구개발이 주목되고 있는 현실에 있다.
그러나 이 균의 산화 응력(stress)에 대한 방어 메카니즘(protective mechanism)은 거의 알려지지 않고 있다. 산화 응력의 한 예로 반응성이 큰 활성산소가 있다. 유기체의 생체내에서는 호흡에 의해서 들어온 산소의 일부는 과산화물(superoxide: O2 -)과 같은 활성산소(active oxygen)가 되어 체내의 여러가지 물질과 반응한다. 장기이식이나, 심장허혈 등 조직의 혈류량이 감소한 후에 혈액을 다시 흐르게 하면, 산소가 조직에 공급과잉이 되어 과산화물이 생산된다고 알려져 있다. 또한 과산화물은 마크로파아지나 백혈구가 항원항체복합체 등 외적자극에 의하여 생산된다. 이렇게 조직에서 발생한 과산화물은 염증과 같은 세포장해의 원인이 된다. 이것은 식세포속에 생기며 식세포가 포식한 이물질을 분해하는 역할을 한다. 과산화물이 과잉으로 생산되면 식세포 밖으로 분비되며 다른 조직에 장해를 일으킨다. 이 과산화물은 병해미생물 등의 막을 파괴하는 유용한 면도 있으나 과도한 발생은 생체에 독성을 준다. 생물은 이러한 조직 장해를 일으키는 과잉의 과산화물을 분해하는 효소 과산화물 디스뮤타아제를 생산하여 조직을 방어하고 있다.
과산화물 디스뮤타아제는 미생물에서 동식물에 이르기까지 산소를 이용하여 신진대사를 하는 유기체(oxygen-metabolizing organism)에서는 어디에서나 발견되는 효소로서 초산화물 불균화효소(hyperoxide dismutase)라고도 한다. 이 효소는 과산화물을 산소 분자(02)와 과산화수소(hydrogen peroxide: H2O2)로 전환하는 불균일 반응(dismutation)에서 촉매작용을 한다. 불균일 반응에서는 산화 및 환원이 동시에 일어나서 같은 종류의 물질이 동시에 각각 다른 상태의 물질도 변화한다.
이 효소는 과산화물 라디칼(superoxide radical)과 그외에 과산화수소, 히드록실 라디칼(hydroxyl radical), 싱글레트 산소(singlet oxygen)와 같은 과산화물 라디칼로부터 형성되는, 반응성이 높은 산소종(oxygen species)의 시토톡신 효과(cytotoxic effect)로부터 생체 세포를 보호하는데에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 이 효소는 스트렙토마이세스로부터 정제되거나 특정화된 적은 없으나 과산화물 디스뮤타아제의 한 종류가 악티노마이세트의 하나인 노르카르디아 아스테로드(Nocardia asterodes)로부터 분리된 적은 있다.
지금까지 과산화물 디스뮤타아제는 이 효소의 활성 부위(active site)에 금속을 가진 효소로 구리·아연을 갖는 구리·아연함유-과산화물 디스뮤타아제(CuZnSOD), 엑스트라셀룰라-과산화물 디스뮤타아제, 망간을 지닌 망간함유-과산화물 디스뮤타아제(MnSOD), 철이든 철함유-과산화물 디스뮤타아제(FeSOD)로 분류한다.
구리, 아연함유-과산화물 디스뮤타아제는 2개의 소단위(subunit)로 되어있으며 분자량은 약 31200이고 5-6분의 반감기를 가지고 있다. 주로 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae), 뉴로스포라크라싸(Neurospora crassa), 포유류 조직 그리고 고등식물과 같은 진핵세포(eucaryotes)의 세포질에 존재하며 포토박터 레이오그나티(Photobacter leiognathi), 카우로박터 크레센투스(Caulobacter crescentus), 헤모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 슈도모나스 말토필리아(Pseudomonas maltophilia), 슈도모나스 디미누타(Pseudomonas diminuta)와 같은 몇몇의 원핵세포(prokaryotes)에서도 발견되어 정제되었다.
망간함유-과산화물 디스뮤타아제는 2 또는 4개의 소단위를 가지고 있으며 약 40000의 분자량을 가진 과산화물 디스뮤타아제로 수신간의 비교적 긴 반감기를 가지고 있으며 심근에 침투성이 좋다. 이 효소는 대장균, 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mitans), 할로박테륨 할로븀(Halobacterium halobium)와 같은 원핵세포와 닭의 간 미토콘드리아(liver mitochondiria)에서 발견되었다.
또한 철함유-과산화물 디스뮤타아제는 대장균(Escherichia coli: E, Coli), 플렉토네마 보리아눔(Plectonema boryanum), 크로마티눔 비노숨(Chromatinum vinosum) 그리고 메타노박테륨 브리안티(Mathanobacterium bryantii)를 포함하는 원핵세포에서도 발견되었다.
어떤 박테리아는 과산화물 디스뮤타아제의 두가지 형태 곧, 망간함유-과산화물 디스뮤타아제와 철함유-과산화물 디스뮤타아제를 가지고 있다. 노르카르디아 과산화물 디스뮤타아제는 활성자리에 망간과 철을 동시에 함유하고 있으며 유기체의 세포멱의 바깥에 분비된다. 이 과산화물 디스뮤타아제의 분비는 노르카르디아가 뉴트로필리스(neutrophilis)와 마크로파아지(macrophage)의 공격으로부터의 응집력을 갖게 한다.
노르카르디아와 스트렙토마이세스가 악티노마이세트에 속한다 할지라도 대부분의 스트렙토마이세스는 노르카르디아 아스테로이드와 달리 비병원균이다. 세포외의 유체에서는 어떤 과산화물 디스뮤타아제의 활성도가 감지되지 않았다. 반면에 어떤 박테리아는 단 한 종류만의 과산화물 디스뮤타아제를 가지고 있다. 예를들면, 스트렙토코코스 산귀스는 망간함유-과산화물 디스뮤타아제만을, 바실루스 세레우스(Bacillus cereus)는 철함유-과산화물 디스뮤타아제만을 가지고 있다.
과산화물 디스뮤타아제는 신장이나 심장의 이식, 심근 경색, 뇌경색 등 치료후의 재환류장해 방지, 류마치스성 관절염, 체외수정난의 보호, 화상피부의 치료, 신생아호흡궁박증후군 치료 등 의약품 외에 식품첨가물(산화 방지제), 화장품등의 응용도 연구가 진행되고 있다.
