ES2354976T3 - Fosfatasa alcalina placentaria para controlar la diabetes. - Google Patents
Fosfatasa alcalina placentaria para controlar la diabetes. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2354976T3 ES2354976T3 ES03796758T ES03796758T ES2354976T3 ES 2354976 T3 ES2354976 T3 ES 2354976T3 ES 03796758 T ES03796758 T ES 03796758T ES 03796758 T ES03796758 T ES 03796758T ES 2354976 T3 ES2354976 T3 ES 2354976T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- palp
- glucose
- human
- active derivative
- physiologically active
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 title claims abstract description 77
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 title claims description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 title claims description 4
- 102100024321 Alkaline phosphatase, placental type Human genes 0.000 claims abstract description 429
- 108010031345 placental alkaline phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 398
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 157
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 146
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 82
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 claims abstract description 24
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 140
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 70
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 70
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 70
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 58
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 24
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 19
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 claims description 18
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 claims description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 11
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 11
- 229940123208 Biguanide Drugs 0.000 claims description 7
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 claims description 7
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 6
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 6
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 6
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 claims description 5
- 229940123464 Thiazolidinedione Drugs 0.000 claims description 5
- 229940127003 anti-diabetic drug Drugs 0.000 claims description 5
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 claims description 5
- 229940122199 Insulin secretagogue Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 3
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 claims description 2
- ZOBPZXTWZATXDG-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2,4-dione Chemical compound O=C1CSC(=O)N1 ZOBPZXTWZATXDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- XNCOSPRUTUOJCJ-UHFFFAOYSA-N Biguanide Chemical compound NC(N)=NC(N)=N XNCOSPRUTUOJCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 90
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 47
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 abstract description 21
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 abstract description 21
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 abstract description 18
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 abstract description 18
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 abstract description 18
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 abstract description 13
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 abstract description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 abstract description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 77
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 72
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 67
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 56
- GZCGUPFRVQAUEE-IFLZFJRASA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxy(114C)hexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[14CH]=O GZCGUPFRVQAUEE-IFLZFJRASA-N 0.000 description 51
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 47
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 39
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 32
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 32
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 27
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 27
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 23
- 230000004153 glucose metabolism Effects 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 21
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 21
- ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N streptozocin Chemical compound O=NN(C)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O ZSJLQEPLLKMAKR-GKHCUFPYSA-N 0.000 description 21
- ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N Streptozotocin Natural products O=NN(C)C(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O ZSJLQEPLLKMAKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229960001052 streptozocin Drugs 0.000 description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 18
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 17
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 17
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 14
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 11
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 11
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 11
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 11
- 230000009471 action Effects 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 8
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 7
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 7
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000004283 biguanides Chemical class 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 208000002249 Diabetes Complications Diseases 0.000 description 5
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 5
- 238000005567 liquid scintillation counting Methods 0.000 description 5
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 5
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 5
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 206010012655 Diabetic complications Diseases 0.000 description 4
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000007446 glucose tolerance test Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 4
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 150000001467 thiazolidinediones Chemical class 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 4
- SWLAMJPTOQZTAE-UHFFFAOYSA-N 4-[2-[(5-chloro-2-methoxybenzoyl)amino]ethyl]benzoic acid Chemical class COC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NCCC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 SWLAMJPTOQZTAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920004011 Macrolon® Polymers 0.000 description 3
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 3
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 3
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000000081 effect on glucose Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 3
- 229950004994 meglitinide Drugs 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 1-[(4s,5s)-4-azido-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-KJFJCRTCSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016621 Focal Adhesion Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010067715 Focal Adhesion Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000006790 cellular biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 2
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 2
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 2
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N pioglitazone Chemical compound N1=CC(CC)=CC=C1CCOC(C=C1)=CC=C1CC1C(=O)NC(=O)S1 HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 2
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000011421 subcutaneous treatment Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 1
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 208000021910 Cerebral Arterial disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 1
- FAEKWTJYAYMJKF-QHCPKHFHSA-N GlucoNorm Chemical compound C1=C(C(O)=O)C(OCC)=CC(CC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C=2C(=CC=CC=2)N2CCCCC2)=C1 FAEKWTJYAYMJKF-QHCPKHFHSA-N 0.000 description 1
- 208000002705 Glucose Intolerance Diseases 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 206010060378 Hyperinsulinaemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010023379 Ketoacidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710113100 Membrane-bound alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000008217 Pregnancy Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010035746 Pregnancy Proteins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- IRLXSDZTLYOBQH-WOUKDFQISA-N [(2r,3s,4r,5r)-3,4-dihydroxy-5-imidazo[2,1-f]purin-3-yloxolan-2-yl]methyl dihydrogen phosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CN2C=CN=C22)=C2N=C1 IRLXSDZTLYOBQH-WOUKDFQISA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960002632 acarbose Drugs 0.000 description 1
- XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N acarviostatin I01 Natural products OC1C(O)C(NC2C(C(O)C(O)C(CO)=C2)O)C(C)OC1OC(C(C1O)O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(O)C(O)C1O XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000593 adipose tissue white Anatomy 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 235000021074 carbohydrate intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000008727 cellular glucose uptake Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004580 glibenclamide Drugs 0.000 description 1
- WIGIZIANZCJQQY-RUCARUNLSA-N glimepiride Chemical compound O=C1C(CC)=C(C)CN1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)N[C@@H]2CC[C@@H](C)CC2)C=C1 WIGIZIANZCJQQY-RUCARUNLSA-N 0.000 description 1
- 229960004346 glimepiride Drugs 0.000 description 1
- 229960001381 glipizide Drugs 0.000 description 1
- ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N glipizide Chemical compound C1=NC(C)=CN=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZJJXGWJIGJFDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002303 glucose derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009229 glucose formation Effects 0.000 description 1
- 230000010030 glucose lowering effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N glyburide Chemical compound COC1=CC=C(Cl)C=C1C(=O)NCCC1=CC=C(S(=O)(=O)NC(=O)NC2CCCCC2)C=C1 ZNNLBTZKUZBEKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003451 hyperinsulinaemic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008980 hyperinsulinism Diseases 0.000 description 1
- 229940126904 hypoglycaemic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 201000001881 impotence Diseases 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006443 lactic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000011542 limb amputation Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 208000018773 low birth weight Diseases 0.000 description 1
- 231100000533 low birth weight Toxicity 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004784 molecular pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 230000007119 pathological manifestation Effects 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 208000030613 peripheral artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003614 peroxisome proliferator Substances 0.000 description 1
- 238000002135 phase contrast microscopy Methods 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960005095 pioglitazone Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000229 preadipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000009104 prediabetes syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000004726 rapid resolution liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000029964 regulation of glucose metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960002354 repaglinide Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229960004586 rosiglitazone Drugs 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 230000000276 sedentary effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
- C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Zoology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
PALP (fosfatasa alcalina placentaria) humana purificada, o un derivado fisiológicamente activo de la misma, para su uso en el tratamiento de la diabetes, mediante lo cual el derivado se selecciona de fragmentos de PALP que demuestran eficacias similares o más eficaces que PALP nativa.
Description
Campo técnico
La presente invención se refiere a métodos para usar fosfatasa alcalina placentaria humana, una enzima producida por la placenta humana durante el embarazo, para reducir el nivel de glucosa en sangre 5 en un mamífero. Pueden usarse regímenes de tratamiento proporcionados por la invención para controlar las formas de tipo 1 y tipo 2 de la diabetes en seres humanos.
Cambios recientes significativos en el comportamiento y estilo de vida humano así como en el entorno humano han dado como resultado la escalada de la diabetes durante las últimas décadas. La diabetes es una enfermedad caracterizada por niveles elevados de glucosa plasmática en sangre, o 10 hiperglucemia. La hiperglucemia, si no se controla, puede conducir a otras complicaciones, tales como ceguera, nefropatía, cardiopatía, accidente cerebrovascular, neuropatías, trastornos circulatorios e impotencia en hombres. La diabetes es una enfermedad crónica con diversas manifestaciones patológicas, y va acompañada de trastornos cardiovasculares y del metabolismo de lípidos así como trastornos del metabolismo glucídico. 15
La diabetes mellitus es un grupo heterogéneo de trastornos caracterizados por altos niveles de glucosa en sangre (azúcar). Existen dos tipos principales de diabetes. El tipo 1, o diabetes insulinodependiente, resulta de una deficiencia de insulina debida a destrucción autoinmunológica de los islotes de células pancreáticas productoras de insulina [Bell, G.I. y Polonsky, K.S., “Diabetes mellitus and genetically programmed defects in -cell function”. Nature 414, 788-791 (2001); Mathis, D., Vence, L. 20 y Benoist, C., “-cell death during progression to diabetes”. Nature 414, 792-798 (2001)]. Las personas con diabetes de tipo 1 deben tomar insulina exógena para su supervivencia para prevenir el desarrollo de cetoacidosis.
En la diabetes de tipo 2, o diabetes mellitus no insulinodependiente (DMNID), las células musculares, los adipocitos y las células hepáticas son resistentes a las acciones de la insulina. Además, 25 no funcionan apropiadamente los mecanismos compensatorios que se activan en las células para secretar más insulina para mantener los niveles de glucosa en sangre dentro de un intervalo fisiológico normal. La diabetes de tipo 2 representa aproximadamente el 90% de todas las diabetes [Saltiel, A.R., “New perspectives into the molecular pathogenesis and treatment of Type 2 diabetes”. Cell 104, 517-529 (2001)]. A los diabéticos de tipo 2 a menudo se les prescriben fármacos basados en o derivados de 30 sulfonilureas hipoglucemiantes, que se asocian con la estimulación de la producción de insulina en las células pancreáticas. Alternativamente, a los pacientes que padecen diabetes de tipo 2 también se les pueden prescribir fármacos basados en o derivados de biguanidas, que se asocian con el aumento de la sensibilidad de un paciente a la insulina.
La diabetes aqueja ya a un 6% estimado de la población adulta en la sociedad occidental, y se 35 pronostica que su frecuencia mundial crece en un 6% al año, alcanzando potencialmente un total de 200-300 millones de casos en 2010 [Zimmet, P., Alberti, K.G.M. y Shaw, J., “Global and societal implications of the diabetes epidemic”. Nature 414, 782-787 (2001)]. Las principales fuerzas que impulsan este aumento de la incidencia son un estilo de vida sedentario y un asombroso aumento de la obesidad.
La diabetes es una enfermedad potencialmente muy peligrosa porque está asociada con una 40 incidencia notablemente aumentada de enfermedad coronaria, cerebral y de arterias periféricas. Como resultado, los pacientes con diabetes tienen un riesgo mucho mayor de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, amputación de extremidades, insuficiencia renal o ceguera. La enfermedad cardiovascular ateroesclerótica es responsable del 80% de la mortalidad por diabetes y más del 75% de todas las hospitalizaciones por complicaciones diabéticas [Moller, D.E., “New drug targets for Type 2 45 diabetes and the metabolic syndrome”. Nature 414, 821-827(2001)]. Pruebas recientes indican que la hiperglucemia conduce a la sobreproducción de superóxido, lo que explica el daño vascular que, a su vez, es la base de la mayoría de las complicaciones diabéticas [Brownlee, M., “Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications”. Nature 414, 813-820 (2001); Ho, E. y Bray, T.M., “Antioxidants, NFB activation, and diabetogenesis”. Proc. Sac. Exp. Biol. Med. 222, 205-213 (1999)]. 50
A pesar de grandes variaciones en la ingesta de hidratos de carbonos con las diversas comidas, la glucemia normalmente permanece en un intervalo estrecho entre 4 y 7 mM en individuos no diabéticos. Tal control estricto se regula mediante el equilibrio entre tres mecanismos principales, es decir (i) absorción de glucosa desde el intestino, (ii) producción de glucosa por el hígado y (iii) captación y metabolismo de la glucosa por los tejidos periféricos, principalmente el músculo esquelético y el tejido 55 graso. En el músculo esquelético y el tejido graso, la insulina aumenta la captación de glucosa, aumenta la conversión de glucosa en glucógeno y aumenta la conversión de glucosa en grasa (principalmente triglicéridos). En el hígado, la insulina inhibe la liberación de glucosa a partir de glucógeno. La insulina es
la única hormona conocida que puede regular los tres mecanismos requeridos para mantener el nivel de glucosa en sangre en el intervalo normal [Saltiel, A.R. y Kahn, C.R., “Insulin signaling and the regulation of glucose and lipid metabolism” Nature 414, 799-806 (2001)].
