PT1171144E - Utilização de tetra-hidrocurcuminóides para regular eventos fisiológicos e patológicos na pele e mucosa - Google Patents

Description

ΕΡ 1 171 144 /PT DESCRIÇÃO "Utilização de tetra-hidrocurcuminóides para regular eventos fisiológicos e patológicos na pele e mucosa"

Antecedentes do invento

Uma célula do corpo deve o seu funcionamento em grande parte ao seu citoesqueleto, a estrutura da célula. 0 citoesqueleto é formado por componentes no citoplasma que mantêm a forma da célula, estabilizam a ligações das células às células vizinhas, e facilita as funções das células especializadas, tais como a endocitose, exocitose e motilidade celular. 0 citoesqueleto inclui várias estruturas filamentosas, tais como microtúbulos, microfilamentos, filamentos intermédios e reticulado microtrabecular. As proteínas que participam na formação de um citoesqueleto, especialmente proteínas associadas a microtúbulos (MAPS) após terem sido produzidas pela célula, são ainda adaptadas à função do citoesqueleto num processo designado por modificação ou reticulação. Este processo de reticulação de proteínas é essencial para estabilizar o citoesqueleto, o evento necessário para manter a homeostase celular, processos fisiológicos e o desenvolvimento e a maturação celular. A modificação pós-translacional de proteínas envolve várias reacções químicas. A fosforilação das proteínas exemplifica um dos mecanismos mais comuns de modificação por pós-translação de proteínas celulares. Outros exemplos incluem metilesterificação das proteínas, ribosilação de ADP, glicosilação de proteínas, acetilação de histona, formação de hipusina e reacções catalisadas com transglutaminase. 0 potencial eléctrico de uma célula é um aspecto da fisiologia celular importante para a compreensão do mecanismo do invento. 0 potencial eléctrico de uma célula é mantido através de um equilíbrio complexo entre moléculas negativamente e positivamente carregadas que resulta num potencial em repouso fisiológico, dentro da célula, de aproximadamente -70 mV. Este valor é indicativo do bem-estar das células. Por outro lado, a incapacidade de uma célula 2

ΕΡ 1 171 144 /PT manter um potencial em repouso óptimo ocorre em condições patológicas, e.g. ataques físicos ou químicos, um processo de doença e o uso e desgaste devido ao envelhecimento. 0 potencial em repouso óptimo é condutor em relação aos processos fisiológicos incluindo a modificação de proteínas pós-translacional e reticulação. É também verdade que a reticulação fisiológica intacta de proteínas é indicativa da capacidade de uma célula de manter um potencial eléctrico em repouso óptimo.

Efeitos positivos da reticulação A reticulação de proteínas, tal como foi previamente mencionado, é um resultado da modificação pós-translacional das proteínas. Algumas das reticulações mais comuns identificadas nas proteínas que formam o citoesqueleto são a Neee-(ggg-glutamil)lisina e a Ν,Ν-bis(gggglutamil)poliamina. A formação destes dois tipos de reticulações é facilitada pela actividade catalítica de um grupo de enzimas conhecidos como transglutaminases. Uma das transglutaminases bem conhecidas no corpo é o Factor XIII de coagulação de proteínas. Este factor provoca a reticulação da fibrina, que actua como um agente estabilizante na formação do coágulo sanguíneo. Este tipo de modificação é um exemplo de um mecanismo de salvamento de vida com base na reticulação de proteínas, que evita uma perda grave de sangue num corte ou numa ferida.

As transglutaminases são responsáveis por facilitar um processo fisiológico de reticulação de proteínas que, em condições normais, conduz à diferenciação de células e, deste modo, a célula é capaz de satisfazer o seu fim, e.g. célula de secreção de muco, célula fagocítica, célula epitelial e do tegúmen que protege a estrutura do tecido. A actividade da transglutaminase, ou a sua ausência, desempenha um papel crítico na diferenciação das células cancerígenas, especialmente no melanoma cancerígeno da pele. 0 melanoma é um cancro que se espalha rapidamente consistindo de células da pele indiferenciadas, e o grau de fraca diferenciação celular correlaciona-se bem com a actividade suprimida da transglutaminase. Por outro lado, a indução experimental da actividade da transglutaminase 3

ΕΡ 1 171 144 /PT conduz a resultados prometedores no abrandamento ou na reversão da progressão do melanoma. Exemplos de indutores de transglutaminase são o ácido retinóico e as metilxantinas. Parece que o potencial terapêutico dos retinóides no melanoma está relacionado com a sua capacidade de activar as transglutaminases intracelulares.