[발명의 목적]
본 발명은 니켈을 함유하는 신규한 과산화물 디스뮤타아제와 스트렙토마이세스에서 추출한 과산화물 디스뮤타아제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1(Streptomyces fp. IMSNU-1)과 스트렙토마이세스 코엘리콜롤A(3)2(Streptomyces coelicolor A(3)2로부터 추출하는 공정을 포함하는 니켈을 함유하는 과산화물 디스뮤타아제를 제공하는 방법을 제공한다.
[발명의 요약]
본 발명은 니켈을 활성금속으로 포함하는 과산화물 디스뮤타아제를 제공한다. 13.4 kDa의 분자량을 가지며, 테트라머로 구성되어 있는 과산화물 디스뮤타아제를 제공한다.
이 과산화물 디스뮤타아제는 시아니드와 과산화수소에 의하여는 억제되나 아지드에 의하여는 거의 억제되지 않는다.
그리고 본 발명은 다음과 같은 N-말단 아미노산 서열을 갖는 과산화물 디스뮤타아제를 제공한다.
X Gly Asp Leu Pro Gly X Val Tyr Asp Pro Ala Gln Ala
상기의 서열에서 X는 감지되지 않는 아미노산이다.
상기한 N-말단 아미노산 서열에서 첫번째 X는 His이거나 일곱 번째 X는 Gly인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 스트렙토마이세스종의 포자를 베네트 배지중에서 28℃의 온도에서 5일동안 배양하고 포자의 최종 농도는 4×106/㎖가 되도록 20%글리세롤과 함께 모아서 0.5중량% 이스트 추출액, 0.5중량% 펩톤, 0.5중량% 카사미노산, 0.3중량% 말트 추출액, 그리고 1중량% 글루코오즈를 혼합하여 pH 7.0으로 보정한 YEME 배지에 접종하고 500㎖의 방지장치용 플라스크에서 28℃, 48시간동안에 공기 분위기에서 배양하고 균사를 뷰히너 깔때기에 있는 여과지에서 수류펌프에 의하여 배양하고 난 후에 0.85% 염화칼슘용액으로 세척하고 세척한 균사를 20mM 인산나트륨과 0.1mM 에틸렌 디아민 트리아세테이트를 혼합하여 제조한 완충용액 A에 분산시키고 비드비터를 이용하여 5분동안 분쇄시켜 얻은 균질화액을 4,000×g에서 15분간 원심분리한 후에 고체 황산암모늄을 상등액에 첨가하여 그 농도가 80%까지 포화되게 하고 15,000×g에서 20분동안 원심분리하여 침전을 수집하고 완충용액 A에 다시 용해시켜 완충용액 A에서 밤새도록 투석하고 미리 완충용액 A로 평형시켜 놓은 DEAE 세파셀에, 투석한 시료를 로드하고 단백질은 0-0.05M 염화나트륨의 직선적 경사를 걸어주면서 용출하여 활성분획을 모은 후에 아미콘 YM10막으로 염을 제거하고 활성 시료는 워터스 델타 프렙 4000 크로마토그래피 시스템으로 정제하여 완충용액 A로 평형시킨 단백질-팍 DEAE 5PW 컬럼에 로드하고 컬럼을 완충용액 A에서 0.15M 염화나트륨으로 세척한 후에 단백질을 완충용액 A에서 0.15-0.30M 염화나트륨의 직선적 경사를 걸어 용출시키고 활성분획을 다시 모아서 아미콘 YM10막으로 염을 제거하고 바이오-라드 모델 491 프렙셀 정제 전기영동 기구를 사용하여 더욱 정제하기 위해 활성시료를 0.1M 트리스-염화수소(pH 6.8), 10% 글리세롤. 0.002% 브로메페놀 블루이 첨가되어 있는 완충용액과 혼합하여 7.5% 항변성 폴리아크릴아미드젤(3.7×11cm)에 로드하고 단백질은 전기영동을 하고난 후에 25mM 트리스-염화수소(pH 8.8)가 들어있는 완충용액 B를 통하여 용출한 후에 정제된 분획을 모은다음 완충용액 A로 치환하고 -70℃에서 보관하는 공정을 포함하는 과산화물 디스뮤타아제의 제조 방법을 제공한다.
[작용]
스트렙토마이세스 에스피피에서 정제된 과산화물 디스뮤타아제는 이전에 알려진 다른 과산화물 디스뮤타아제와는 구별된다. 스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제는 13.4kDa의 분자량으로 여느 과산화물 디스뮤타아제보다 작은 소단위를 가지고 있으며 동일한 소단위로 구성된 테트라머(tetramer)로 되어있다.
더우기 니켈은 활성 금속으로서 효소와 결합되어 있으며 구리, 아연은 거의 발견되지 않는다. 이제까지 과산화물 디스뮤타아제의 어느 것도 활성 금속으로서 니켈을 함유한 것은 없다. 스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제의 흡수 스펙트럼은 다른 과산화물 디스뮤타아제와는 다르다. 효소 속의 니켈의 존재는 EPR 스펙트럼에서 명백하게 알 수 있다. 이 효소의 측정 매개변수는 기본적으로 다른 세 과산화물 디스뮤타아제(구리아연-, 망간- 그리고 철함유 과산화물 디스뮤타아제)와는 다르나 데술포비브리오 기가스(.Desulfovibrio gigas)로부터 추출한 니켈함유-히드로게나제와는 제일 비슷하다. 흡수 스펙트럼. 원자 흡수분석, EPR 스펙트럼의 결과로부터 스트렙토마이세스 에스피.
IMSNU-1과 스트렙토마이세스 코엘리콜롤 A(3)2로부터 추출한 과산화물 디스뮤타아제는 니켈 과산화물 디스뮤타아제(니켈함유-과산화물 디스뮤타아제: NiSOD)로 명명할 수 있다.
니켈함유-과산화물 디스뮤타아제는 스트렙토마이세스 그리슈스(streptomyces griseus)와 스트렙토마이세스 라벤둘라에(streptomyces lavendulae)에서도 역시 정제되므로 이 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제는 스트렙토마이세스군에 일반적으로 분포되어 있다고 할 수 있다. 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제는 이스트나 소의 에리트로사이트에서 분리한 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제와 대장균으로부터 분리한 철함유-, 망간함유-과산화물 디스뮤타아제와는 면역학적으로 다르다. 효소 억제 분석에서 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제는 과산화수소와 시아니드에는 매우 민감하고, 철함유-과산화물 디스뮤타아제는 과산화수소에는 민감하지만 시아니드에는 그렇지 않다. 그리고 망간함유-과산화물 디스뮤타아제는 시아니드나 과산화수소 모두에 의해서 억제되지 않는다.