En la actualidad, el único tratamiento disponible establecido para la diabetes de tipo 1 grave es la inyección de insulina diaria (a menudo múltiple). A parte de la incomodidad del procedimiento de 5 inyección, varios efectos adversos pueden acompañar al tratamiento con insulina, incluyendo hipoglucemia ocasionalmente grave (nivel de glucosa en sangre inferior al normal) y aumento de peso; desafortunadamente, este último efecto secundario puede hacer que el tejido diana sea incluso más resistente a las acciones de la insulina [U.K. Prospective Diabetes Study Group, “U.K Prospective Diabetes Study 16. Overview of 6 years’ therapy of Type 2 diabetes: A progressive disease”. Diabetes 44, 10 1249-1258 (1995)]. En una base experimental, el trasplante clínico de islotes también está ganando aceptación, particularmente para pacientes con hipoglucemia sintomática [Ryan, E.A., Lakey, J.R.T., Paty, B.W., Imes, S., Korbutt, G.S., Kneteman, N.M., Bigam, D., Rajotte, R.V. y Shapiro, A.M.J., “Successful islet transplantation: Continued insulin reserve provides long-term glycemic control”. Diabetes 51, 2148-2157 (2002)]; sin embargo, este método aún esta lejos de establecerse. Aparte del problema de que es 15 muy difícil ajustar la producción de insulina para satisfacer las necesidades del paciente, los inmunosupresores, que se usan para prevenir el rechazo del tejido trasplantado, pueden ejercer efectos secundarios potentes y no deseados. Es obvio que una sustitución incluso parcial de la insulina por un agente más seguro y eficaz que no requiera un procedimiento quirúrgico complicado beneficiaría en gran medida a los pacientes diabéticos de tipo 1. 20
En la diabetes de tipo 2, es esencial un control agresivo de la hiperglucemia mediante medicación; de lo contrario esta enfermedad evolucionará a la diabetes de tipo 1 incluso más peligrosa. Para este fin están disponibles varios fármacos en cinco categorías principales, actuando cada uno mediante un mecanismo diferente [Moller, D.E., “New drug targets for Type 2 diabetes and the metabolic syndrome”. Nature 414, 821-827 (2001)]: 25
- (A) Los secretagogos de insulina, incluyendo sulfonilureas (por ejemplo, glipizida, glimepirida, gliburida) y meglitinidas (por ejemplo, nateglidina y repaglinida), potencian la secreción de insulina actuando sobre las células pancreáticas. Aunque ésta terapia puede disminuir el nivel de glucosa en sangre, tiene eficacia y tolerabilidad limitadas. Además, provoca aumento de peso y a menudo induce hipoglucemia. Finalmente, los 30 pacientes a menudo se vuelven resistentes a este tratamiento.
- (B) Se piensa que las biguanidas (por ejemplo, metformina) actúan principalmente disminuyendo la producción de glucosa en el hígado. Las biguanidas provocan a menudo trastornos gastrointestinales y acidosis láctica, lo que limita su uso.
- (C) Los inhibidores de -glucosidasa (por ejemplo, acarbosa) disminuyen la absorción de 35 glucosa a partir del intestino. Estos agentes provocan a menudo también trastornos gastrointestinales.
- (D) Las tiazolidindionas (por ejemplo, pioglitazona, rosiglitazona) actúan sobre un receptor específico (receptor-gamma activado por proliferador de peroxisomas (PPAR)) en tejidos hepático, muscular y graso. Regulan el metabolismo de lípidos y por tanto 40 potencian la respuesta de estos tejidos a las acciones de la insulina. El uso frecuente de estos fármacos puede conducir a aumento de peso y puede inducir edema y anemia.
- (E) La insulina se usa en casos más graves, o bien sola o bien en combinación con los agentes anteriores.
Todas estas medicaciones se administran al paciente diariamente, a menudo dos o tres veces al 45 día.
Dado que cada agente que está usándose en el tratamiento médico de la diabetes tiene o bien efectos secundarios significativos o bien provoca el aumento de peso (que, a su vez, deteriora más las acciones de la insulina), o ambos, se necesitan urgentemente enfoques más nuevos para controlar la diabetes de tipo 2. Un nuevo tratamiento eficaz cumpliría los siguientes criterios: (a) no tendría efectos 50 secundarios significativos incluyendo inducción de hipoglucemia; (b) no provocaría aumento de peso; (c) sustituiría al menos parcialmente a la insulina actuando por medio de mecanismo(s) que es/son independiente(s) de las acciones de la insulina; (d) sería de manera deseable metabólicamente estable para permitir un uso menos frecuente (por ejemplo, una vez por semana); y (e) podría usarse en combinación con cantidades tolerables de cualquiera de las categorías de fármacos enumerados 55 anteriormente.
La fosfatasa alcalina placentaria (PALP) es un miembro del grupo de enzimas de fosfatasas alcalinas que hidrolizan compuestos que contienen fosfatos a pH alcalino. PALP madura es un dímero de dos subunidades glicosiladas idénticas. Una fuente primaria de PALP es la placenta humana, que sintetiza esta enzima durante el embarazo de modo que hacia el final del tercer trimestre el nivel de la enzima en el tejido placentario y la sangre materna/fetal es muy alto. Por tanto, es muy improbable que 5 PALP humana ejerza efectos tóxicos y patológicos en tejidos humanos. Las subunidades de la fosfatasa alcalina placentaria humana tienen un peso molecular aproximado de 66 kDa, tal como se determina mediante electroforesis en gel.
En 1965 se notificó una determinación de una semivida in vivo para PALP humana [Clubb, J.S., Neale, F.C. y Posen, S., “The behavior of infused human placental alkaline phosphatase in human 10 subjects”. J. Lab. & Clin. Med. 66, 493-507 (1965)]. En sujetos humanos, se notifica que PALP inyectada permanece notablemente estable en la circulación, con una semivida biológica estimada de aproximadamente 7 días. En los experimentos notificados, se inyectó PALP como constituyente minoritario en una mezcla de PALP y albúmina obtenida mediante extracción, sin purificación adicional. Los autores notificaron que PALP hasta la concentración sérica de 975 unidades “King-Armstrong” (KA) 15 parecía metabólicamente inerte, y plantearon la hipótesis de que PALP no realiza ninguna función fisiológica medible en la circulación.
Hasta hace poco se desconocía la función fisiológica de PALP, cuando Kiss y sus colaboradores descubrieron que, en fibroblastos de embrión de ratón y feto humano, la enzima funciona tanto como factor de crecimiento como promotor de la supervivencia en medio de cultivo deficiente en factor sérico 20 [She, Q.-B., Mukhezjee, J J., Huang, J.-S., Crilly, K.S. y Kiss, Z., “Growth factor-like effects of placental alkaline phosphatase in human and mouse embryo fibroblasts”. FE BS Lett. 469, 163-167 (2000); She, Q.-B., Mukherjee, J.J., Chung, T. y Kiss, Z., “Placental alkaline phosphatase, insulin, and adenine nucleotides or adenosine synergistically promote long-term survival of serum-starved mouse embryo and human fetus fibroblasts”. Cellular Signalling 12, 659-665 (2000)]. 25
El documento WO 02/072136 da a conocer que la fosfatasa alcalina placentaria interacciona de manera sinérgica con factores de crecimiento y factores séricos correspondientes estimulando la proliferación de fibroblastos adultos. Brock et al Brit. J. Obstetr. gyn, vol. 95, n.º 1, 1988 págs. 79-83 se refieren a la medición de AP en plasma materno como indicador del posterior desenlace de bajo peso al nacer. 30
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra una imagen de una separación en gel, que demuestra que PALP purificada homogénea usada para los experimentos descritos en los ejemplos 21, 22 y 24 no contienen ninguna proteína contaminante.
La figura 2 demuestra que en ratones en ayunas macho BDF1, la administración de una 35 preparación que comprende PALP comercial antes de una carga de glucosa redujo sustancialmente un aumento en el nivel de glucosa en sangre.
La figura 3 demuestra que en ratones macho BDF1, la aplicación intraperitoneal de estreptozotocina aumentó el nivel de glucosa en sangre aproximadamente 9 veces en tres días (), y que la administración previa de una preparación que comprendía PALP comercial redujo en gran media tal 40 aumento en el nivel de glucosa (♦).
La figura 4 demuestra que en ratones macho BDF1, la aplicación intraperitoneal de estreptozotocina disminuyó considerablemente el peso corporal a lo largo de un periodo de ocho días (), y que la administración previa de una preparación que comprendía PALP comercial evitó parcialmente la disminución en el peso corporal (♦). 45
La figura 5 indica que en adipocitos L1 diferenciados, PALP comercial estimula la captación celular de D-[14C]glucosa a diversos niveles de glucosa y suero en el medio de incubación.
La figura 6 demuestra que en adipocitos L1 diferenciadas, PALP comercial estimula la síntesis celular de glucógeno a partir de D-[14C]glucosa a diversas composiciones del medio de incubación.
La figura 7 demuestra que en adipocitos L1 diferenciados, PALP comercial estimula la síntesis 50 celular de lípidos a partir de D-[14C]glucosa a diversas composiciones del medio de incubación.
La figura 8 demuestra que en células musculares L6 diferenciadas, tanto PALP comercial 1 U/ml como insulina 50 nM potencian la captación y el metabolismo de D-[14C]glucosa tras tratamientos durante 6 horas; PALP e insulina en combinación tuvieron efectos aproximadamente aditivos.
La figura 9 muestra una imagen de una separación en gel que demuestra que la digestión de PALP humana con bromelina da como resultado la formación de un fragmento principal y varios fragmentos más pequeños, concomitante con la desaparición de la enzima PALP nativa.
La figura 10 demuestra que en adipocitos L1 diferenciados, un producto de la digestión de PALP humana con bromelina potencia la síntesis de glucógeno, pero no de lípidos, a partir de D-[14C]glucosa, 5 en relación con PALP nativa. La bromelina no afectó al nivel celular total de D-[14C]glucosa, aunque potenció ligeramente la síntesis de glucógeno y lípidos.
La figura 11 demuestra que en adipocitos L1 diferenciados, el tratamiento con o bien PALP comercial o bien insulina durante 6 horas disminuyó la cantidad de D-[14C]glucosa en el medio de incubación, lo que indica que ambos agentes potencian la captación celular de glucosa radiomarcada. 10
La figura 12 indica que en adipocitos L1 diferenciados, PALP comercial 1 U/ml es más eficaz que insulina 10 nM en la potenciación de la captación celular de D-[14C]glucosa, así como el metabolismo de la glucosa radiomarcada para formar glucógeno y lípidos, tanto a las 2 horas como a las 6 horas tras el tratamiento.
La figura 13 demuestra que en adipocitos L1 diferenciados, PALP comercial 1 U/ml es algo 15 menos eficaz que insulina 50 nM (suprafisiológica) en la estimulación de la captación y el metabolismo de D-[14C]glucosa, tanto a las 2 horas como a las 6 horas tras el tratamiento.
La figura 14 demuestra que en fibrablastos NIH 3T3 de embrión de ratón, PALP comercial es más eficaz que la insulina en la estimulación de la captación y el metabolismo de [D-14C]glucosa, y que la insulina no modifica el efecto de PALP cuando se usa en combinación con PALP. 20
La figura 15 indica que en adipocitos L1 diferenciados, las preparaciones preparadas a partir de diferentes lotes de PALP comercial (conteniendo cada preparación 1,5 U/ml) tienen efectos sobre la pérdida de D-[14C]glucosa a partir del medio de incubación que incluyen algo de variabilidad que parece ser mayor que el error interexperimental. Cada una de las preparaciones fue algo menos eficaz que insulina 50 nM. 25
La figura 16 indica que en adipocitos L1 diferenciados, las preparaciones preparadas a partir de diferentes lotes de PALP comercial tienen efectos sobre la síntesis de glucógeno y lípidos a partir de D-[14C]glucosa que incluyen algo de variabilidad.
La figura 17 demuestra que en adipocitos L1 diferenciados, PALP purificada homogénea es algo menos eficaz que la insulina en la reducción de la cantidad de D-[14C]glucosa en el medio de incubación. 30
La figura 18 demuestra que en adipocitos L1 diferenciados, PALP purificada homogénea es algo menos eficaz que la insulina en la potenciación de la captación y el metabolismo de D-[14C]glucosa.
La figura 19 demuestra que en adipocitos L1 diferenciados, un anticuerpo frente a PALP puede inhibir todos los efectos de PALP purificada homogénea sobre la captación y el metabolismo de D-[14C]glucosa. 35
Descripción detallada de la invención
La observación de los efectos estimuladores de PALP sobre la proliferación celular, descritos anteriormente, condujo a los experimentos descritos en los ejemplos en el presente documento. En un primer conjunto de experimentos, se determinaron los efectos de PALP sobre el nivel de glucosa en sangre mediante pruebas de tolerancia a la glucosa en ratones, así como en modelos para la diabetes de 40 tipo 1 y de tipo 2. En un segundo conjunto de experimentos, se observaron los efectos de PALP sobre la captación de glucosa celular en sistemas modelo apropiados para tejido graso (adipocitos L1 diferenciados) y músculo esquelético (células musculares L6 diferenciadas).
Los resultados de los conjuntos de experimentos demuestran que PALP tiene potentes efectos estimuladores independientes de insulina sobre el metabolismo y la captación de glucosa in vitro, y 45 efectos hipoglucemiantes significativos correspondientes in vivo, sin efectos patológicos y sin provocar aumento de peso. Los datos, combinados con otras observaciones que incluyen a) que altos niveles de PALP parecen ejercer sólo efectos fisiológicos positivos en mujeres embarazadas, y b) que la enzima es muy estable en la circulación, indican que es probable que PALP proporcione un control eficaz, seguro y sostenido de la hiperglucemia en pacientes diabéticos. Por consiguiente, la invención incluye el uso de 50 PALP como agente reductor de la glucemia eficaz y seguro, y como agente eficaz en un régimen de tratamiento para el tratamiento de la diabetes.
Método para reducir el nivel de glucosa en sangre
En una realización, la presente invención proporciona un método de reducción del nivel de glucosa en sangre en un mamífero, que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de fosfatasa alcalina placentaria (PALP) humana purificada, o un derivado activo seleccionado de fragmentos de PALP que demuestran eficacias similares o más eficaces que PALP 5 nativa. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones indica una dosificación que es eficaz en, o se dirige a, o bien conseguir un nivel de glucosa en sangre deseado o bien mantener un nivel de glucosa en sangre deseado a lo largo de un periodo de tiempo apropiado.
En la práctica de los métodos de esta realización, el mamífero puede ser un ser humano. El 10 método puede ser eficaz para reducir el nivel de glucosa en sangre de un ser humano hasta por debajo de aproximadamente 10 mM, y preferiblemente en el intervalo normal de aproximadamente 4 mM a aproximadamente 7 mM. El método puede usarse en un ser humano diabético, y puede usarse en combinación con la administración de un medicamento antidiabético.
