CH634992A5

CH634992A5 - Ein ein peptid mit lh-rh-wirkung enthaltendes, fuer die vaginale verabreichung geeignetes praeparat.

Info

Publication number: CH634992A5
Application number: CH887778A
Authority: CH
Inventors: Hiroaki Okada; Iwao Yamazaki; Takatsuka Yashiki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1977-08-24
Filing date: 1978-08-22
Publication date: 1983-03-15
Also published as: FR2400904A1; AU517349B2; FR2400904B1; CA1112570A; IT1098199B; IT7826956A0; AU3918378A; US4211769A; DE2836631A1; GB2003386B; GB2003386A

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Ein ein Peptid mit LH-RH-Wirkung enthaltendes, für die vaginale Verabreichung geeignetes Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wasserlösliche aliphatische Carbonsäure mit 2 bis 6 C-Atomen enthält.

2. Vaginalpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen öligen Arzneiträger enthält.

3. Vaginalpräparat nach Anspruch 1 in Form einer wäss-rigen Zubereitung.

4. Vaginalpräparat nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch einen pH-Wert von 2 bis 6.

5. Vaginalpräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid mit LH-RH-Wirkung die Formel

(PyrJGlu-Rj-Trp-Ser-Rj-Ra-R^Arg-Pro-Rs hat, worin Rt für His, Tyr, Trp oder p-NH2-Phe, R2 für Tyr oder Phe, R3 für Gly oder einen D-Aminosäurerest, R4 für Leu, Ile oder Nie und R5 für Gly-NH-R6, worin R6 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls eine Hydroxylgruppe enthaltenden, niederen Alkylrest steht, oder NH-R6, worin R6 die oben genannte Bedeutung hat, stehen.

6. Vaginalpräparat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es als Peptid mit LH-Wirkung

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5,

5 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-C2HS oder

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5,

enthält.

io 7. Vaginalpräparat nach Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es als wasserlösliche aliphatische Carbonsäure eine Monocarbonsäure oder mehrbasische Säure enthält.

8. Vaginalpräparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es als Monocarbonsäure Essigsäure, Milchsäure oder Ascorbinsäure enthält.

9. Vaginalpräparat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es als mehrbasische Säure eine Dicarbonsäure,

20 z.B. Bernsteinsäure, Weinsäure, Malonsäure, Glutarsäure, Apfelsäure oder Asparaginsäure, oder eine Tricarbonsäure, z.B. Zitronensäure, enthält.

Vaginalsuppositorien, die ein Peptid mit der Wirkung von luteinisierendem Hormon-releasing Hormon (nachstehend als «LH-RH» bezeichnet) haben, werden beispielsweise in der GB-PS 1 393 628 (entsprechend der US-PS 3 917 825) beschrieben. Dieses bekannte Suppositorium enthält eine Zubereitung, die durch Dispergieren eines Peptids mit LH-RH-Wirkung in einem Gemisch einer öligen Grundlage und eines nichtionogenen Tensids erhalten wird. Es wurde gefunden, dass die Einarbeitung einer bestimmten Art einer wasserlöslichen Carbonsäure in eine solche Zubereitung eine überraschend gesteigerte Resorption des Wirkstoffs durch den lebenden Körper zur Folge hat. Dieser Feststellung folgen weitere Untersuchungen, die in der vorliegenden Erfindung gipfelten.

30 Gegenstand der Erfindung sind demgemäss

1. ein Vaginalpräparat, das ein Peptid mit LH-RH-Wirkung und eine wasserlösliche aliphatische Carbonsäure mit 2 bis 6 C-Atomen enthält;

2. das Vaginalpräparat gemäss 1 mit einer öligen Grund-35 läge und

3. das Vaginalpräparat gemäss 1 als wässrige Zubereitung sowie

4. das Vaginalpräparat gemäss 1, worin das Peptid mit LH-RH-Wirkung die Formel

12 3 4-567 8 9 (Pyr)Gl"u-R^-Trp-Ser-R2-E^-E^-Arg-Pro-R^ (i)

hat,

worin Ri für His, Tyr, Trp oder p-NH2-Phe, R2 für Tyr oder Phe, R3 für Gly oder einen D-Aminosäurerest, R4 für Leu, He oder Nie und R5 für Gly-NH-R6 (worin R6 für H oder einen niederen Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen steht, der gegebenenfalls eine Hydroxylgruppe enthält) oder NH-R6 (worin Re die vorstehend genannte Bedeutung hat) steht.

Die in der Zubereitung gemäss der Erfindung enthaltene wasserlösliche aliphatische Carbonsäure mit 2 bis 6, vorzugsweise 3 bis 6 C-Atomen kann eine Monocarbonsäure, Dicarbonsäure, Tricarbonsäure usw. sein. Als Monocarbon-säuren kommen beispielsweise niedere Fettsäuren und Mo-nocarbonsäuren mit 1 bis 5 Hydroxylgruppen in Frage. Als Di- oder Tricarbonsäuren eignen sich beispielsweise Alkan-di- oder -tricarbonsäuren (mit 2 oder 3 Carboxylgruppen, die an beliebige Stellungen einer Alkankette gebunden sind). Diese Alkanketten können in beliebigen Stellungen mit Hydroxylgruppen und/oder Aminogruppen substituiert sein, wobei die Zahl dieser Hydroxylgruppen 1 bis 3 und die Zahl der Aminogruppen normalerweise 1 beträgt.

Als Beispiele dieser Carbonsäuren sind Essigsäure, Propionsäure, n-Buttersäure, n-Pentansäure, Ascorbinsäure,

Milchsäure, Gluconsäure, Glucuronsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Weinsäure, Apfelsäure, Glutarsäure, Adipinsäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure so zu nennen. Bei mehrbasischen Säuren gibt es Fälle, in denen wenigstens eine ihrer Carboxylgruppen frei ist, während die andere bzw. die anderen Carboxylgruppen in Form eines Esters oder Salzes vorliegen. Von den wasserlöslichen aliphatischen Carbonsäuren sind Bernsteinsäure, Weinsäure, 55 Citronensäure usw. besonders vorteilhaft für praktische Zwecke.

Die Zubereitung gemäss der Erfindung kann in beliebiger Form, die in die Vagina eingeführt werden kann, hergestellt werden. Beispielsweise kann sie in beliebigen Arzneiformen beispielsweise als Suppositorien, Salben, Tabletten, wässrige Lösungen (einschliesslich solcher, die auf eine feste Matrix aufgebracht sind), wässrige Gele und Emulsionen verwendet werden.

65 Die geeignete Menge der wasserlöslichen aliphatischen Carbonsäure hegt in vielen Fällen, mit Ausnahme der wäss-rigen Lösungen, im Bereich von etwa 0,5 bis 50 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von etwa 2 bis 20 Gew.-%.

