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Hintergrund
der Erfindung
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Eine
Körperzelle
verdankt ihr Funktionieren zum Großteil ihrem Cytoskelett, dem
strukturellen Gerüst der
Zelle. Das Cytoskelett wird durch Komponenten im Cytoplasma gebildet,
die die Form der Zelle erhalten, Zellbefestigungen an Nachbarzellen
stabilisieren und Spezialfunktionen der Zelle, wie die Endocytose,
die Exocytose und die Beweglichkeit der Zelle, erleichtern. Das
Cytoskelett beinhaltet verschiedene faserartige Strukturen, wie
Mikrotubuli, Mikrofilamente, Zwischenfilamente und mikrotrabekulare
Gitter. Proteine, die an der Bildung eines Cytoskeletts beteiligt
sind, besonders Mikrotubular-verbundene
Proteine (MAPS) werden, nachdem diese von der Zelle hergestellt
wurden, in einem Verfahren, das als posttranslationale Modifikation oder
Quervernetzung bezeichnet wird, weiter an die Cytoskelettfunktion
angepasst. Dieses Verfahren der Quervernetzung von Proteinen ist
essenziell, um das Cytoskelett zu stabilisieren, der Ablauf ist
erforderlich, um die Zellhomeostase, physiologische Prozesse und
die Zellentwicklung und Reifung aufrechtzuerhalten.
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Die
posttranslationale Modifikation von Proteinen beinhaltet verschiedene
chemische Reaktionen. Die Proteinphosphorylierung dient als Beispiel
eines der häufigsten
Mechanismen der posttranslationalen Modifikation von zellulären Proteinen.
Andere Beispiele beinhalten die Methylveresterung von Proteinen,
die ADP-Ribosylierung, die Proteinglycosylierung, die Histonacetylierung,
die Bildung von Hypusin und Transglutaminase-katalysierte Reaktionen.
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Das
elektrische Potenzial einer Zelle ist ein Aspekt der zellulären Physiologie,
der für
das Verständnis des
Mechanismus der Erfindung wichtig ist. Das elektrische Potenzial
einer Zelle wird durch ein komplexes Gleichgewicht zwischen negativ
und positiv geladenen Molekülen
aufrechterhalten, das zu einem physiologischen Ruhepotenzial von
ungefähr
70 mV im Innern der Zelle führt.
Dieser Wert weist auf das Wohlbefinden der Zelle hin. Andererseits
kommt die Unfähigkeit
der Zelle, ein optimales Ruhepotenzial aufrecht zu erhalten, bei
pathologischen Bedingungen vor, z.B. bei physikalischen oder chemischen
Verletzungen, bei Krankheitsprozessen und bei Altersverschleiß. Ein optimales
Ruhepotenzial fördert
den physiologischen Prozess, die posttranslationale Proteinmodifikation
und die Quervernetzung eingeschlossen. Es gilt auch, dass die intakte physiologische
Quervernetzung von Proteinen auf die Fähigkeit einer Zelle hinweist,
ein optimales elektrisches Ruhepotenzial aufrecht zu erhalten.
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Positive Effekte der Quervernetzung
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Die
Quervernetzung von Proteinen ist, wie zuvor schon erwähnt, ein
Ergebnis der posttranslationalen Modifikation von Proteinen. Einige
der meist üblichen
Quervernetzungen, die in Proteinen, die das Cytoskelett bilden,
identifiziert wurden, sind Neee-(ggg-Glutamyl)lysin und N,N-bis(ggg-Glutarnyl)polyamin.
Die Bildung dieser zwei Typen von Quervernetzungen wird durch die
katalytische Aktivität
einer Gruppe von Enzymen erleichtert, die als Transglutaminasen
bekannt sind. Eine der am besten bekannten Transglutaminasen im
Körper
ist das Gerinnungsprotein Faktor XIII. Dieser Faktor verursacht
die Quervernetzung des Fibrins, das als stabilisierendes Mittel
bei der Blutgerinnselbildung wirkt. Dieser Typ der Modifikation
ist ein Beispiel eines lebensrettenden Mechanismus, der auf der
Quervernetzung von Proteinen basiert, der die Verblutung bei einem Schnitt
oder einer Wunde verhindert.
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Transglutaminasen
sind verantwortlich dafür,
dass ein physiologischer Prozess der Proteinquervernetzung erleichtert
wird, der unter normalen Bedingungen zur Zellteilung führt, dadurch
ist die Zelle in der Lage, ihren Zweck zu erfüllen, z.B. die schleimabsondernde
Zelle, die phagozytische Zelle, Epithel- und Tegumenzelle, die die
Gewebestruktur schützen.