그런데, 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제는 시아니드와 과산화수소에 의하여 억제되는 것으로 나타났으며 아지드에 의하여는 거의 억제되지 않는다. 이 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제의 억제 패턴은 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제의 그것과 비슷하다. 스트렙토마이세스 에스피피의 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제의 발견은 스트렙토마이세스는 세 과산화물 디스뮤타아제 강(class)의 체계화된 계통발생에 속할 수 없다는 문제가 발생한다.
이 문제에 대한 해답을 얻기 위하여는 우선 단백질과 이에 대응하는 유전자 그리고 활성금속으로 니켈을 받아들이는 고유한 메카니즘에 대한 서열 정보가 필요하다. 지금까지 생물학적 시스템에서 니켈-단백질에 관한 연구는 니켈을 함유하는 히드로게나제(hydrogenase), 일산화탄소 디히드로게나제(COdehydrogenase), 그리고 유레아제(urease)에 관한 것이 전부이다. 그러므로 니켈을 함유하는 효소에 관한 연구가 더욱 요구되고 있다.
다음의 실시예를 통하여 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제의 신규성을 규명하고자 한다
[실시예]
하기에 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 일 실시예일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
1. 스트렙토마이세스 에스피, IMSNU-1와 스트렙토마이세스 코엘리콜롤 A(3)2의 배양
본 발명인 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제를 에세이하기 위하여 다음의 실험 과정을 거쳐서 배양하였다. 관악산에서 분리한 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1 KCTC 0188BP와 스트렙토마이세스 코엘리콜롤 A(3)2의 포자를 베네트 배지(Bennet medium)중에서 28℃의 온도와 5일동안 배양한 후에 20% 글리세롤(glycerol)과 함께 모았다. 포자의 최종 농도는 4×106/㎖였다. 이 포자를 보정한 YEME 배지에 접종하였다. YEME 배지는 0.5중량% 이스트 추출액(yeast extract), 0.5중량% 펩톤(peptone), 0.5중량% 카사미노산(casamino acid), 0.3중량% 말트 추출액(malt extract), 그리고 1중량% 글루코오즈(glucose)를 혼합하여 pH 7.0으로 맞추었다. 500㎖의 방지장치용 플라스크(baffled flask)에서 28℃, 48시간동안에 공기 분위기에서 배양하였다.
과산화물 디스뮤타아제와 비교하기 위하여 사용한 균주는 하기와 같다,:
대장균 KCTC 11033, 사카로마이세스 세레비시아에 ATCC 26787, 스트렙토마이세스 롱지스포로플라부스 ATCC 19915 그리고 스트렙토마이세스 코엘리콜롤 A(3)2였다 이들 균주는 대장균을 37℃에서 배양하고 18시간 후에 수확한 것을 제외하고는 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1에서와 동일한 조건에서 실험하였다.
균주 IMSNU-1는 고체 배지에서 전형적인 스트렙토마이세트 균사와 수많은 포자를 생산하였다. 시험 배지에 전개된 군체(Colony)는 까끌거리며 단단했다.
무기염 녹말 아가 배지(inorganic salts starch agar medium: ISP 4)에서 성장한 공기 포자의 색은 회색이었다. 베네트 액체 배지에서 성장한 균주 IMSNU-1의 성장 균계는 가지가 달린 것이며 단편적(fragmented)이지 않았다.
IMSNU-1은 장쇄형의, 직각으로 휘어질수 있는 포자를 전개시켰으며 포자 표면의 물질은 조면성을 나타내었다. 균주 IMSNU-1 세포벽 내에서의 디아미노피멜릭산(diaminopimelic acid: DAP)의 형태는 LL-DAP으로 나타났다.
알라닌, 글루타민산염, 글리신은 LL-DAP와 같이 감지되었다. 전체 세포 하이드롤리세트에서의 진단당은 전혀 감지되지 않았다. 이러한 결과는 균주 IMSNU-1이 키모타입 I 세포벽과 타입 C 전체세포 당패턴을 가지고 있다는 것을 가리킨다. 균주 IMSNU-1에서의 인지질 패턴처럼 포스포에탄올아민(phosphoethanolamine), 포스포이노시톨(phodphoinositol), 디포스파딜글리세롤(diphosphatidylglycerol) 그리고 포스파딜리노시톨 만노시드(phosphatidylinositol mannosides)에서도 발견되었다. 형태학적인 데이타와 키모탁소노한 특징에서 보면 균주 IMSNU-1는 스트렙토마이세스 종에 속한다고 할 수 있다.
2. 과산화물 디스뮤타아제 에세이(SOD assay)
과산화물 디스뮤타아제 에세이는 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium: NBT)의 환원을 억제하는 과산화물 디스뮤타아제의 정도를 알아보기 위하여 간접적 방법을 실시하였다. 반응 혼합물은 50mM 나트륨인산염(sodium phosphate: pH 7.4)에 1mM 디에틸렌트리아민-펜타아세틱 에시드(diethyltriamine-pentaacetic acid: DETAPAC), 1U 카탈라제(catalase), 56μM NBT, 100 μM 크산틴, 그리고 560nm에서 0.025-0.040의 범위에서 흡광도(absorbance)의 증가에 대한 NBT의 분당 환원 속도가 50mM 나트륨인산염(sodium phosphate)에서 나오게 하기 위한 크산틴 옥시다제(xanthine oxidase)가 포함되어 있었다. 크산틴-크산틴 옥시다제 시스템(xanthine-xanthine oxidase system)에 의하여 생성된 과산화물을 스캐비닝(scanvening)하였다. 과산화물 디스뮤타아제의 활성도(activity)에 대한 한 단위(unit: U)는 NBT 환원에 50% 억제 작용을 할 수 있는 효소의 양으로 정의했다. 기질로서는 ο-디아니시딘(ο-dianisidine)과 리보플라빈(riboflavin)을 사용하였다. 변성되지않은(denaturing) 폴리아크릴아미드 젤(polyacrylamide gel)에서의 과산화물 디스뮤타아제에 대한 양성 염색반응(positive-staining)을 실시하였다.