Die Menge der wasserlöslichen aliphatischen Carbonsäure in den Lösungen kann im Bereich von etwa 0,5 bis 20 Gew.-% liegen und beträgt in Abhängigkeit vom vorgesehenen Verwendungszweck etwa 1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der wässrigen Lösung im Vaginalpräparat gemäss der Erfindung (z. B. einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen aliphatischen Carbonsäure, eines Peptids mit

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LH-RH-Wirkung, eines pH-Reglers, eines wässrigen Gels als Grundlage, eines Gelstabilisators, Konservierungsmittels usw.).

s Das in den Zubereitungen gemäss der Erfindung enthaltene Peptid kann ein beliebiges Peptid mit LH-RH-Wirkung sein. Geeignet sind beispielsweise Peptide der Formel

12 3 4-567 8 9

(Pyr)Glu-E^-Trp-Ser-Rg-E^-E^-Arg-Pro-R^

(I)

Hierin steht Rj für Hys, Tyr, Trp oder p-NH2-Phe, R2 für Tyr oder Phe, R3 für Gly oder einen D-Aminosäurerest, R4 für Leu, Ile oder Nie und Rs für Gly-NH-R6 (worin R6 für H oder einen niederen Alkylrest mit 1 bis 3 C-Atomen steht, der gegebenenfalls eine Hydroxylgruppe enthält) oder NH-R6 (worin R6 die oben genannte Bedeutung hat).

Als Beispiele von D-Aminosäureresten R3 sind die Reste von a-D-Aminosäuren mit bis zu 9 C-Atomen (z.B. D-Leu, D-Ile, D-Nle, D-Val, D-Nval, D-Abu, D-Phe, D-Phg, D-Ser, D-Thr, D-Met, D-Ala und D-a-Aibu, D-Trp, D-Tyr usw.), die geeignete Schutzgruppen (z.B. t-Butyl, t-Butoxy und t-Butoxycarbonyl) enthalten, zu nennen. Natürlich können auch Salze des Peptids (I) mit Säuren sowie Metallkomplexverbindungen des Peptids (I) ebenso wie das Peptid (I) verwendet werden. Alle hier gebrauchten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren, Peptide, Schutzgruppen usw. entsprechen den Vorschriften der IUPAC-IUB-Kom-mission für biologische Nomenklatur oder den üblicherweise auf dem jeweiligen Gebiet verwendeten Abkürzungen. Wenn die hier genannten Aminosäuren der optischen Isomerie unterliegen, ist bei allen diesen hier genannten Aminosäuren die L-Form gemeint, falls nicht anders angegeben.

Beispielsweise werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

Abu: a-Aminobuttersäure a-Aibu: a-Aminoisobuttersäure

Ala: Alanin

Arg: Arginin

Gly: Glycin

His: Histidin

Ile: Isoleucin

Leu: Leucin

Nie: Norleucin

Nva: Norvalin

Met: Methionin

Phe: Phenylalanin

Phg: a-Phenylglycin

Pro: Prolin

(Pyr)Glu: Pyroglutaminsäure

Ser: Serin

Thr: Threonin

Trp: Tryptophan

Tyr: Tyrosin

Val: Valin

Bu': t-Butyl

Alle bekannten Peptide mit LH-RH-Wirkung können verwendet werden. Beispiele dieser Peptide sind nachstehend genannt.

(Pyr)Glu-His-T rp-Ser-T yr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5

(Pyr)Glu-His-T rp-Ser-T yr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5

15 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHCH2CH2OH

(Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NHCH3 20 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Pyrrolidin (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-NLe-Arg-Pro-NHC2H5 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Pro-NHC2H5 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Phe-Gly-Ile-Arg-Pro-NHC2H5 (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Met-Arg-Pro-NHC2H5 25 Die vorstehend genannten Peptide werden beispielsweise in den folgenden Patentschriften beschrieben: US-PS 3 853 837 (entsprechend der BE-PS 798 114, der DE-OS 2 321 174 und niederländische Offenlegungsschrift 7 305 995), BE-PS 817 989 (entsprechend der DE-OS 30 2 435 027 und der niederländischen Offenlegungsschrift 7 410 026), US-PS 4 008 209 (entsprechend der BE-PS 820 451, der DF-OS 2 446 005 und der niederländischen Offenlegungsschrift 74 12 837) und der US-PS 3 972 859 (entsprechend der BE-PS 826 430, der DE-OS 2 509 783 und der 35 niederländischen Offenlegungsschrift 75 02 564).

Die Menge des Peptids mit LH-RH-Wirkung, die verwendet wird, variiert, sollte jedoch genügen, um die gewünschte pharmakologische Wirkung sicherzustellen. Beispielsweise kann sie in vielen Fällen im Bereich von etwa 40 0,000025 bis 10 Gew.-%, bezogen auf die Zubereitung gemäss der Erfindung, liegen. Wenn die Auslösung der Ovulation die gewünschte Wirkung ist, kann die Menge zuweilen im Bereich von etwa 0,000025 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise im Bereich von etwa 0,0001 bis 0,2 Gew.-% liegen, wobei 45 eine Menge von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% besonders bevorzugt wird. Wenn eine tumorhemmende Wirkung auf Brustkrebs angestrebt wird, kann die Menge zuweilen im Bereich von 0,001 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise etwa 0,01 bis 10 Gew.-% liegen, wobei eine Menge von 0,01 bis 5 Gew.-% besonders so bevorzugt wird.

Die Zubereitungen gemäss der Erfindung können nach bekannten pharmazeutischen Verfahren hergestellt werden.

Zu den Zubereitungen gemäss der Erfindung gehören Vaginalsuppositorien, die bei Raumtemperatur fest bleiben, 55 aber bei der Körpertemperatur schmelzen; Salben, die in öligen Trägern dispergiert sind und immer flüssig sind, und Zubereitungen vom Geltyp, die durch Röhrchen od. dgl. verabreicht werden. Als weitere Arzneiform kommt eine Zubereitung in Frage, die nach der vaginalen Anwendung in den 60 Vaginalflüssigkeiten gelöst wird oder zerfallt. Eine solche Zubereitung lässt sich leicht vorzugsweise mit Hilfe eines Applikators oder einer Einführvorrichtung verabreichen.

Zur Herstellung eines Vaginalsuppositoriums oder einer Vaginalsalbe wird die vorstehend genannte Carbonsäure als 65 feines Pulver in dem vorher geschmolzenen öligen Arzneiträger gelöst oder dispergiert, worauf ein Peptid mit LH-RH-Wirkung zugesetzt und bei einer geeigneten erhöhten Temperatur verrührt wird, bis sich eine homogene Disper

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sion gebildet hat. Diese geschmolzene Masse wird dann zu Dosierungseinheiten geformt. Bei einem anderen Verfahren, das ebenfalls für die Herstellung von Suppositorien und Salben bekannt ist, wird die organische Säure im Arzneiträger dispergiert, eine wässrige Lösung des Peptids mit LH-RH-Wirkung in der Schmelze gleichmässig verteilt und die erhaltene Dispersion geformt.