Reticulação nociva A reticulação de proteínas intracelulares não é, contudo, sempre um evento positivo. Quando uma reticulação aleatória e massiva é precipitada por um estímulo abrupto não fisiológico, acontece um envelhecimento acelerado das células. Devido à natureza da reticulação aleatória, que desafia o propósito da organização e a diferenciação celular, esta pode conduzir não apenas a um envelhecimento e morte prematuros da pele, mas pode conduzir também a uma patologia incluindo malignidade. Por exemplo, os radicais livres gerados pelos raios UVA nas células da pele podem provocar reticulação prematura das proteínas e a libertação de enzimas proteolíticos. Este último evento conduz à destruição do citoesqueleto e à rápida deterioração da organização celular que compromete o funcionamento celular.

Tem interesse especial mencionar aqui o termo lipofuscina, com a alcunha de "o pigmento do envelhecimento" ou "manchas da velhice", que ocorrem na epiderme e membranas da mucosa, provavelmente como resultado da quebra do metabolismo celular e sistémico. Tem sido demonstrado que a lipofuscina resulta da degeneração oxidativa das mitocôndrias e/ou lisossomas nas células. A lipofuscina é postulada como sendo um resultado de um erro metabólico que resulta em hipoanabolismo combinado com hipercatabolismo. É aqui postulado que a formação de lipofuscina é, em parte, uma manifestação do processo quebrado de modificação da proteína pós-translacional, e que este processo se intensifica com qualquer processo de doença sistémica, incluindo o processo de envelhecimento.

Arte relacionada

Tal como previamente mencionado, as transglutaminases são responsáveis por facilitar o processo fisiológico da 4

ΕΡ 1 171 144 /PT reticulação das proteínas que, sob condições normais, conduz a diferenciação celular, maturação e envelhecimento de acordo com o tempo. Existe uma evidência considerável de que a actividade da transglutaminase intracelular pode ser iniciada em certas patologias, por exemplo, malignidade, e.g. melanoma. Parece que o potencial terapêutico dos indutores de transglutaminase, tais como os retinóides e as metilxantinas no melanoma está relacionado com a sua capacidade de activar as transglutaminases intracelulares. Isto, por seu lado, conduziria a diferenciação das células, que na prática clínica conduziria a um abrandamento do processo de doença devido a uma diminuição no número de células malignas indiferenciadas.

Os derivados de curcumina, incluindo a tetra-hidrocurcumina e curcuminóides são bem conhecidos da literatura como um grupo de antioxidantes fenólicos (Majeed et al. "Curcuminoid book"). Majeed et al, na Patente U.S. N.° 5861415 estabeleceram que a combinação de curcuminóides naturais isolados a partir da raiz de açafrão, i.e. curcumina, desmetoxicurcumina e bisdesmetoxicurcumina produzem uma larga gama de protecção antioxidante descrita como acção bioprotectora. A acção bioprotectora, caracterizada pela prevenção da formação de radicais livres e intervenção na eliminação de radicais livres, é exercida pela(os) tetra-hidrocurcumina(óides) (THC) assim como pela(os) curcumina(óides) (Majeed et al., Tumeric and the Healing Curcuminoids, Keats Publications 1996 e Majeed et al., Curcuminoids Antioxidant Phytonutrients, NutriScience Publishers 1995). Contudo, a(os) tetra-hidrocurcumina(óides) apresentam propriedades de eliminação de radicais livres superiores em comparação com a curcumina ou os curcuminóides (Majeed et al., "Curcuminoid book"). Outra vantagem dos tetra-hidrocurcuminóides é que estes não são curcuminóides tão altamente coloridos e, deste modo, podem ser aplicados tipicamente sem manchamento significativo.

Recentemente verificou-se que a curcumina, mas não a tetra-hidrocurcumina, possuía um efeito preventivo na reticulação do colagénio em ratazanas diabéticas. (Sajithal GB, Chithra P, Chandrajasan G., Biochem Pharmacol. 1998 Dez 15;56(12):1607-14) . Contudo, o efeito anti-reticulação da 5

ΕΡ 1 171 144 /PT curcumina foi atingido com uma dose oral muito elevada do composto (200 mg/kg de peso corporal). Verificou-se também que o efeito preventivo da curcumina na reticulação avançada do colagénio era mais pronunciado do que o seu efeito terapêutico. Os autores deste estudo explicaram que o mecanismo de anti-reticulação da curcumina é devido à eliminação dos radicais livres, que por seu turno previne a reticulação acelerada do colagénio na diabetes. Este estudo suporta a utilização de curcumina para evitar, e em algum grau tratar, a reticulação excessiva das proteínas em condições caracterizadas pela reticulação acelerada, tal como a diabetes.