또 하나의 과산화물 디스뮤타아제 에세이는 스핀-트랩핑제(spin-trapping agent)와 20mM 크산틴용액 50㎕, 5.5mM DETAPAC 35㎕, DMPO 15㎕, 0.1U/mol크산틴 옥시다제 50㎕ 그리고 3000 U/mol의 정제된 과산화물 디스뮤타아제 50㎕를 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에서 혼합하여 제조한 5.5'-디메틸피롤린-N-옥시드(5,5'-dimethylpyrroline-N-oxide: DMPO)-OH의 생산속도가 과산화물 디스뮤타아제에 의하여 감소되는 것을 EPR 분광기(Bruker ESP 3005 EPR spectrometer: Germany)를 이용하여 측정하였다. 용액은 넓적한 전자 상자기성 공명셀(electron paramagnetic resonance cell: EPR cell)에 옮긴 다음 1 분동안 혼합후에 DMPO-OH 첨가물(adduct)을 첨가하였다. EPR 스펙트럼은 실온의 온도에서 다음과 같은 조건에서 실시하였다. : 4 mW의 마이크로파 전력, 1G의 변조 진폭(modulation amplitude), 100kHz의 변조 진동수(modulation frequency) 그리고 9.76GHz의 마이크로파 진동수(microwave frequency)
제1a도는 7.5% 변성되지 않는 폴리아크릴아미드 젤에 염색된 과산화물 디스뮤타아제의 활성도를 나타낸 것이고 제1b도는 7.5% 변성되지 않는 폴리아크릴아미드 젤에 코마시-블루(Coomassie-blue)로 염색된 결과를 나타내었다. 레인 a는 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1에서 분리한 세포 추출액(80 ㎍)이며, 레인 b는 정제된 스트렙토마이세스의 과산화물 디스뮤타아제(10㎍)를 로드한 것이다.
제1도에서 보는 바와 같이 스트렙토마이세스 에스피.의 세포 추출물에서 과산화물 디스뮤타아제의 활성도의 싱글 밴드(single band)가 나타났다.과산화물 음이온 라디칼은 스핀-트랩핑제인 DMPO와 반응하여 반감기가 긴 라디칼(DMPO-OH, aN=ab H=14.9G)을 생성하는 것으로 나타났다. 과산화물 디스뮤타아제의 첨가는 DMPO-OH의 생성속도에의 감소를 가져왔으며, 이것은 스트렙토마이세스 에스피, IMSNU-1로부터 정제된 과산화물 디스뮤타아제가 크산틴-크산틴 옥시다제 시스템으로 부터 생성된 과산화물 음이온 라디칼을 스캐빈져할 수 있다는 것에 대한 확실한 증거가 된다. (데이타는 나타내지 않았다.)
3. 과산화물 디스뮤타아제의 정제
과산화물 디스뮤타아제의 분자량과 소단위의 구조를 알아보기 위하여 이 효소를 정제할 필요가 있었기에 다음과 같은 과정을 거쳐서 정제하였다.
균사(mycelia)를 뷰히너 깔때기(Buchner funnel)에 있는 여과지에서 수류펌프(aspiration)에 의하여 배양하고 난 후에 0.85% 염화칼슘(potassium chloride: KCl)용액으로 세척하였다. 세척한 균사는 20mM 인산나트륨(sodium phosphate: NaPO4, pH 7.4)과 0.1mM 에틸렌 디아민 트리아세테이트(Ethylene Diamine Triacetate: EDTA)를 혼합하여 제조한 완충용액 A(buffer A)에 분산시키고 비드비터(bead-beater, Biospec Production, Inc., U. S. A.)를 이용하여 5분동안 분쇄시켰다. 얻어진 균질화액(homogenate)은 4,000×g에서 15분간 원심분리하였다. 고체 황산암모늄(ammonium sulfate)를 상등액(supernatant)에 첨가하여 그 농도가 80%까지 포화되게 하였다. 침전은 15,000×g에서 20분동안 원심분리하여 수집하고 완충용액 A에 다시 용해시켰다. 침전을 재용해시킨 용액을 완충용액 A에서 밤새도록 투석(dialysis)하였다. 미리 완충용액 A로 평형시켜 놓은 DEAE 세파셀(DEAE Sephacel: 4×40cm)에, 투석한 시료를 로드(load)하고 단백질은 0-0.05 M 염화나트륨(sodium chloride: NaCl)의 직선적 경사(linear gradient)를 걸어주어 용출(elute)하였다. 활성분획(active fraction)을 모은 후에 아미콘(Amicon) YM10막(membrane)으로 염을 제거하였다. 활성 시료는 워터스 델타 프렙(Waters Delta Prep) 4000 크로마로그래피 시스템(chromatography system)으로 정제하였다. 시료는 완충용액 A로 평형시킨 단백질-팍(Protein-Pak) DEAE 5PW 컬럼(2.15×15cm)에 로드하였다. 컬럼을 완충용액 A에서 0.15M 염화나트륨으로 세척한 후에 단백질을 완충용액 A에서의 0.15-0.30M 염화나트륨의 직선적 경사를 걸어 용출시켰다.
활성분획을 다시 모아서 아미콘 YM10막으로 염을 제거하였다. 시료는 바이오-라드 모델 491 프렙셀 정제 전기영동 기구(Bio-Rad Model 491 Prep Cell preparative electrophoresis apparatus: Bio-Rad, U. S. A)를 사용하여 더욱 정제하였다. 과산화물 디스뮤타아제의 활성도의 1단위(unit:U)는 NBT 환원의 50%를 억제할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다. 활성시료는 0.1M 트리스-염화수소(Tris-HCl, pH 6.8), 10% 글리세롤. 0.002% 브로메페놀 블루(bromophenol blue)이 첨가되어 있는 시료완충용액과 혼합하여 7.5% 항변성(nondenaturing) 폴리아크릴아미드젤(3.7×11cm)에 로드하였다. 단백질은 전기영동을 하고난 후에 25mM 트리스-염화수소(pH 8.8)가 들어있는 완충용액 B를 통하여 용출하였다. 과산화물 디스뮤타아제의 정제된 분획을 모은 다음 완충용액 A로 치환하고 -70℃에서 보관하였다.
스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1에서 정제한 과산화물 디스뮤타아제는 표 1에서 각 과정에 따른 효소의 성질에 대하여 나타내었다. 황산 암모늄 단계에 대해서 상대적으로 20.2배를 정제하여 20.3%의 복구율(recovery)을 보여주었다.
여기에서의 단백질의 농도는 브래드포드(Bradford)에 의해서 제안된 방법에 따라서 측정하였다. 또한 순수도(purity)는 7.5%의 변성되지 않는 폴리아크릴아미드 젤(제1b도)과 SDS-폴리아크릴아미드 젤(제2도)에서 알 수 있었다.