Für die Zwecke der Erfindung können beliebige bekannte Grundlagen bzw. Arzneiträger für Salben und Suppositorien verwendet werden. Beispielsweise können als wasserlösliche Grundlagen Arzneiträger auf Basis von Polyäthylen-glykol verwendet werden. Besonders zweckmässig sind Poly-äthylenglykole mit einem Polymerisationsgrad von nicht weniger als 100. Als Beispiele geeigneter Polyäthylenglykole sind solche mit einem Polymerisationsgrad von 200, 300, 400,1000,4000 und 6000 zu nennen. Diese Grundlagen und Arzneiträger können allein oder in Mischung verwendet werden. Als ölige Grundlagen eignen sich beispielsweise Öle und Fette wie Sesamöl, Olivenöl, Maisöl, Sojabohnenöl, Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Kakaobutter, Rizinusöl, Lau-rin, Rindertalg, Schmalz, Wollfett, Schildkrötenöl und Squalen, die entsprechenden modifizierten Materialien, die durch Verfahren wie Hydrierung, Fettsäureaustausch, Ace-tylierung, fraktionierte Extraktion usw. modifiziert worden sind, Mineralöle, z.B. Vaseline, Paraffin, Isoparaffin und Si-liconöl, Glycerinester von Fettsäuren mit 6 bis 30 C-Atomen, insbesondere höhere Fettsäureester wie Glycerinpal-mitat, Glycerinlaurat, Glycerinstearat und Glycerinmyristat, Ester von Fettsäuren mit 6 bis 30 C-Atomen mit Alkoholen mit 2 bis 8 C-Atomen, insbesondere Wachse wie Isopropyl-myristat, Butylstearat, Diisopropyladipat und Diäthyl-sebacat und höhere Féttsâuren mit 6 bis 30 C-Atomen, insbesondere Stearinsäure und Ölsäure.

Die genannten öligen Grundlagen können allein oder in Mischung verwendet werden. Besonders vorteilhaft als ölige Grundlagen oder Arzneiträger sind Maisöl, Kakaobutter und Fettsäure-ausgetauschte Öle (z.B. Mono-, Di- und Triglyceride von Palmitinsäure, Stearinsäure und anderen Fettsäuren).

Zur Herstellung von Vaginaltabletten wird der Wirkstoff im allgemeinen nach einem bekannten Verfahren zu geeigneten Arzneiformen gepresst, wobei Verdünnungsstoffe wie Lactose, Saccharose, Stärke usw., Auflockerungsmittel wie Stärke und Natriumhydrogencarbonat, Bindemittel wie Stärke, Gelatine, Carboxymethylcellulose, Polyvinyl-pyrrolidon und Hydroxypropylcellulose, Gleitmittel wie Talkum, Magnesiumstearat, Polyäthylenglykol (6000) und Stearinsäure usw. verwendet werden. Wenn die erforderliche Dosis sehr gering ist, kann erhöhte Gleichmässigkeit des Produkts erzielt werden, indem eine gemischte Lösung aus einem Peptid mit LH-RH-Wirkung mit einem Hilfsstoff wie Lactose, Stärke oder Mannit vorher hergestellt, die Lösung durch Gefriertrocknen oder Sprühtrocknen unter Bildung eines gestreckten Pulvers getrocknet und dieses gestreckte Pulver zu Tabletten gepresst wird. Angesichts der geringen Menge der Vaginalflüssigkeiten im Vergleich zu Gastrointe-stinalflüssigkeiten sind der Zerfall und die Auflösung wichtige Punkte, die berücksichtigt werden müssen.

Um den Zerfall und die Auflösung zu beschleunigen, können Brausetabletten mit Hilfe von Natriumhydrogencarbonat und Weinsäure hergestellt werden.

Die wässrigen Vaginalpräparate gemäss der Erfindung können nach bekannten pharmazeutischen Verfahren hergestellt werden. Zur Herstellung einer wässrigen Lösung können das Peptid mit LH-RH-Wirkung und die wasserlösliche aliphatische Carbonsäure mit 2 bis 6 C-Atomen in beliebiger Reihenfolge gelöst werden. Diese wässrige Lösung muss sauer sein und vorzugsweise im pH-Bereich von etwa 2 bis 6

liegen. Das aus den genannten Mengen des Peptids und der wasserlöslichen aliphatischen Carbonsäure und Wasser bestehende wässrige Vaginalpräparat kann einen pH-Wert im vorstehend genannten Bereich haben. Wenn dies nicht der Fall ist, wird die Zubereitung mit einer geeigneten Säure, Base, einem Puffer od. dgl. auf einen erwünschten pH-Wert im genannten Bereich eingestellt. Als Beispiele geeigneter Säuren für die pH-Einstellung sind wasserlösliche aliphatische Carbonsäuren mit 2 bis 6 C-Atomen, die als Klasse eine Komponente der Zubereitung gemäss der Erfindung sind, und anorganische Säuren zu nennen. Als Basen eignen sich beispielsweise Natriumhydroxyd und Kaliumhydroxyd. Als Beispiele von Puffern sind Sörensen-Puffer (Ergeb.

Physiol. 12 (1912) 393), Clark-Lubs-Puffer (J. Bact. 2 (1) (1971) 109,191), Macllvaine-Puffer (J. Biol. Chem. 49 (1921) 183), Michaelis-Puffer (Die Wasserstoffionenkonzentration, Seite 186 (1914) und Kolthoff-Puffer (Biochem. Z. 179 (1926) 410 zu nennen.

Die Herstellung des wässrigen Vaginalpräparats in Form von wasserlöslichen Gelsuppositorien kann durch Mischen der wasserlöslichen aliphatischen Carbonsäure mit 2 bis 6 C-Atomen, des Peptids mit LH-RH-Aktivität, des Wassers und einer Gelgrundlage nach einem zur Herstellung von wässrigen Vaginalsuppositorien bekannten Verfahren erfolgen. Als wasserlösliche Gelgrundlagen eignen sich beispielsweise natürliche Gummen (z.B. Traganthgummi, Gummiarabikum, Karayagum, irisches Moos, Guaiagum, Xanthangum und Johannisbeerkerngum), Cellulosederivate (z.B. Methyl-cellulose und Carboxymethylcellulose), Acrylsäurepoly-merisate (z.B. Polyacrylsäure und Polymethacrylsäure), Vinylpolymerisate (z.B. Polyvinylpyrrolidon, Polyvinyl-alkohol, Polyvinylmethyläther und Carboxypolymethylen), synthetische Polysaccharide (z.B. Polysaccharose, Polyglu-cose und Polylactose), Stärke, Dextrin, Pektin und Natrium-alginat. Diese Arzneiträger können entweder allein oder,

falls erforderlich, als Gemisch von zwei oder mehr verschiedenen Grundlagen verwendet werden. Copolymerisate der vorstehend genannten Polymerisate sind ebenfalls geeignet.

Die wasserlöslichen Gelsuppositorien können beispielsweise wie folgt hergestellt werden: Zunächst wird eine wässrige Lösung, die eine wasserlösliche aliphatische Carbonsäure mit 2 bis 6 C-Atomen enthält, hergestellt. Der Lösung werden dann pH-Regler, Konservierungsmittel und andere notwendige Komponenten zugesetzt. Diese Lösung wird in zwei Teile geteilt. Die Gelgrundlage wird dann in einem dieser Teile dispergiert oder gelöst. Das Gemisch wird dann zur Herstellung eines stabilen Gels nach Bedarf erhitzt oder gekühlt. Im anderen Teil der Lösung wird das Peptid mit LH-RH-Wirkung gelöst. Die beiden Teile werden dann gleichmässig gemischt, wobei die gewünschten wasserlöslichen Gelsuppositorien erhalten werden.

Die wässrige Lösung gemäss der Erfindung kann auch beispielsweise in einer auf eine feste Matrix aufgebrachten Form vaginal verabreicht werden.