El método también puede usarse para prevenir la aparición de la diabetes de tipo 2, para un ser 15 humano que está en riesgo de desarrollo de diabetes. En particular, el método puede ser apropiado para un ser humano que presenta un nivel de glucosa en sangre elevado de manera crónica, pero al que aún no se le ha diagnosticado diabetes. Además, el método puede ser útil para prevenir una evolución de diabetes de tipo 1 a diabetes de tipo 2. Esto es porque los niveles de glucosa en sangre continuamente altos asociados con la diabetes de tipo 2 conducen finalmente a la destrucción de las células 20 productoras de insulina en los islotes de Langerhans, lo que da como resultado una deficiencia en insulina.
El principio activo
El principio activo en los métodos y las composiciones de la presente invención es PALP humana, o un derivado activo tal como se definió anteriormente. Tal como se usa en el presente 25 documento, el término “PALP” y la expresión “PALP humana” se usan indistintamente para referirse a la fosfatasa alcalina placentaria humana.
Tal como se demuestra mediante los ejemplos en el presente documento, no se requiere la enzima PALP completa en su estado nativo para lograr un efecto reductor de la glucosa. Por tanto, los derivados activos de PALP son adecuados para la práctica de la presente invención. Por ejemplo, la 30 digestión de PALP mediante una proteasa, tal como bromelina, puede proporcionar un derivado activo. Asimismo, un experto en la técnica puede sintetizar o desarrollar un derivado activo que es un fragmento más pequeño de una secuencia de PALP que demuestra eficacia similar a la de la enzima PALP nativa. En la práctica de la presente invención, se prevé que los fragmentos de PALP puedan ser eficaces de manera similar o incluso más eficaces que la enzima PALP nativa, y se considera que cada uno son 35 derivados activos.
PALP humana en forma sólida está comercialmente disponible de Sigma Chemical (St. Louis, Missouri), por ejemplo (número de catálogo de Sigma P3895; número de registro CAS 9001-78-9). Otra fuente comercial de PALP humana es Calbiochem (San Diego, California; número de catálogo 524604).
PALP humana también puede obtenerse mediante extracción a partir de tejido placentario. Por 40 ejemplo, puede obtenerse una preparación parcialmente purificada mediante extracción con butanol de placenta homogeneizada. También son adecuados otros métodos de extracción a partir de tejido placentario.
PALP humana, o un derivado activo tal como se definió anteriormente, también puede obtenerse mediante síntesis química usando métodos convencionales. Por ejemplo, pueden usarse técnicas de 45 síntesis en fase sólida para obtener PALP o un derivado activo. También son adecuados métodos recombinantes de obtención de cantidades de PALP, tal como se conoce en la técnica.
Los métodos y regímenes de tratamiento descritos en el presente documento incluyen la administración de fosfatasa alcalina placentaria humana purificada, o dicho derivado activo. En la práctica de la presente invención, generalmente se administra PALP o un derivado activo en forma de una 50 preparación que comprende la enzima PALP o dicho derivado activo. El término “preparación” tal como se usa en el presente documento significa una composición que comprende PALP humana purificada o dicho derivado activo disuelto o dispersado en un vehículo. En una preparación para su administración a un ser humano, el vehículo debe ser un vehículo fisiológicamente aceptable.
El término “purificado” se usa en el presente documento para abarcar composiciones que se 55 obtienen a partir de un material de partida mediante una o más etapas de purificación (tal como extracción con disolvente, separación en columna, separación cromatográfica, etc.) que potencian la concentración
del agente activo en relación con el material de partida. El término “purificado” también abarca composiciones que contienen una cantidad significativa de agente activo en relación con las impurezas, se obtengan o no mediante un procedimiento de purificación. El término “purificado” no debe interpretarse que connota pureza absoluta.
Por tanto, la expresión “fosfatasa alcalina placentaria humana purificada” incluye composiciones 5 tales como una PALP humana parcialmente purificada disponible de Sigma Chemical, que se usó como material de partida para los experimentos descritos en los siguientes ejemplos.
También puede obtenerse una composición de PALP humana purificada, por ejemplo, mediante un procedimiento de purificación descrito en otra parte [She, Q.-B., Mukherjee, J.J., Huang, J.-S., Crilly, K.S. y Kiss, Z., “Growth factor-like effects of placental alkaline phosphatase in human and mouse embryo 10 fibroblasts”. FE BS Lett. 469, 163-167 (2000)].
El término “homogéneo” se usa en el presente documento para indicar una composición que produce una única banda de proteína en una separación en gel electroforética, tal como mediante la técnica de SDS-PAGE descrita en el ejemplo 1. Por tanto, la expresión “fosfatasa alcalina placentaria humana purificada homogénea” incluye composiciones que producen una única banda para la enzima 15 PALP en una separación electroforética. Puede obtenerse una PALP humana purificada homogénea, por ejemplo, mediante los procedimientos de purificación descritos en el ejemplo 1.
Una consideración separada es el grado de pureza que se requiere para el material de PALP que va a usarse en una preparación para su administración a un ser humano. Una ventaja del uso de una preparación que comprende PALP altamente purificada u homogénea en los métodos y regímenes de 20 tratamiento de la presente invención es que posibles efectos secundarios provocados por proteínas contaminantes no serán un problema. Sin embargo, preparaciones de PALP purificada menos exhaustivamente, tales como aquellas que comprende la PALP humana comercialmente disponible de Sigma, también pueden usarse siempre que pueda demostrarse su seguridad. Dado que cada etapa de purificación adicional da como resultado una pérdida significativa de la enzima, el uso de material de 25 PALP menos purificado para las preparaciones de PALP sería más económico.
Administración de PALP
Dado que PALP humana es una proteína relativamente grande, y sus acciones parecen implicar al tejido adiposo y músculo, su administración sistémica es un modo apropiado de administración.
A modo de ejemplo, la administración sistémica puede incluir la administración de una 30 preparación que contiene PALP. Para su administración a un ser humano, se disuelve o dispersa PALP humana purificada en solución salina fisiológica o en otro vehículo fisiológicamente aceptable, o se incluye en liposomas tales como immunoliposomas, u otras formulaciones o sistemas de administración tal como se conocen en la técnica, para producir una preparación que contiene PALP.
Por ejemplo, una preparación de PALP adecuada para la práctica de la presente invención 35 comprende PALP humana purificada disuelta en una solución salina fisiológica 0,9 N para producir una concentración de PALP de 10 mg/ml. Otra preparación de PALP adecuada comprende PALP humana purificada disuelta en solución salina fisiológica 0,9 N para producir una concentración de PALP de 30 mg/ml.
Una preparación de PALP puede administrarse mediante inyección, por ejemplo. Una 40 preparación de PALP puede administrarse mediante inyección intravenosa, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular, o cualquier otro modo de administración que garantice una distribución apropiada y una estabilidad relativa de la enzima en el organismo.
En una realización del método, se administra fosfatasa alcalina placentaria humana purificada, o 45 dicho derivado activo, a un ser humano. Un modo común para expresar una dosificación adecuada es gramos de agente activo por metro cuadrado de área de superficie corporal para el sujeto. Se conocen varias fórmulas para estimar el área de superficie corporal de un sujeto humano, basándose en la altura (en cm) y la masa (en kg) del ser humano. La tabla 1 enumera una variedad de fórmulas conocidas para estimar el área de superficie corporal (ASC) propuestas por investigadores. Pueden emplearse asimismo 50 otras fórmulas adecuadas.
Tabla 1. Fórmulas para estimar el área de superficie corporal (ASC)
- Autor(es)
- Fórmula de ASC
- Du Bois y Du Bois
- ASC(m2) = masa(kg)0,425 x altura(cm)0,725 x 0,007184
- Gehan y George
- ASC(m2) = masa(kg)0,51456 x altura(cm)0,42246 x 0,02350
- Haycock
- ASC(m2) = masa(kg)0,5378 x altura(cm)0,3964 x 0,024265
- Mosteller
- ASC(m2) = masa(kg)0,5 x altura(cm)0,5 x 0,016666
Preferiblemente, se administra una dosificación de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3 g/m2 de PALP humana purificada o dicho derivado activo al ser humano; más preferiblemente, se administra una dosificación de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1,0 g/m2 al ser humano. 5
El ser humano puede tener un nivel de glucosa en sangre elevado antes de la administración de PALP humana purificada. Por “elevado” quiere decirse que el nivel de glucosa en sangre del ser humano es mayor que el intervalo normal de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 mM. La administración sistémica de PALP preferiblemente reduce el nivel de glucosa en sangre en un ser humano hasta por debajo de aproximadamente 10 mM, más preferiblemente hasta por debajo de aproximadamente 8 mM y 10 lo más preferiblemente hasta dentro del intervalo normal de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 mM.
Debido al tamaño relativamente grande de la enzima PALP, se espera que su reparto en los tejidos diana tras su administración sea lenta. Preferiblemente, se administra PALP varias horas antes de una carga de glucosa esperada; más preferiblemente, se administra PALP al menos aproximadamente 12 15 horas antes de la carga de glucosa esperada; lo más preferiblemente, se administra PALP al menos aproximadamente 24 horas antes de la carga de glucosa esperada.
En otra realización del método, se administra PALP humana purificada, o dicho derivado activo, a un ser humano diabético. El ser humano diabético puede padecer diabetes o bien de tipo 1 o bien de tipo 2. 20
En el tratamiento de un ser humano diabético, la administración de PALP humana purificada puede usarse en combinación con insulina o cualquier medicamento antidiabético (es decir biguanidas, secretagogos de insulina tales como sulfonilureas o meglitinidas, inhibidores de -glucosidasa, tiazolidindionas y otros). En esta realización, el medicamento antidiabético se administra como parte de un curso de tratamiento planeado para la diabetes, conjuntamente con PALP humana purificada. El 25 medicamento antidiabético puede administrarse por vía oral o mediante cualquier otro método convencional. Aunque algunos medicamentos antidiabéticos pueden funcionar en combinación con PALP más eficazmente que otros, en la actualidad no se ha observado ninguna contraindicación del uso de cualquier medicamento en combinación con PALP.
Para el ajuste gradual del nivel de glucosa en pacientes diabéticos tratados con PALP, un 30 derivado de acción prolongada recientemente desarrollado del péptido-1 similar al glucagón (GLP-1), NN2211, puede ser especialmente útil como medicamento antidiabético. NN2211 tiene la propiedad útil de que potencia la secreción de insulina mediante el islote sólo a niveles de glucosa en sangre superiores a los normales [Rolin, B., Larsen, M.O., Gotfredsen, C.F., Deacon, C.F., Carr, R.D., Wilken, M. y Knudsen, L.B., “The long-acting GLP-1 derivative NN2211 ameliorates glycemia and increases -cell mass in 35 diabetic mice”. Am J. Physiol. Endocrinol. Metab. 283, E745-E752 (2002)].
En la combinación de tratamientos, la situación del paciente determinará si la administración de PALP se produce antes o tras la administración del medicamento antidiabético. Por ejemplo, si se requiere un control glucémico muy rápidamente, entonces se administrará en primer lugar insulina seguido por la administración de PALP; en esta realización la administración de PALP garantizará el 40 control glucémico de larga duración.
Régimen de tratamiento para tratar la diabetes
En otra realización, la invención proporciona un régimen de tratamiento para tratar la diabetes, que comprende administrar periódicamente a un ser humano diabético una cantidad terapéuticamente eficaz de fosfatasa alcalina placentaria humana purificada, o dicho derivado activo. El método puede 45 usarse en combinación con la administración de un medicamento antidiabético. El método puede ser eficaz para mantener el nivel de glucosa en sangre del ser humano por debajo de aproximadamente 10 mM, y preferiblemente en el intervalo normal de 4 mM a 7 mM.
El régimen de tratamiento emplea el mismo componente activo, fosfatasa alcalina placentaria humana purificada o dicho derivado activo, descrito anteriormente. El componente activo puede obtenerse y purificarse tal como se describió anteriormente.
La administración de PALP humana purificada en el régimen de tratamiento también puede llevarse a cabo tal como se describió anteriormente. Las preparaciones de PALP descritas en el presente 5 documento también son adecuadas para su uso en los regímenes de tratamiento.
Tal como se usa con respecto a los regímenes de tratamiento descritos en el presente documento, el término “periódicamente” se refiere a la administración repetida de PALP humana purificada dirigida a mantener el nivel de glucosa en sangre dentro de un intervalo deseado a lo largo del periodo de tratamiento. El término “periódicamente” incluye la administración repetida a intervalos fijos, 10 pero también incluye la administración repetida a lo largo de intervalos irregulares según requiera el estado del paciente. Además, en los regímenes de tratamiento de esta realización, la cantidad terapéuticamente eficaz de PALP humana purificada que se administra no necesita ser idéntica para cada administración separada. Puede administrarse PALP humana más o menos purificada en administraciones separadas, según dicten las necesidades del paciente. 15
Tal como apreciarán los expertos en la técnica, la dosificación y el número de tratamientos dependerán de la gravedad de la diabetes y la tolerancia del paciente individual. Preferiblemente, se administran al paciente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3 g/m2 una vez al día; más preferiblemente, se administran al paciente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1,0 g/m2 una vez al día; incluso más preferiblemente, se administran al paciente de aproximadamente 0,2 a 20 aproximadamente 3 g/m2 una o dos veces al día; y lo más preferiblemente se administran al paciente de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 3 g/m2 una vez cada dos semanas.
Se espera que en casos graves de diabetes tanto de tipo 1 como de tipo 2, la administración una vez a la semana, dos veces a la semana o diaria de PALP o derivado activo dará como resultado una reducción significativa del nivel de glucosa en sangre. El régimen de tratamiento puede ser eficaz para 25 mantener el nivel de glucosa en sangre de un ser humano por debajo de aproximadamente 10 mM, preferiblemente por debajo de aproximadamente 8 mM y lo más preferiblemente en el intervalo normal de 4 mM a 7 mM.