Die Transglutaminaseaktivität
oder ihr Fehlen spielt eine kritische Rolle bei der Teilung von
Krebszellen, besonders von Hautkrebsmelanomen. Das Melanom ist ein
sich schnell ausbreitender Krebs, der aus undifferenzierten Hautzellen
besteht, und der Grad der geringen Zelldifferenzierung korreliert
gut mit der unterdrückten
Aktivität
der Transglutaminase. Andererseits führt die experimentelle Induktion
der Transglutaminaseaktivität
zu viel versprechenden Ergebnissen beim Abbremsen oder der Reversion der
Progression von Melanomen. Beispiele für Transglutaminaseinduktoren
sind Retinoinsäure
und Methylxantine. Daraus wird ersichtlich, dass das therapeutische
Potenzial von Retinoiden bei Melanomen auf ihre Fähigkeit
zurückzuführen ist,
intrazelluläre
Transglutaminasen zu aktivieren.
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Schädliche Quervernetzung
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Die
Quervernetzung von intrazellulären
Proteinen ist jedoch nicht immer ein positives Ereignis. Wenn eine
willkürliche
und massive Quervernetzung durch einen abrupten, nicht physiologischen
Reiz ausgelöst wird,
erfolgt eine beschleunigte Alterung der Zelle. Aufgrund der Natur
der Quervernetzung, die dem Zweck der Zellorganisation und Differenzierung
entgegenläuft,
kann dies nicht nur zu vorzeitiger Zellalterung und -tod, sondern
auch zu einer Pathologie führen,
bösartige
Tumore eingeschlossen. Z.B. können
freie Radikale, die durch UVA erzeugt werden, in Hautzellen vorzeitige
Quervernetzung von Proteinen und die Freisetzung von proteolytischen
Enzymen bewirken. Dieses letztere Ereignis führt zur Zerstörung des
Cytoskeletts und der schnellen Zerstörung der Zellorganisation,
die das Funktionieren der Zelle gefährdet.
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Es
ist von besonderem Interesse, hier den Begriff Lipofuscin zu erwähnen, der
den Spitznamen "Alterspigment" oder "Leberflecken" trägt, der
in der Epidermis und Schleimmembranen, wahrscheinlich als Ergebnis
eines unterbrochenen zellulären
und systemischen Metabolismus vorkommt. Es wurde gezeigt, dass Lipofuscin
auf den oxidativen Abbau von Mitochondrien und/oder Lysosomen in
der Zelle zurückzuführen ist.
Es wird vorausgesetzt, dass Lipofuscin das Ergebnis eines metabolischen
Fehlers ist, der zu Hypoanabolismus in Kombination mit Hyperkatabolismus
führt.
Es wird hier vorausgesetzt, dass die Bildung von Lipofuscin ein Teil
des Sichtbarwerdens des gestörten
Verfahrens der posttranslationalen Modifikation von Proteinen ist,
und dass dieses Verfahren mit jeglichem systemischen Krankheitsprozess
intensiviert wird, den Altersprozess eingeschlossen.
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Verwandter Stand der Technik
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Wie
zuvor erwähnt
wurde, sind Transglutaminasen verantwortlich dafür, dass die physiologischen
Prozesse der Quervernetzung von Proteinen erleichtert werden, die
unter normalen Bedingungen zur Zelldifferenzierung, Reifung und
zeitgemäßen Alterung
führen.
Es gibt einen beachtlichen Beweis dafür, dass die intrazelluläre Transglutaminaseaktivität bei einer
bestimmten Pathologie verhindert wird, z.B. bei bösartigen
Tumoren, z.B. Melanomen. Es scheint, dass das therapeutische Potenzial
von Transglutaminaseinduktoren, wie Retinoiden und Methylxantinen,
bei Melanomen auf deren Fähigkeit,
die intrazelluläre
Transglutaminase zu aktivieren, zurückzuführen ist. Dies würde umgekehrt
zur Differenzierung der Zelle führen,
was in der klinischen Praxis zu einer Verlangsamung des Krankheitsprozesses
aufgrund einer Abnahme der Zahl der undifferenzierten bösartigen
Zellen führen
würde.
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Curcuminderivate,
Tetrahydrocurcumin und Curcuminoide eingeschlossen sind in der Literatur
als eine Gruppe phenolischer Antioxidantien wohlbekannt (Majeed
et al. Curcuminoides Buch). Majeed et al., U.S. Patent Nr. 5,861,415,
haben festgestellt, dass die Kombination von natürlich vorkommenden Curcuminoiden,
die aus der Gelbwurzel isoliert wurden, d.h. Curcumin, Demethoxycurcumin
und Bisdemethoxycurcumin, einen breiten Bereich eines Schutzes gegen
Antioxidantien herstellen, der als bioprotektive Wirkung beschrieben wird.
Die bioprotektive Wirkung, die dadurch charakterisiert ist, dass
die Bildung von freien Radikalen und das Eingreifen in freie Radikalfänger verhindert
wird, wird sowohl von Tetrahydrocurcumin(oiden) (THC) als auch von
Curcumin(oiden) ausgeübt
(Majeed et al., Die Gelbwurzel und heilende Curcuminoide, Keats
Publications 1996 und Majeed et al., Curcuminoide antioxidantische
Phytonährstoffe,
NutriScience Publishers 1995). Tetrahydrocurcumin(oide) zeigen jedoch
im Vergleich zu Curcumin oder Curcuminoiden bessere Radikalfängereigenschaften
(Majeed et al. Curcuminoides Buch). Ein weiterer Vorteil von Tetrahydrocurcuminoiden
ist, dass diese nicht so stark gefärbt sind wie Curcuminoide und
daher ohne bedeutende Verfärbung
topisch angewandt werden können.