4. 분자량 결정
정제된 효소의 변성되지 않는 분자량은 슈퍼로즈 12프렙 그레이드 젤여과 크로마토그래피(Soporose 12 Prep grade gel filtation chromatography:2×60cm)에 의하여 결정하고 카탈라제(catalase: 240kDa), 알돌라제(aldolase:158 kDa), 알부민(albumin: 68 kDa) 그리고 키모트립시노겐(chymotrysinogen: 25 kDa: 25 kDa)으로 보정하였다. 과산화물 디스뮤타아제에 있는 소단위의 수를 결정하기 위하여 디메틸 수베리미데이트(dimethayl subermidate)를 교차결합제(Gloss-linking agent)로 사용하고 교차결합된 단백질을 직선적 경사(5-20%)가 걸려있는 나트륨 도데실황산염-폴리아크릴아미드젤(sodium dodecyl sulfate: SDS-polyacrylamide gel)에서 전기영동을 하였다. 표준표지물(standard marker)로는 α2-마크로글로불린(macroglobulin: 170 kDa), β-갈락토시다제(β-galactosidase: 116.4 kDa), 푸룩토즈-6-포프패이트 키나제(fructose-6-phosphate kinase: 85.2 kDa), 글루타민산 데히드로게나아제(glutamate dehydrogenase: 55.6 kDa), 알돌라아제(aldolase: 39.2 kDa), 트립신 억제제(trypsin inhibitor: 20.1 kDa) 그리고 라이소자임(Iysozyme: 14.3 kDa)이 사용되었다. 단백질은 은염색(silver staining)법에 의해서 측정되었다. 보다 정확한 과산화물 디스뮤타아제 소단위의 분자량을 구하기 위하여, 10% 트리신-SDS-PAGE(Tricine-SDS-PAGE)가 상기와 동일한 방법으로 실시되었다. 저분자량인 경우에는 분자량 마커키트(Molecular Weight Marker Kit: MW-SDS-17)가 사용되었다.
과산화물 디스뮤타아제의 분자량은 5-20% 직선적경사의 SDS-PAGE(제2도)로부터 13.4 kDa로, 10% 트리신-SDS-PAGE로부터 13.0 kDa이 측정되었다. 5-20% 직선적 경사 SDS-PAGE(제2도)를 실시한 후에 13.4, 26.9, 41.7 그리고 53.7 kDa의 네개의 밴드가 나타났다. 네이티브 효소의 겉보기의 분자량은 수퍼로즈 12에서의 젤여과 크로마토그래피로 약 60 kDa으로 측정되었다 환원제(2-머캅토에탄올 또는 디티오트레이톨)의 존재하에서 과산화물 디스뮤타아제 소단위의 분자량은 환원제가 존재하지 않을 때와 같은 양이었으며, 이것은 이들 소단위가 사슬내의 황-황 결합(disulfide bond)에 의해서 연결되어 있지 않다는 것을 가리킨다. 일반적으로 박테리아 과산화물 디스뮤타아제는 18.0-22.0 kDa의 범위의 분자량을 가지고 있다.
스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제의 분자량은 다른 박테리아 과산화물 디스뮤타아제의 분자량보다 적었다. 대부분의 과산화물 디스뮤타아제는 다이머 형태를 가지고 있었다. 반면에 테트라머 형태는 메타노박테리움 브리안티(Methanobacterium bryantii)로 부터 추출한 철함유-과산화물 디스뮤타아제와 같은 박테리아 과산화물 디스뮤타아제에서 발견되고 있다. 또한, 더 고등한 유기체에서 발견되는 망간함유-과산화물 디스뮤타아제는 테트라 단백질로 알려져 있다.
5. 아포효소의 제조
스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1에서 추출한 네이티브 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제와 아포-니켈함유-과산화물 디스뮤타아제(apo-NiSOD)의 차이점을 비교하여 이 과산화물 디스뮤타아제에서의 니켈의 역할을 알아보기 위하여 하기와 같은 과정을 거쳐 아포 효소를 분리, 정제하였다.
Privalle et al.에 의하여 제안된 과정에 따라서 아포효소를 분리하였다. 정제된 효소는 20mM 8-하이드록 실퀴놀린(8-hydroxylquinoline), 2.5 M 염화구아니디늄(guanidium chloride) 0.1mM 에틸렌디아민트리아세테이트(EDTA), 5mM 트리스(pH 3.8)을 혼합한 용액에서 4℃, 18시간동안에 투석하였다. 50mM 트리스완충용액(pH 7.8)을 여러번 교체하면서 24시간동안에 투석하였다. 15분동안에 12000×g에서 원심분리하여 변성된 단백질은 버리고 난 후 남은 용액은 아미콘 울트라필트레이션 시스템(Amicon ultrafiltration system)에 의해서 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.4)으로 교체하였다.
네이티브 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제와 아포-니켈함유-과산화물 디스뮤타아제의 과산화물 디스뮤타아제의 활성도의 비교를 표 3에 나타내었다. 과산화물 디스뮤타아제의 활성도는 맥콜드와 프리도비치(McCord Flidovich)에 의하여 제안된 간접적인 방법에 의하여 에세이되었다. 반응 혼합물에는 50mM 인산나트륨 완충용액(pH7.8)안에 0.1mM EDTA, 50μM 크산틴, 10μM 시토크롬 c(cytochrom c)이 포함되어 있었다. 0.02-0.04/min사이에서의 흡광 속도(absorbance rate)를 주는 크산틴 옥시다제의 충분한 양을 첨가한 후에 550nm에서 시토크롬 c의 환원이 일어났다. 과산화물 디스뮤타아제의 활성도의 프리도비치 단위는 시토크롬 c 환원의 50%의 억제를 할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.
네이티브 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제의 금속당 고유활성도(specific activity)는 50.9 U/ng-atom Ni이었다. 이 값은 소의 에리트로사이트에서 추출한 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제의 것(55.0 U/ng-atom Cu)과 매우 비슷하다. 반면에 아포-니켈함유-과산화물 디스뮤타아제(apo-NiSOD)의 단백질당 고유활성도(U/mg enzyme)은 네이티브 효소의 7%에 불과하였다.
제3도에서 보여주듯이 378nm에 나타난 대표 신호는 아포 효소에서는 보이지 않았다. 그러므로 아포-니켈함유-과산화물 디스뮤타아제의 단백질당 고유활성도의 담소는 네이티브 니켈함유-과산화물 디스뮤타아제의 니켈의 상실에 의한 것이다. 스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제에서 니켈은 소의 에리트로사이트에서 분리한 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제에서 구리처럼 산화환원(redox) 활성 자리로 작용한다. 세번째에 위치한, 히스티틴 잔기를 가지고 있는 니켈-올리고펩티드는 퀀칭 과산화물 음이온 라디칼의, 과산화물 디스뮤타아제와 같은 활성도를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 아포효소의 금속당 고유활성도는 네이티브 효소의 그것과 거의 동일하나 실제적으로 네이티브 과산화물 디스뮤타아제의 고유활성도의 거의 절반(45%)에 해당한다.