Als feste Matrix oder Träger eignen sich die bekannten Träger, z.B. poröse Materialien aus hochmolekularen Verbindungen (z.B. Siliconkautschuk und Polyurethan), biologische Polymerisate (z.B. Kollagen und Hyaluronsäure) und Cellulosematerialien (z.B. Watte und Papier). Nachdem die wässrige Lösung auf eine solche feste Matrix aufgebracht worden ist, wird die Matrix zur Entfernung des Wassers getrocknet. Nach intravaginaler Einführung der das Arzneimittel enthaltenden Matrix wird der Wirkstoff unter dem Einfluss der Vaginalflüssigkeiten freigegeben.

Die wässrige Lösung gemäss der Erfindung kann auch nach Überführung in eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder Wasser-Öl-Wasser-Emulsion in üblicher Weise mit Hilfe ei4

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ner geeigneten oberflächenaktiven Verbindung, z.B. der Produkte der Handelsbezeichnung «Span», «Arlacel» (höhere Fettsäuresorbitanester, Hersteller Atlas Powder Co.), «Tween» (Polyoxyäthylensorbitanfettsäureester (Hersteller Atlas Powder Co.), «Pluronic» (Polyoxypropylen-polyoxy-äthylen, Hersteller Windot Co.), «Brij» (Polyoxyäthylen-alkyläther, Hersteller Atlas Powder Co.), Lecithin, Ölen und Fetten (z.B. Sesamöl, Maisöl, Rapsöl, Olivenöl, Erdnussöl, Baumwollsaatöl, Ölsäure und Linolsäure) verabreicht werden.

Die wässrige Lösung gemäss der Erfindung kann auch in Aerosolschaum verabreicht werden.

Falls erforderlich, können die wässrigen Vaginalpräparate gemäss der Erfindung ausserdem andere geeignete Komponenten wie Elektrolyte (z.B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Natriumcarbonat und Magnesiumsulfat), Netzmittel (z. B. Glycerin, Propylenglykol und Sorbit), Konservierungsmittel (z.B. Methylparaben, Propylparaben, Chlor-butanol, Benzylalkohol und Sorbinsäure) und Antioxy-dantien (z. B. Butylhydroxyanisol, Natriumhydrogensulfit und Nordihydroguaiaretinsäure) enthalten.

Die Einzeldosis der Vaginalpräparate gemäss der Erfindung kann mit der Arzneiform, der jeweiligen Art des Wirkstoffs, der Tiergattung, der das Präparat verabreicht wird (z. B. Maus, Ratte, Pferd, Rind, Mensch oder andere Warmblüter) und dem Ziel der Behandlung variieren. In jedem Fall muss die Dosis genügen, um pharmakologisch wirksam zu sein. Sie kann im Bereich von beispielsweise etwa 1 bis 500 mg des endgültigen Präparats pro kg Körpergewicht liegen. Die geeignete Zahl der Verabreichungen pro Tag kann ebenfalls in Abhängigkeit von den genannten Faktoren variieren. Sie kann einmal bis etwa dreimal täglich erfolgen.

Die Antitumorwirkung des Peptids ist bekannt, z. B. aus «Science» 194, 329 (1976), «Cancer Research» 36, 3830 (1976) und US-PS 4 002 738.

Die Vaginalpräparate gemäss der Erfindung haben die folgenden Vorteile und weiteren vorteilhaften Merkmale:

1. Bei vaginaler Verabreichung eines Peptids mit LH-RH-Wirkung gibt es Fälle, in denen das Vaginalpräparat gemäss der Erfindung die Ovulation auch bei niedrigen Konzentrationen auslöst, die bei den üblichen Arzneimitteln keine Ovulation bewirken würden.

2. Bei der vaginalen Verabreichung eines LH-RH-ak-tiven Peptids zur Auslösung der Ovulation löst dieses wässrige Vaginalpräparat, das sauer ist und die genannte organische Säure enthält, wirksam die Ovulation bei reduzierter Peptidkonzentration oder bei Zugabe nur einer geringen Menge der organischen Säure aus.

3. Die Verabreichung eines aktiven Derivats von LH-RH mit tumorhemmender Wirkung gegen Brustkrebs, Uteruskrebs usw. in Form eines Vaginalpräparats, das die genannte wasserlösliche Carbonsäure gemäss der Erfindung enthält, bringt die gewünschte tumorhemmende Wirkung bei reduzierten Peptidkonzentrationen hervor.

4. Mit der vaginalen Arzneiform gemäss der Erfindung können verschiedene pharmakologische Wirkungen, z.B. Besserung der Amenorrhoe, Dysmenorrhoe, Hypophyseo-privus oder postkoitale Kontrazeption durch Verhinderung der Implantation leicht mit einer reduzierten Menge des LH-RH-aktiven Peptids erreicht werden. Bisher waren vergleichbare Wirkungen nur durch mehrfache häufige Injektionen erzielbar.

5. Auch wenn eine tumorhemmende Wirkung gewünscht wird, die häufige Injektionen erfordert, ermöglicht es das Vaginalpräparat gemäss der Erfindung dem Patienten, sich selbst zu behandeln, so dass eine Heimtherapie möglich ist.

6. Insbesondere wässrige Vaginalpräparate gemäss der Erfindung haben eine hohe Affinität zur Vaginalschleim5 634 992

haut. Sie ermöglichen leichte pH-Einstellung und leichte Reinigung des Instruments und der Vagina nach jeder Verabreichung. Da ferner die Komponenten vorher gelöst worden sind, entsteht weder Brennen noch Reizung der Vaginal-5 Schleimhaut. Da ausserdem jede Dosierungseinheit aus geringeren Mengen des Arzneiträgers für Suppositorien und anderer Komponenten besteht, bleibt nur eine geringe Rückstandsmenge im Vaginaltrakt zurück.

7. Im Vergleich zu parenteralen Zubereitungen können io die Serumkonzentrationen von LH (luteinisierendes Hormon, nachstehend mit der Abkürzung «LH» bezeichnet) und des FSH (follikelstimulierendes Hormon) nach vaginaler Verabreichung während einer bedeutend längeren Zeit aufrechterhalten werden.

15 Beispiel 1

8 g höheres gesättigtes Fettsäuretriglycerid («Witepsol S55», Hersteller Dynamit Nobel Aktiengesellschaft, gesättigtes Triglycerid von Pflanzenfettsäure mit einem geringen Gehalt an Monoglycerid) wurden bei 50 °C geschmolzen. 20 Der Schmelze wurde 1 g gemahlene Bernsteinsäure zugesetzt. Nach gutem Mischen wurde 1 g des Triglycerids «Witepsol S55», das 2 mg vorher darin dispergiertes natürüches LH-RH der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 enthielt, zugesetzt. Unter Erwärmen und 25 Rühren wurde die Masse in Suppositorienformen für Ratten in einer Menge von je 50 mg pro Form gefüllt. Die Formen wurden dann in Eiswasser abgeschreckt. Hierbei wurden Suppositorien erhalten. Es ist zu bemerken, dass der Gehalt an Peptid mit LH-RH-Wirkung in jedem Suppositorium ein-30 gestellt werden kann, indem die Konzentration von LH-RH im getrennt hergestellten Triglycerid «Witepsol S55» erhöht oder eine erhöhte Menge des gleichen Arzneiträgers mit Carbonsäuren einem Arzneiträger, der LH-RH enthält, zugesetzt wird.