Además, la administración de un medicamento antidiabético en combinación con la PALP puede ayudar a normalizar completamente los niveles de glucosa. En los regímenes de tratamiento de esta 30 realización, puede usarse la administración de PALP humana purificada en combinación con insulina o cualquier medicamento antidiabético (es decir, biguanidas, secretagogos de insulina tales como sulfonilureas o meglitinidas, inhibidores de -glucosidasa, tiazolidindionas y otros) para garantizar el ajuste gradual del control glucémico según se requiera. El medicamento antidiabético puede administrarse por vía oral o mediante cualquier otro método convencional. Un derivado de acción prolongada 35 recientemente desarrollado del péptido-1 similar al glucagón (GLP-1), NN2211, puede ser especialmente útil. Aunque algunos de los medicamentos antidiabéticos pueden funcionar en combinación con PALP más eficazmente que otros, en la actualidad no se ha observado ninguna contraindicación del uso de cualquier medicamento en combinación con PALP.
Al tratar a un paciente diabético usando los regímenes de tratamiento descritos en el presente 40 documento, pueden conseguirse el control sobre los estados relacionados con la diabetes. Por ejemplo, el tratamiento mediante los regímenes de tratamiento puede ser eficaz para reducir la pérdida de peso asociada con la diabetes para un paciente que normalmente experimentaría perdida de peso cuando se trata mediante un método alternativo. Además, los regímenes de tratamiento pueden ser eficaces en el tratamiento de otras complicaciones relacionadas con la diabetes que se han vinculado con la 45 hiperglucemia. Las complicaciones relacionadas con la diabetes, relacionadas con la hiperglucemia, incluyen ceguera, insuficiencia renal y diversas neuropatías. [Brownlee, M., “Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications”. Nature 414, 813 (2001)].
Método para inducir pérdida de peso o reducir el aumento de peso
Otra realización de la invención proporciona un método para tratar a un ser humano para inducir 50 pérdida de peso o para reducir el aumento de peso, que comprende administrar regularmente fosfatasa alcalina placentaria humana purificada, o dicho derivado activo, al ser humano en una cantidad eficaz para inducir pérdida de peso, para reducir un aumento de peso esperado o para mantener un peso corporal constante para el ser humano a lo largo del tiempo.
El método puede ser particularmente adecuado para el tratamiento de un ser humano que 55 padece diabetes mellitus de tipo 2. Entonces, el método puede ser eficaz para inducir pérdida de peso o para reducir el aumento de peso que precede a, está provocado por, o está asociado con la diabetes.
El método también puede ser adecuado para tratar a una persona obesa, cuyo nivel de glucosa en sangre no está elevado, para inducir pérdida de peso. Además, el método puede ser adecuado para tratar a un ser humano que es obeso y no diabético, pero que tiene un nivel de glucosa en sangre elevado de manera crónica antes de comenzar el tratamiento. En esta realización, el tratamiento puede ser eficaz en la prevención de la aparición de la diabetes. 5
Tal como se usa en el presente documento, el término “obeso” se refiere a un estado en el que el índice de masa corporal (IMC) de una persona es de aproximadamente 30 kg/m2 o mayor. El índice de masa corporal se define como la masa de una persona (en kilogramos) dividida entre el cuadrado de la altura de la persona (en metros). Se sabe que las personas que están en la categoría de obesas están en mayor riesgo de desarrollar aumento de la glucemia (o “tolerancia a la glucosa deteriorada”), 10 insensibilidad a la insulina y finalmente diabetes de tipo 2.
El método puede ser útil además para inducir pérdida de peso o reducir un aumento de peso esperado que precede a la aparición de la diabetes para una persona en riesgo de diabetes de tipo 2. En esta realización, el tratamiento puede ser eficaz en la prevención de la aparición de la diabetes.
El método emplea el mismo componente activo, fosfatasa alcalina placentaria humana purificada 15 o dicho derivado activo, descrito anteriormente. El componente activo puede obtenerse y purificarse tal como se describió anteriormente.
La administración de PALP humana purificada en el método también puede llevarse a cabo tal como se describió anteriormente. A modo de ejemplo solamente, la etapa de administración puede realizarse mediante la inyección de una preparación que comprende un vehículo fisiológicamente 20 aceptable y fosfatasa alcalina placentaria humana o derivado activo, disuelta o dispersada en el vehículo. El modo de inyección puede ser intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular o intradérmico.
Las preparaciones de PALP descritas en el presente documento son adecuadas para su uso en los métodos. A modo de ejemplo, una preparación adecuada comprende fosfatasa alcalina placentaria humana purificada homogénea. 25
Tal como se usa con respecto a los métodos descritos en el presente documento, la expresión “administrar regularmente” se refiere a la administración repetida de PALP humana purificada dirigida a inducir pérdida de peso o reducir un aumento de peso esperado a lo largo del periodo de tratamiento. El aumento de peso esperado puede estar provocado por o asociado con la aparición de la diabetes, por ejemplo. El término “regularmente” incluye administración repetida a intervalos fijos, pero también incluye 30 administración repetida a lo largo de intervalos irregulares. Además, en los métodos de esta realización, la cantidad eficaz de PALP humana purificada que se administra no necesita ser idéntica para cada administración separada. Puede administrarse PALP humana más o menos purificada en administraciones separadas, según dicten las necesidades del paciente.
La etapa de administración regular puede incluir la administración de fosfatasa alcalina 35 placentaria humana o dicho derivado activo aproximadamente una vez cada dos semanas en algunas realizaciones. En otras realizaciones, la etapa de administración regular puede incluir la administración de fosfatasa alcalina placentaria humana o dicho derivado activo aproximadamente una vez a la semana, aproximadamente dos veces a la semana, o incluso aproximadamente una vez al día.
A modo de ejemplo solamente, la cantidad eficaz puede estar en el intervalo de 40 aproximadamente 0,2 gramos a aproximadamente 3 gramos por metro cuadrado de área de superficie calculada para el ser humano. En una realización, la cantidad eficaz está en el intervalo de aproximadamente 0,2 gramos a aproximadamente 1 gramo por metro cuadrado de área de superficie calculada para el ser humano. En otra realización, la cantidad eficaz está en el intervalo de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 3 gramos por metro cuadrado de área de superficie 45 calculada para el ser humano.
Preparación fisiológicamente aceptable de PALP homogénea
En otra realización, la invención proporciona una preparación para su administración a un ser humano, comprendiendo la preparación PALP humana purificada homogénea en un vehículo fisiológicamente aceptable. Puede obtenerse PALP humana tal como se describió anteriormente, y puede 50 purificarse hasta la homogeneidad mediante los procedimientos de purificación descritos en el ejemplo 1. A modo de ejemplo, la preparación puede ser una disolución que contiene PALP en la que se disuelve o dispersa PALP humana purificada homogénea en solución salina fisiológica. Alternativamente, la preparación puede comprender PALP humana purificada homogénea disuelta o dispersada en otro vehículo fisiológicamente aceptable, o incluida en liposomas tales como immunoliposomas, u otras 55 formulaciones o sistemas de administración que se conocen en la técnica.
La preparación puede contener adecuadamente, por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mg de PALP humana purificada homogénea por mililitro de preparación. Más adecuadamente, la preparación puede contener de aproximadamente 3 a aproximadamente 15 mg de PALP humana purificada homogénea por mililitro de preparación. Como ejemplo solamente, una preparación adecuada comprende PALP humana purificada homogénea disuelta en una solución salina 5 fisiológica 0,9 N para producir una concentración de PALP de 10 mg/ml. Otra preparación de PALP adecuada comprende PALP humana purificada homogénea disuelta en una solución salina fisiológica 0,9 N para producir una concentración de PALP de 30 mg/ml.
Ejemplos
Ejemplo 1. Purificación y ensayo espectrofotométrico de PALP. 10
Se obtuvo comercialmente PALP humana (tipo XXIV, 1020 unidades de actividad total) en una forma parcialmente purificada de Sigma Chemical. Sigma Chemical realizó una extracción con butanol de tejido placentario, seguido por una o más etapas cromatográficas, para obtener el material parcialmente purificado. La extracción con butanol inactiva la mayoría de las otras proteínas placentarias, incluyendo factores de crecimiento, pero no reduce la actividad o bien mitogénica o bien enzimática de PALP. 15
Tal como se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), la PALP parcialmente purificada obtenida de Sigma (“PALP comercial”) no era homogénea y contenía otras proteínas. La figura 1 muestra una imagen de una separación en gel de una preparación que comprende PALP comercial sin purificación adicional, y otras preparaciones de PALP de pureza creciente. El carril 2 representa una preparación que comprende PALP comercial, los carriles 3 y 4 20 representan preparaciones que comprenden material de PALP comercial tras etapas de purificación adicional (descritas a continuación), y el carril 5 representa una preparación de PALP purificada homogénea obtenida mediante el procedimiento de purificación completa descrito a continuación. El carril 1 contiene diversos patrones de masa molecular para la comparación.
Tal como puede observarse haciendo referencia a la figura 1 en el carril 2, la preparación que 25 comprende PALP comercial contenía proteínas distintas de PALP, y no produjo una banda homogénea en la separación electroforética. La preparación que comprende PALP comercial contiene al menos tres proteínas principales (una es PALP a aproximadamente 66 kDa, mientras que una banda a aproximadamente 52 kDa es 1-antitripsina) y varias proteínas minoritarias. Haciendo referencia al carril 5 de la figura 1, la preparación que comprende PALP purificada homogénea (obtenida mediante el 30 procedimiento de purificación completa descrito a continuación) contiene aparentemente sólo PALP.
Se realizó un procedimiento de purificación que consistía en varias etapas para purificar adicionalmente la PALP obtenida comercialmente y para producir una banda homogénea en la separación electroforética. Se siguió el mismo procedimiento de purificación que se describe en otra parte [She, Q.-B., Mukherjee, J.J., Huang, J.-S., Crilly, K.S. y Kiss, Z., “Growth factor-like effects of placental alkaline 35 phosphatase in human and mouse embryo fibroblasts”. FEBS Lett. 469, 163-167 (2000)].
Se preparó una preparación de PALP parcialmente purificada disolviendo 350 mg de PALP comercial en 10 ml de tampón A (acetato de sodio 0,1 M, NaCl 0,5 M, MgCl2 1 mM, CaCl2 1 mM, ajustado a pH 6,5). Entonces, se purificó adicionalmente esta preparación mediante cromatografía en concanavalina A-Sepharose y Q-Sepharose sucesiva, siguiendo esencialmente el procedimiento descrito 40 en otra parte [Chang, T.-C., Huang, S.-M., Huang, T.-M. y Chang, G.-G., “Human placenta alkaline phosphatase: An improved purification procedure and kinetic studies”. Eur. J. Biochem. 209, 241-247 (1992)], tal como sigue.
Se procesó la preparación a través de una columna de concanavalina A-Sepharose usando tampón A como disolvente. Para la elución, el tampón A incluyó -metil-D-manopiranósido 50 mM. Se 45 reunieron fracciones activas recogidas del efluente y se dializaron frente a tampón B (Tris-HCl 50 mM a pH 7,7). En la figura 1, en el carril 3, se muestra la separación en SDS-PAGE de la fracción recogida y dializada.
Entonces, se hizo pasar la fracción recogida y dializada de la etapa anterior a través de una columna de Q-Sepharose. Se eluyó la fracción de interés con tampón B usando un gradiente lineal de 50 fosfato de potasio 0-250 mM a un pH de 7,5. Se reunieron las fracciones activas de la columna de Q-Sepharose y se dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato y se concentraron mediante ultrafiltración Amicon. En la figura 1, en el carril 4, se muestra la separación en SDS-PAGE de la fracción recogida y dializada, que demuestra que al menos dos proteínas principales todavía están presentes en la fracción tras la diálisis. 55
Entonces, se purificó la fracción recogida y dializada de la etapa anterior hasta homogeneidad mediante cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) de t-butilo. Antes de añadir la fracción a una columna de HIC de t-butilo, se preparó la fracción en sulfato de amonio 2 M, y se ajustó el pH a 6,8. Se
conectó el cartucho de HIC de t-butilo de volumen de lecho de 5 ml (BIO-RADIATION, Hercules, California) a un sistema de cromatografía de líquidos de resolución rápida (FPLC) de PHARMACIA (Peapack, Nueva Jersey). Se introdujo la fracción en la columna de HIC, y se eluyó la columna con tampón C (tampón fosfato de sodio 100 mM, sulfato de amonio 2 M a pH 6,8). Se eluyó la columna con tampón C hasta que se eluyó completamente una fracción que contenía una primera proteína, y entonces 5 se hizo pasar sobre la columna un gradiente negativo de sulfato de amonio 2 M-0 M en fosfato de sodio 100 mM a pH 6,8. Se usó el gradiente lineal negativo para eluir una fracción que contenía una segunda proteína, que contenía la proteína PALP enzimáticamente activa.