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Kürzlich wurde
gefunden, dass Curcumin, aber nicht Tetrahydrocurcumin einen vorbeugenden
Effekt auf die Quervernetzung von Collagen bei diabetischen Ratten
hat. (Sajithlal GB, Chithra P, Chandrakasan G., Biochem Pharmacol,
15. Dezember 1998, 56(12): 1607–14).
Der antiquervernetzende Effekt von Curcumin war jedoch mit einer
sehr hohen oralen Dosis der Verbindung erreicht worden (200 mg/kg
Körpergewicht).
Es wurde auch beobachtet, dass der vorbeugende Effekt von Curcumin
auf die fortgeschrittene Quervernetzung von Collagen ausgeprägter war
als sein therapeutischer Effekt. Die Autoren dieser Studie erklärten dies
damit, dass der antiquervernetzende Mechanismus von Curcumin durch
das Quenching der freien Radikale bedingt ist, was umgekehrt die
beschleunigte Quervernetzung von Collagen bei Diabetes verhindern
würde.
Diese Studie unterstützt
die Verwendung von Curcumin zur Vorbeugung und in gewissem Maße zur Behandlung
von exzessiver Quervernetzung von Proteinen bei Behandlung von Bedingungen,
die durch beschleunigte Quervernetzung charakterisiert sind, wie
Diabetes.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung ist geeignet für
ein Verfahren zur Behandlung eines prämalignen Zustands oder von bösartigen
Tumoren bei einem Patienten, umfassend die Verabreichung einer wirksamen
Menge einer Mischung von Tetrahydrocurcuminoiden an einen Patienten,
der unter einem prämalignen
Zustand oder einem bösartigen
Tumor leidet, insbesondere für
ein Verfahren, bei dem der bösartige
Tumor ein Melanom ist.
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Daher
ist ein Aspekt der Erfindung die Verwendung einer wirksamen Menge
einer Mischung von Tetrahydrocurcuminoiden zur Herstellung eines
Medikaments zur Behandlung von Melanomen.
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Die
Erfindung ist auch geeignet für
ein Verfahren zur Reduzierung von "Altersflecken" aufgrund der Bildung von Lipofuscin
bei einem Patienten, der eine derartige Behandlung benötigt, umfassend
die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Mischung enthaltend
75–85%
Tetrahydrocurcumin, 10–20%
Tetrahydrodimethoxycurcumin und 2,0 bis 4,5% Tetrahydrobisdimethoxycurcumin
an den Patienten, insbesondere für
ein Verfahren, bei dem die Zusammensetzung topisch verabreicht wird.
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Daher
ist ein weiterer Aspekt der Erfindung die Verwendung einer wirksamen
Menge einer Mischung von Tetrahydrocurcuminoiden zur Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung von Altersflecken aufgrund der
Bildung von Lipofuscin.
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Der
Mechanismus der Erfindung besteht darin, dass die Homeostase und
das Funktionieren der Zellen basierend auf dem regulatorischen,
sowohl inhibitorischen und anregenden Effekt der Quervernetzung
von intrazellulären
Proteinen erhalten werden. Dieser regulatorische Mechanismus, der
zuvor für
Curcumin und seine Derivate unbekannt war, steht auch nicht in Bezug
zu den gut untersuchten und beschriebenen antioxidantischen Eigenschaften
von Curcumin(oiden) und Tetrahydrocurcumin(oiden). Es ist ein neuer
Weg der Erzielung eines weit reichenden regulatorischen Effekts
bei biologischen Prozessen. Ein vergleichbarer regulatorischer Effekt
auf die Quervernetzung von Proteinen im Organismus wurde zuvor weder
mit einer einzelnen Verbindung noch mit Kombinationen von Verbindungen
beschrieben. Im Wesentlichen unterscheidet sich die Erfindung von
anderen Verbindungen, die den Quervernetzungsprozess beeinflussen
dadurch, dass die zuvor beschriebenen Verbindungen die intrazelluläre Quervernetzung
stimulieren oder inhibieren, wohingegen die Erfindung als Quervernetzungsmodifikator
(CLM) oder "Crossregulin" wirkt. Diese Begriffe
werden hier zum ersten Mal verwendet, um den Mechanismus der Erfindung
zu beschreiben. CLM oder Crossregulin bedeutet, dass eine Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung einen positiven Einfluss auf die posttranslationale Proteinmodifikation
und den Quervernetzungsprozess sowohl bei physiologischen als auch
bei pathologischen Bedingungen ausübt. Der CLM-Effekt der Erfindung
wird dadurch erreicht, dass eine spezifische Zusammensetzung des
Produkts verwendet wird, das in dem Abschnitt "Verfahren zum Erhalten von THC" beschrieben wird.
