DE3851257T4

DE3851257T4 - Azyliertes Derivat von Superoxid-Dismutase und dieses enthaltende Zusammensetzung.

Info

Publication number: DE3851257T4
Application number: DE19883851257
Authority: DE
Inventors: Yukio Ando; Masayasu Inoue; Kozo Utsumi; Toshihiko Utsumi
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1987-05-21
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2008-05-21
Also published as: EP0292321B1; AU1649788A; DE3851257D1; EP0292321A2; AU607764B2; DE3851257T2; EP0292321A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Derivate der Superoxiddismutase "nachfolgend als "SOD" abgekürzt), insbesondere acylierte Superoxiddismutasen (nachfolgend als "Ac-SOD" abgekürzt).
Superoxiddismutase (SOD) ist ein Enzym, welches ein für den lebenden Körper schädliches Superoxid (aktives Sauerstoffatom) spaltet und eliminiert und kommt in allen Eingeweiden und intracellulären Fraktionen (Cytoplasma und Mitochondrien) vor. Aber dieser schützende Mechanismus ist extrem schwach an der Zellmembran und außerhalb der Zellgewebe, so daß manchmal sehr gefährliche oxidative Schäden an diesen Bereichen auftreten können. Bis jetzt wurde, um solchen Schaden wegen oxidativ verletzten Gewebes zu beseitigen, SOD intravenös oder lokal verabreicht. Aber die auf die vorstehende Weise verabreichte SOD zeigt keine ausreichende schützende Wirkung, wegen seiner Instabilität im Körper und seiner kurzen Halbwertszeit (etwa 4 bis 6 Minuten).
Bis jetzt wurde SOD chemisch auf verschiedene Weise modifi ziert, um seine Halbwertszeit im Blut zu erhhen. Z.B. wurde SOD mit Polyoxyethylenglycol (JP-A-61-249388), polymerem Dextran (W. F. Petrone et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1159 (1980)) und Insulin (JP-A-58-32826) modifiziert.
Nichtsdestoweniger sind diese modifizierten SOD's noch mangelhaft, da das Ziel der Entwicklung der wie vorstehend modifizierten SOD's war, sie intravenös oder intramuskulär zu verabreichen, wobei der Schutz oxidativer Schäden des Gewebes im Blut durchgeführt wird. Die oxidativen Schäden (z.B. Entzündungen) des Gewebes beinhalten nicht nur Erkrankungen, die eine systemische Behandlung verlangen, sondern auch solche, die in den Augen (Keratitis und Keratohelkose), der Haut (Verbrennungen, verschiedene Dermatitiden oder dergleichen) und den Schleimhäuten der Mundhöhlen und der Verdauungstrakte, wie des Magens (verschiedene Entzündungen und Geschwüre) auftreten. Darüber hinaus tritt ein Biotoxin einer aktiven sauerstoffmolekularen Spezies (wie Superoxid) hauptsächlich an der Membran auf, und aus diesem Grund ist es wichtig, diese schädliche Sauerstoffspezies zu spalten und zu eliminieren, insbesondere um die Zellmembranen der letztgenannten Erkrankungen.
Obwohl die herkömmlich modifizierten SOD's im Blut stabil sind, handelt es sich dabei um riesige Moleküle, und aus diesem Grund haben sie z.B. den Nachteil, daß die Diffusion im einem Spalt zwischen den Geweben verringert ist und eine Wirkung nach Annäherung oder Bindung an der Oberfläche der Zellmembran unmöglich ist.
Die US-A-4,017,605 (äquivalent zur DE-A-25 39 778) beschreibt antiinflammatorische Orgoteinderivate mit Superoxiddismutase Aktivität, in denen die Aminogruppen acyliert sind. Die Verwendung von zumindest zehn Acylgruppen, von denen jede bis zu 8 Kohlenstoffatome aufweist, wird pro Molekül empfohlen.
Die Entwicklung eines neuen SOD-Derivates, welches nach Annäherung oder Bindung an der Zellmembran wirkt, wo die aktiven Sauerstoffmolekülspezien ihre Toxizität ausüben, ist gewünscht. Insbesondere zur Inhibierung oder Verringerung oxidativer Beschädigungen in den Geweben, wie dem Auge, der Haut und der Schleimhäute der Mundhöhle und des Verdauungstraktes, und daher besteht ein starkes Bedürfnis für die Entwicklung eines SOD-Derivates, welches enzymologisch stabil ist, keine Nebenwirkungen ausübt und an die Zellmembran bindet, d.h. das an der Oberfläche der Zellmembran gebunden werden kann oder schnell metabolisiert und ausgeschieden wird, wenn es im Blut ist und sehr wenige Nebenwirkungen ausübt.