35 _ . . , „

Beispiel 2

In etwa 0,5 ml Wasser wurden 71,4 mg Peptid der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 gelöst. Der Lösung wurden 4 g Lanolin zugesetzt. Das 40 Gemisch wurde gut homogenisiert. Dann wurde ein Gemisch von 91 g des höheren Fettsäuretriglycerids «Witepsol S55», das vorher bei 50 °C geschmolzen worden war, und 5 g feingemahlener Citronensäure langsam unter Rühren zugesetzt. Die Masse wurde in Suppositorienformen aus Kunst-45 stoff in einer Menge von 1,4 g pro Form zur Herstellung von Vaginalsuppositorien für den menschlichen Gebrauch geformt. Jedes Suppositorium enthielt 1 mg Peptid.

Beispiel 3

In 40 ml Wasser wurden 2 mg Peptid der Formel (Pyr)-50 Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 gelöst und 5 g Lactose dispergiert. Die Lösung wurde gefriergetrocknet. Das getrocknete Gemisch wurde gemahlen. Mit 1 g dieses Gemisches wurden 6,175 g Lactose gemischt. Dem Gemisch wurden 1 g Citronensäure und 1 g Maisstärke zu-55 gesetzt. Dann wurden 2 ml einer vorher hergestellten 10%igen äthanolischen Lösung von Hydroxypropylcellulose (HPC) zugesetzt und zugemischt. Das Gemisch wurde gesiebt, granuliert und 8 Stunden bei 50 °C getrocknet. Das Granulat wurde mit 500 mg Maisstärke und 125 mg 60 Magnesiumstearat gut gemischt. Aus dem Gemisch wurden Tabletten von je 50 mg hergestellt. In dieser Weise wurden zur Auflösung bestimmte Vaginaltabletten für Ratten, die 2 (ig des Peptids pro Tablette enthielten, erhalten.

65 Beispiel 4

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurden verschiedene Mengen von natürlichem LH-RH der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 in ei

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ner öligen Grundlage («Witepsol»), in der 10% Citronensäure dispergiert worden war, in Form von feinen Teilchen sowie in einem ähnlichen öligen Träger, der keine Carbonsäure enthielt, dispergiert. Die erhaltenen Zubereitungen wurden Ratten vaginal verabreicht, um die ovulationsaus-lösenden Wirkungen festzustellen.

Weibliche SD-Ratten im Diöstrus (120 bis 150 Tage, Körpergewicht 250 bis 350 g) erhielten das Präparat vaginal und wurden am nächsten Tag autopsiert, um festzustellen, ob Ovulation stattgefunden hatte, festgestellt auf der Grundlage der Anwesenheit oder Abwesenheit von Ova in der Am-pulla. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannt.

Tabelle 1

Zusatzstoffe

Dosis von natürlichem LH-RH (ng/Ratte) EDS0 (95%

400 600 800 1000 10 000 20 000 40 000 60 000 80 000 Konfidenzgrenze)

(ng/Ratte)

Ohne Zusatz

Citronensäure (10%) 1/10 1/10 4/10 8/10 4/4 n/n = Zahl der ovulierenden Ratten/Zahl der vaginal behandelten Ratten

1/10 2/10 10/10 9/10 10/10 24400

(17 300-32100) 830(680-1140)

Beispiel 5

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde ein syn- schiedene organische Säuren eingearbeitet worden waren, di-thetisches Peptid der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D- spergiert. Ein Versuch zur Auslösung der Ovulation auf va-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 in aliquoten Teilen einer öligen 25 ginalem Wege wurde auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise Grundlage (bezogen auf Glyceryltrilaurat), in die jeweils ver- durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 genannt.

Tabelle 2

Carbonsäuren

Dosis (ng/Ratte) 20 40 60

80

100

150

200 400

600

800

EDS0 (ng/Ratte keine

0/10

3/10

8/10

9/10

10/10

270 (194-353)*

Citronensäure (10%)

2/10

6/10

8/10

9/10

10/10

5/5

56(38-69)*

Bernsteinsäure (10%)

0/10 4/10

6/10

8/10

9/10

50 (37-63)*

Weinsäure (10%)

1/10

5/10

8/10

5/5

82 (69-97)*

Asparaginsäure (10%)

2/10

4/10

9/10

10/10

5/5

122(79-169)*

Glutaminsäure (10%)

0/10

7/10

10/10

5/5

177 (133-243)*

Milchsäure (2%)

2/10

0/10

3/10

8/10

117(95-184)*

Ascorbinsäure (10%)

3/10

2/10

4/10

7/10

114(80-161)*

* 95% Konfidenzgrenze

n/n = Zahl der ovulierenden Ratten/Zahl der vaginal behandelten Ratten

Beispiel 6

Das in Beispiel 5 beschriebene Peptid wurde in einem öligen Arzneiträger, der überwiegend aus Glyceryltrilaurat bestand und durch 10% Citronensäure ergänzt war, dispergiert. Die hergestellten Vaginalsuppositorien wurden ständig in die Vagina von sechs weiblichen Ratten eingeführt, bei denen vorher Brustkrebs durch orale Verabreichung von DMBA (7,12-Dimethylbenzanthracen) ausgelöst worden war, um die tumorhemmenden Wirkungen zu untersuchen und zu bewerten. Das Peptid wurde in einer Menge von 350 ng/Ratte in 50 g der Arzneigrundlage für Suppositorien dispergiert. Vier Tiere erhielten täglich mit Ausnahme von Samstag und Sonntag während einer Zeit von 2,5 Monaten das Präparat. Zum Vergleich erhielten zwei Ratten das in physiologischer Kochsalzlösung gelöste Peptid in einer Menge von 100 ng/kg subkutan nach dem gleichen vorstehend beschriebenen Zeitplan.

Die Ergebnisse zeigten, dass mässige Wachstumshemmung der Tumore in beiden Fällen bei subkutaner Verabreichung erreicht wurde, mässige Hemmung bei drei von vier der vaginal behandelten Tiere und vollständiges Verschwinden der Tumore bei dem verbleibenden Tier erzielt wurde.

In allen Fällen wurde Atrophie des Uterus und der Ovarien beobachtet. Dies war wahrscheinlich auf das verabreichte Peptid zurückzuführen. Im Falle von Krebs sind die Wir-50 kungen einer Medikation schwierig quantitativ zu bestimmen, weil die verschiedensten Faktoren wie Krebsstadium, Dosierung, Häufigkeit der Verabreichung usw. eine Rolle spielen.

Die Ergebnisse dieses Versuchs lassen jedoch bedeutende 55 tumorhemmende Wirkungen, ein Zeichen für befriedigende Resorption, erkennen.

Wie die Ergebnisse der in Beispielen 4, 5 und 6 beschriebenen Versuche zeigen, hat die Zumischung einer organischen Säure, z.B. Citronensäure, eine wesentlich ge-60 steigerte Resorption der Peptide mit LH-RH-Wirkung aus der Vagina zur Folge.