Se dializó la fracción enzimáticamente activa de la separación con HIC frente a solución salina tamponada con fosfato y se concentró mediante ultrafiltración Amicon. Se confirmó la presencia y pureza 10 de la enzima PALP en la fracción mediante SDS-PAGE. Tras la separación electroforética, se tiñó el gel usando azul de coomassie o tinción de plata para la observación visual de bandas de proteínas. Se observó una única banda de proteína con un peso molecular aproximado de 66 kDa (figura 1, carril 5). Se realizó la identificación de la banda de PALP mediante análisis de secuencia por la Mayo Clinic Protein Core Facility (Rochester, Minnesota). 15
Se sometió a ensayo la actividad enzimática de PALP espectrofotométricamente monitorizando la hidrólisis de 4-nitrofenilfosfato (como un aumento en absorbancia a 410 nm) a temperatura ambiente (22ºC) tal como se describe en otra parte [Chang, G.-G., Shiao, M.-S., Lee, K.-R. y Wu, J.-J., “Modification of human placental alkaline phosphatase by periodate-oxidized 1,N6-ethenoadenosine monophosphate”. Biochem J. 272, 683-690 (1990)]. Se realizó el análisis de la actividad de 5-10 g de enzima purificada en 20 1 ml de volumen de incubación que contenía NaHCO3/Na2CO3 50 mM, MgCl2 10 mM, 4-nitrofenilfosfato 10 mM a pH 9,8. El coeficiente de extinción de 4-nitrofenol se tomó como 1,62 x 104 M-1 cm-1. Una actividad enzimática de 1 U (unidad) se define como 1 mol de sustrato hidrolizado/min. a 22ºC a pH 9,8.
Ejemplos 2-8- Efectos de PALP sobre los niveles de glucosa en sangre y el peso corporal en ratones. 25
Ejemplo 2. Determinación de niveles de glucosa en sangre en ratones sanos tratados y no tratados en pruebas de tolerancia a la glucosa.
Se prepararon dos preparaciones de PALP comercial, sin purificación adicional. Una primera preparación incluía PALP comercial 30 mg/ml en una solución salina fisiológica 0,9 N. Una segunda preparación incluía PALP comercial 10 mg/ml en una solución salina fisiológica 0,9 N. 30
En el experimento se usaron ratones macho adultos (de 10 a 12 semanas de edad) BDF1 híbridos de la primera generación (C57B1/6 hembras x DBA/2 machos), que pesaban 22-23 g cada uno. Estos animales, desarrollados en el Instituto Nacional del Cáncer (Budapest, Hungría), están en la categoría higiénica libre de patógenos específicos (SPF). Se mantuvieron los animales objeto en jaulas macrolon a 22-24ºC y humedad del 50-60%, con régimen de iluminación de 12 horas de luz/12 horas de 35 oscuridad. Los animales tenían libre acceso a agua corriente y se alimentaron con una dieta estándar esterilizada (Charles River VRF1, que puede esterilizarse en autoclave; Alemania) según las instrucciones proporcionadas. Los animales se cuidaron según los “Guiding Principles for the Care and Use of Animals” basados en la declaración de Helsinki.
Los ratones ayunaron durante 16 horas antes de la administración de glucosa. En este 40 experimento se trataron y se observaron cuatro grupos de ratones. Se trató un primer grupo mediante inyección intraperitoneal de 500 g de PALP comercial (inyección de 50 l de la segunda preparación) exactamente 16 horas antes de la administración intraperitoneal de glucosa (2 mg/ratón). Se trató un segundo grupo mediante inyección intraperitoneal de 1500 g de PALP comercial (inyección de 50 l de la primera preparación) 24 horas antes de la administración intraperitoneal de glucosa (2 mg/ratón). Se 45 trató un tercer grupo mediante 0,5 U.I. de insulina, 15 minutos antes de la administración de glucosa (2 mg/ratón). Un grupo control sólo recibió la administración intraperitoneal de glucosa (2 mg/ratón).
Se monitorizó la concentración de glucosa en sangre para los ratones de cada grupo, a lo largo de un período de seis horas tras la administración de la glucosa. Se tomaron muestras de sangre de la comisura de los ojos (canto), e inmediatamente se midieron las concentraciones de glucosa en muestras 50 de sangre completa con la prueba de glucosa C rápida (Wako Chemicals EE.UU. Inc., Richmond, Virginia). Los datos se muestran en el gráfico de la figura 2.
Los datos mostrados en la figura 2 demuestran que, para los ratones del grupo control (●), los niveles de glucosa en sangre aumentaron de 3,2 a 4,3 veces en el plazo de 0,5 a 6 horas tras la administración de glucosa intraperitoneal, con un aumento máximo en el punto de tiempo de 3 horas. 55 Para ratones que recibieron tratamiento con insulina (▲), la insulina fue eficaz para bloquear inicialmente (es decir, a los 30 minutos) un aumento brusco en el nivel de glucosa en sangre, pero en puntos de tiempo posteriores fue progresivamente menos eficaz, y en el punto de tiempo de 6 horas no tuvo ningún
efecto significativo. Para los ratones que recibieron 500 g de PALP (■), se observó un efecto similar al observado con insulina en los puntos de tiempo de 1, 3 y 5 horas. Finalmente, para los ratones que recibieron 1500 g de PALP (♦), el tratamiento con PALP dio como resultado mayores efectos inhibitorios sobre los niveles de glucosa que los observados con insulina en los puntos de tiempo de 1, 3 y 6 horas.
Este experimento de tolerancia a la glucosa indicó claramente que una cantidad apropiada de 5 PALP puede tener efectos a más largo plazo que cuando se usa insulina a una concentración que es segura en animales. En otros experimentos (no mostrados), se determinó que para lograr efectos máximos PALP necesita administrarse de aproximadamente 16 a aproximadamente 24 horas antes de la carga de glucosa. Se cree que la administración previa es más eficaz porque PALP es una molécula relativamente grande y su distribución en el organismo lleva tiempo. Esta observación es también una 10 indicación de que PALP es metabólicamente estable in vivo. De hecho, otros demostraron que en sujetos humanos inyectados PALP permanece extraordinariamente estable en la circulación con un tiempo de semivida biológica estimado de 7 días [Clubb, J.S., Neale, F.C. y Posen, S., “The behavior of infused human placental alkaline phosphatase in human subjects”. J. Lab. & Clin Med. 66, 493-507 (1965)]. Se espera que, para los regímenes de tratamiento descritos en el presente documento, la estabilidad 15 metabólica permitirá la administración de PALP una vez cada 5-14 días, a diferencia de prácticamente todos los fármacos antidiabéticos que están disponibles en la actualidad, que requieren dosis diarias (a menudo múltiples).
Ejemplo 3. PALP disminuye el nivel de glucosa en sangre en ratones BDF1 tratados con estreptozotocina.
Se usaron ratones macho BDF1, que pesaban 27-28 g cada uno. En este experimento, se 20 trataron y se observaron cuatro grupos de ratones. Inicialmente se trataron un primer grupo y un segundo grupo mediante inyección intraperitoneal de 1500 g de PALP comercial (inyección de 50 l de la primera preparación del ejemplo 2). No se trataron un tercer grupo y un cuarto grupo.
Veinticuatro horas después (día 0), se trataron una vez el primer grupo y tercer grupo con estreptozotocina (STZ) a una dosificación de 200 mg/kg. STZ se usa ampliamente para destruir 25 selectivamente células productoras de insulina en el islote mediante un mecanismo oxidativo. En este momento no se trataron el segundo grupo y el cuarto grupo. Entonces, se les administraron repetidamente a los ratones en los grupos primero y segundo 1500 g de PALP comercial mediante inyección intraperitoneal (inyección de 50 l de la primera preparación del ejemplo 2) en los días 2, 3, 4 y 5. 30
Se monitorizó la concentración de glucosa en sangre para cinco ratones de cada grupo, a lo largo de un período de seis días tras la administración de STZ (día 0). Se tomaron muestras de sangre de los ojos, y se midieron inmediatamente las concentraciones de glucosa en muestras de sangre completa mediante la prueba de glucosa C. Se determinó la concentración de glucosa en sangre en los días 0, 3, 4, 5 y 6. Los datos se muestran en el gráfico de la figura 3. 35
Los datos mostrados en la figura 3 demuestran que, para ratones del cuarto grupo (●) (no tratados), el nivel basal de glucemia era estable a lo largo del período de observación de 6 días. Para ratones del segundo grupo (▲), la administración de PALP no aumentó y, de manera importante, no disminuyó el nivel basal de glucemia. Para ratones del tercer grupo (■), tratados con STZ en ausencia de PALP, el nivel de glucosa en sangre aumentó 9 veces al tercer día y 10,9 veces al sexto día. Para el 40 primer grupo (♦), el tratamiento con PALP disminuyó el efecto de STZ en un 63-67%.
Estos experimentos indican claramente que la administración repetida de PALP es eficaz en la reducción de los niveles de glucosa en sangre para ratones que tienen células dañadas.
Ejemplo 4. PALP disminuye los niveles de glucosa en sangre incluso tras el tratamiento previo con STZ.
Se trataron inicialmente ratones macho BDF1 con STZ (200 mg/kg). Dos semanas tras los 45 tratamientos iniciales, se trataron los ratones con 1500 g de PALP comercial (inyección de 50 l de la primera preparación del ejemplo 2) una vez al día durante 5 días, y se determinó la glucemia como anteriormente en el sexto día. El tratamiento con PALP redujo el nivel de glucosa en sangre promedio desde 22,5 mM (n=5) para un grupo control hasta 11,5 mM (n=5) para el grupo tratado con PALP.
Este experimento indica fuertemente que el efecto de PALP sobre los niveles de glucosa en 50 sangre es independiente de la insulina, porque en los animales tratados con STZ prácticamente no queda control glucémico (tal como se muestra mediante el aumento de 10 veces en el nivel de glucosa en comparación con el cuarto grupo del ejemplo 3), lo que concuerda con la muerte masiva de células y la fuerte reducción o ausencia de insulina en la circulación. No se hizo ningún intento para determinar los efectos potencialmente mayores de concentraciones superiores de PALP. 55
Ejemplo 5. PALP disminuye la pérdida de peso corporal inducida por el tratamiento con STZ, y aumenta la vida de animales tratados con STZ.
En el mismo experimento descrito en el ejemplo 3, se midió el peso de cada uno de los ratones en los días 0, 2, 4, 6 y 8. Los datos se representan gráficamente en la figura 4, que muestra que ratones del cuarto grupo no tratado (●) y animales tratados con PALP del segundo grupo (▲) aumentaron poco de 5 peso, si es que lo hicieron algo, durante el período de observación de 8 días. Los ratones del tercer grupo (■) tratados con STZ en ausencia de PALP perdieron aproximadamente 5 gramos. La pérdida de peso para los ratones del primer grupo (♦) tratados tanto con PALP como STZ se inhibió en aproximadamente el 50%.
Se sabe que, en ausencia de insulina, se potencia la degradación de proteínas en músculos 10 conduciendo a la pérdida de peso (desgaste). En animales tratados con STZ, es casi seguro que este mecanismo desempeña un papel clave en la pérdida de peso. En un trabajo no publicado, Kiss y colaboradores encontraron que en células musculares L6 diferenciadas, la administración de PALP aumenta la síntesis de proteínas a partir de diversos aminoácidos (alanina, prolina, leucina, glutamina, metionina). Por tanto, la estimulación de la síntesis de proteínas en el músculo es probable que explique, 15 al menos en parte, la capacidad de PALP para prevenir parcialmente la pérdida de peso en animales tratados con STZ.
PALP, administrada o bien por vía subcutánea o bien por vía intraperitoneal, tuvo un efecto profundo sobre la supervivencia de animales tratados con STZ. De los 15 animales tratados con STZ sola, sólo 6 sobrevivieron hasta los 6 meses. Por otro lado, los 23 animales tratados con STZ (una vez) más 20 1,5 mg de PALP/ratón (durante al menos cinco días consecutivos) sobrevivieron durante al menos 8 meses. Debido a que convencionalmente puede garantizarse una alta tasa de supervivencia de animales tratados con STZ sólo con la inyección diaria de insulina, los efectos positivos de PALP sobre la supervivencia de los animales indican además que PALP tiene efectos fisiológicos similares a la insulina, pero independientes de la insulina, incluyendo la reducción del nivel de glucosa en sangre. La reducción 25 en el nivel de glucosa en sangre y el aumento de la síntesis de proteínas conjuntamente pueden explicar la capacidad de PALP para promover la supervivencia de estos animales.
Ejemplo 6. Determinación de los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos no obesos no tratados y tratados con PALP.
En este conjunto de experimentos, se determinó el efecto de PALP sobre los niveles de glucosa 30 en sangre en ratones hembra adultos diabéticos no obesos. Los datos para los experimentos se proporcionan en la tabla 2.
Se obtuvieron ratones hembra adultos (140-150 días de edad) consanguíneos diabéticos no obesos (NOD) que pesaban 22-26 g cada uno de Charles River Italia S.P.A. (Italia). La cepa de ratones NOD es un modelo animal espontáneo de diabetes de tipo 1 humana aislada de la sublínea CTS 35 propensa a cataratas de ratón ICR no consanguíneo. Los ratones también están en la categoría libre de patógenos específicos (SPF). Estos ratones se caracterizan por una incidencia acumulativa de diabetes, que alcanza el 60-80% en hembras y el 10-20% en machos a una edad de 150-200 días. En estos ratones, células T espontáneamente autorreactivas destruyen las células de los islotes productoras de insulina en el páncreas. 40
Las siguientes referencias proporcionan un resumen del entendimiento actual de cómo se desarrolla la diabetes en ratones NOD: Lyons, P.A., Armitage, N., Lord, C.J., Phillips, M.S., Todd, J.A., Peterson, L.B. y Wicker, L.S., “Mapping by Genetic Interaction: High resolution congenic mapping of the type 1 diabetes loci Idd10 y Idd18 in the NOD mouse”. Diabetes 50, 2633-2637 (2002); Kaufman, D.L., Tisch, R, Sarvetnick, N., Chatenoud, L., Harrison, L.C., Haskins, K., Quinn, A., Sercarz, E., Herrath, M., 45 Wegmann, D., Wen, L. y Zekzer, D., “Report from the 1st international NOD mouse T-cell workshop and the follow-up mini-workshop”. Diabetes 50, 2459-2463 (2001); Bonifacio, E., Atkinson, M., Eisenbarth, G., Serreze, D., Kay, T.W.H., Lee-Chan, E. y Singh, B., “International Workshop on lessons from animal models for human type 1 diabetes: Identification of insulin but not glutamic acid decarboxylase or IA-2 as specific autoantigens of humoral autoimmunity in nonobese diabetic mice”. Diabetes 50, 2451-2458 50 (2001).