Weiterhin wird es gewünscht bei der Verabreichung von SOD oder einem Derivat davon bei Erkrankungen der Cornea, eine Eintröpfelung anzuwenden, die eine routinemäßige und nicht aggressive Methode in der Ophthalmologie ist. Aber SOD und ihre herkömmlichen Derivate werden schnell von der Oberfläche der Cornea durch Tränen entfernt und können daher ihre Wirkung auf diese nicht ausüben. Aus diesem Grund besteht auch der Wunsch zur Entwicklung einer Zubereitung, welche auf der Cornea-Oberfläche für eine lange Zeit verbleibt und wirksam auf ihr wirken kann.
Es wurde nun gefunden, daß durch Acylierung von SOD mit verschiedenen Fettsäuren erhaltene Derivate auf den Oberflächen von verschiedenen Zellgeweben und einer Doppel-Lipidschicht binden können, um das vorliegende Superoxid zu eliminieren oder schnell im Blut metabolisiert und aus ihm ausgescheiden werden können, und das nicht ein riesiges Molekül ist. Darüber hinaus wurde gefunden, daß das vorstehend erwähnte neue Derivat der SOD pharmazeutisch nützliche Eigenschaften aufweist, welche nicht-modifizierte SOD und herkömmliche SOD-Derivate nicht zeigen. Insbesondere können die neuen SOD-Derivate an den Oberflächen der Zellmembranen von Cornea, Haut, Schleimhäuten des Verdauungstraktes, Erythrocyten und dergleichen gebunden und fixiert werden, und inflammatorische Erkrankungen, die an diesen Bereichen über einen langen Zeitraum auftreten, bemerkenswert inhibieren oder reduzieren. Die vorstehend erwähnten neuen Derivate von SOD haben insbesondere eine hohe Affinität gegenüber der Lipidschicht in der epithelialen Zellmembran der Cornea.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird ein acyliertes Derivat der Superoxiddismutase der allgemeinen Formel
[R-CO-]- -[-(NH) -E] (1)
bereitgestellt, in der R-CO- eine Acylgruppe einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen, m eine Zahl von 4 bis 8 und (NHm)E eine Gruppe der Superoxiddismutase (NH&sub2;)mE darstellen.
Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden solche Derivate enthaltende Zusammensetzungen und insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von Entzündungen, wie Keratohelkose bereitgestellt.
Spezifisch wird gemäß einer Ausführungsform eine Zusammensetzung bereitgestellt, die eine wirksame Menge des acylierten Derivats der Superoxiddismutase als ein präventives oder Heilmittel für eine durch direkte oder indirekte schädliche Wirkung von Superoxid verursachte Erkrankung, als ein Stabilisierungsmitel für ein Blutprodukt oder als ein Modifizierungsmittel für eine Oberfläche eines medizinischen Behälters zusammen mit einem geeigneten Träger enthält.
Darüber hinaus wird gemäß vorliegender Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Keratohelkose bereitgestellt, die das acylierte Derivat der Superoxiddismutase zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten.
Die Erfindung wird anhand der Figuren näher erläutert. In ihnen zeigen
Fig. 1 eine graphische Darstellung, die das Verhältnis zwischen der Acylierungszeit mit einer Zahl von acylierten Aminogruppen und der Restaktivität des Enzyms bei Acylierung von menschlicher SOD zeigt,
Figuren 2a und 2b die Ergebnisse einer Aagarosegel-Elektrophorese von nicht-modifizierten SOD's und acylierten SOD's von Mensch und Hefe,
Fig. 3 die Menge an an Erythrocyten im Serum und PBS-gebundenen nicht-modifizierten SOD's und acylierten SOD's,
Figuren 4a und 4b Sephadex G-200-Säulenchromatogramme von Reaktionsprodukten von nicht-modifizierten SOD's und acylierten SOD's (mit Myristinsäure modifizierte Hefe-SOD ) mit Liposom,
Fig. 5 Enzymaktivitäten (SOD's) für an Liposom gebundene nicht-modifizierte SOD und acylierte SOD, und
Fig. 6 Metabolismen für nicht-modifizierte SOD und acylierte SOD (modifiziert mit Caprylsäure) im Blut.
Das acylierte Derivat der Superoxiddismutase (Ac-SOD) gemäß vorliegener Erfindung hat typischerweise die Struktur der allgemeinen Formel