Hinsichtlich der ovulationsauslösenden Wirkung wurde eine 30fache Steigerung der stimulierenden Wirkung gegenüber dem Vergleichsversuch (ohne Carbonsäure) im Falle 65 von natürlichem LH-RH erzielt (Tabelle 1). Bei dem gemäss Beispiel 5 verwendeten synthetischen Peptid hatte die Zumischung von 10% Bernsteinsäure eine 5,4mal grössere Resorption als beim Vergleichsversuch (ohne organische Säure)

zur Folge. Hieraus ergibt sich eindeutig, dass eine gegebene pharmakologische Wirkung bei einer Dosis, die dem 5,2fachen der intravenösen Dosis oder dem 3, lfachen der subkutanen Dosis entspricht, erzielt werden kann. Es ist zu bemerken, dass zur Erzielung einer gegebenen pharmakologischen Wirkung durch orale Verabreichung der gleichen Verbindung eine Dosis, die das 1900fache der intravenösen Dosis beträgt, erforderlich ist und ohne Verwendung einer Carbonsäure, wie Tabelle 2 zeigt, eine Dosis, die 26mal so gross ist wie die intravenöse Dosis, verabreicht werden muss, wenn der vaginale Weg gewählt wird. Diese Tatsachen zeigen eindeutig, dass die vaginale Verabreichung gemäss der Erfindung ein sehr vorteilhafter Weg der Medikation ist.

Hinsichtlich der tumorhemmenden Wirkung ist zwar zu berücksichtigen, dass komplizierende Faktoren wie Phase des Krebses, Dosierung und Häufigkeit der Verabreichung eine Rolle spielen, jedoch wurde Wirksamkeit in 3 von 5 Fällen und in einem Fall ein sehr grosser Erfolg (Verschwinden von Tumoren) erzielt.

Die Zumischung einer Carbonsäure ermöglichte somit die Behandlung von Krebserkrankungen mit geringeren Mengen des Peptids mit LH-RH-Wirkung nach einem bequemen Verfahren der vaginalen Verabreichung, die von den Patienten selbst vorgenommen werden kann. Dies ist ein erheblicher Beitrag zum therapeutischen Wert des Peptids mit LH-RH-Wirkung, das vom Verdauungstrakt nur sehr begrenzt resorbiert wird und bisher nur durch Injektionen verabreicht wurde.

Ausser den vorstehenden Bewertungen der pharmakologischen Wirkung wurden die Resorption von LH-RH und seine Langzeitwirkung nach vaginaler Verabreichung mit Hilfe des Radioimmuntests von Serum-LH untersucht. Dieser Versuch wird nachstehend in Beispiel 7 beschrieben.

Beispiel 7

50 ng des in Beispiel 5 beschriebenen Peptids wurden in einem öligen Arzneiträger (der überwiegend aus Glyceryltrilaurat bestand) dispergiert, dem vorher 10% Citronensäure zugemischt worden waren. Die Konzentration von Serum-LH wurde dann mit Hilfe des Radioimmuntests bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.

Tabelle 3

Änderungen der Serum-LH-Konzentrationen nach einmaliger intravaginaler Verabreichung an Ratten im Diöstrus

Minuten nach der Serum-LH-Konzentration

Verabreichung (Mittelwert, ng/ml + S.F.

0 23.8 ± 9.1

10 46.5 ± 7.8

20 59.7 ± 12.0

40 110.0+ 16.4

60 178.0 + 83.4

120 602.0 ± 254.9

180 166.6 + 97.5

240 380.0 +182.4

300 158.6 + 78.8

360 39.0 ± 9.1

In jeder Gruppe wurden 5 Ratten verwendet.

S.F. = Standardfehler

Bei vaginaler Verabreichung von 50 ng des in Beispiel 5 beschriebenen Peptids wurde somit eine Spitzen-LH-Kon-zentration, die 25mal so hoch ist wie die normale Konzentration, erzielt, und selbst 5 Stunden nach der Verabreichung

634 992

betrug die Konzentration noch etwa das 7fache der Konzentration vor der Verabreichung. Es gibt viele Berichte, die erkennen lassen, dass hinsichtlich der ovulationsauslösenden Wirkung nicht nur die Konzentrationen der LH- und FSH-Maxima, sondern auch die Aufrechterhaltung ausreichender Konzentrationen sehr wichtige Faktoren sind.

Dies zeigt eindeutig, dass durch Verwendung dieser Vaginalsuppositorien, die eine gewisse organische Säure enthalten, der Schmerz und die Unannehmlichkeiten, die mit intravenöser Instillation über längere Zeit oder häufigen intramuskulären oder subkutanen Injektionen verbunden ist, vermieden wird und die Erzielung der gewünschten therapeutischen Wirkung mit verhältnismässig geringen Mengen des Peptids mit LH-RH-Wirkung möglich ist.

Beispiel 8

Über Nacht wurden 10 g säurebehandelte Gelatine in 10 g einer 5%igen wässrigen Citronensäurelösung (pH 3,5, mit einer geringen Menge konzentriertem wässrigem NaOH eingestellt, nachstehend als Lösimg A bezeichnet) gehalten, wodurch die Gelatine stark quoll. Unter Zusatz von 20 g Glycerin wurde die gequollene Gelatine dann durch Erhitzen auf 60 °C geschmolzen. Zu einem Teil von 33,3 g dieser gly-cerinhaltigen Gelatine wurden 27,8 g Glycerin und 33,9 ml der vorstehend genannten Lösung A gegeben. Das Gemisch wurde bei 60 °C gerührt, bis es homogen war. Nach der Bildung eines homogenen Gemisches wurden 5 ml der Lösung A, die 83 bis 533 mg eines synthetischen Peptids der Formel (Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 enthielt, zugesetzt. Das Gemisch wurde bei 60 °C geschmolzen, bis es homogen war, in Formen gegossen und abgeschreckt. Hierbei wurden Vaginalpräparate (pH 3,5) für Ratten erhalten, die 50 bis 200 ng Peptid enthielten. Jedes Suppositorium wog 60 mg.

Beispiel 9

1,5 g Xanthangum wurden in 47 ml der Lösung A dispergiert. Die Dispersion wurde bei etwa 90 °C gerührt, bis sie homogen war. Getrennt hiervon wurden 1,5 g Johannisbrot-kerngum in der gleichen Weise in 45 ml der Lösung A dispergiert. Die Dispersion wurde bei etwa 90 °C gerührt, bis sie homogen war. Die beiden Flüssigkeiten wurden bei etwa 90 °C gemischt, wobei ein homogenes Gel erhalten wurde. Während auf 70 bis 80 °C erhitzt wurde, wurde eine Lösung von 20 bis 100 jig des Peptids (Monoacetat.Pentahydrat. -Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5) in 5 ml der Lösung A dem homogenen Gel zugesetzt. Das Gemisch wurde gut gerührt, bis ein homogenes Gel (pH 3,5) erhalten wurde. Zur Herstellung eines Vaginalpräparats für Ratten wurden 100 mg dieses Gels in einen Applikator gefüllt.