Descrição do invento 0 invento é adequado para um método para tratar um estado pré-maligno num doente compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma mistura de tetra-hidrocurcuminóides a um doente que sofra de um estado pré-maligno ou de malignidade, em particular para um método em que a referida malignidade é o melanoma.

Por isso, um aspecto do invento é a utilização de uma quantidade eficaz de uma mistura de tetra-hidrocurcuminóides para a produção de um medicamento para tratar o melanoma. O invento é também adequado para um método para reduzir "manchas da idade" devidas à formação de lipofuscina num doente que necessite de tal tratamento, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de uma mistura compreendendo 75-85% de tetra-hidrocurcumina, 10-20% de tetra-hidrodesmetoxicurcumina e 2,0-4,5% de tetra-hidrobis-desmetoxicurcumina ao referido doente, em particular para um método em que a referida composição é administrada topicamente.

Em consequência, um outro aspecto do invento é a utilização de uma quantidade eficaz de uma mistura de tetra-hidrocurcuminóides para a produção de um medicamento para o tratamento das manchas da idade devidas à formação de lipofuscina. 6

ΕΡ 1 171 144 /PT Ο mecanismo do invento é o de preservar a homeostase e o funcionamento das células com base no seu efeito regulador, quer inibidor quer estimulante, relativamente à reticulação de proteínas intracelulares. Este mecanismo regulador, previamente desconhecido para a curcumina e os seus derivados, não está também relacionado com as bem investigadas e descritas propriedades antioxidantes da(os) curcumina(óides) e tetra-hidrocurcumina(óides). Esta é uma nova via para se alcançar um amplo efeito regulador nos processos biológicos. Um efeito regulador comparável da reticulação das proteínas no organismo não foi previamente descrito com qualquer composto único ou com produtos compostos. Na sua essência, a mistura do invento difere de outros compostos que afectam o processo de reticulação pelo facto de que os compostos previamente descritos estimularão ou inibirão a reticulação intracelular, enquanto que o a mistura do invento actuará como modificador da reticulação (CLM) ou "regulador da reticulação". Estes termos são aqui utilizados pela primeira vez para descrever o mecanismo do invento. 0 CLM ou o regulador da reticulação indica que uma composição do presente invento exerce uma influência positiva na modificação das proteínas pós-translacional e no processo de reticulação em condições fisiológicas a patológicas semelhantes. 0 efeito CLM da mistura do invento é conseguido utilizando uma composição específica do produto, tal como descrito na secção "Processo de Obter THC". 0 mecanismo ocorre também com modificações da molécula de THC, por exemplo, éter-THC, éter trimetílico-THC, éter dimetílico-THC, éter benzílico-THC e sais de potássio, magnésio e cobre de THC. Demonstrou-se que o mecanismo do invento em condições experimentais in vivo prevenia a queimadura por UV e a reticulação (percentagem de células do dímero de timina) nas células de pele expostas a radiação UV. As propriedades biológicas da mistura do invento foram comparadas com as dos curcuminóides e apesar do facto de a presente composição ser desprovida de cor amarela esta ainda produz efeitos protectores contra os raios UV comparáveis aos dos curcuminóides amarelos. Esta actividade parece ser diferente dos efeitos antioxidantes característicos do THC e dos curcuminóides. 7

