JPS63287482A - ス−パ−オキサイドディスムタ−ゼ誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はスーパーオキサイドディスムターゼ（以下ＳＯ
Ｄと略す）の新規な誘導体に関し、更に詳しくは、アシ
ル化スーパーオキサイドディスムターゼ（以下Ａｃ　−
ＳＯＤと略す）、並びにＡｃ　−５００を含有する医薬
品として有用な組成物、すなわち、スーパーオキサイド
（活性酸素分子）が直接または間接的に生体に有害な作
用を及ぼす疾患の予防及び治療剤、血液製剤の安定化剤
、または医療容器表面の改善剤として用いる上記のアシ
ル化スーパーオキサイドディスムターゼを含有する組成
物に関する。

〔従来の技術〕

スーパーオキサイドディスムターゼ（Ｓ　ＯＤ）は、生
体に有害なスーパーオキサイド（活性酸素分子）を分解
消去する酵素であり、全ての臓器、細胞内画分（細胞質
およびミトコンドリア）に存在する。しかし、細胞膜お
よび組繊細胞外空間ではこのような防御機構は極めて不
十分であり、そのためこれらの局所で、時として生体に
極めて危険な酸化的病態が発現する。従来より、これら
の酸化的組織損傷病態を改善する目的でＳＯＤの静脈内
投与や局所投与が試みられてきてはいるが、いずれもそ
の生体内不安定性や短い半減期（４〜６分）の故に、そ
の防御作用を十分発現しうるには至っていない。

最近、ＳＯＤの血中半減期を延長させるため、ＳＯＤの
種々の化学修飾が行われている０例えば、ポリオキシエ
チレングリコール（特開昭６ｌ−２４９３８８）　、高
分子デキストラン０１．Ｆ、Ｐｅｔｒｏｎｅ　ｅｔ。

ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ　７７．１１５９（１９８０））、またはイヌリン
（特開昭５８−３２８２６）などによるＳＯＤの修飾が
行われている。しかし、これらの修飾ＳＯＤは、下記に
示すように種々の欠点を有し、問題点を十分解決するに
は至ってない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上記のＳＯＤ誘導体は全て、静脈内投与や筋肉内投与等
により、生体の酸化的組織障害を血中水溶液空間におい
て防御する事を目的として開発されたものである。

炎症をはじめとする生体の酸化的組織損傷には、全身性
の病態管理を必要とする疾患に加え、眼（角膜炎および
角膜潰瘍）、皮Ｈ（火傷、種々の皮膚炎等）、口腔およ
び胃消化管粘膜（種々の炎症および潰瘍病変）において
生ずる疾患も極めて多い、一方、活性酸素分子種（スー
パーオキサイドなど）の生体毒性が主として生体膜にお
いて発現するため、これらの疾患では特に細胞膜近傍で
有毒な酸素種を分解消去することが重要である。

上記のＳＯＤ誘導体は血中では安定ではあるが、巨大分
子化されているが故に、組織間隙への浸潤拡散が低下し
たり、また細胞膜表面に近接結合して作用することがで
きない等の欠点を有している。

これらのことから、活性酸素分子種の毒性発現の場であ
る細胞膜に近接結合して作用するＳＯＤ誘導体の開発が
望まれていた。特に、眼、皮膚、口腔および胃消化管粘
膜を主体とした酸化的組織損傷の阻止軽減には、酵素化
学的に安定で、副作用のない細胞膜結合性ＳＯＤ誘導体
すなわち、組繊細胞膜表面に結合し、また血中に吸収さ
れた場合には速やかに代謝排泄され副作用の極めて少な
いＳＯＤ誘導体の開発が急務である。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の問題点を解決すべく鋭意研究の結
果、ＳＯＤを種々の脂肪酸でアシル化することにより、
ＳＯＤを巨大分子化することなく、−しかも、種々の組
繊細胞の表面およびその脂質二重層に結合して、その局
所でスーパーオキサイドを消去し、また血中では速やか
に代謝排泄しうるＳＯＤ誘導体を開発し、本発明を完成
するに至った。