표 3에서 보여주듯이 아포효소의 정제과정에서 니켈 함량의 잔여 속도(remaining rate: 66.4 - 11.2: 17 %)가 과산화물 디스뮤타아제의 활성도의 잔여 속도(3380 - 240: 7 %)의 2배이기에 이 결과는 불완전한 투석에 의한 것이라고 할 수 있다.
6. 과산화물 디스뮤타아제 항혈청의 제조
웨스턴 이뮤노 블러팅의 면역원(immunogen)으로 사용하기 위하여 과산화물 디스뮤타아제 항혈청을 제조하였다. 정제된 과산화물 디스뮤타아제를 10% 트리신-SDS-PAGE를 실시하였다. 전기영동을 한 후에 주요한 폴리펩티드를 젤로부터 잘라서 호모게나이저(homogenizer)로 분쇄하였다. 실험용쥐 세마리의 피하조직에 프로인츠 컴플리트 어쥬반트(Freund's complete adjuvant)에 유상으로 되어있는 약 10μg의 SOD를 주사하였다. 약 10μg SOD를 8주 동안에 2주 간격으로 주사하였다.
7 웨스턴 이뮤노블롯팅(Western immunoblotting)에 의한 과산화물 디스뮤타아제의 비교
SDS-PAGE를 상기에서와 동일한 방법으로 실시하였다. 단백질의 일렉트로트랜스퍼(electrotransfer)가 Towbin wet al.에 의해서 제안된 방법에 따라서 실시되었다. 단백질은 바이오-라드 트랜스블롯 장치(Bio-Rad transblot apparatus: Bio-Rad, U. S. A.)을 사용하여 10% 메탄올이 포함되어 있는 트리스-글리신 완충용액(Tris-glycine buffer: pH 8.3), 170mA속에서 1시간동안 니트로셀룰로즈막(nitrocellulose membrane: Schleicher Schuell)으로 일렉트로트랜스퍼(electrotransfer)하였다. 블롯은 TBST(10 mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 0,05% 트윈 20(tween 20))에 용해되어 있는 0.5% 소혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA)과 함께 인큐베이션(incubation)시킴으로 블록(block)되었다. 블롯된 막은 SDS혈청의 1/100배 희석된 용액에서 인큐베이션하였다. 그리고 나서 안티-마우스 이뮤노글로불린 지(anti-mouse immunoglobulin G: IgG) 알칼리 포스파타제 콘쥬게이트(alkaline phosphatase conjugate)의 1/10000배 희석용액에서 인큐베이션하였다. 알칼리 포스파타제는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스패이트(BCIP)방법에 따라서 검출하였다.
다른 과산화물 디스뮤타아제와의 면역학적인 유사성을 관찰하기 위하여 몇몇 스트렙토마이세스 에스피피.(a, b), 대장균(d), 세레비지에의 원 추출액(e)과 소의 에리트로사이트(f)에서 추출한, 상업적으로 유용한 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제의 SDS-PAGE를 실시하였다. 또한 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1에서 분리한 과산화물 디스뮤타아제(g)에 대한 항체와의 이뮤노 블러팅을 실시하였다. 그 결과는 제6도에 나타내었다. 레인 a는 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1의 세포 추출액이고, b는 스트렙토마이세스 코엘리콜롤 A3(2)의 세포 추출액, c는 롱지스포로플라부스 ATCC 19915의 세포 추출액, d는 대장균 KCTC 11033, e는 사카로마이세스 세레비지아에 ATCC 26787, f는 소의 구리아연-함유 과산화물, 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1에서 정제한 과산화물 디스뮤타아제의 밴드를 나타낸 것이다. 이 항체는 하나의 밴드만이 나타났는데 스트렙토마이세스종 균주의 각각의 추출액에서 나온 분자량이 비슷한 밴드와 동일한 패턴이었다. 대장균(d)과 세레비지에의 원 추출액(e)과 소의 에리트로사이트(f)에서 추출한 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제에서는 교차반응성(crossreactivity)이 발견되지 않았다. 이것은 스트렙토마이세스 에스피피.에서 분리한 과산화물 디스뮤타아제는 이제까지 알려진 다른 과산화물 디스뮤타아제와는 면역학적으로 다르다는 것을 의미한다.
8. 과산화수소, 시안니드 및 아지드에 의한 과산화물 디스뮤타아제의 억제작용
30분간 인큐베이션하고 10mM 시안화칼륨(KCN)을 첨가함으로 과산화물 디스뮤타아제를 억제하였다. 5mM 시안화칼륨의 첨가는 과산화물 디스뮤타아제의 활성도의 70.0%를 억제시켰다. 5mM, 10mM 농도의 과산화수소의 첨가가 각각 과산화물 디스뮤타아제 활성도의 56.8%, 73.4% 감소시켰다. 그러나 30분간의 인큐베이션 후에 10mM 아지드화나트륨(sodium azide: NaN3)을 첨가하였을 때는 효소 활성도의 15.0%만이 억제되었다. 금속과 결합된 고유한 억제제에 의한 스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제의 억제 패턴은 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제의 그것과 비슷하다.
9. 단백질의 N-말단 서열
정제된 효소를 트리신-SDS-PAGE을 실시하였다. 전기영동을 한 후에 단백질의 일렉트로트랜스퍼는 Towbin et al.가 제안한 방법에 따라서 실시하였다. 단백질은 바이오-라드 트랜스블롯 장치를 이용하여 10% 메탄올을 포함하고 있는 CAPS 완충용액(pH 11)속에서 폴리비닐리덴 디플루오리드 막(polyvinylidene difluoride membrane: PVDF Imbomilon-P, Millipore)으로, 170mA의 전류로 1 시간동안 일렉트로트랜스퍼되었다. 전기영동 후에 막을 0.1% 쿠마시-블루(Coomassie-blue) R250으로 5 시간동안 염색한 후에 50% 메탄올용액으로 10분동안에 세번 탈색하고 증류수로 세 번 세척하였다. 블롯된 폴리펩티드를 잘라서 과산화물 디스뮤타아제의 N-말단 서열을 밀리겐/바이오서치 6600 프로시퀸서 프로테인 시퀸스 시스템(Milligen/Biosearch 6600 Prosequencer protein sequencing system: Millipore, U.S.A.)을 이용하여 결정하였다.