ΕΡ 1 171 144 /PT Ο seguinte descreve o mecanismo do invento com detalhe 1. É proposto que em estados fisiológicos caracterizados por modificação de proteínas pós-translacional óptima, reticulação das proteínas assim como o potencial eléctrico óptimo das células, o THC não interferirá com os estados atrás exemplificados de bem-estar celular. 2. Contudo, nos estados caracterizados por uma fraca diferenciação morfológica e funcional das células, e.g. estados pré-malignos ou malignidades, o THC contribuirá para a modificação pós-translacional e reticulação das proteínas e optimização do potencial eléctrico das células. Isto será conseguido por interacção entre os anéis fenólicos e ligações olefínicas do THC e NH2 assim como de grupos COO dos aminoácidos da proteína. As ligações resultantes actuarão como uma "âncora" que iniciará a reticulação com outras proteínas. 3. Nos estados de envelhecimento celular e nos estados em que a reticulação aleatória é precipitada por uma influência térmica devida à acção dos raios UV, por exemplo, o processo indesejado será evitado pelo invento. O THC evitará a reticulação indesejada ligando-se aos grupos amino e carboxi dos aminoácidos das proteínas. Isto resultará na interferência da reticulação aleatória, um mecanismo comparável a uma acção de "tamponamento". Esta acção de "tamponamento" parará eficazmente a reacção em cadeia que, de outro modo, conduziria à deterioração da homeostase das células, envelhecimento prematuro e morte prematura das células. 4. 0 invento possui também um mecanismo de suporte na prevenção da reticulação aleatória de proteínas intracelulares que é baseada nas propriedades antioxidantes do THC, especialmente na capacidade do invento de eliminar os radicais livres. É proposto que devido a esta acção antioxidante seria facilitada a disrupção das cargas eléctricas das moléculas de proteínas "supercarregadas", que é uma das razões pelas quais a reticulação aleatória é acelerada. Este mecanismo combinado de regulação da reticulação e da acção antioxidante é particularmente 8

ΕΡ 1 171 144 /PT aplicável na prevenção das "manchas da idade" devidas à formação da lipofuscina, e condições inflamatórias, tais como a psoriase. 5. A fonte das porções de oxigénio no THC para ligação aos grupos NH2 e COO será o grupo para-hidroxi que já não está em conjugação com a ligação olefinica e os grupos hidroxi dos anéis fenólicos. 6. Ao contrário do(s) composto(s) curcumina(óides), a(s) molécula(s) de THC podem rodar mais livremente, proporcionando deste modo, um melhor acesso aos grupos reactivos para reacções de "ancoramento" e/ou "tamponamento". 7. Considerando que, tal como previamente mencionado, a mistura do invento é relativamente inactiva nos estados da fisiologia da célula, o seu mecanismo de regulação da reticulação será gradualmente expresso proporcionado em relação ao grau de estresse a que a célula está sujeita. Deste modo, o mecanismo de regulação do THC no sistema biológico dependerá do tipo de acção dos danos experimentados no sistema biológico.

Processo para a obtenção do THC

Os tetra-hidrocurcuminóides do invento são produtos da redução química dos curcuminóides, obtidos a partir dos rizomas de Curcuma longa, correntemente conhecido como açafrão ou qualquer outra planta adequada da família das Zingiberáceas. A arte precedente ensina-nos que quando os curcuminóides obtidos a partir da Curcuma longa são cataliticamente reduzidos e então isolados no processo de cristalização, a tetra-hidrocurcumina (THC) é recuperada sem perdas, mas com perdas substanciais de tetra-hidrobisdesmetoxicurcumina (THBDC) e tetra-hidrodesmetoxicurcumina (THDC). Como resultado, a razão entre os tetra-hidrocurcuminóides é significativamente alterada em comparação com a razão original dos compostos de partida, curcuminóides. A razão de curcuminóides é preferida porque se correlaciona com a actividade biológica óptima dos curcuminóides. A patente 9

ΕΡ 1 171 144 /PT U.S. N.° 5861415 descreve curcuminóides numa razão específica e óptima como Bioprotectores, proporcionando um efeito protector máximo da célula viva. 0 presente invento proporciona um método novo, mais eficiente, de recuperação de THCs. Este processo evita a perda de TBDMC e TDMC e proporciona uma composição Bioprotectora de THCs. THCurcuminóides % teor da arte % teor do precedente invento Tetra-hidrocurcuminóides 90 75-85 Tetra-hidrodesmetoxicurcumina 9 10-20 Tetra-hidrobisdesmetoxicurcumina 1 2-4, 5

Breve resumo do processo da arte anterior para produzir THC

Curcuminóides naturais (95%) - 100 g

Acetona - 1 litro

Pd-C (catalisador) 5% - 2,5 g A solução de curcuminóides naturais foi carregada para o hidrogenador. O catalisador foi cuidadosamente adicionado e a pressão de hidrogénio foi mantida a cerca de 2 kg/cm2. Esta reacção completa-se em 3 a 4 horas. O catalisador é então removido por filtração. A solução de acetona é concentrada sob vácuo. O resíduo é cristalizado a partir de toluenos. Os compostos tetra-hidro são cristalizados sob a forma de um pó branco cremoso possuindo um ponto de fusão de 92-94 °C.