Der Mechanismus kommt mit Modifikationen des THC-Moleküls, z.B. Ether-THC, Trimethylether-THC, Dimethylether-TCH,
Benzylether-THC und Kalium-, Magnesium- und Kupfersalzen von THC
vor. Der Mechanismus der Erfindung wurde bei in vivo experimentellen
Bedingungen wie bei dem Verhindern von UV-Sonnenbrand und Quervernetzung
(Prozent der Thymindimerzellen) bei Hautzellen gezeigt, die UV-Strahlung
ausgesetzt wurden. Die biologischen Eigenschaften der Erfindung
wurden mit denen von Curcuminoiden verglichen und trotz der Tatsache,
dass die vorliegende Zusammensetzung frei von gelber Farbe ist,
zeigt sie immer noch vergleichbar schützende Wirkungen gegen UV-Strahlung
wie die gelben Curcuminoide. Diese Aktivität scheint anders zu sein als
die antioxidativen Effekte, die für THC und Curcuminoide charakteristisch
sind.
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Im
Folgenden wird der Mechanismus der Erfindung ausführlich beschrieben:
- 1. Es wird vorgeschlagen, dass bei physiologischen
Zuständen,
die durch optimale posttranslationale Proteinmodifikation, Proteinquervernetzung,
sowie durch das optimale elektrische Zellpotenzial charakterisiert sind,
THC die oben veranschaulichten Zustände von zellulärem Wohlbefinden
nicht stört.
- 2. Aber bei den Zuständen,
die durch eine schwache morphologische und funktionelle Differenzierung
von Zellen gekennzeichnet sind, z.B. prämaligne Zustände oder
bösartige
Tumore, würde
THC zur posttranslationalen Proteinmodifikation und Quervernetzung
beitragen und das elektrische Potenzial der Zelle optimieren. Dies
würde sowohl
durch die Wechselwirkung zwischen den phenolischen Ringen und der
Olefinbildung von THC und NH2 als auch durch
die COO-Gruppen der Proteinaminosäuren erreicht werden. Die resultierenden
Bindungen würden
als "Anker" fungieren, der die
Quervernetzung mit anderen Proteinen initiiert.
- 3. Bei den Zuständen
der Zellalterung und bei den Zuständen, in denen eine willkürliche Quervernetzung beispielsweise
durch eine thermische Verletzung aufgrund von UV-Strahlen auftritt,
würde der
unerwünschte
Prozess durch die Erfindung verhindert werden. THC würde die
unerwünschte
Quervernetzung dadurch verhindern, dass es sich an Amino- und Carboxygruppen
der Proteinaminosäuren
anhängt.
Dies würde
zu einer Wechselwirkung mit der willkürlichen Quervernetzung führen, einem
Mechanismus, der mit einer "Puffer"-Wirkung vergleichbar
ist. Diese "Puffer"-Wirkung würde die
Kettenreaktion effektiv stoppen, die andererseits zur Verschlechterung
der Zellhomeostase, vorzeitiger Zellalterung und vorzeitigem Zelltod
führen würde.
- 4. Die Erfindung hat auch einen unterstützenden Mechanismus bei der
Verhinderung von willkürlicher
Quervernetzung von intrazellulären
Proteinen, die auf den antioxidantischen Eigenschaften von THC beruht,
insbesondere auf der Fähigkeit
der Erfindung, freie Radikale einzufangen. Es wird vorgeschlagen,
dass THC aufgrund seiner antioxidativen Wirkung die Unterbrechung
der elektrischen Ladung von "supergeladenen" Proteinmolekülen erleichtert,
was einer der Gründe
ist, warum die willkürliche
Quervernetzung beschleunigt wird. Dieser kombinierte Mechanismus
der Crossregulin- und antioxidantischen Wirkung ist besonders anwendbar
bei der Verhinderung von "Altersflecken" aufgrund der Bildung
von Lipofuscin und entzündlichen Bedingungen,
wie Psoriasis.
- 5. Die Quelle von Sauerstoffresten in THC für die Bindung an NH2- oder COO-Gruppen, wäre von der Parahydroxygruppe
nicht länger
in Verbindung mit der olefinischen Bindung und von den Hydroxygruppen
der Phenolringe.
- 6. Im Gegensatz zu den Curcumin(oiden)-Verbindung(en) können THC-Molekül(e) freier
rotieren und stellen daher einen besseren Zugang zu den reaktiven
Gruppen für "Anker"- und/oder "Puffer"-Reaktionen dar.
- 7. Dahingegen ist die Erfindung, wie zuvor erwähnt, relativ
inaktiv bei den Zuständen
der Zellphysiologie, ihr Crossregulinmechanismus würde schrittweise
proportional zu dem Grad des Stresses, der auf die Zelle einwirkt
ausgedrückt
werden. Daher würde
der Crossregulinmechanismus von THC im biologischen System von der
Art der verletzenden Wirkung abhängen,
die das biologische System erfährt.
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Verfahren zum Erhalten
von THC:
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Die
Tetrahydrocurcuminoide der Erfindung sind Produkte der chemischen
Reduktion von Curcuminoiden, die aus den Wurzelstöcken von
Curcuma longa, üblicherweise
bekannt als die Gelbwurz, erhalten werden, oder aus jeglicher anderer
geeigneter Pflanze der botanischen Familie Zingiberaceae.