[R-CO-]- -[-(NH) -E] (1),
in der R-CO- eine Acylgruppe einer gesättigten oder ungesättigten, vorzugsweise gesättigten oder mono-ungesättigten Fettsäure mit 10 bis 16, insbesondere 12 Kohlenstoffatomen, m eine ganze Zahl von 4 bis 8 und (NH)mE eine Gruppe der Superoxiddismutase (NH&sub2;)mE darstellen.
Jede SOD von Organismen, wie Tieren (z.B. Mensch, Rind), Pflanzen und Mikroorganismen kann verwendet werden, um das Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung herzustellen. Die als Ausgangsmaterialien verwendeten SOD's können natürlich vorkommende Produkte sein oder solche, die durch Genmanipulation erhalten worden sind.
Das Verfahren zur Modifizierung von SOD mit Acylgruppen ist nicht beschränkt. Z.B. kann, falls Myristinsäure als Acylierungsmittel verwendet wird, Myristuchlond mit N-Hydroxysuccinimid umgesetzt werden, um einen aktiven Myristinsäureester zu bilden. Anschließend wird der aktive Ester tropfenweise zugesetzt und mit SOD in 0,1M NaHCO&sub3;-Lösung umgesetzt, um myristiliertes SOD zu bilden.
In der vorstehend genannten allgemeinen Formel (1) kann die Acylgruppe sich von jeglichen gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit einer ungeraden Anzahl von Kohlenstoffatomen herleiten. Vorzugsweise jedoch leitet sich die Acylgruppe von gesättigten Fettsäuren mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoffatomen wie z.B. Caprinsäure (C&sub1;&sub0;), Laurinsäure (C&sub1;&sub2;), Myristinsäure (C&sub1;&sub4;), Palmitinsäure (C&sub1;&sub6;) oder dergleichen her. Dies liegt darin, da gesättigte Fettsäuren mit einer geraden Anzahl von Kohlenstoffatomen im Körper natürlich vorkommen und in einem normalen Lipidmetabolismus gespalten werden können, um Energie zu erzeugen, was vom Gesichtspunkt der Toxizität bevorzugt ist.
Die Anzahl (m) der Acylgruppen kann durch verschiedene Reaktionsbedingungen zwischen dem aktiven Ester der Fettsäure und SOD gesteuert werden. In diesem Zusammenhang ist es notwendig darauf hinzuweisen, daß die Superoxiddismutase (E) andere als durch -(NH&sub2;) dargestellte Aminogruppen enthalten kann.
Es wird angenommen, daß die Acylgruppe des Ac-SOD eine Affinität zum hydrophoben Bereich der Oberflächenschicht der Zelle aufweist, und daß die Acylkette an der Oberfläche der Zellmembran reversibel bindet, um dadurch die gewünschten nützlichen Effekte auszuüben.
Im Vergleich zu der natürlichen (nicht-modifizierten) SOD, hat Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung eine höhere Affinität zu dem Lipid in der Zellmembran, wobei SOD per se örtlich an der Erkrankungsstelle in einem stabilen Zustand konzentriert werden kann. Darüber hinaus kann Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung stabil am Auge, der Haut und der Schleimhaut der Mundhöhle und des Verdauungstraktes einschließlich des Magens gehalten werden. Aus diesem Grund kann Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung z.B. zum Schutz gegen durch schädliche Wirkungen aktiven Sauerstoffs (Superoxids) verursachte Erkrankungen verwendet werden, insbesondere Lungen- oder Augener krankungen oder Strahlengefährdungen (insbesondere Hautgeschwüre), ein Hindernis für den Fortschritt durch Peroxidation von Lipid erzeugter Erkrankungen, z.B. Alterung, Schutz der Zellmembran oder als ein präventives oder heilendes Mittel für weite Bereiche von Entzündungserkrankungen, wie Dermatitis, Verbrennungen, Entzündungen der Mundhöhle oder des Verdauungstraktes (z.B. Osophagitis, Gastritis, Geschwüre im Verdauungstrakt).
Darüber hinaus kann die Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung Medikamente mit einem hohen Sicherheitsfaktor bereitstellen, wenn sie in Verbindung mit anderen Medikamenten (z.B. ein Anti-Krebsmittel zeigt starke Nebenwirkungen), die durch Erzeugung von Superoxid verursachte Nebenwirkungen zeigen, oder Hauterkrankungen, die durch mit Sonnenlicht oder Strahlung erzeutem Superoxid verursacht werden, verwendet werden. Das vorliegende Ac-SOD kann als ein stabilisierendes und haltbarmachendes Mittel für ein Blutprodukt, insbesondere ein konzentriertes Erythrocytenprodukt, verwendet werden.