従って本発明はアシル化されたＳＯＤ誘導体を提供する
ものである。

〔発明の効果〕

本発明のＳＯＤ誘導体（Ａｃ　−５００）は、角膜、皮
膚、消化管粘膜および赤血球等の細胞膜表面に結合固定
化され、そこで起こる種々の炎症性病変を著明にかつ長
期間に亘り阻止軽減するという、従来のＳＯＤ誘導体や
未修飾ＳＯＤには見られない医薬上極めて有用な性質を
有するものである。さらに、この性質を利用して医療容
器表面の改善剤として本発明のＳＯＤ誘導体を使用する
ことも可能である。

〔具体的な説明〕

本発明のアシル化スーパーオキシドディスムターゼ（Ａ
Ｃ−５ＯＤ）の構造は一般式、（ＣＨｓ（ＣＨｔ）ｎｃ
ｏ）　ｍ　−（ＮＨ−５ＯＤ）で表わされ、アシル残基
ＣＨｓ（ＣＨｚ）ｎｃＯにおけるｎは好ましくは２から
１８の間のいずれかの整数であり、さらに好ましくは８
から１４で、最も好ましい数はｌＯである。また、式中
ｍは、ＳＯＤ　１分子当りにより結合するアシル残基数
を示し、好ましくは２から２０の整数、さらに好ましく
は４から８である。

本発明のＡｃ　−ＳＯＤの製造に用いるＳＯＤは動物（
例えばヒト、牛）、植物、微生物などの生物中に含まれ
ているものはいずれも使用出来る。また天然のもの、お
よび遺伝子組換え技術により得られたもののいずれでも
良い。

アシル基によってＳＯＤを修飾する場合の修飾法は特に
限定はされない。例えばアシル基としてミリスチン酸を
用いる場合、ミリスチン酸クロリドにＮ−ハイドロキシ
スクシニイミドを反応させ、ミリスチン酸活性エステル
を調製し、０．ＩＭＮａＨＣＯｓ溶液にとかしたＳＯＤ
に滴加反応させ、ミリスチル化’Ｓ　ＯＤを調製すれば
良い。

上記一般式中のアシル残基数ｎは、アシル基として用い
る飽和もしくは不飽和脂酸によって変えることができる
。例えば、ｎが６　、８．１０．１２゜１４　、１６　
、及び１８の場合は、各々カプリル酸、カプリン酸、ラ
ウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸
□、及びアラキン酸などを用いればよい。ここでは、ｎ
が偶数の飽和脂肪酸の例を示しているが、これは、生体
内で天然に存在し、かつ正常な脂質代謝系で分解されて
エネルギー源となり、生体毒性の面から好ましいからで
ある。

しかしながら、ｎが奇数の飽和または不飽和脂肪酸でも
よい。

ＳＯＤ１分子当りに結合するアシル残基数ｍは、各々の
脂肪酸活性化エステルとＳＯＤとの反応条件によりコン
トロールすることができる。

本発明のＡｃ　−５００の効果は、Ａｃ　−ＳＯＤのア
シル基が細胞表層の疎水域に親和性を有し、その結果、
アシル鎖が細胞膜表面に可逆的に結合することになるた
めと考えられる。

その結果、本発明のＡｃ　−ＳＯＤは天然型（未修飾）
ＳＯＤに比べ、細胞膜脂質との強い親和性を有し、しか
もＳＯＤ自身の疾患局部への局在安定化を可能ならしめ
る。また、本発明のＡｃ　−ＳＯＤは、眼、皮膚、口腔
内粘膜、胃および消化管粘膜にも安定に保持される。従
って、本発明のＡｃ　−５０口の用途としては、活性酸
素（スーパーオキサイド）が生体に有害に作用する疾患
、特に、肺疾患、眼科疾患、放射線障害の防？１１（特
に皮膚潰瘍病変）、老化をはじめとする脂質過酸化反応
による生体病変の進行阻止、細胞膜の保護、皮膚炎症、
火傷、口腔内炎症、消化管炎症（食道炎、胃炎、胃消化
管潰瘍など）など広い範囲に亘る炎症性病変の予防、ま
たは治療剤としての使用が可能である。