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Der
Stand der Technik lehrt, dass, wenn Curcuminoide, die aus Curcuma
longa erhalten werden, katalytisch reduziert und dann in einem Kristallisationsverfahren
isoliert werden, Tetrahydrocurcumin (THC) ohne Verlust erhalten
wird, aber dass Tetrahydrobisdemethoxycurcumin (THBDC) und Tetrahydrodemethoxycurcurmin
(THDC) mit beträchtlichem
Verlust erhalten werden. Als Ergebnis ist das Verhältnis zwischen
Tetrahydrocurcuminoiden im Vergleich zu dem ursprünglichen
Verhältnis
der Stammverbindungen, den Curcuminoiden beträchtlich verändert. Das Mengenverhältnis der
Curcuminoide ist bevorzugt, weil es mit der optimalen biologischen
Aktivität
der Curcuminoide korreliert. Das U.S. Patent Nr. 5,861,415 beschreibt
Curcuminoide in einem spezifischen und optimalen Verhältnis als
Bioprotektantien, die einen maximal schützenden Effekt auf die lebende
Zelle ausüben.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein neues effizienteres Verfahren zur
Gewinnung von THCs bereit. Dieses Verfahren verhindert den Verlust
von TBDMC und TDMC und stellt eine bioprotektive Zusammensetzung
von THCs bereit.
Kurzer
Abriss des Verfahrens des Standes der Technik zur Herstellung von
THCs
Natürliche Curcuminoide
(95%) | – 100 g |
Aceton | – 1 Liter |
Pd-C
(Katalysator) 5% | – 2,5 g |
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Die
Lösung
von natürlichen
Curcuminoiden wurde in einen Hydrierapparat geladen. Der Katalysator wurde
vorsichtig hinzugefügt
und der Wasserstoffdruck bei ungefähr 2 kg/cm2 gehalten.
Diese Reaktion ist in 3 bis 4 Stunden abgeschlossen. Der Katalysator
wird dann herausgefiltert und entfernt. Die Acetonlösung wird unter
Vakuum konzentriert. Der Rückstand
wird aus Toluolen kristallisiert. Die Tetrahydroverbindungen kristallisieren
als cremefarbiges weißes
Pulver aus, das einen Schmelzpunkt von 92–94°C hat.
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Verfahren
der vorliegenden Erfindung
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Dieses
Verfahren verwendet bei der katalytischen Wasserstofftransferreaktion,
die als Hydridübertragungsreaktion
bekannt ist, eine neue Methode der Sättigung von zwei olefinischen
Bindungen in Curcuminoiden. Es folgt ein Beispiel eines Hydridübertragungsverfahrens.
- 1. Ein 3 Liter-Rundhalskolben mit einem Rührer und
einem Rückflusskühler wird
mit 1 Liter Essigester befüllt;
- 2. Die Lösung
wird mit 200 g natürlichen
Curcuminoiden in einer zuvor beschriebenen bioprotektiven Zusammensetzung,
d.h. Curcumin (C) 70–80%,
Demethoxycurcumin (DMC) 15–20%
und Bisdemethoxycurcumin (BDMC 2,5–6,5%) versetzt und bis zur
Gleichmäßigkeit
bei Raumtemperatur gerührt;
- 3. Diese Mischung wird mit 1 Liter Triethylamin versetzt, gefolgt
von 12 g Palladium auf Kohlenstoff und 80 ml Ameisensäure;
- 4. Die Mischung wurde gerührt
und dann bei 80°C
für 12
Stunden unter Rückfluss
erhitzt;
- 5. Periodisch wurde Ameisensäure
in 5 ml Aliquoten in 2 Stunden-Intervallen zugegeben, während die
Mischung weiter unter Rückfluss
erhitzt wurde;
- 6. Die DC wurde überprüft, um die
Vervollständigung
der Reaktion zu beobachten (System: mit Silika vorbeschichtete 0,25
mm dicke Platten/Chloroform : Methanol = 9 : 1);
- 7. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Reaktionsmischung
auf Raumtemperatur abgekühlt.
Sie wurde dann filtriert, um den Palladium-Katalysator zu entfernen, und mit 50
ml Essigester gewaschen;
- 8. Essigester und Triethylamin wurden abdestilliert (2 Liter
Destillat wurden gesammelt);
- 9. Die Rohmasse wurde dann mit Toluol extrahiert (3 × 500 ml);
- 10. Der Toluolextrakt wurde mit 200 ml von 5% HCl und 3 × 500 ml
Wasser gewaschen und über
Natriumsulfat getrocknet;
- 11. Das Lösungsmittel
wurde unter Vakuum entfernt, um ungefähr 200 g einer blassgelben
Paste zu erhalten.
- 12. Die Paste wurde mit 200 ml Ether verrieben, filtriert und
unter Vakuum getrocknet, um ein blassgelbes Pulver von Tetrahydrocurcuminoiden
zu erhalten, 175 g (70%) Ausbeute.