Processo do presente invento

Este processo utiliza um novo método de saturação de duas ligações olefínicas em curcuminóides na reacção catalítica de transferência de hidrogénio conhecida como reacção de transferência de hidreto. A seguir é apresentado um exemplo de um método de transferência de hidreto. 1. Um balão de fundo redondo de 3 litros com um agitador e um condensador de refluxo é carregado com 1 litro de acetato de etilo; 10

ΕΡ 1 171 144 /PT 2. A solução é carregada com 250 g de curcuminóides naturais numa composição Bioprotectora previamente descrita, i.e. curcumina (C) 70-80%, Desmetoxicurcumina (DMC) 15-20% e Bisdesmetoxicurcumina (BDMC) 2,5-6,5% e agita-se até se obter uniformidade à temperatura ambiente; 3. Esta mistura é carregada com 1 litro de trietilamina seguida de 12 g de paládio sobre carbono e 80 ml de ácido fórmico; 4. A mistura foi agitada e subsequentemente refluxada a 80 graus Celsius durante 12 horas; 5. Periodicamente foi carregado ácido fórmico em aliquotas de 5 ml com intervalos de 2 horas enquanto o refluxo estava a ser realizado; 6. O TLC verificado para monitorizar a conclusão da reacção. (sistema: placas com um espessura de 0,25 mm pré-revestidas de silica/clorofórmiormetanol = 9:1); 7. Após a reacção se ter completado, a mistura reaccional foi arrefecida até à temperatura ambiente. Esta foi filtrada para remover o catalisador de paládio e lavou-se com 50 ml de acetato de etilo; 8. O acetato de etilo e a trietilamina foram removidos por destilação (foram recolhidos 2 litros de destilado); 9. A massa em bruto foi então extractada com tolueno (3 χ 500 ml); 10. O extracto de tolueno foi lavado com 200 ml de HC1 5% e 3 χ 500 ml de água e secou-se com sulfato de sódio; 11. O solvente foi removido sob vácuo para se obter uma pasta amarela pálida, com aproximadamente 200 g. 12. A pasta foi amassada com 20 ml de éter, filtrada e seca sob vácuo para se obter um pó amarelo pálido de tetra-hidrocurcuminóides, originando 175 g (70%). 11

ΕΡ 1 171 144 /PT

Ensaio: THC 75 a 85% THDHC 10 a 20% THBDMC 2 a 4,5%

Noutra variação da reacção de transferência de hidreto, os curcuminóides foram tratados com formato de amónio ou di-hidrogenofosfito de sódio (como reagente de transferência de hidrogénio catalítico) na presença de Pd/C e ácido acético. A redução completa-se em 20 a 30 minutos a 100 a 110 graus Celsius. Este método gera 50% de tetra-hidrocurcuminóides. O THC pode ser administrado topicamente num veículo adequado ou com um dispositivo de aplicação, e.g. um emplastro transdérmico, numa concentração variando de 0,025% a 5%; sob a forma de injecções subcutâneas ou um emplastro transdérmico numa concentração variando de 0,025% a 5%; ou numa forma de dosagem administrada oralmente com uma concentração variando de 5 mg a 500 mg por dose ou de 0, 083-8,3 mg/kg de peso corporal. O THC é adequado para utilização em humanos e em animais.

Outras vias de administração incluem, mas não estão limitadas a: dispositivos em aerosol ou outros para administração a pulmões, pulverização nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, vaginal e rectal. Excipientes que podem ser utilizados como veículo de administração do fago tornar-se-ão evidentes para os especialistas na matéria.

Composições de tetra-hidrocurcuminóides para administração tópica devem ser essencialmente sem cor. O termo "essencialmente sem cor" pretende significar que a composição não contém cor ou tem uma tão pequena quantidade de cor que a composição não mancha a pele por aplicação tópica. O termo "curcumina com a cor removida" refere-se à mistura de tetra-hidrocurcuminóides de acordo com o presente invento. 12

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Molécula de THC actuando como "âncora" para aminoácidos de proteínas, para iniciar as reticulações das proteínas. Este mecanismo contribuirá para a reticulações fisiológicas.