스트렙토마이세스 에스피, IMSNU-1과 스트렙토마이세스 코엘리콜롤 A(3)2에서 정제한 과산화물 디스뮤타아제의 N-말단 서열은 기존의 과산화물 디스뮤타아제와 함께 제7도에 도시하였다. 스트렙토마이세스 에스피.
IMSNU-1에서 정제한 과산화물 디스뮤타아제의 N-말단 서열은 X-Gly-Asp-Leu-Pro-Gly-X-Val-Tyr-Asp-Pro-Ala-Gln-Ala(X;잔기들은 감지되지 않음)였고, 스트렙토마이세스 코엘리콜롤은 His-Gly-Asp-Leu-Pro-Gly-Val-Tyr-Asp-Pro-Ala-Gln-Ala였다. 두 스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제는 발견하지 못한 잔기를 제외하고는 서로 일치한다. 4와 5번 위치한 류신(leucine)과 프롤린(proline)는 다른 박테리아 과산화물 디스뮤타아제의 그것과 일치하지만, 13와 14번에 위치한 알라닌(alanine)과 류신은 다른 과산화물 디스뮤타아제와 일치하지 않는다.
10. 분광학적인 연구
모든 시료의 흡수 스펙트럼이 시마쯔 유브이-265 분광기(Shimadzu UV-265, Japan)으로 측정되었다. 스펙트럼은 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.4)에 용해되어 있는 네이티브 효소와 첨가된 효소이 들어있는 1cm의 유리 큐베트(quartz cuvette)을 이용하여 25℃에서 측정하였다. 환원된 형태는 공기를 공급하면서 1mM 네이티브 효소(18.2μM)에 칼륨과산화물(potassium superoxide)을 첨가함으로써 얻었다. 과산화물 디스뮤타아제에 대한 EPR의 고찰은 브루커 ESP 3005 EPR 분광기를 이용하여 4K와 77K에서 실시되었다. 77K에서 측정하기 위하여 인산나트륨 완충용액(pH 7.4)에 함유되어 있는 60μM의 과산화물 디스뮤타아제와 하기와 같은 조건에 만족되었다.: 9.44 GHz의 마이크로파 진동수, 5mW의 마이크로파 전력, 10G의 변조 진폭. 그리고 4K에서 측정하기 위하여는 상기한 완충용액에 들어있는 42μM의 효소와 하기와 같은 조건이 갖춰져 있었다. : 9.49GHZ의 마이크로파 진동수, 20mW 마이크로파 전력, 20mW의 변조 진동수, 20G의 변조진폭.
스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1에서 추출한 네이티브 과산화물 디스뮤타아제와 아포효소의 흡수 스펙트럼을 제3도에 나타내었다. 여기에서 각 효소의 단백질의 양은 약 1.3mg/㎖이었다. 스트렙토마이세스의 과산화물 디스뮤타아제는 276,378 nm에서 최대치를, 531 nm에서 완만한 피크를 보여주었다. 몰라흡광계수(molar absorption coefficient)는 53.7kDa 분자량을 기준으로 보았을 때, 276, 378 nm에서 각각 71200, 10700M-1이었다. 이 효소 용액을 공기 분위기에서 칼륨 과산화물로 최종 농도가 1mM가 되게 처리하면 378, 531 nm에서의 흡수 피크가 사라지는데 이것은 이 효소의 색이 갈색에서 표백되었기 때문이다. 이것은 과산화물 라디칼의 전자가 과산화물 디스뮤타아제에 있는 니켈로 전달되었기 때문에 일어나는 현상이다. 구리-아연함유 과산화물 디스뮤타아제, 망간 함유-과산화물 디스뮤타아제, 철함유-과산화물 디스뮤타아제의 흡수 스펙트럼의 최대치와는 명백하게 구분되었다. 철함유-과산화물 디스뮤타아제의 흡수 스펙트럼은 320-500 nm의 범위에서 완만한 특징 없는 쇼울더(shoulder)가 나타난 반면에 망간함유-과산화물 디스뮤타아제는 473 nm에서 흡수 최대치를, 구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제 660 nm에서 흡수 최대치를 나타내었고 280 nm에서의 최대치는 단백질과의 결합으로 없어졌다.
스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1에서 분리한 네이티브 과산화물 디스뮤타아제(A) 아포효소(B)의 X-밴드 EPR 스펙트럼을 제4도에 도시하였다. 스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제의 EPR 스펙트럼은 이전에 보고된 여느 과산화물 디스뮤타아제의 패턴에 있어서 차이가 있었다.
구리아연함유-과산화물 디스뮤타아제의 경우에 있어서, EPR 스펙트럼에서의 g값, gm=2.073, g1=2.260이었다. 그리고 철함유-과산화물 디스뮤타아제의 EPR 스펙트럼에서 신호의 매개변수는 gz=4.90, gx=3.88, gy=3.53이었고 네이티브 망간함유-과산화물 디스뮤타아제의 스펙트럼에서는 아무 신호도 감지되지 않았다. 제4a도에서 보는 바와 같이 액체 질소와 액체 헬륨 온도에서의 스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제의 EPR 스펙트럼에서는 고유한 신호의 매개변수값(g1=2.304, g2=2.248, g31=2.024, g32=2.012 그리고 g33=1.998)을 보여주었다. g1=2.31, g2=2.23, g3=2.02의 g값을 갖는 이완이 느린, 사방(rhomic) EPR 신호를 보여주는 데술포비브리오 기가스로부터 추출한 페리플라즈믹 하이드로게나제(periplasmic hydrogenase)와 비슷하다. 데술포비브리오 기가스 하이드로게나제의 경우에는 질소 배위(nitrogen coordination)에 의한 하이퍼화인 분할(hyperfine splitting)이 g=2.02에서 전혀 관찰되지 않았다. 니켈(III) 배위 쉬피어(sphere)가 황원자에 의하여 좌우되기 때문이다. 그러나 스트렙토마이세스 과산화물 디스뮤타아제의 경우에는 매개변수 g3는 g31, g32그리고 g33의 트리플렛(triplet) 상태로 분리되었으며 하이퍼화인 분할 상수(hyperfine splitting constant:a3)는 26G이었다. 트리플렛 상태는 니켈의 디-오비탈 전자와 히스티딘(histidine) 잔기의 이미다졸(imidazole) 고리와 같은 질소(I=1)리간드와의 상호인력작용에 의한 것이다. 트리플렛 패턴이 Fe-NO의 것과 다소 비슷하더라도 스트렙토마이세스종에서 분리한 과산화물 디스뮤타아제에서 철이 거의 발견되지 않았기 때문에(표 2) 중앙 g=2.012의 트리플렛 패턴이 Fe-NO에서 나온 것이라고 볼 수 없었다. 제4b도에 나타났듯이 모든 g값이 아포효소의 EPR 스펙트럼에서는 나타나지 않았으며, 제5도에서 보여주듯이 g=2.304에 대한 마이크로파 전력의 포화 패턴은 마이크로파 전력의 증가치만큼 g=2.012에 대한 마이크로파 전력의 포화 패턴에 비례했다. 그러므로, 모든 g값은 같은 종에서 기인한 것이라고 볼 수 있었다.