Wenn die Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung im Blut aufgenommen wird, obwohl es beabsichtigt ist, daß es seine Wirkung auf die Oberfläche der Zellmembran ausübt, wird es schnell metabolisiert und von der Niere in den Urin ausgeschieden, ähnlich einem nicht-modifizierten SOD, und aus diesem Grund wird angenommen, daß nur eine geringe Chance zur Verursachung von jeglichen Nebenwirkungen besteht, die durch eine Retention der Ac-SOD über einen langen Zeitraum im Körper verursacht werden. Wenn Fettsäuren der gleichen Art wie diejenigen, die im menschlichen Körper vorkommen, für die Acylierung der SOD der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wird das Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung nicht nebeneffekt- und toxizitätsverursachende Metabolite erzeugen.
Das Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung kann zur Behandlung der vorstehenden Erkrankungen in verschiedenen Formen medizinischer Zubereitungen und durch verschiedene Verabreichungs methoden gegeben werden. Z.B. kann eine durch Lösen von Ac- SOD in einer 5 %-igen Glucoselösung oder physiologischen Kochsalzlösung hergestellte Zubereitung durch Eintröpfelung bzw. Einflößung oder Veneninfusion verabreicht werden. Eine Mischung einer geeigneten Menge (z.B. 0,2 bis 10 mg/ml) von Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung und eine 10 bis 30 %-ige Glycerinlösung können auf der Haut oder auf einem örtlichen Erkrankungsabschnitt aufgebracht werden.
Eine durch Mischen eines lyophilisierten Pulvers von Ac-SOD und einer geeigneten Menge an Lactose hergestellte Zubereitung kann als eine zum inneren Gebrauch geeignete Medizin verwendet werden. Wenn diese in ein Blutprodukt wie einem konzentrierten Erythrocytenprodukt eingebracht wird, können 1 bis 20 mg Ac-SOD zu 200 bis 400 ml des Produktes zugesetzt werden. Weiterhin kann die Ac-SOD-Lösung in Kontakt mit der Oberfläche eines medizinischen Behälters gebracht werden, wobei Ac-SOD an der Oberfläche absorbiert und als das Modifizierungsmittel dafür dient.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung der Keratohelkose, die Ac-SOD als wirksamen Bestandteil enthält, kann wie folgt hergestellt werden. Ac-SOD wird durch Acylierung modifiziert, aber es behält seine Proteineigenschaften bei. Aus diesem Grund sollte vorsichtig vorgegangen werden, wenn Ac-SOD gegen Mikroorganismen in einer wäßrigen Eintröpfelungs-Lösung stabilisiert wird. Um die Lagerstabilität sicherzustellen, wird vorzugsweise ein in der Ophthalmologie bekanntes Konservierungsmittel, z.B. Benzalkoniumchlorid, Cetylpyridiniumchlorid, Chlorbutanol oder Thyronesal individuell oder in Kombinationen in einer Menge von 0,001 bis 0,1 %, bezogen auf die Gesamtzubereitung, zugesetzt. Das osmotische Druckverhältnis ist vorzugsweise etwa 1. Als isotonisches Mittel können Natriumchlorid, Mannitol, Borsäure oder dergleichen verwendet werden. Der pH-Wert der Zusammensetzung beträgt vorzugsweise 7 bis 8, und als Puffer kann Phosphat, Borat, das Salz einer organischen Säure oder dergleichen, wie in den herkömmlichen Eintröpfelungslösungen verwendet werden. Darüber hinaus kann gegebenenfalls ein sicheres Verdickungsmittel und ein proteinstabilisierendes Mittel wie Dextrin oder Cyclodextrin eingearbeitet werden.
Eine geeignete Eintröpfelzusammensetzung (0,1 bis 3%) kann durch Lösen von lyophilisiertem Ac-SOD in destilliertem Wasser zur Injektion, die die Hilfszusätze enthält, Filtrieren und anschließendem Sterilisieren hergestellt werden. Die Additive können dem destillierten Wasser in jeder Reihenfolge zugesetzt werden. Wenn das lyophilisierte Ac-SOD unmittelbar vor seiner Verwendung in Wasser gelöst wird, kann es direkt in physiologischer Kochsalzlösung für die Injektion ohne Lagerungsstabilisatoren gelöst werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1: Acylierung von Hefe-SOD