Legenda: aminoácido/proteína

Molécula de THC actuando como tampão na prevenção das reticulações aleatórias em reticulações precipitadas por UV. Este mecanismo contribuirá para a prevenção de reticulações patológicas.

INTRODUÇÃO 0 estudo foi projectado para determinar a toxicidade oral aguda da Curcumina a que se Removeu a Cor em ratazanas

Sprague Dawley. As linhas orientadoras seguidas foram as 13

ΕΡ 1 171 144 /PT prescritas nas Gaitonde Committe Guidelines, CIB, Nova Deli. PROJECTO N.a 4952

MATERIAIS E MÉTODOS

SUBSTÂNCIA DE TESTE

Fornecedor: Sami Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore

Identificação da Curcumina a que se Removeu a Cor amostra: Lote N.° - CRC/65 A R N.° - BL8C 0445

Descrição: Pó cristalino branco cremoso

Identificação: Espectro no IV: Conforme

Solubilidade: Solúvel em metanol

Pureza por HPLC: 99,0%_

SUMÁRIO O estudo agora relatado foi projectado para determinar a toxicidade oral aguda da Curcumina a que se Removeu a Cor em ratazanas Sprague Dawley. A substância de teste suspensa em óleo de milho foi administrada por via oral a ratazanas. As ratazanas foram observadas durante 14 dias após tratamento em relação aos sintomas relacionados com o produto. A substância de teste provocou salivação em todos os animais e poliureia em dois animais com inicio 2 horas após tratamento. Todos os animais sobreviveram ao longo do estudo de 14 dias e estavam livres de sinais de intoxicação 24 horas após tratamento.

Verificou-se que o valor de LD50 da Curcumina a que se Removeu a Cor em ratazanas por via oral era superior a 5000 mg/kg.

SISTEMA DE TESTE

Ratazana Sprague Dawley Sala de animais do I.I.T. Machos e Fêmeas 6 a 8 semanas 120,5 a 141,9 gramas 5 por sexo

Espécie:

Raça:

Origem:

Sexo:

Idade:

Gama de peso: N.° animais por dose: 14

ΕΡ 1 171 144 /PT 14 ΕΡ 1 171 144 /PT Selecção:

Aclimatação:

Identificação dos animais: Dieta: Água: Gestão:

Via: Veiculo utilizado Volume de dose:

Seleccionados aleatoriamente em grupos de cinco do mesmo sexo na altura do inicio do estudo Não efectuada dado que os animais foram reproduzidos e criados no mesmo Instituto

Por número de gaiola e marcação individual na pele

Ração em peletes fornecida pela Nav Maharashtra Chakan Oil Mills Ltd. Água pura Aquaguard em garrafas de vidro ad libitum

As ratazanas foram colocadas, 5 de cada do mesmo sexo, em gaiolas de propileno proporcionadas com uma cama de casca de cereais. A temperatura foi mantida entre 20 e 24°C e a humidade relativa entre 50 e 60%; foi mantido um ciclo de 12 horas de escuridão e de luz.

Com a alimentação oral Óleo de milho 10 ml/kg

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A substância de teste, suspensa em óleo de milho, foi administrada uma vez com a alimentação oral em ratazanas de ambos os sexos. As ratazanas foram deixadas sem comer durante 16 horas antes e 2 horas após a administração da substância de teste. Os animais foram observados durante 14 dias após o doseamento do produto em relação aos sintomas tóxicos relacionados com o produto e à mortalidade. Foi realizada a necropsia em animais mortos durante o período de observação. No final do período de observação os animais sobreviventes foram sacrificados, dissecados e examinados em relação a grandes anormalidades patológicas, se existissem. LD50 em ratazanas 15

ΕΡ 1 171 144 /PT

Dez ratazanas (5 machos e 5 fêmeas) foram usadas para tratamento como se segue.

Grupo N.° N.° ratos por sexo Dose (mg/kg) 1 5 5000

RESULTADOS LD50 em ratazanas

Grupo N.0 Dose (mg/kg) N.° animais mortos N.° animais tratados Mortalidade 1 5000 0/10 0

Sintomas:

Grupo 1:

Observações da necropsia: LD50:

Foi observada salivação em todos os animais e poliureia em dois animais com inicio 2 horas após o tratamento. Todos os animais sobreviveram no periodo de estudo de 14 dias e estavam livres de sinais de intoxicação 24 horas após o tratamento. Não se conseguem ver alterações significativas a olho nú.