また、日光や放射線により発生するスーパーオキサイド
に起因する皮膚病変や、スーパーオキサイド発生が１１
１作用の原因となる薬剤、例えば副作用の強い制がん剤
などに併用することにより、安全性の高い薬剤を提出す
ることも可能である。また、本発明のＡｃ　−ＳＯＤは
、血液製剤、特に濃縮赤血球製剤の安定化および保存改
善剤として使用することも可能である。

本発明のＳＯＤ誘導体は、特に細胞膜表面で作用するが
、これが血中に吸収された場合には、未修飾のＳＯＤと
同様、速かに腎より尿中に代謝排泄される。従って、そ
れが体内に長時間とどまることに起こりうる副作用は極
めて少ないと考えられる。また、ＳＯＤのアシル化に用
いる脂肪酸を生体構成成分と同じものを使うことにより
、本発明のＳＯＤ誘導体の代謝産物による副作用および
毒性は皆無と考えられる。

本発明の＾ｃ’−５ＯＤを既述の疾患に用いる場合、種
々の薬剤形態あるいは投与方法が考えられる。

例えば、Ａｃ−５０口を５％ブドウ糖液または生理的食
塩水に溶解せしめた薬剤を、点眼または静脈注射しても
よい。また、皮膚又は局所に塗布して使用する場合は、
１０％から３０％グリセロール溶液に本発明のＡｃ　−
３００を適当量（例えば０．１■〜１０■／ｍｌ）混合
したものを用意すればよい。

内服薬としては、凍結乾燥したＡｃ　−ＳＯＤ粉末を適
当量の乳糖と混合した製剤も可能である。また、濃縮赤
血球溶液などの血液製剤に使用する場合は、Ａｃ　−３
０口を例えば該製剤２００〜４００ｍ１当り１及至２０
糖を添加さえしておけばよい。

さらに、医療容器表面の改善剤として用いる場合は、当
該容器の表面にＡｃ　−ＳＯＤ溶液を接触させ、表面吸
着せしめてもよい。

以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明する。

ス１」０エ　　　ＳＯＤのアシル Ｎ−ハイドロキシスクシニイミド（３６ｍ　ｍｏｌｅ）
を２０ｒｒｌのピリジンに？容解し、これにピリジン５
０ｍ１に溶解したミリスチン酸クロリド（３６ｍ　ｍｏ
ｌｅ）を添加し、室温で１２時間攪拌した。反応溶液に
１００ｍ１の酢酸エチルを加え抽出を行った後、ＩＮ塩
酸、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和塩化ナトリウム溶液
で洗浄し、残存する水分を硫酸ナトリウムで除去し、上
記操作過程で生じた沈澱物を口過により除去した。得ら
れた口液を濃縮乾固し、ヘキサンさらにエタノールによ
り結晶化を行い、ミリスチン酸活性エステルを調製した
。

酵母Ｓ　ＯＤ　２　ｍ（０，０６１μ５ｏｌｅ）を０．
１　Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８，０）　　１　
ｍｌに溶解させた後、これにＤＭＳＯ溶液Ｑ、ｌｎｌに
溶解した上記調製のミリスチン酸活性エステル０．２■
（０，６１μ５ｏｌｅ）を加え、攪拌下２５℃で２４時
間反応させた。

反応終了後、１００ｍＭ　Ｎａｃｌ含有２０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，４）（以下ＰＢＳと略記する。）で平
衡化した５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−２５カラムクロマトグ
ラフイー（φｌＸ３０ａｓ）に供した後、活性画分をＰ
ＢＳに対し透析を行い、ミリスチン酸修飾ＳＯＤを調製
した。

ｍ　　ヒトＳＯＤのアシル ヒト赤血球より精製したＳ　ＯＤ　３．３■を０．１Ｍ
炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８，０）　　１　ｍｌに
溶解させた後実施例１に記載された方法と同様の方法に
より調製されたカプリル酸活性エステルを加え、攪拌下
２５℃で反応を行い、以下実施例１と同じようにしてカ
プリル酸修飾ＳＯＤを調製した。