N-Hydroxysuccinimid (36 mmol) wird in 20 ml Pyridin gelöst. Dieser Lösung wird in 50 ml Pyridin gelöstes Myristylchlorid (36 mmol) zugesetzt und bei Raumtemperatur während 12 Stunden gerührt. Nach Zugabe von 100 ml Ethylacetat wird die Reaktionslösung extrahiert und mit 1N HCl, einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Das Restwasser wird mit Natriumsulfat entfernt und das aus den vorstehenden Verfahrensschritten erhaltene Precipitat abgefiltert. Das erhaltene Filtrat wird zur Trockene konzentriert und aus Hexan und anschließend aus Ethanol umkristallisiert, wobei ein aktiver Ester der Myristinsäure erhalten wird.
2 mg (0,061 µMol) Hefe-SOD werden in 1 ml 0,1 M Natriumhydrogencarbonatlösung (pH 8,0) gelöst. Zu dieser Lösung werden 0,2 mg (0,61 µMol) des in 0,1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten aktiven Esters der Myristinsäure gegeben und die Reaktion unter Rühren bei 25ºC während 24 Stunden durchgeführt.
Nach Abschluß der Reaktion wird das Reaktionsprodukt durch mit 20 mmol Phosphatpuffer, der 100 mmol NaCl (pH 7,4) (nachfolgend als "PBS" abgekürzt) enthält, equilibrierte Sephadex G-25-Säulenchromatographie (Durchmesser 1 x 30 cm) behandelt und die Dialyse der aktiven Fraktionen gegen PBS durchgeführt, wobei eine mit Myristinsäure modifizierte SOD erhalten wird.