11. 금속함유량
정제된 과산화물 디스뮤타아제를 금속을 제거한 밀리-큐 그레이드 워터(dematalized Mill-Q grade water)에 대해서 24시간동안 투석하였다. 개개의 금속(Fe, Mn, Cu, Zn 그리고 Ni)는 AA-880 마크 II 원자 흡수 분광기(Jarrell Ash, Japan)을 이용하여 측정하였다.
스트렙토마이세스 에스퍼. IMSNU-1과 스트렙토마이세스 코엘리콜롤 A3(2)에서 추출된 과산화물 디스뮤타아제에 함유되어 있는 금속의 함량을 표 2에 나타내었다. 이 값은 원자 흡수 분광학적인 실험에서 얻어진 것이며, 다른 두개의 시료에서 얻은 값의 평균을 취한 것이다. 소단위의 몰종도는 13.4kDa의 분자량으로 계산하였다. 배지에서의 금속 함량은 접종(inoculation)이전에 측정하였다. 원자 흡수 분석은 소단위 1몰당 0.74g의 원자가 존재하는 것으로 나타났다. 니켈, 철, 아연, 망간 그리고 구리가 포함되어 있는 배지에서 배양되었지만 철과 아연의 소량은 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1의 효소 준비과정에서만 검출되었고, 구리와 망간은 전혀 검출되지 않았다. 그러므로 스트렙토마이세스 에스피. IMSNU-1과 스트렙토마이세스 코엘리콜롤에서 정제한 과산화물 디스뮤타아제는 활성자리의 금속으로 특정하게 철, 망간, 아연 그리고 구리가 아닌 니켈을 받아들였다고 고려된다.

Claims (4)

  1. 니켈을 활성금속으로 포함하고, 13.4kDa의 분자량을 가지며, 테트라머로 구성되어 있고, 다음과 같은 N-말단 아미노산 서열을 갖으며, 과산화물을 분해하는 과산화물 디스뮤타아제. His GLy Asp Leu Pro Gly Gly VaL Tyr Asp Pro ALa Gln ALa
  2. 제1항에 있어서, 상기한 과산화물 디스뮤타아제는 시아니드와 과산화수소에 의하여는 억제되나 아지드에 의하여는 거의 억제되지 않는 과산화물 디스뮤타아제.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 스트렙토마이세스종에서 분리 정제한 과산화물 디스뮤타아제.
  4. 스트렙토마이세스 종의 포자를 베네트 배지중에서 28℃의 온도에서 5일동안 배양하고, 포자의 최종 농도는 4×106㎖가 되도록 20% 글리세롤과 함께 모아서 0.5중량% 이스트 추출액, 0.5중량% 펩톤, 0.5중량% 카사미노산, 0.3중량% 말트 추출액, 그리고 1중량% 글루코오즈를 혼합하여 pH 7.0으로 보정한 YEME 배지에 접종하고, 500㎖의 방지장치용 플라스크에서 28℃, 68시간 동안에 공기 분위기에서 배양하고, 균사를 뷰히너 깔때기에 있는 여과지에서 수류펌프에 의하여 배양하고 난 후에 0.85% 염화칼슘용액으로 세척하고, 세척한 균사를 20mM 인산나트륨과 0.1mM 에틸렌디아민 트리아세테이트를 혼합하여 제조한 완충용액 A에 분산시키고; 비드버터를 이용하여 5분동안 분쇄시켜 얻은 균질화액을 4,000×g에서 15분간 원심분리한 후에 고체 황산암모늄을 상등액에 첨가하여 그 농도가 80%까지 포화되게 하고, 15.000×g에서 20분 동안 원심분리하여 침전을 수집하고 완충용액 A에 다시 용해시켜 완충용액 A에서 밤새도록 투석하고; 미리 완충용액 A로 평형시켜 놓은 DEAE 세파셀에, 투석한 시료를 로드하고, 단백질은 0-0.05M 염화나트륨의 직선적 경사를 걸어주면서 용출하여 활성분획을 모은 후에 아미콘 YM10막으로 염을 제거하고, 활성 시료는 워터스델타 프렙 4000 크로마토그래피 시스템으로 정제하여 완충용액 A로 평형시킨 단백질-팍 DEAE 5PW 칼림에 로드하고, 칼럼을 완충용액 A에서 0.15M 염화나트륨으로 세척한 후에 단백질을 완충용액 A에서 0.15-0.30M 염화나트륨의 직선적 경사를 걸어 용출시키고, 활성분획을 다시 모아서 아미콘 YM10막으로 염을 제거하고 바이오-라드 모델 491 프렙셀 정제 전기영동 기구를 사용하여 더욱 정제하고, 활성시료를 0.1M 트리스-염화수소(pH 6.8), 10% 글리세롤, 0.002% 브로모페놀 블루가 첨가되어 있는 완충용액과 혼합하여 7.5% 항변성 폴리아크릴아미드젤(3.7×11cm)에 로드하고, 단백질은 전기영동을 하고난 후에 25mM 트리스-염화수소(pH 8.8)가 들어있는 완충용액 B를 통하여 용출한 후에 정제된 분획을 모은 다음 완충용액 A로 치환하고 -70℃에서 보관하는; 공정을 포함하는 13.4kDa의 분자량을 가지며, 테트라머로 구성되어 있고, 다음과 같은 H-말단 아미노산 서열을 갖으며, 과산화물을 분해하는 과산화물 디스뮤타아제의 제조방법.
    His GLy Asp Leu Pro Gly Gly VaL Tyr Asp Pro ALa Gln ALa
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103805587A (zh) * 2014-01-13 2014-05-21 李健 一种超氧化物歧化酶脂肪酸包合物及其制备方法

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