Superior a 5000 mg/kg

Tabela de mortalidade

Gr. N° Dose mg/kg Mortalidade Horas Dia N° animais mortos 2 4 6 24 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 N° animais tratados 1 5000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10

Projecto N.a 4953

SUMÁRIO O estudo foi projectado para determinar o potencial de irritação da pele primário da Curcumina a que se Removeu a Cor fornecida por Sami Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore. A substância de teste, numa quantidade de 500 mg, foi aplicada na pele das costas rapadas em locais intactos e esfregados de três coelhos por sexo. Cada local de aplicação foi cuidadosamente observado e a reacção foi avaliada de acordo com o método de Draize às 24 e 72 horas. 16

ΕΡ 1 171 144 /PT A Curcumina a que se Removeu a Cor não provocou irritação na pele dos coelhos.

Avaliação da irritação da pele primária = 0,00

MATERIAIS E MÉTODOS SUBSTANCIA DE TESTE:

Fornecedor: Sami Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore identificação da Curcumina a que se Removeu a Cor amostra: Lote N.° - CRC/65 A R N.0 - BL8C 0445

Descrição: Identificação: Solubilidade: Pureza por HPLC: Pó cristalino branco cremoso Espectro no IV: Conforme Solúvel em metanol 99,0%_

SISTEMA DE TESTE

Espécie: Raça: Origem: Sexo: Idade: Gama de peso: N° animais por dose Selecção:

Aclimatação: Identificação dos animais: Dieta:

Agua: Gestão:

Coelho

Branco da Nova Zelândia

Serum Institute of índia Ltd.,Pune

Machos e Fêmeas

Adultos saudáveis 2,00 a 2,40 kg 3 por sexo

Seleccionados aleatoriamente em grupos de três do mesmo sexo na altura do inicio do estudo

Período de 7 dias de tratamento

Por número de gaiola e marcação individual na orelha

Ração em peletes fornecida por Nav

Maharashtra Chakan Oil Mills Ltd.,

Pune Água pura Aquaguard em garrafas de vidro ad libitum

Os coelhos foram colocados, individualmente, em gaiolas de aço inox proporcionadas com um fundo de 17

ΕΡ 1 171 144 /PT malha de aço inox. A temperatura foi mantida entre 20 e 23°C e a humidade relativa entre 50 e 60%; foi mantido um ciclo de 12 horas de escuridão e de luz.

Via: Dérmica

Volume de dose: 500 mg/local

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Foram utilizados três coelhos por sexo neste estudo. O pêlo de ambos os lados foi removido com tosquiadores eléctricos um dia antes do tratamento. A substância de teste, numa quantidade de 500 mg, foi aplicada nos locais da pele intacta e esfregada de cada animal de teste. Foi tido cuidado de modo a que a abrasão penetrasse o estrato córneo mas não a derme. Um emplastro foi fixado sobre cada área de tratamento por meio de uma fita adesiva. Os animais foram colocados cada um com um colar plástico à volta dos seus pescoços durante 24 horas, de modo a evitar a ingestão da substância de teste. O emplastro e a substância de teste não absorvida foram removidos após 24 horas. Cada local de aplicação foi cuidadosamente observado e a reacção foi avaliada de acordo com o método de Draize às 24 e às 72 horas.

Avaliação de Draize de Reacções na Pele

Classificação da reacção da pele 1. Eritema e Formação de Escara

Sem eritema................................................................................................................ 0

Eritema muito ligeiro (dificilmente perceptivel). 1

Eritema bem definido................................................................................... 2

Eritema severo a moderado.................................................................... 3

Eritema severo (vermelho beterraba) a ligeira formação de escara (danos em profundidade)................... 4

Avaliação do eritema possível máximo total: 4 2. Formação de Edema

Sem edema........................................................................................................................ 0

Edema muito ligeiro (dificilmente perceptivel)....... 1 18

ΕΡ 1 171 144 /PT

Ligeiro edema (extremidades da área bem definidas por elevação definida)............................................................................... 2

Edema moderado (elevado aproximadamente 1 mm).......... 3

Edema severo (elevado mais do que 1 mm e extensão para lá da área exposta)......................................................................... 4