Se mantuvieron los animales objeto en jaulas macrolon a 22-24ºC y humedad del 50-60%, con régimen de iluminación de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Los animales tenían libre acceso a agua corriente y se alimentaron con una dieta estándar esterilizada (Charles River VRF1, que puede esterilizarse en autoclave; Alemania) según las instrucciones proporcionadas. Se cuidaron los animales 55 según los “Guiding Principles for the Care and Use of Animals” basados en la declaración de Helsinki.
Para animales NOD tratados y control (180 días de edad), se tomaron muestras de sangre de la comisura del ojo, y se determinaron los niveles de glucosa en sangre iniciales (día 1) mediante la prueba
de glucosa C rápida. A lo largo de un período de once días, se inyectó una disolución de PALP comercial (30 mg/ml en solución salina fisiológica) en cuatro animales tratados (1,5 mg/ratón) por vía subcutánea (s.c.) o por vía intraperitoneal (i.p.) cuatro veces. Se administraron las inyecciones en los días 1, 3, 5 y 8. En el día 11, se tomaron muestras de sangre de la comisura del ojo para animales tanto tratados como control, y se determinaron los niveles de glucosa en sangre mediante la prueba de glucosa C rápida. 5
Tal como se indica mediante los datos en la tabla 2, para los tres ratones NOD no tratados, las concentraciones de glucosa en sangre aumentaron en 7,2-8,4 mM durante el período de 11 días. Por el contrario, en los cuatro animales tratados con PALP por vía subcutánea, los aumentos en los niveles de glucosa en sangre fueron considerablemente inferiores (en el intervalo de 0,6-3,1 mM). Para los animales tratados con PALP por vía intraperitoneal, hubo una reducción similar en el aumento (en el intervalo de 10 0,7-3,4 mM) en los niveles de glucosa en sangre (datos no proporcionados en la tabla 2).
Tabla 2. Cambios en los niveles de glucosa en sangre observados para ratones NOD tratados con PALP y no tratados.
- Ratones no tratados Ratones tratados con PALP (subcutánea)
- Sujeto
- 1 2 3 1 2 3 4
- Nivel de glucosa en sangre (mM) Nivel de glucosa en sangre (mM)
- Día 1
- 12,7 8,2 12,9 7,9 12,9 8,1 13,3
- Día 11
- 20,8 15,4 21,3 8,5 16,0 8,7 16,2
- Aumento
- 8,1 7,2 8,4 0,6 3,1 0,6 2,9
- Supervivencia (días)
- 12 22 16 <150 25 <150 27
Además, se observó que los ratones no tratados sobrevivieron durante no más de 22 días; por el 15 contrario, los ratones tratados con PALP sobrevivieron durante al menos 25 días, y hasta más de 150 días en algunos casos.
En este conjunto de experimentos, no se hizo ningún intento de examinar los efectos potencialmente más fuertes de administrar una mayor cantidad de PALP. Los resultados indican claramente que la administración de PALP reduce notablemente la subida en los niveles de glucosa en 20 sangre en el modelo diabético de tipo 1 no obeso.
Ejemplo 7. Determinación de los niveles de glucosa en sangre en ratones diabéticos obesos tratados con PALP y no tratados.
En este conjunto de experimentos, se determinó el efecto de PALP sobre los niveles de glucosa en sangre en ratones hembra adultos diabéticos obesos. Los datos para los experimentos se 25 proporcionan en la tabla 3.
Se obtuvieron ratones C57BI/6J Bom-ob hembra adultos (seis semanas de edad) consanguíneos diabéticos obesos que pesaban 33-37 g de Charles River Laboratories, Alemania. Estos animales están en la categoría higiénica libre de patógenos específicos (SPF). Se propagó una mutación en el gen de leptina, responsable de la obesidad, en la cepa consanguínea C57B1/6J (B1/6). Estos animales obesos 30 homocigotos (ob/ob) desarrollaron hiperglucemia, hiperinsulinemia y obesidad a las seis semanas de edad. En ese momento aumentó enormemente la ingesta de alimento.
Se mantuvieron los animales objeto en jaulas macrolon a 22-24ºC y humedad del 50-60%, con régimen de iluminación de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Los animales tenían libre acceso a agua corriente y se alimentaron con una dieta estándar esterilizada (Charles River VRF1, que puede 35 esterilizarse en autoclave) según el patrón prescrito. Se cuidaron los animales según los “Guiding Principles for the Care and Use of Animals” establecidos en la declaración de Helsinki.
En el día 43 (día 1 en la tabla 3), se dividieron los animales en cinco grupos (I-V) que consistían, cada uno, en cuatro animales, y se iniciaron los tratamientos tal como se especifica en la tabla 3. Se seleccionaron animales con altos niveles de glucosa en sangre de manera similar para cada uno de los 40 grupos I-V. En resumen, los tratamientos fueron: no tratados (grupo I); tratados con PALP comercial durante 28 días, 5 veces/semana, por vía intraperitoneal (grupo II); tratados con PALP comercial durante
28 días, 3 veces/semana, por vía intraperitoneal (grupo III); tratados con PALP comercial durante 28 días, 5 veces/semana, por vía subcutánea (grupo IV); tratados con PALP comercial durante 28 días, 3 veces/semana, por vía subcutánea (grupo V). Inicialmente, cada tratamiento consistió en 1,5 mg de PALP comercial/ratón en solución salina fisiológica; entonces, en el día 15 (grupo II y IV) o en el día 16 (grupo II y V) se aumentó la dosificación de PALP comercial hasta 3 mg/ratón. Se analizaron muestras de sangre 5 para determinar la glucosa en los días indicados en la tabla. Los datos del nivel de glucosa en sangre (BGL) son la media D.E. de determinaciones simultáneas individuales a partir de cuatro animales del grupo.
En la tabla 3 se tabulan los datos. Para los animales no tratados del grupo I, los niveles de glucosa en sangre aumentaron de manera constante a lo largo del período de 28 días. Sin embargo, tanto 10 para la administración intraperitoneal (grupos II y III) como para la subcutánea (grupos IV y V) de PALP, se observó una disminución constante en la glucemia en los animales objeto. Los datos indican además que la dosificación de 1,5 mg de PALP/ratón era eficaz en la disminución del nivel de glucosa en sangre, mientras que la dosificación de 3 mg/ratón era ligeramente más eficaz.
Debe observarse que los tratamientos intraperitoneal y subcutáneo fueron eficaces de manera 15 similar, proporcionando la administración intraperitoneal resultados algo mejores. También es digno de mención que el tratamiento de 5 veces/semana sólo fue ligeramente más eficaz que el tratamiento de 3 veces/semana para la administración o bien intraperitoneal o bien subcutánea. Los datos sugieren que, en seres humanos, puede no requerirse la administración diaria con el fin de controlar eficazmente la hiperglucemia. 20
Tabla 3. Cambios en niveles de glucosa en sangre observados en ratones diabéticos obesos tratados con PALP y no tratados. (BGL=Nivel de glucosa en sangre (mM))
- Grupo I Grupo II intraperito-neal Grupo III intraperito-neal Grupo IV subcutáneo Grupo V subcutáneo
- Día
- BGL D.E. BGL D.E. PALP BGL D.E. PALP BGL D.E. PALP BGL D.E. PALP
- 1
- 5,6 0,7 7,2 0,2 1,5 mg 7,6 0,9 7,1 0,5 1,5 mg 7,3 0,5
- 2
- - 7,3 0,2 1,5 mg 7,6 0,8 1,5 mg 7,1 0,4 1,5 mg 7,3 0,6 1,5 mg
- 3
- 5,8 0,9 6,6 0,2 1,5 mg 7,1 0,6 6,7 0,2 1,5 mg 7,3 0,6
- 4
- - 6,4 0,3 1,5 mg 6,8 0,2 1,5 mg 6,8 0,1 1,5 mg 6,8 0,4 1,5 mg
- 5
- 6,2 0,6 5,4 0,3 1,5 mg 6,4 0,5 6,5 0,1 1,5 mg 6,4 0,3
- 7
- - 5,1 0,2 1,5 mg 6,1 0,7 1,5 mg 6,3 0,2 1,5 mg 6,2 0,5 1,5 mg
- 8
- 7,6 1,2 5,0 0,5 1,5 mg 5,5 0,7 6,1 0,1 1,5 mg 5,8 0,3
- 9
- - 5,2 0,2 1,5 mg 5,7 0,6 1,5 mg 6,1 0,2 1,5 mg 5,7 0,5 1,5 mg
- 10
- 7,9 4,5 1,5 mg 5,5 6,1 1,5 mg 5,5
- 0,2
- 0,3 0,6 0,3 0,6
- 11
- - 4,4 0,3 1,5 mg 5,2 0,4 1,5 mg 5,9 0,3 1,5 mg 5,3 0,4 1,5 mg
- 14
- 8,6 1,3 4,6 0,2 1,5 mg 5,1 0,5 1,5 mg 5,7 0,3 1,5 mg 5,3 0,4 1,5 mg
- 15
- - 4,4 0,1 3 mg 4,8 0,4 5,2 0,3 3 mg 5,0 0,4
- 16
- 8,8 0,4 3,5 0,3 3 mg 4,4 0,4 3 mg 4,1 0,2 3 mg 4,2 0,2 3 mg
- 17
- - 2,9 0,2 3 mg 3,4 0,2 3,7 0,2 3 mg 3,6 0,2
- 18
- 8,0 0,2 2,7 0,2 3 mg 3,1 0,2 3 mg 3,5 0,1 3 mg 3,4 0,3 3 mg
- 21
- - 2,5 0,2 3 mg 2,9 0,3 3 mg 3,4 0,3 3 mg 3,3 0,2 3 mg
- 22
- 8,6 0,5 2,3 0,2 3 mg 2,7 0,2 3,6 0,2 3 mg 3,0 0,4
- 23
- - 2,4 0,3 3 mg 2,5 0,1 3 mg 3,1 0,1 3 mg 2,6 0,3 3 mg
- 24
- 8,8 0,5 2,3 0,1 3 mg 2,2 0,2 2,9 0,2 3 mg 2,6 0,3
- 25
- - 2,0 0,2 3 mg 2,1 0,3 3 mg 2,8 0,2 3 mg 2,5 0,3 3 mg
- 28
- 8,5 0,4 1,5 0,1 1,6 0,1 2,3 0,3 2,3 0,2
Ejemplo 8. Efecto del tratamiento con PALP sobre el peso corporal para ratones diabéticos obesos.
La obesidad se caracteriza por un aumento en el tejido adiposo y el peso corporal hasta un nivel que produce efectos adversos para la salud, incluyendo aumento del riesgo de desarrollo de diabetes. El tejido adiposo blanco secreta varios factores que regulan el equilibrio de energía y la homeostasis de todo 5 el organismo; uno de los factores más importantes de este tipo es la hormona leptina [F.M. Gregoire, “Adipocyte differentiation: From fibroblast to endocrine cell”. Exp. Biol. Med. 226, 997-2001 (2001)].
El gen responsable de la producción de leptina se denomina el gen ob. En animales ob/ob, la leptina secretada del tejido adiposo se trunca y de ese modo se inactiva [B.M. Spiegelman y J.S. Flier, “Obesity and the regulation of energy balance”. Cell 104, 531-543 (2001)]. Debido a la ausencia de la 10 regulación mediada por leptina, los animales ob/ob aumentan de peso sustancialmente, lo que conduce gradual e inevitablemente a una disminución de la sensibilidad a la insulina en los tejidos periféricos tales como músculo, tejido adiposo e hígado. Como consecuencia, en animales ob/ob el nivel de glucosa en sangre es alto debido a la captación y el metabolismo deteriorados de la glucosa por los tejidos periféricos, y al aumento de la producción de glucosa por el hígado, que normalmente se inhibe por la 15 insulina. El síndrome de obesidad en ratones ob/ob puede corregirse mediante la administración de
leptina [B.M. Spiegelman y J.S. Flier, “Obesity and the regulation of energy balance”. Cell 104, 531-543 (2001)].
De manera importante, los altos niveles de glucosa que se inducen por acontecimientos fisiológicos distintos a la obesidad no conducen a obesidad. Además, la disminución del nivel de glucosa no conduce necesariamente a pérdida de peso; es decir, un alto nivel de glucosa no es un factor de riesgo 5 para la obesidad. Por ejemplo, algunos de los agentes más importantes que se usan para tratar la diabetes disminuyendo el nivel de glucosa en sangre, incluyendo insulina, sulfonilureas y tiazolidindionas, pueden provocar aumento de peso significativo [véase la tabla 1 en D.E. Moller, “New drug targets for type 2 diabetes and the metabolic syndrome”. Nature 414, 821-827 (2001)], mientras que las biguanidas (por ejemplo, metformina) pueden provocar aumento de peso moderado [U.K. Prospective Diabetes Study 10 Group, “U.K Prospective Diabetes Study 16. Overview of 6 years’ therapy of Type 2 diabetes: A progressive disease”. Diabetes 44, 1249-1258 (1995)]. No se sabe que ninguno de los agentes hipoglucemiantes usados en la actualidad provoque pérdida de peso.