Beispiel 2: Bindungseigenschaft von Ac-SOD gegen Erythrocyten

Rattenerythrocyten und 20 µg menschlicher SOD, die mit radioaktiv-markierter Caprinsäure, Laurinsäure oder Myristinsäure modifiziert ist, werden in 1 ml PBS oder Serum bei 27ºC während 30 Minuten inkubiert, zweimal mit 2 ml PBS gewaschen und anschließend die Menge des an die Erythrocyten gebundenen Enzyms bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Die Menge der an die Rattenerythrocyten gebundenen acylierten SOD ist zwei bis sieben mal so hoch wie die der nicht-modifizierten SOD. Die Bindungseigenschaft ist höher unter serumfreien Bedingungen (d.h. in PBS; Vgl. die untere Hälfte der Fig. 3).

Beispiel 3: Bindungseigenschaft von Ac-SOD an Liposomen

In 0,5 ml PBS werden 2,5 mg Dipalmitoryl-L-α-phosphatidylcholin (DPPC)-Liposom suspendiert, um ein Liposom zu bilden. In 0,5 ml PBS gelöste Hefe-SOD oder mit Myristinsäure (0,5 mg) modifizierte Hefe-SOD werden dann zugesetzt und die Reaktion bei 25ºC während 30 Minuten durchgeführt. Anschließend wird eine Reinigung mittels Gelfiltration über Sephadex G-200 (Durchmesser 1 x 30 cm) durchgeführt. Fig. 4 zeigt das Säulenchromatogramm auf Sephadex G-200. In Fig. 4 ist die Absorption bei 240 nm, die von Liposom, und die Absorption bei 660 nm, die von Protein (Verfahren nach Lowry et al). Fig. 5 zeigt einen Vergleich der Aktivitäten zwischen nicht-modifizierter SOD und mit Myristinsäure modifizierter SOD und anschließender Bindung an Liposom. Obwohl die acylierte SOD an Liposom gebunden ist, ist ihre enzymatische Aktivität vergleichbar mit der von nicht-modifizierter SOD. Dieses Ergebnis zeigt, daß, falls Ac-SOD gemäß vorliegender Erfindung an die Oberfläche der Zellmembran gebunden ist, der Acylbestandteil an den Lipidbereich in der Membran gebunden ist, und daß die enzymatische Aktivität von Ac-SOD die gleiche ist, wenn sie in einer Lösung vorliegt oder wenn sie an die Membranoberfläche gebunden ist.

Beispiel 4: Bindungseigenschaft von acyliertem menschlichen SOD an die Kornea und Konjunktiva

In das Auge einer Ratte werden 16 µg von mit Caprylsäure, Caprin-, Laurin- oder Myristinsäure modifizierte menschliche Erythrocyten-SOD eingetröpfelt. Nach 30 Minuten wird das Auge mit 2 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend die Menge der an die Kornea und Konjunktiva gebundenen Enzyme bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. In diesem Beispiel haben die vier verwendeten Ac- SOD's 5,5,3 und 4 Acylreste in einem Molekül, die sich von den vorstehenden Fettsäuren herleiten. Tabelle 1 Bindung und Absorption menschlicher acylierter SOD an Kornea und Konjuktiva von Ratten acylierte SOD Stelle nicht-modifizierte SOD Kornea µg (%) Konjunktiva µg (%) nicht absorbiert µg (%)
Das Auge wird mit 2 ml physiologischer Kochsalzlösung 30 Minuten nach der Eintröpfelung menschlicher SOD (16 µg/Auge) gewaschen. Ein Großteil der eingetröpfelten SOD wird durch Tränen vor dem Waschen entfernt, welches 30 Minuten später durchgeführt wird. "Nicht absorbiert" bedeutet die Menge an SOD in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung.
Aus Tabelle 1 ist es eindeutig, daß die Menge der an die Kornea und Konjunktiva gebundenen acylierten SOD 4 bis 10 mal so hoch war wie die der nicht-modifizierten SOD.

Beispiel 5: Verteilung von acylierter SOD in Kaninchenaugengewebe mit induzierter alkalischer Entzündung

Nicht-modifizierte SOD oder mit Laurinsäure modifizierte SOD (3 bis 5 Acylreste in einem Molekül), von denen jede mit ¹²&sup5;I markiert ist, werden in ein Kaninchenauge mit induzierter alkalischer Entzündung eingetröpfelt (200 µg; 400.000 cpm). Nach 12 Stunden werden die Radioaktivitäten an verschiedenen Stellen gemessen. Alkalische Entzündung des Auges wird durch Aufbringen einer kreisförmigen, mit 10 % Natriumhydroxidlösung imprägnierten Schwammfolie (Durchmesser 4 mm) auf die Kornea des Kaninchens während 5 Sekunden induziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Aktivitäten der nichtgespaltenen Enzyme sind in Klammern gesetzt. Tabelle 2 Verteilung acylierter SOD in Kaninchenaugengewebe mit induzierter alkalischer Entzündung Stelle nicht-modifizierte SOD acylierte SOD (Ac-SOD) Kornea Linse Iris Sklera
Nicht-modifizierte SOD und Ac-SOD werden jeweils in 200 µg/50 µl (400.000 cpm) eingetröpfelt.
Nicht-modifizierte SOD wird nicht in die tiefen Gewebe des Auges aufgenommen, aber die acylierte SOD wird in solche Gewebe aufgenommen. Dies zeigt, daß die hydrophobe Ac-SOD eine gute Permeabilität für Gewebezellmembranen hat.