Beispiel 10

50 ml Lösung A, in der 0,12% Methylparaben und 0,012% Propylparaben gelöst worden waren (nachstehend wird die hierbei erhaltene Lösung als Lösung B bezeichnet), wurden auf etwa 80 bis 90 °C erhitzt, worauf 5 g Methylcel-lulose («Methorose 90 SH 4000», Hersteller Shin-etsu Kaga-ku, Japan) zugesetzt und unter Rühren gut dispergiert wurden. Getrennt hiervon wurde 1 g synthetisches Peptid der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 in 45 ml Lösung B gelöst. Die Lösung wurde gekühlt (etwa 4 bis 10 °C). Diese gekühlte Lösung wurde der vorstehend genannten Dispersion zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gut gerührt, bis sich ein homogenes Gel gebildet hatte. Zum Ausgleich des durch Verdampfung während dieses Arbeitsschrittes verlorenen Wassers wurde destilliertes Wasser zur Aulfüllung auf insgesamt 100 g zugesetzt. Anschliessend wurde das Gel (pH 3,5) zentrifugiert,

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

634992

entschäumt und in ein Rohr gefüllt, das dann verschlossen wurde. 1 g dieses Gels wurde in Vaginal-Einführröhrchen aus Kunststoff gefüllt, wobei wässrige Vaginalpräparate in Dosierungseinheiten für den menschlichen Gebrauch mit je 10 mg Peptid erhalten wurden.

Beispiel 11

250 mg des synthetischen Peptids der Formel (Pyr)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5 wurden genau abgewogen und in einer solchen Menge einer wässrigen Lösung gelöst, die 0,12% Methylparaben, 0,012% Propylpara-ben und 3,0% Bernsteinsäure (vorher mit einer geringen Menge lOn-NaOH auf pH 3,0 eingestellt) enthielt, dass das Gesamtvolumen 100 ml betrug. Ein Teil von 1 ml dieser Lösung (pH 3,0) wurde dann durch Sorption auf eine mit Glutaldehyd behandelte poröse Kollagenmatrix in einem Kunsts-toffapplikator aufgebracht, wobei eine vaginale Dosierungseinheit, die 2,5 mg des Peptids enthielt, erhalten wurde.

Beispiel 12

Ein synthetisches Peptid (Monoacetatpentahydrat; (Pyr)-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NH-C2H5) wurde in aliquoten Teilen von Clark-Lubs-Puffer (J. Bact. 2 (1) (1917) 109,191 (oder Sörensen Puffer (Ergeb. Physiol. 12 (1912) 3931) bei pH 2 bis 7 gelöst. Jede Lösung wurde auf ein Stück Watte (mit im wesentlichen vorbestimmtem Volu-5 men) aufgebracht und in die Vagina von Ratten eingeführt, um die pH-Abhängigkeit der ovulationsauslösenden Wirkung des Peptids zu untersuchen.

Ausgewachsenen weiblichen SD-Ratten (120 bis 150 io Tage alt, Körpergewicht 250 bis 350 g) wurde jedes Präparat während des Diöstrus vaginal verabreicht. Die Tiere wurden am nächsten Morgen autopsiert, um das Auftreten der Ovulation auf der Grundlage der Anwesenheit oder Abwesenheit von Ova in der Ampulla zu überprüfen. Die Ergebnisse sind 15 in Tabelle 4 genannt.

Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, dass die vaginale Resorption des Peptids pH-abhängig ist. Wenn der pH-Wert der Dosierungslösung von 6,70 bis 2,02 verändert wurde, 20 ging der ED50-Wert auf 1/4,5 zurück, ein Zeichen, dass eine bedeutend höhere Resorption erzielt werden kann, wenn die Lösung sauer eingestellt wird.

Tabelle 4

ph-Wert der Dosis (ng/100 g Körpergewicht der Ratte) EDS0 (ng/100 g Ratte)

Dosierungs- 20 30 40 50 60 80 100 150 200 (95%-Konfidenz-

lösung grenze)

6.70 4.76 3.47 2.02

2/10 5/10

0/10 4/10 4/10

4/20 12/20 13/20 15/20 15/15

0/10 2/10 3/13 8/10 5/5 6/10 7/10 10/10

8/10

144(115-201) 52 ( 44- 58) 67 ( 60- 79} 32 ( 23- 40)

n/n = Zahl der ovulierenden Ratten/Zahl der vaginal behandelten Ratten

Als Lösungsmittel für die Herstellung der Lösungen von pH 6,7 und pH 4,76 wurde Clark-Lups-Puffer verwendet. Als Lösungsmittel für die Lösungen von pH 3,47 und pH 2,02 wurde Sörensen' Puffer verwendet.

Beispiel 13

Das gleiche Peptid wie in Beispiel 12 wurde in wässrigen Lösungen, die pro Liter 0,238 Mol verschiedener wasserlöslicher aliphatischer Carbonsäuren enthielten und vorher mit geringen Mengen lOn-NaOH auf pH 3,5 eingestellt worden

40 waren, gelöst. Nach der in Beispiel 12 beschriebenen Methode erhielten Ratten vaginal je 0,2 ml/kg von jeder Lösung (pH 3,5) mit einer Dosis von 40 ng/100 g, um den Einfluss dieser Säuren auf die ovulationsauslösende Wirkung zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 genannt.

Tabelle 5

Zugesetzte organische Carbonsäure

Zahl der ovulierenden Ratten/ Zahl von vaginal behandelten Ratten (40 ng/100g Körpergewicht der Ratte)

Citronensäure

Weinsäure

Bernsteinsäure

Malonsäure

Essigsäure

Apfelsäure

0/10 9/10 2/10 10/10 7/10 5/10 3/10

Die Ergebnisse zeigen, dass diese aliphatischen Carbonsäuren die Resorption des aktiven Peptids erheblich förderten.

Anschliessend wurde ein Versuch zur Untersuchung des Einflusses der zugesetzten Säuremenge unter Verwendung von Citronensäure durchgeführt. Dieser Versuch ist in Beispiel 14 beschrieben.

Beispiel 14

Das gleiche Peptid wie in Beispiel 12 wurde als Wirkstoff verwendet. Aliquoten Teilen eines Phthalatpuffers (pH 3,5) 65 wurde Citronensäure in einer Menge von 1,2, 5, 7 und 10% (Gew./Vol.) zugesetzt. Der pH-Wert jeder Lösung wurde mit einer geringen Menge konzentriertem NaOH erneut auf 3,5 eingestellt. Diese Lösungen wurden Ratten auf die in

634 992

Beispiel 12 beschriebene Weise vaginal verabreicht, um den Einfluss verschiedener zugesetzter Mengen der Citronensäure auf die ovulationsauslösende Wirkung zu untersuchen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 genannt.

Tabelle 6

Konzentration der Citronensäure in der Dosierungslösung, %

Dosis (ng/100 g Körpergewicht der Ratte) 10 20 30 40 50

EDjo (ng/100 g

60 80 100 Körpergewicht der Ratte) (95%-Konfidenzgrenzen

0

0/10

2/10

3/13 8/10 5/5

67 (60-79)

1

0/10

1/10

6/10

5/10

8/10

44 (37-54)

2

1/10

2/10

4/10

6/10

53 (40-77)

5

1/10

4/10

6/10

9/10

23 (16-31)

7

0/10

5/10

9/10

20 (15-25)

10

2/10

7/10

10/10

15 (10-19)

n/n = Zahl der ovulierenden Ratten/Zahl der vaginal behandelten Ratten

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, dass die Adsorption des Peptids nach vaginaler Verabreichung mit steigenden Mengen der zugesetzten Citronensäure, einer mehrbasischen organischen Säure, stieg. Die Lösungen, die 1 bis 5% Citronensäure enthielten, wurden mit NaCl isotonisch gemacht.