Avaliação do edema possível máximo total: 4

RESULTADOS

Resumo da avaliação da irritação dérmica individual a seguir à aplicação de Curcumina a que se Removeu a Cor em coelhos. COELHO SEXO ESFREGADO INTACTO N. ° 24 horas 72 horas 24 horas 72 horas Eritema Edema Eritema Edema Eritema Edema Eritema Edema 1 Macho 0 0 0 0 0 0 0 0 2 Macho 0 0 0 0 0 0 0 0 3 Macho 0 0 0 0 0 0 0 0 4 Fêmea 0 0 0 0 0 0 0 0 5 Fêmea 0 0 0 0 0 0 0 0 6 Fêmea 0 0 0 0 0 0 0 0 Total 0 0 0 0 0 0 0 0 Média 0 0 0 0 0 0 0 0 Grande total 0

Classificação da irritação da pele primária 0,0/4 = 0,00

CONCLUSÃO

Conclui-se, com base no presente estudo, que a substância Curcumina a que se Removeu a Cor fornecida por Sami Chemicals and Extracts Ltd., Bangalore não provoca irritação na pele em coelhos.

Classificação da irritação da pele primária: 0,00

Efeito (%) da eliminação da curcumina e dos seus derivados no radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo

Composto 32 ,8 Concentração 16, 4 (pg/ml) 8, 2 Curcuminóides amostra 1 88,09 + o, 4 83,04 + 1,5 51,02 + o, 9 Curcuminóides amostra 2 88,71 + 0, 4 81,51 + 0,1 53,60 + 1, 6 Tetra-hidrocurcumina 88,17 + 0, 9 83,00 + 0,7 65, 76 + 0, 9 Tetra-hidrocurcumina (NTC) 87, 39 + 0, 4 82,30 + 1,4 68,61 + 0, 8 Tetra-hidrocurcumina (STC) 84,07 + 2, 0 77,13 + 0, 8 56,53 + 0, 7 * NTC: natural; STC: sintética 19

ΕΡ 1 171 144 /PT

Efeito da aplicação tópica da curcumina e da tetra-hidrocurcumina na formação induzida por luz ultravioleta B de dímeros de timina na epiderme do rato

Tratamento Número por grupo Percentagem das células de dímeros de timina Percentagem de protecção 1. Sem UVB 3 0 - 2. Acetona + UVB 7 8,9 + 0,02 0 3. THC (10 μπιοί) + UVB 6 7,3 + 0,03 24, 7 4. THC (20 μπιοί) + UVB 6 1,6 + 1,30 82, 0 5. Curcumina (10 μπιοί) + UVB 5 1,6 + 0,01 82, 0 6. Curcumina (20 pmol) + UVB 5 1,2 + 1,69 86, 5

Ratos SKH-1 fêmeas (8-9 semanas de idade) foram tratados topicamente com 100 μΐ de acetona, ou o composto de teste em 100 μΐ de acetona. Cinco minutos mais tarde os ratos foram irradiados com uma dose única de UVB (30 mj/cm2) . Os ratos foram mortos uma hora mais tarde e as amostras de pele foram armazenadas num tampão de 10% formalina-fosfato para o ensaio de dimeros de timina.

Efeito na formação induzida por UVB de células com queimadura da pele na epiderme do rato

Tratamento N° por Percent. de Percent. grupo células com de queimadura solar protecção Sem UVB 5 0,1 - Acetona + UVB (60 mJ/ cm2) 5 3 - DBM (10 pmol) 5 1,2 60 DBM (20 μπιοί) 5 0,9 70 Tetra-hidrocurcumina (10 μιηοΐ) + UVB 5 1,6 47 Tetra-hidrocurcumina (20 μπιοί) + UVB 5 1,4 53

Ratos Sencar fêmeas foram irradiados com uma dose única de UVB (60 mJ/cm2). Os ratos foram tratados topicamente com 100 μΐ de acetona, ou inibidor em 100 μΐ de acetona cinco minutos antes da irradiação UVB. Oito horas mais tarde os ratos foram mortos e as amostras de pele foram removidas e mantidas num tampão de 10% formalina-fosfato para o ensaio de células com queimadura solar.

Lisboa

Claims (2)

1. ΕΡ 1 171 144 /PT 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma quantidade eficaz de uma mistura de tetra-hidrocurcuminóides para a produção de um medicamento para tratamento do melanoma.
2. 2. utilização de uma quantidade eficaz de uma mistura de tetra-hidrocurcuminóides para a produção de um medicamento para o tratamento de manchas da idade devidas à formação de lipofuscina. Lisboa,