Beispiel 6: Schützende Wirkung aylierter SOD gegen durch Endotoxin induzierte Keratohelkose

Eine Keratohelkose-Modell für einen Test wird durch Injektion von 10 µg Endotoxon in die Kornea eines Kaninchens induziert.
Dem Kaninchenauge werden 6 mal am Tag physiologische Kochsalzlösung oder 200 µg acylierte SOD (die gleiche gemäß Beispiel 5) eingetröpfelt und die schützenden Wirkungen auf die Gewebe während 7 Tagen überprüft. Die Leukocyten-Permeationsgrade der Konjunktiva, Wimpern, Kammerwasser und Iris sowie die Opazität der Kornea werden verglichen. Darüber hinaus werden Gesamtbeurteilungen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Wirkung der SOD auf durch Endotoxin induzierte Augenentzündung Zeit nach der Endotoxin-Injektion (Tag) beobachtete Stelle (Physiologische Kochsalzlösung) Konjunktiva Wimper Kornea Kammerwasser Iris Gesamt (acylierte SOD-Verabreichung)
(Die Zahlen 0 bis 5 zeigen die visuelle Wertung von leichtesten zu schwersten Zuständen)
Die Verabreichung acylierter SOD bewirkt eine beträchtiche Heilung der Erkrankungen.
Die Ergebnisse zeigen, daß acylierte SOD's gemäß vorliegender Erfindung eine gute Biokompatibilität und Permeabilität für Gewebezellmembranen zeigen, die enzymatische Aktivität der acylierten SOD die gleiche ist, ob in Lösung oder an der Membranoberfläche gebunden, und die acylierte SOD wirksam für Geschwüre und Entzündungen der Kornea ist.

Zubereitungsbeispiel

Die Eintröpfelungszubereitung wird durch Lösen von acylierter SOD (1,5 %), Dikaliumglycyrrhizinat (0,1 %), Borax (0,3 %), Borsäure (0,45 %), Chlorbutanol (0,15 %), Benzalkoniumchlorid (0,01 %) und Natriumchlorid (0,15 %) in gereinigtem Wasser hergestellt und unter sterilen Bedingungen gefiltert.

Claims

1. Acyliertes Derivat der Superoxiddismutase der allgemeinen Formel

[R-CO-]- -[-(NH) -E] (1),

in der R-CO- eine Acylgruppe einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 10 bis 16 Kohlenstoffatomen, m eine Zahl von 4 bis 8 und (NH)m E eine Gruppe der Superoxiddismutase (NH&sub2;)m E darstellen.

2. Acyliertes Derivat der Superoxiddismutase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Acylgruppe 10 Kohlenstoffatome enthält.

3. Zusammensetzung enthaltend eine wirksame Menge eines acylierten Derivates der Superoxiddismutase nach Anspruch 1 oder 2 als ein Präventiv- oder Heilmittel für eine durch eine direkte oder indirekte schädigende Wirkung des Superoxids hervorgerufene Erkrankung, als ein Stabilisierungsmittel für ein Blutprodukt oder als ein Modifizierungsmittel für eine Oberfläche eines medizinischen Behälters, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Träger.

4. Eine, eine wirksame Menge eines acylierten Derivates der Superoxiddismutase nach Anspruch 1 oder 2, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, enthaltende entzündungshemmende Zusammensetzung.

5. Entzündungshemmende Zusammensetzung nach Anspruch 4 zur Behandlung der Keratohelkose.

6. Verwendung eines acylierten Derivates der Superoxiddismutase nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung der Keratohelkose.