Test: THC | 75
bis 85% |
THDHC | 10
bis 20% |
THBDMC | 2
bis 4,5% |
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In
einer anderen Variante der Hydridtransferreaktion wurden Curcuminoide
mit Ammoniumformat oder Natriumdihydrogenphosphit (als katalytisches
Wasserstoffübertragungsreagenz)
in Gegenwart von Pd/C und Essigsäure
behandelt. Die Reduktion ist in 20 bis 30 Minuten bei 100 bis 110
Grad Celsius abgeschlossen. Dieses Verfahren ergibt 50% Tetrahydrocurcuminoide.
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THC
kann in einem geeigneten Vehikel oder mit einer Anwendungsvorrichtung,
z.B. einem transdermalen Pflaster, in einer Konzentration von 0,025%
bis 5%; in der Form von subkutanen Injektionen oder einem transdermalen
Pflaster von 0,025% bis 5% topisch verabreicht werden; oder in einer
oral verabreichten Dosierungsform in einer Konzentration von 5 mg
bis 500 mg pro Dosis oder 0,083–8,3
mg/kg des Körpergewichts. THC
ist geeignet für
die Verwendung am Menschen und am Tier.
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Andere
Verabreichungsvehikel schließen
ein, aber sind nicht beschränkt
auf: Aerosol oder andere Vorrichtungen zur Abgabe an die Lungen,
Nasensprays, intravenös,
intramuskulär,
intraperitoneal, intrathekal, vaginal und rektal. Arzneiträger, die
als Vehikel zur Abgabe des Phagen geeignet sind, sind dem Fachmann
offensichtlich.
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Zusammensetzungen
von Tetrahydrocurcuminoiden für
die topische Anwendung sollten im Wesentlichen farblos sein. Der
Begriff "im Wesentlichen
farblos" soll bedeuten,
dass die Zusammensetzung keine Farbe enthält oder solch eine geringe
Menge an Farbe enthält,
dass die Zusammensetzung bei topischer Verabreichung die Haut nicht
verfärbt.
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Der
Begriff "farbentferntes
Curcumin" bezieht
sich auf die tetrahydrocurcuminoide Mischung gemäß der vorliegenden Erfindung.
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THC-Molekül, das als "Anker" für Aminosäuren von
Proteinen wirkt, um Proteinquervernetzungen zu initiieren. Dieser
Mechanismus würde
zu den physiologischen Quervernetzungen beitragen.
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Legende:
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THC-Molekül, das als
Puffer wirkt, zur Verhinderung von willkürlicher Quervernetzung aufgrund
von UV bewirkten Quervernetzungen. Dieser Mechanismus würde zu der
Vorbeugung von pathologischen Quervernetzungen beitragen.
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Legende:
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EINFÜHRUNG
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Die
Studie wurde entwickelt, um die akute orale Toxizität von farbentferntem
Curcumin auf Sprague Dawley Ratten zu bestimmen. Die Richtlinien,
nach denen vorgegangen wurde, wurden durch das Gaitonde Committee
Guidelines, CIB, New Delhi vorgeschrieben. PROJEKT
NR. 4952 MATERIALIEN
UND METHODEN TESTSUBSTANZ:
Sponsor
: | Sami
Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore. |
Bezeichnung
auf der Probe: | Farbentferntes
Curcumin
Charge Nr. – CRC/65
A
R Nr. – BL8C
0445 |
Beschreibung: | cremeweißes kristallines
Pulver |
Identifizierung: | IR
Spektrum: erfüllt |
Löslichkeit: | löslich in
Methanol |
Reinheit
gemäß HPLC: | 99,0% |
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PROJEKT NR. 4952
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
jetzt berichtete Studie wurde entwickelt, um die akute orale Toxizität von farbentferntem
Curcumin bei Sprague Dawley Ratten zu bestimmen. Die in Maiskeimöl suspendierte
Substanz wurde auf dem oralen Weg an die Ratten verabreicht. Die
Ratten wurden 14 Tage lang nach der Behandlung auf Symptome hin
beobachtet, die mit dem Produkt zusammenhängen könnten. Die Testsubstanz verursachte
Speichelfluss bei allen Tieren und Polyharnstoff bei zwei Tieren
mit einem Anfall nach zwei Stunden nach der Behandlung. Alle Tiere überlebten
während
der Studiendauer von 14 Tagen und waren 24 Stunden nach der Behandlung
frei von Vergiftungserscheinungen.
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Es
wurde gefunden, dass der LD
50-Wert von farbentferntem
Curcumin bei Ratten bei dem oralen Weg größer als 5000 mg/kg ist. TESTSYSTEM
Spezies: | Ratte |
Stamm: | Sprague
Dawley |
Quelle: | I.