Die Ergebnisse der in den Beispielen 12,13 und 14 beschriebenen Versuche zeigen, dass die vaginale Resorption eines Peptids mit LH-RH-Wirkung erheblich gesteigert werden kann, indem der pH-Wert einer Lösung sauer eingestellt und eine organische Säure eines bestimmten Typs der Lösung zugesetzt wird.

So ergibt ein Vergleich der ovulationsauslösenden Wirkung des Peptids bei verschiedenen Darreichungswegen,

dass der EDS0-Wert 3,8 ng/100 g (Körpergewicht der Ratte) bei intravenöser Verabreichung, 5,8 ng/100 g (Körpergewicht der Ratte) bei subkutaner Verabreichung und 9,9 ng/ 100 g (Körpergewicht der Ratte) bei vaginaler Verabreichung einer wässrigen Lösung, die mit 10% Citronensäure bei pH 2,0 ergänzt war, betrug.-Um eine gegebene ovulationsauslösende Wirkung zu erzielen, ist für das vaginale Präparat gemäss der Erfindung nur das 2,6fache der Peptid-menge wie bei intravenöser Verabreichung und die l,7fache Peptidmenge wie bei subkutaner Verabreichung erforderlich. Die ungewöhnliche Wirksamkeit des Vaginalpräparats gemäss der Erfindung ist auch daran erkennbar, dass die orale

Verabreichung die 1900fache Peptidmenge wie bei intravenöser Verabreichung, die rektale Verabreichung die 82fache Peptidmenge die bei intravenöser Verabreichung und die va-25 ginale Verabreichung mit dem öligen Arzneiträger («Witepsol S55») die 26fache Peptidmenge wie bei intravenöser Verabreichung erfordert.

Im Hinblick auf praktische Anwendungen wurde eine wässrige Lösung des Peptids ähnlich dem in Beispiel 12 ver-30 wendeten in aliquoten Teilen verschiedener wasserlöslicher Gele dispergiert. Die ovulationsauslösende Wirkung jeder Dispersion wurde ermittelt, um die Resorbierbarkeit zu bewerten.

35 Beispiel 15

Unter Verwendung des gleichen Peptids wie in Beispiel 12 und verschiedener wasserlöslicher Gele wurden Vaginalpräparate auf die in den Beispielen 12,13 und 14 beschriebene Weise sowie nach analogen Verfahren hergestellt. 40 Jedes Präparat wurde Ratten mit einem Glasapplikator vaginal in Dosen von 60 bis 100 mg verabreicht. Die ovulationsauslösenden Wirkungen wurden auf die in Beispiel 12 beschriebene Weise untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 genannt.

45 Es ist erkennbar, dass stets befriedigende Ergebnisse erhalten wurden, obwohl die Resorption des Peptids mit den verwendeten verschiedenen Gelgrundlagen etwas variierte.

Tabelle 7

Arzneiträger Dosis (ng/Ratte) ED50 (ng/Ratte)

30 40 50 60 70 80 100 120 150 200 (95%-Konfidenz-

grenzen)

Xanthangum

3% 1/10

3/10 7/10

8/10

9/9

45 (38—54)

Methylcellulose

5%

1/10

2/10

3/10 8/10

9/10

75 (67—86)

Glycerinhaltige

33%

0/10

2/10

4/15 6/9

179 (145—349)

Gelatine

GMC-Na

5%

1/7

5/5

Carrageenin

5%

2/5

5/5

5/10

9/10

Polyacrylsäure

5%

1/5

2/5

Agar

10%

0/5

4/5

Stärke

10%

1/10

5/5

GMC-Glycerin

5%

1/5

n/n = Zahl der ovulierenden Ratten/Zahl der vaginal behandelten Ratten

634992

10

Das gleiche Peptid wie in Beispiel 12 wurde in einem Puffer, der 10% Citronensäure enthielt (pH 2,0), gelöst. Nach vaginaler Verabreichung der Lösung (pH 2,0) auf die in Beispiel 12 beschriebene Weise wurde die Konzentration von LH im Serum durch den Radioimmuntest in bestimmten Zeitabständen bestimmt. Zum Vergleich wurde eine Lösung

Beispiel 16

des gleichen Peptids in physiologischer Kochsalzlösung subkutan bzw. intravenös verabreicht, worauf die LH-Konzen-trationen im Serum in der gleichen Weise gemessen wurden. In allen Fällen entsprach die Dosis dem ED50-Wert für die ovulationsauslösende Wirkung.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 genannt.

Tabelle 8

Änderungen der LH-Konzentrationen im Serum nach einmaliger Verabreichung des Peptids bei Ratten im Diöstrus

(Mittelwert von mg/ml —

Standardfehler)

Minuten nach s.c.

i.v.

Intravaginal, Puffer

Verabreichung

5.8 ng/100 g

3.8 ng/100 g in Wattekügelchen

Körpergewicht

+ 5% Citronensäure, pH 2,9,9 ng/100 g Körpergewicht

0

27.2+ 2.7 (21 Ratten)

27.2 + 2.7 (21 Ratten)

27.2+ 2.7(21 Ratten)

10

40.9 + 5.3

116.5+ 8.2

30.4 + 5.5

20

78.5 + 15.1

90.5 + 16.6

35.2 + 7.1

40

138.0 + 19.3

120.5 + 16.0

28.0 + 2.5

60

297.0 + 89.5

323.5 + 51.4

76.4+ 21.3

120

561.0 + 68.5

208.5 + 24.9

648.0 + 207.5

180

170.0 ±50.6

46.6 + 9.4

628.0 + 137.2

240

44.1 + 10.0

35.9 + 7.9

357.0 + 89.0

300

25.8 + 4.9

41.8 + 18.4 .

93.0+ 11.9

360

56.1 + 19.3

43.0 +13.6

71.1 + 8.5

In jeder Gruppe wurden 5 Ratten verwendet, s.c. = subkutan, i.v. = intravenös

Die Ergebnisse zeigen, dass zwar die ovulationsauslösen-den Wirkungen vergleichbar sind, jedoch das Vaginalpräparat gemäss der Erfindung eine LH-Konzentration im Serum ergibt, die ein höheres Maximum aufweist und wesentlich länger anhält als bei subkutaner oder intravenöser Verabreichung.

LH-RH und synthetische LH-RH-Derivate haben stets sehr kurze biologische Halbwertzeiten im Körper, jedoch ergibt die Verwendung der Arzneiform gemäss der Erfindung, die eine Daueranwendung ermöglicht, eine lang anhaltende Konzentration im Blut bei Verabreichung einer einzelnen Dosis, so dass eine Verstärkung der LH-RH-Wirkimg mög-40 lieh ist. Die Vaginalpräparate gemäss der Erfindung sind ferner besonders wirksam bei bestimmten Anwendungen, beispielsweise wenn tumorhemmende Wirkungen angestrebt werden, wobei die LH-RH-Wirkung während eines längeren Zeitraums aufrechterhalten werden muss.

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