En vista de la regulación diferencial del peso de tejido adiposo y el nivel de glucosa en sangre, era de interés determinar si la administración de PALP también modifica el peso corporal que 15 principalmente resulta del aumento de peso del tejido adiposo en ratones ob/ob. Por consiguiente, en el experimento descrito en el ejemplo 7, también se midió regularmente el peso corporal de ratones diabéticos obesos tratados con PALP y no tratados. En la tabla 4 se proporciona el programa de los tratamientos y los resultados.
Tabla 4. Efecto de la administración de PALP sobre el peso corporal de ratones diabéticos obesos. 20
- Grupo I Grupo II intraperitoneal Grupo III intraperitoneal Grupo IV subcutáneo Grupo V subcutáneo
- Día
- Peso corpo-ral (g) D.E. Peso corpo-ral (g) D.E. PALP Peso corpo-ral (g) D.E. PALP Peso corpo-ral (g) D.E. PALP Peso corpo-ral (g) D.E. PALP
- 1
- 35,5 0,9 37,2 1,3 1,5 mg 33,3 1,7 33,5 0,6 1,5 mg 33,0 0,7
- 2
- 34,4 1,0 36,7 0,6 1,5 mg 31,7 1,6 1,5 mg 32,1 1,0 1,5 mg 31,6 1,1 1,5 mg
- 3
- 35,5 0,8 36,3 0,5 1,5 mg 32,2 1,4 31,7 1,0 1,5 mg 32,7 0,8
- 4
- 35,6 0,9 35,8 0,7 1,5 mg 31,7 1,9 1,5 mg 31,5 0,9 1,5 mg 31,6 0,5 1,5 mg
- 5
- 36,0 1,1 35,3 0,7 1,5 mg 31,8 1,5 32,1 1,2 1,5 mg 31,7 0,5
- 7
- 37,3 0,9 - 1,5 mg 32,3 1,3 1,5 mg 32,9 0,9 1,5 mg 33,2 0,3 1,5 mg
- 8
- 38,5 1,3 35,9 0,6 1,5 mg 32,2 2,1 33,4 0,6 1,5 mg 32,4 1,1
- 9
- 38,0 1,8 35,4 0,8 1,5 mg 32,2 1,6 1,5 mg 33,7 0,9 1,5 mg 32,8 0,6 1,5 mg
- 10
- 37,9 1,0 35,3 0,5 1,5 mg 32,3 1,6 33,7 1,6 1,5 mg 32,2 0,5
- 11
- 37,9 1,3 35,0 0,4 1,5 mg 32,3 1,9 1,5 mg 33,8 1,9 1,5 mg 32,9 0,4 1,5 mg
- 14
- 39,7 1,2 33,9 1,0 1,5 mg 33,0 1,2 1,5 mg 34,8 2,3 1,5 mg 34,2 1,0 1,5 mg
- 15
- 39,7 1,0 34,0 1,9 3 mg 33,0 1,9 36,0 1,0 3 mg 33,7 0,5
- 16
- 39,9 1,4 33,8 0,8 3 mg 32,9 2,1 3 mg 34,7 2,1 3 mg 33,9 0,5 3 mg
- 17
- 39,8 1,5 33,5 1,1 3 mg 32,6 2,2 34,8 2,2 3 mg 33,8 0,4
- 18
- 40,1 1,3 33,3 1,0 3 mg 32,8 2,3 3 mg 35,2 1,6 3 mg 34,1 0,4 3 mg
- 21
- 41,4 1,7 33,6 1,2 3 mg 33,7 2,4 3 mg 36,2 1,7 3 mg 36,2 0,7 3 mg
- 22
- 41,7 1,6 33,1 1,8 3 mg 33,5 1,8 35,9 1,7 3 mg 36,0 1,0
- 23
- 41,6 2,8 - 3 mg 33,4 2,3 3 mg 35,6 1,7 3 mg - 3 mg
- 24
- 41,8 2,0 - 3 mg 33,2 1,5 35,8 1,6 3 mg -
- 25
- 41,6 1,4 32,2 1,3 3 mg 32,6 1,4 3 mg 36,1 2,1 3 mg 37,1 0,8 3 mg
- 28
- 43,7 2,7 32,8 0,8 32,9 1,4 37,4 1,6 37,4 1,0
- % de Aumento
- 23,1% -11,8% -1,2% 11,6% 13,3%
Los animales no tratados del grupo I aumentaron de peso de manera constante a lo largo del período de observación de 28 días, aumentando el peso corporal aproximadamente un 23% globalmente. Por el contrario, los animales tratados con PALP administrada por vía intraperitoneal cinco veces a la semana (grupo II) realmente disminuyeron de peso en aproximadamente un 12% globalmente, mientras 5 que los animales tratados con PALP administrada por vía intraperitoneal tres veces a la semana mantuvieron esencialmente su peso (grupo III). Los animales tratados con PALP cinco veces a la semana (grupo IV) administrada por vía subcutánea, o tres veces a la semana (grupo V) administrada por vía subcutánea aumentaron aproximadamente la mitad del peso que el grupo control.
Debido a que los tratamientos intraperitoneal y subcutáneo tuvieron efectos similares sobre el 10 nivel de glucosa en sangre (tabla 3), la capacidad claramente establecida para lograr un control del peso mediante la administración por vía intraperitoneal de PALP puede implicar algún mecanismo además del
control del nivel de glucosa. De hecho, considerando que para el modelo ob/ob la obesidad conduce a insensibilidad a la insulina y a niveles de glucosa en sangre superiores, pero no viceversa, es probable que en este modelo un modo de acción primario de PALP fuese el control del peso, y que la reducción del nivel de glucosa en sangre fuese un efecto secundario. No se conoce el mecanismo mediante el cual PALP logra el control del peso. Sin embargo, dado que la ausencia de hormona leptina funcional es 5 responsable de la obesidad en animales ob/ob, es razonable suponer que PALP actúa como sustituto para las funciones más importantes relacionadas con el control del peso de la leptina.
Ejemplos 9-12 - Efectos de PALP sobre la captación y el metabolismo de la glucosa en adipocitos 3T3-L1 diferenciados y células L6 de rata a diferentes niveles de glucosa y suero en el medio.
Los experimentos descritos anteriormente sugerían que PALP disminuyó el nivel de glucosa en 10 sangre en los ratones tratados estimulando la captación y el metabolismo de la glucosa en tejidos periféricos, lo que explica el tiempo relativamente largo requerido para su distribución y acción en el organismo. Se examinó esta hipótesis en células musculares y adipocitos diferenciados.
Se obtuvieron preadipocitos 3T3-L1 de ratón y células de músculo esquelético L6 de rata de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, Maryland). Se hicieron crecer las células 3T3-L1 en 15 medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con alto contenido en glucosa complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% (v/v) y antimicótico/antibiótico al 1% (GIBCO, Grand Island, Nueva York) compuesto por penicilina G 10.000 unidades/ml, estreptomicina 10 mg/ml y anfotericina B 25 g/ml.
Para inducir la diferenciación celular de las dos líneas celulares, se usaron métodos convencionales, tal como sigue. Se mantuvieron las células 3T3-L1 en un estado de confluencia durante 2 20 días, seguido por tratamientos durante 3 días con insulina 400 nM (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana), dexametasona 250 nM (Sigma-Aldrich, Inc., San Luis, Missouri) e isobutilmetilxantina 0,5 mM (Sigma-Aldrich, Inc.). Se sustituyó el medio por medio nuevo que contenía suero al 10%, y se cambió el medio dos veces a la semana. Se usaron las células diferenciadas 14 días tras eliminar los agentes que inducen la diferenciación. 25
Se indujo que las células L6 en cultivo en monocapa se diferenciasen en medio esencial mínimo (MEM) que contenía FBS al 2% (v/v) y disolución antimicótico/antibiótico al 1% (v/v). Se suministró a las células medio nuevo cada 48 horas. Se monitorizó la diferenciación de mioblastos, que se produce aproximadamente al séptimo día, mediante microscopía de contraste de fases.
Para examinar la captación y el metabolismo celulares de la glucosa, se incubaron células 30 diferenciadas (adheridas) en placas de 12 pocillos con D-[14C]glucosa a 37ºC en un incubador de CO2 (95% de aire:5% de CO2) en medio que contenía D-glucosa 5 mM o libre de glucosa que contenía suero al 10% o suero al 2% (tal como se especifica en los ejemplos específicos) durante 2-6 horas. En los diversos experimentos, se varió la cantidad de otros reactivos (tales como PALP o insulina) en el medio de incubación, tal como se especifica. 35
A la finalización de la incubación, se retiró el medio; se tomó una alícuota del medio para determinar la pérdida de D-[14C]glucosa del medio, que se corresponde con la captación de glucosa por las células. Se lavaron las células dos veces con 3-3 ml de medio para eliminar trazas de medio que contiene radiactividad no incorporada. Entonces, se añadió la mezcla (1 ml) de 99,8% de metanol/0,2% de agua (v/v) enfriada con hielo a las monocapas, y se extrajeron células durante 2 horas a -20ºC. Este 40 tratamiento dio como resultado la precipitación de glucógeno y la solubilización de los lípidos y la glucosa libres celulares.
Se suspendió el [14C]glucógeno precipitado en 0,75 ml de NaOH 1 M y se transfirió a viales de centelleo; se repitió este procedimiento con otra alícuota de 0,75 ml de NaOH, se añadió HCl 10 mM (150 l) a los viales para neutralizar la suspensión, seguido por la adición de 8,5 ml de ECOLUME (ICN 45 Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, California). Mientras que la suspensión de NaOH 1 M contenía algo de material particulado (en su mayor parte proteína que no se marcó con glucosa radiomarcada), tras la transferencia a ECOLUME no quedó nada de precipitado. Este procedimiento dio como resultado la eliminación cuantitativa del glucógeno precipitado; no pudo eliminarse radiactividad adicional del pocillo mediante KOH al 30% (que se neutralizó con HCl antes de la determinación de la radiactividad). 50
Se trató la mezcla de metanol que contenía lípidos y glucosa libres celulares tal como sigue. Se añadieron la fase de metanol (1 ml) y un lavado con metanol de 1 ml posterior a 2 ml de cloroformo, seguido por la adición de 3 ml de agua. La separación de esta mezcla acuosa orgánica se facilitó mediante una breve centrifugación. De las dos fases resultantes, la inferior contenía los lípidos radiomarcados totales, mientras que la superior contenía glucosa radiomarcada. Se transfirieron alícuotas 55 de las fases superior e inferior a viales de centelleo para determinar las cantidades de glucosa radiomarcada y lípidos totales, respectivamente, mediante recuento por centelleo líquido.
En algunos experimentos, se usó un procedimiento publicado [Huang, D., Cheung, AT., Parsons, J.T. y Bryer-Ash, M., “Focal adhesion kinase (FAK) regulates insulin stimulated glycogen synthesis in hepatocytes”. J. Biol. Chem. 277, 18151-18160 (2002)] paralelo al método anterior para determinar la incorporación de glucosa en el glucógeno. Tras incubaciones con D-[14C]glucosa, se solubilizaron las células con KOH al 20% durante 2 horas. Se extrajeron lisados con ácido tricarboxílico al 8%, se 5 neutralizaron con HCl 2,0 M, entonces se sometieron a ebullición durante 5 minutos. Se precipitó el glucógeno total mediante la adición de etanol al 80% (concentración final) durante 2 horas a -20ºC seguido por centrifugación a 1100 x g durante 10 minutos. Se repitió la precipitación y centrifugación. Entonces volvió a disolverse el precipitado en agua destilada, y se precipitaron los sólidos de nuevo como anteriormente. Este método produjo esencialmente los mismos resultados que el método de precipitación 10 con metanol descrito anteriormente. Por tanto, en todos los experimentos posteriores, se usó el método de precipitación con metanol porque éste permitió el análisis simultáneo de la glucosa, el glucógeno y los lípidos celulares para una muestra individual.
Ejemplo 9. Efecto estimulante de PALP sobre la captación de glucosa en células L1 diferenciadas.
Se trataron tres grupos de células L1 diferenciadas (usadas 14 días tras el tratamiento de 15 diferenciación descrito anteriormente) en placas de 12 pocillos tal como sigue: un primer grupo control se dejó sin tratar; se trató un segundo grupo con 0,75 ml de una preparación que comprendía PALP comercial 0,5 U/ml en DMEM libre de glucosa y libre de suero durante 30 minutos, y se trató un tercer grupo con 0,75 ml de una preparación que comprendía PALP comercial 1,0 U/ml en DMEM libre de glucosa y libre de suero durante 30 minutos. Se realizó el siguiente experimento por triplicado para cada 20 grupo.
Se incubó entonces cada grupo tal como se describió anteriormente durante 5 horas tras la adición de D-[14C]glucosa, en cuatro condiciones diferentes tal como sigue: (1) el medio de incubación no contenía suero ni D-glucosa no marcada; (2) el medio de incubación contenía suero bovino fetal (FBS) al 2% pero no D-glucosa no marcada; (3) el medio de incubación contenía D-glucosa no marcada 5 mM 25 pero no suero; y (4) el medio de incubación contenía D-glucosa no marcada 5 mM + FBS al 2%.
Para cada condición para cada grupo, se determinó la cantidad de glucosa radiomarcada mediante recuento por centelleo líquido. Los resultados se representan gráficamente en la figura 5. Los datos son la media D.E. de tres determinaciones para cada grupo en cada condición. En cada una de las cuatro condiciones, el tratamiento con PALP tanto a concentraciones de 0,5 U/ml como de 1,0 30 U/ml (■) potenció el contenido celular de D-[14C]glucosa aproximadamente dos veces o más, en relación con el grupo control no tratado (□). En presencia de D-glucosa 5 mM no marcada (condiciones 3 y 4), las células L1 obviamente incorporaron menos D-[14C]glucosa (debido a una actividad específica disminuida en gran medida); al mismo tiempo PALP tuvo efectos estimulantes algo mayores sobre la captación de D-[14C]glucosa en comparación con su efecto en medio libre de glucosa. Se repitió el experimento para cada 35 grupo al menos una vez, con resultados similares.