I. T. Animal house |
Geschlecht: | männlich und
weiblich |
Alter: | 6
bis 8 Wochen |
Gewichtsbereich: | 120,5
bis 141,9 g |
Zahl
der Tiere pro Dosis: | 5
pro Geschlecht |
Randomisierung: | wahllos
ausgewählt
aus Gruppen von fünf
des gleichen Geschlechts zu der Zeit, zu der die Studie begonnen
wurde. |
Akklimatisierung: | wurde
nicht durchgeführt,
da die Tiere in demselben Institut gezüchtet und aufgezogen wurden. |
Identifizierung
der Tiere: | durch
Käfignummer
und individuelle Markierung auf dem Fell. |
Ernährung: | pelletiertes
Futter, das durch Nav Maharashtra Chakan Oil Mills Ltd., Pune bereitgestellt
wurde. |
Wasser: | Aquagard
reines Wasser in Glasflaschen nach Belieben. |
Management: | Jeweils
5 Ratten desselben Geschlechts wurden in Polypropylenkäfigen, die
mit einem Strohboden ausgestattet waren, untergebracht.
Die
Temperatur wurde zwischen 20 und 24°C gehalten und die relative
Luftfeuchtigkeit zwischen 50 und 60%; es wurde jeweils ein Zyklus
von 12 Stunden Dunkelheit und Helligkeit aufrechterhalten. |
Weg: | mündliche
Sondenernährung |
Benutztes
Vehikel: | Maiskeimöl |
Dosierungsvolumen: | 10
ml/kg |
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EXPERIMENTELLES
VERFAHREN
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Die
in Maiskeimöl
suspendierte Testsubstanz wurde jeweils einmal durch orale Sondenernährung an die
Ratten beiderlei Geschlechts verabreicht. Die Ratten wurden 16 Stunden
vor und 2 Stunden nach der Verabreichung der Testsubstanz ausgehungert.
Die Tiere wurden 14 Tage lang nach der Dosierung hinsichtlich toxischer
Symptome und Sterblichkeit betreffend das Produkt beobachtet. Bei
Tieren, die während
der Beobachtungsperiode starben, wurde eine Nekropsie durchgeführt. Am
Ende der Beobachtungsperiode wurden die überlebenden Testtiere getötet, seziert
und hinsichtlich großer
pathologischer Abnormalitäten,
wenn überhaupt,
geprüft.
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LD50 bei
Ratten
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Zehn
Ratten (5 männliche
und 5 weibliche) wurden der Behandlung wie folgt unterzogen.
PROJEKT
NR. 4952 ERGEBNISSE LD
50 bei Ratten
- Symptome:
Gruppe 1 – Bei allen
Tieren wurde Speichelfluss und bei zwei Tieren wurde Polyharnstoff
beobachtet, wobei der Ausbruch 2 Stunden nach der Behandlung erfolgte.
Alle Tiere überlebten
während
der Studiendauer von 14 Tagen und waren 24 Stunden nach der Behandlung
frei von Vergiftungserscheinungen.
- Ergebnisse der Nekropsie: Mit dem bloßen Auge konnten keine bedeutenden Änderungen
gesehen werden.
- LD50: Größer als 5000 mg/kg.
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PROJEKT NR. 4953
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ZUSAMMENFASSUNG
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Die
Studie wurde entwickelt, um das primäre Hautreizungspotenzial von
farbentferntem Curcumin zu bestimmen, das von Sami Chemicals and
Extracts Ltd., Bangalore zur Verfügung gestellt wurde. Die Testsubstanz
wurde in einer Menge von 500 mg auf geschorener Rückhaut,
sowohl auf der intakten als auch auf der aufgescheuerten Seite,
bei drei Kaninchen pro Geschlecht angewandt. Jeder Ort der Anwendung
wurde sorgfältig
beobachtet und die Reaktion nach der Methode von Draize bei 24 und
72 Stunden ausgewertet.
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Farbentferntes
Curcumin verursachte keine Hautreizung bei Kaninchen.
Primärer Hautreizungswert
= 0,00. PROJEKT
NR. 4953 MATERIALIEN
UND METHODEN TESTSUBSTANZ:
Sponsor: | Sami
Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore |
Bezeichnung
auf der Probe: | Farbentferntes
Curcumin
Charge Nr. – CRC/65
A
R Nr. – BL8C
0445 |
Beschreibung: | cremeweißes kristallines
Pulver |
Identifizierung: | IR
Spektrum: entspricht den Anforderungen |
Löslichkeit: | löslich in
Methanol |
Reinheit
durch HPLC: | 99,0% |
TESTSYSTEM
Spezies: | Kaninchen |
Stamm: | New
Zealand Weiß |
Quelle: | Serum
Institute of India Ltd., Pune. |
Geschlecht: | männlich und
weiblich |
Alter: | gesunde
Erwachsene |
Gewichtsbereich: | 2,00
bis 2,40 kg |
Nr.