アシル化アミノ酸残基数及び残存酵素活性の経時変化を
第１図に示す、未処理ＳＯＤ及びアシル化ＳＯＤのアガ
ロースゲル電気泳動図を第２図に示す、第２図から明ら
かなごとく、均一なアシル化ＳＯＤが得られた。

なお、酵素活性の測定は次の如くして求めた。

光路１３セルに０．１ｍＭキサンチン、１ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸ナトリウム、２５μＭニトロブルーテト
ラゾリウムを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）　０．８　ｍｌにキサンチンオキシダーゼ溶液（
０，２Ｘ　１０−’ｕｎｉｔ／ｍＪ！　）　０．１ｍ１
２を入れ、これに測定可能な濃度に希釈した酵素液Ｑ、
１ｍ１を添加し全量をｌｎｌとし、分光光度計にて、２
５℃で反応を開始し、５６０ｎｍにおけるニトロブルー
テトラゾリウム還元の初速度（Ｖ）を測定する。また酵
素液の代りに蒸留水を加えた時のニトロブルーテトラゾ
リウム還元籾速度（Ｖ、）をも測定する。酵素力価は上
記反応条件下、ニトロブルーテトラゾリウムの還元籾速
度を５０％阻害する酵素量を１単位とした。

災施斑１Ａｃ−５ＯＤの、　　への　ム放射性標識した
カプリン酸−、ラウリン酸−またはミリスチン酸−修飾
ヒト型５Ｏ０２０μｇとラット赤血球をＰＢＳまたは血
清１ｍＪＩ中で３７℃にて３０分間インキエベートした
後、２ｍ１ＰＢＳで２回洗浄し、赤血球に結合した酵素
量を測定した。その結果を第３図に示す。

未処理ＳＯＤに比較してアシル化ＳＯＤは、ラット赤血
球に対し２〜７倍量結合した。この結合は、血清がない
状ａ（第３図の右側：　ＰＢＳ中）でより強く現われた
。

Ｕ全り汐側Ａエ　Ａｃ　−５００の１ポソームとの１七
人ジパルミトイルーし一α−フォスファチジルコリン（
ＤＰＰＣ）−リポソーム２．５■をＰ　Ｂ　３０．５ｍ
ｌに懸濁してリボゾームを形成し、これにＰＢＳｏ、５
ｍｉ！に溶解した酵母ＳＯＤまたはミリスチン酸修飾酵
母５ＯＤ（０，５■）を添加し、２５℃で３０分間反応
させた後、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００ゲルロ過（
φｌＸ３０ｃｍ）により精製を行った。

５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２００カラムクロマトグラム
を第４図に示す、第４図中、２４０ｎｍの吸光はリポソ
ームによる吸光を示し、６６０　ｎ　ｍの吸光はローリ
−法による蛋白質の吸光を示す。また未処理ＳＯＤ及び
リポソームに結合させたミリスチン酸修飾ＳＯＤの活性
の比較を第５図に示す。

アシル化ＳＯＤはリポソームに結合し、その酵素活性は
未処理ＳＯＤと同等の活性を示した。

これらの結果は、本発明のＡｃ　−５００が細胞膜表面
に結合する際には、その膜脂質部位がＡｃ　−ＳＯＤの
アシル部位と結合していること、またＡｃ　−ＳＯＤの
酵素活性は、溶液中および膜表面に結合した状態のいず
れでも同等に発現することを示唆している。

実見■１Ａｃ　　ＳＯＤの　　での′−放射性標識した
酵母由来の未処理ＳＯＤ及びカプリル酸修飾ＳＯＤにつ
いて、静脈内投与後の血中濃度変化を測定した。

測定方法は、ｄｄＹマウスを用い、マウス体重２５ｇに
対し放射性標識したＳＯＤおよびそのアシル化誘導体（
Ａｃ−５ＯＤ）　２０μｇを生理食塩水に溶解し、尾静
脈から注入後、経時的に血漿中のＳＯＤ濃度を測定した
。その結果を第６図に示す。