an Tieren pro Dosis: | 3
pro Geschlecht |
Randomisierung: | wahllos
ausgewählt
aus Gruppen von drei des gleichen Geschlechts zur Zeit des Beginns
der Studie. |
Akklimatisierung: | eine
siebentägige
Periode zur Behandlung. |
Identifizierung
der Tiere: | durch
die Käfignummer
und individuelle Markierung. am Ohr. |
Ernährung: | pelletiertes
Futter, das von Nav Maharashtra Chakan Oil Mills Ltd., Pune bereitgestellt
wurde. |
Wasser: | Aquaguard
reines Wasser in Glasflaschen nach Belieben. |
Management: | Die
Kaninchen wurden jedes einzeln in rostfreien Stahlkäfigen mit
Edelstahlgitterboden untergebracht. Die Temperatur wurde zwischen
20 und 23°C
gehalten und die relative Luftfeuchtigkeit zwischen 50 und 60%;
es wurde ein Zyklus von jeweils 12 Stunden Dunkelheit und Helligkeit
aufrechterhalten. |
Weg: | dermal |
Dosisvolumen: | 500
mg/Ort. |
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EXPERIMENTELLES
VERFAHREN
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Für diese
Studie wurden drei Kaninchen pro Geschlecht verwendet. Auf beiden
Seiten wurde das Haar durch eine elektrische Haarschneidemaschine
einen Tag vor der Behandlung entfernt. Die Testsubstanz wurde mit
einer Menge von 500 mg auf die intakten und abgeriebenen Hautstellen
jedes Testtiers aufgetragen. Dabei wurde besonders darauf geachtet,
dass die Abschürfungen
durch das Stratum corneum, aber nicht durch die Haut dringen. Ein
Gazeflicken wurde über
jedem behandelten Gebiet durch Klebeband gesichert. Die Tiere wurden
einzeln mit einer Plastikmanschette um ihren Nacken für 24 Stunden
untergebracht, um die Nahrungsaufnahme der Testsubstanz zu vermeiden.
Das Pflaster und die nicht absorbierte Testsubstanz wurden nach 24
Stunden entfernt. Jede Stelle der Anwendung wurde sorgfältig beobachtet
und die Reaktion nach der Methode von Draize bei 24 und 72 Stunden
ausgewertet. Draize
Evaluierung von Hautreaktionen – Einstufung
der Hautreaktion 1.
Erythema und Eschar Bildung
Kein
Erythema | 0 |
Sehr
leichtes Erythema (kaum wahrnehmbar) | 1 |
Gut
definiertes Erythema | 2 |
Gemäßigtes bis
schweres Erythema | 3 |
Schweres
(Beetröte)
bis leichtes Erythema | |
Escharbildung
(Verletzung in der Tiefe) | 4 |
Maximal mögliche
Erythemae Bewertung: 4 2.
Bildung von Ödemen
Keine Ödeme | 0 |
Sehr
leichte Ödeme
(kaum wahrnehmbar) | 1 |
Leichte Ödeme (Umrandung
des Gebietes, definiert durch deutliche Erhebung) | 2 |
Gemäßigte Ödeme (mehr
als 1 mm erhaben) | 3 |
Schwere Ödeme (mehr
als 1 mm erhaben und sich erstreckend über das Gebiet der Anwendung
hinaus) | 4 |
Maximal mögliche Ödem Bewertung:
4 ERGEBNISSE Zusammenfassung
der individuellen dermalen Reizung nach der Anwendung von farbentferntem
Curcumin bei Kaninchen.
Primärer
Hautreizungswert 0,00/4 = 0,00
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PROJEKT NR. 4953
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SCHLUSSFOLGERUNG
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Auf
Basis der vorliegenden Studie wurde geschlossen, dass die Testsubstanz
farbentferntes Curcumin, die durch Sami Chemicals and Extracts Ltd.,
Bangalore bereitgestellt wurde, bei Kaninchen keine Hautreizung
auslöst.
Erste
Hautreizungszahl: 0,00. Radikalfängereffekt
von Curcumin und seiner Derivate auf den 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl-Rest
- *NTC: natürlich; STC: synthetisch.
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Effekt
der topischen Anwendung von Curcumin und Tetrahydrocurcumin auf
Ultraviolett-B lichtinduzierte Bildung von Thymindimeren in Mausepidermis
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Weibliche
SKH-1 Mäuse
(8–9 Wochen
alt) wurden topisch mit 100 μl
Aceton behandelt oder einer Testverbindung in 100 μl Aceton
behandelt. Fünf
Minuten später
wurden die Mäuse
mit einer einzelnen Dosis von UVB (30 mJ/cm2)
bestrahlt. Die Mäuse
wurden eine Stunde später
getötet
und die Hautproben wurden in einer 10%igen Formalin-Phosphatpuffer-Lösung für den Thymindimertest
aufbewahrt.
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Effekt
von UVB-induzierter Bildung von Hautsonnenbrandzellen in der Mausepidermis
-
Weibliche
Sencar-Mäuse
wurden mit UVB (60 mJ/cm2) bestrahlt. Die
Mäuse wurden
topisch mit 100 μl
Aceton oder einem Inhibitor in 100 μl Aceton 5 Minuten vor der UVB-Einstrahlung
behandelt. Acht Stunden später
wurden die Mäuse
getötet
und die Hautproben wurden entfernt und in einer 10%igen Formalinphosphatpuffer-Lösung für den Sonnenbrandzellentest
aufbewahrt.