アシル化ＳＯＤは血中では未処理ＳＯＤと同等の挙動を
示し、すみやかに消失する。この結果は、体内に投与ま
たは吸収されたアシル化ＳＯＤは、未修飾ＳＯＤと同様
の代謝排泄過程により処理され、生体内に不必要に長く
とどまらないことを示している。このことは、本発明の
アシル化ＳＯＤによる未知の副作用発現を阻止する上で
も有効と考えられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒ）ＳＯＤのアシル化における、アシル化ア
ミノ酸残基数および残存酵素（ＳＯＤ）活性の経時変化
を示す。 第２図は、未処理ＳＯＤおよび種々の脂肪酸で修飾され
たアシル化ＳＯＤのアガロースゲル電気泳動を示す。 第３図は、血清中およびＰＢＳ中における未処理ＳＯＤ
及び各種のアシル化ＳＯＤと赤血球との結合量を示す。 第４図は、未処理ＳＯＤおよびアシル化５ＯＤ（ミリス
チン酸修飾酵母５ＯＤ）をリポソームと反応させた後の
５ｅｐｈａｄｅｘ　（セファデックス）Ｇ−２００カラ
ムクロマトグラムを示す。 第５図は、未処理ＳＯＤ及びリポソーム結合アシル化Ｓ
ＯＤの酵素（Ｓ　ＯＤ）活性を示す。 第６図は、未処理ＳＯＤ及びカプリル酸で修飾されたア
シル化ＳＯＤの血中での代謝経過を示す。 第１図 ■ ヒト型５ＯＣ） ＳＯＤ　　５ＣＸ）　　５００ 酵母Ｃｕ／Ｚｎ　５００ □ 第２図 Ｑｌ　　　２　　３４　　５６７ ラット赤血球へのＳＯＤの結合景 （μ９１１０細胞） 催−３Ｍ （２４０ｒｍ）　　０５Ｏ５１０１５（６６Ｑｎ画分番
号 ３＋１ムロ没−トム１へ＼：Ｎきく１１１旧ｍｅ　　　
　　　　　　　　堝ξ１ で 手続補正書（自発） 昭和６２年１り月々日 ２、発明の名称 スーパーオキサイドディスムターゼ誘導体３、補正をす
る者 事件との関係　　　特許出願人 名称　（１９０）サントリー株式会社 氏名井上正康 ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号（外
５名） ５、補正の対象 （１）　　明細書の「発明の詳細な説明」の欄（２）　
　明細書の「図面の簡単な説明」の欄６、補正の内容 （１）■　明細書第７頁第１４行目「不飽和脂酸」を「
不飽和脂肪酸」に補正する。 ■　同第９頁第１０行目「提出」を「提供１に　　″補
正する。 ■　同第１１頁第１８行目ｒＮａｃｌＪを’ＮａＣＩＪ
に補正する。 ■　同第１２頁第１１行目「アシル化アミノ酸残基数」
を「アシル化されたアミノ基数１に補正する。 ■　同第１３頁第２０行目「右側」をｒ下側ｊに補正す
る。 （２）　　同第１６頁第２〜３行目「アシル化アミノ酸
残基数」を「アシル化されたアミノ基数１に補正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アシル化されたスーパーオキサイドディスムターゼ
   誘導体。 ２、アシル基が炭素原子数４〜２０個の脂肪酸のアシル
   基である特許請求の範囲第１項に記載のスーパーオキサ
   イドディスムターゼ誘導体。 ３、スーパーオキサイドディスムターゼ１分子当りアシ
   ル基の数が２〜２０個である特許請求の範囲第１項に記
   載のスーパーオキサイドディスムターゼ誘導体。 ４、スーパーオキサイドが直接的または間接的に生体に
   有害な作用を及ぼす疾患の予防もしくは治療剤、血液製
   剤の安定化剤、または医療容器表面の改善剤として、ア
   シル化されたスーパーオキサイドディスムターゼ誘導体
   を有効量含有する組成物。