Ejemplo 10. Efecto estimulante de PALP sobre la síntesis celular de [14C]glucógeno a partir de D-[14C]glucosa.
Se usaron las mismas condiciones descritas en el ejemplo 9, excepto porque se determinó la cantidad de glucógeno radiomarcado mediante recuento por centelleo líquido. Los resultados se 40 representan gráficamente en la figura 6. Los tratamientos incluyeron PALP a 0,5 U/ml y 1,0 U/ml (■), y el grupo control no tratado (□). De nuevo, mientras que en presencia de D-glucosa no marcada 5 mM las células L1 obviamente incorporaron menos D-[14C]glucosa en glucógeno, en presencia de D-glucosa 5 mM PALP tuvo efectos estimulantes ligeramente mayores (de 2 a 3 veces) sobre la síntesis de [14C]glucógeno. 45
Ejemplo 11. Efecto estimulante de PALP sobre la incorporación de D-[14C]glucosa en la fracción lípidica total.
Se usaron las mismas condiciones descritas en el ejemplo 9, excepto porque se determinó la cantidad de lípidos radiomarcados totales mediante recuento por centelleo líquido. Los resultados se representan gráficamente en la figura 7. Los tratamientos incluyeron PALP a 0,5 U/ml y 1,0 U/ml (■), 50 y el grupo control no tratado (□). Aunque en presencia de D-glucosa no marcada 5 mM las células incorporaron menos D-[14C]glucosa en lípidos, tal como se esperaba, PALP tuvo efectos estimulantes ligeramente mayores (de 2 a 2,5 veces) sobre la síntesis de [14C]lípidos en comparación con sus efectos en ausencia de D-glucosa.
En general, los experimentos descritos en los ejemplos 9-11 indican que, en células L1 55 diferenciadas, PALP estimula claramente la captación y el metabolismo celulares de D-glucosa, que PALP es más eficaz a una concentración de 1 U/ml que a una de 0,5 U/ml y que los efectos de PALP no
dependen fuertemente de la concentración de glucosa en el medio. Estos experimentos sugieren fuertemente que una diana primaria de PALP en ratones, y por extensión en seres humanos, es el tejido graso.
Ejemplo 12. Efecto estimulante de PALP sobre el metabolismo de la glucosa en células L6 diferenciadas.
Otra posible diana de PALP puede ser el músculo esquelético. Se determinaron los efectos de 5 PALP sobre la captación/el metabolismo de la glucosa en células L6 diferenciadas, un modelo ampliamente usado para músculo esquelético.
Se incubaron células L6 diferenciadas en placas de 12 pocillos en MEM que contenía FBS al 2% durante 6 horas con 1 Ci/ml de D-[14C]glucosa en ausencia (□) o presencia de PALP comercial 1 U/ml , insulina 50 nM (“Ins”) , o PALP comercial 1 U/ml + Ins 50 nM (■). Los datos, mostrados en la 10 figura 8, son la media D.E. de tres determinaciones en un experimento (se repitió el experimento una vez con resultados similares).
PALP estimuló claramente, aunque sólo ligeramente, tanto la captación celular de D-[14C]glucosa como su metabolismo a [14C]glucógeno y [14C]lípido total para las células L6 diferenciadas. La insulina fue al menos un 50% más eficaz que PALP en la estimulación de los tres mecanismos, y en cada caso los 15 efectos de PALP más insulina fueron aproximadamente aditivos o menores que el aditivo.
Ejemplos 13 y 14- La digestión con proteasa no reduce los efectos de PALP sobre el metabolismo de la glucosa.
Ejemplo 13. Digestión de PALP con bromelina.
La bromelina (BRL) es una proteasa que se mostró anteriormente que digiere eficazmente PALP 20 conduciendo a la formación de fragmentos de masa molecular inferior [Kottel, R.H y Hanford, W.C, “Differential release of membrane-bound alkaline phosphatase isoenzymes from tumor cells by bromelain”. Biochem Biophys. Methods 2, 325-330 (1980)]. Basándose en esta observación, se usó bromelina para digerir PALP comercial para determinar si la digestión con una proteasa puede generar un fragmento de PALP más pequeño que pueda estimular el metabolismo de la glucosa. 25
Se incubó una preparación que comprendía PALP comercial 20 U/ml y 0,01 mg/ml de BRL (Sigma-Aldrich) en 1 ml de tampón Tris-HCl 25 mM (pH 7,4) a 37ºC durante 2 horas. La figura 9 muestra una imagen de gel (obtenida mediante SDS-PAGE usando poliacrilamida al 7,5%) con PALP comercial no digerida en el carril 1 y PALP digerida con BRL en el carril 2. Es evidente que, tras la digestión con 0,01 mg/ml de BRL, no queda ninguna cantidad detectable de la molécula de PALP original. 30
Ejemplo 14. Efecto del producto de digestión con bromelina de PALP sobre el metabolismo de la glucosa.
Se preincubaron células L1 diferenciadas en DMEM libre de glucosa y libre de suero durante dos horas en las siguientes condiciones: (a) no tratadas; (b) en presencia de PALP comercial 1 U/ml; (c) en presencia de 0,01 mg/ml de BRL; y (d) en presencia de PALP comercial 1 U/ml + BRL 0,01 mg/ml. Entonces, se incubó cada grupo durante 5 horas en presencia de D-[14C]glucosa. Se determinaron los 35 lípidos radiomarcados, la glucosa radiomarcada y el glucógeno radiomarcado totales mediante recuento por centelleo líquido, tal como se describió anteriormente.
Los datos se muestran en la figura 10. El tratamiento con BRL sola potenció ligeramente la síntesis tanto de [14C]glucógeno como de [14C]lípido pero no tuvo un efecto claro sobre el contenido celular de D-[l4C]glucosa, en relación con células no tratadas (□). El tratamiento con el producto de 40 digestión con bromelina de PALP (■) potenció la síntesis de glucógeno, la síntesis de lípidos y la captación de glucosa en relación con células no tratadas (□). El tratamiento con el producto de digestión con bromelina de PALP (■) potenció ligeramente la síntesis de glucógeno pero no la síntesis de lípidos, y no tuvo un efecto claro sobre el contenido celular de D-[14C]glucosa, en relación con el tratamiento mediante PALP . 45
Este experimento indicó que al menos un fragmento de PALP (es decir, una secuencia de PALP que es más pequeña que la PALP de tamaño completo) conservó al menos parcialmente la capacidad de PALP nativa para potenciar el metabolismo de la glucosa. Además, el experimento también justifica la suposición de que un fragmento de PALP puede ser incluso más activo en la estimulación de la síntesis de glucógeno que PALP nativa. Potencialmente, cualquier secuencia derivada de PALP podría ser activa 50 en la promoción del metabolismo de la glucosa.
Ejemplos 15-17- Comparación de los efectos de PALP e insulina sobre el metabolismo de la glucosa en células L1 diferenciadas.
Durante el transcurso de los experimentos, se observó que las células L1 responden mejor a PALP si las células se usan de 8 a 11 días tras finalizar el tratamiento con agentes que inducen la diferenciación; en contraposición a 14 días que se puso en práctica en los experimentos anteriores. Por tanto, en los experimentos posteriores se usaron células L1 en el plazo de 9 a 11 días tras finalizar el tratamiento con agentes que inducen la diferenciación. 5
Ejemplo 15. Efecto de PALP e Ins sobre el contenido en glucosa del medio de incubación en células L1 diferenciadas.
En este experimento, se incubaron células L1 diferenciadas en placas de 12 pocillos (en 0,75 ml de volumen/pocillo) en DMEM libre de glucosa que contenía BFS al 2% durante 6 horas con 1 Ci/ml de D-[14C]glucosa en ausencia o presencia de PALP comercial 1 U/ml o Ins 50 nM. Al final del experimento, 10 se añadieron alícuotas de 0,5 ml del medio de incubación a 9,5 ml de ECOLUME, y se determinó la radiactividad mediante recuento por centelleo. Los datos que indican pérdida de D-[14C]glucosa del medio son las medias E.E.M. de tres experimentos realizados cada uno por triplicado.
Los datos se representan gráficamente en la figura 11. El experimento mostró que el tratamiento con PALP e Ins 50 nM (■) estimuló la pérdida de D-[14C]glucosa del medio (es decir, la captación por 15 las células) en un 86% y 77%, respectivamente, en relación con el control no tratado (□). Por tanto, Ins, a la concentración de 50 nM fisiológicamente superior a la máxima, fue más eficaz que PALP en el aumento de la captación de D-[14C]glucosa por células L1 diferenciadas.
Ejemplo 16. Efecto de PALP e Ins sobre la captación y el metabolismo celulares de la glucosa en células L1 diferenciadas. 20
Se incubaron células L1 diferenciadas en placas de 12 pocillos en DMEM libre de glucosa que contenía FBS al 2% con 1 Ci/ml de D-[14C]glucosa durante 2 horas (figura 12, panel superior) o 6 horas (figura 12, panel inferior) en ausencia (□) o presencia de PALP comercial 0,25 U/ml , PALP comercial 1 U/ml o Ins 10 nM (■). Los datos mostrados en la figura 12 son la media D.E. de tres determinaciones en un experimento (se repitió el experimento una vez con resultados similares). 25 Obsérvese que, en esta ocasión, la concentración de Ins fue sólo de 10 nM, que está más próxima (aunque todavía es superior) a la concentración fisiológica de Ins (aproximadamente 1 nM o menos).
Tras tratamientos durante 2 horas, PALP 1 U/ml tuvo efectos algo mayores que Ins sobre el nivel celular de D-[14C]glucosa y [14C]glucógeno (panel superior). Tras incubaciones durante 6 horas, 1 U/ml de PALP fue más eficaz que Ins 10 nM en la estimulación de la captación de D-[14C]glucosa y su conversión 30 posterior tanto en [14C]glucógeno como en [14C]lípido total (panel inferior).
Ejemplo 17. Comparación de los efectos de PALP y una alta concentración de Ins sobre la captación y el metabolismo celulares de la glucosa en células L1 diferenciadas.
Se incubaron células L1 diferenciadas en placas de 12 pocillos en DMEM libre de glucosa que contenía FBS al 2% durante 2 horas (figura 13, panel superior) o 6 horas (figura 13, panel inferior) con 1 35 Ci/ml de D-[14C]glucosa en ausencia (□) o presencia de PALP comercial 0,25 U/ml , PALP comercial 1 U/ml o Ins 50 nM (■). Los datos mostrados en la figura 13 son la media D.E. de tres determinaciones en un experimento (se repitió el experimento una vez con resultados similares).
Tras incubaciones durante o bien 2 dos horas (figura 13, panel superior) o bien 6 horas (figura 13, panel inferior), Ins 50 nM fue significativamente más eficaz que 1 U/ml de PALP sobre la síntesis de 40 [14C]glucógeno y ligeramente más eficaz sobre la síntesis de [14C]lípidos totales y el contenido celular de D-[14C]glucosa.
Ejemplo 18. Comparación de la estimulación de la captación y el metabolismo de la glucosa en fibroblastos NIH 3T3 de embrión de ratón mediante PALP e Ins.
Los datos mostrados en la figura 14 son para un experimento que compara los efectos de PALP 45 e Ins sobre el metabolismo de la glucosa en fibroblastos NIH 3T3 de embrión de ratón. Se eligió esta línea celular porque es relativamente insensible a Ins y, por tanto, parece ser adecuada para verificar adicionalmente lo que se había sugerido mediante experimentos con animales; concretamente, que los efectos de PALP se producen independientemente de Ins. Dado que el suero puede contener Ins, se incubaron los fibroblastos en medio libre de suero para excluir adicionalmente cualquier contribución de 50 Ins.
Por consiguiente, se incubaron cultivos de fibroblastos NIH 3T3 confluentes en placas de 12 pocillos durante 5 horas en DMEM libre de glucosa y libre de suero con 1 Ci/ml de D-[14C]glucosa en
ausencia (□) o presencia de PALP comercial 1 U/ml , Ins 50 nM o PALP comercial 1 U/ml + Ins 50 nM (■). Los datos mostrados en la figura 14 son la media D.E. de tres determinaciones en un experimento (se repitió el experimento una vez con resultados similares).
PALP potenció la captación celular de D-[14C]glucosa en un 38% y su metabolismo a [14C]glucógeno y [14C]lípido total en un 77% y un 55%, respectivamente. En cada caso, el tratamiento con 5 Ins sola sólo fue aproximadamente el 50% tan eficaz como PALP sola , e Ins no potenció ninguno de los efectos de PALP cuando se usó en combinación (■), en relación con el tratamiento mediante PALP sola . Por tanto, este experimento demuestra que PALP ejerce un efecto sobre el metabolismo de la glucosa sin requerir la presencia de insulina.
Ejemplos 19 y 20. Efectos de preparaciones de PALP sobre el metabolismo de la glucosa en 10 células L1 diferenciadas en presencia de suero al 10%.
En presencia de FBS al 10%, la mayoría de los acontecimientos celulares, particularmente la proliferación celular, se estimulan al máximo o casi al máximo debido a la presencia de concentraciones óptimas de factores de crecimiento. Es difícil evaluar qué nivel de suero (suero al 2% o al 10%) usado para experimentos in vitro se corresponde mejor con la situación in vivo (que, a su vez, también 15 dependerá del hábito de alimentación y la combinación de diversos parámetros fisiológicos del individuo). Sin embargo, como enfoque conservativo, generalmente se acepta que si puede observarse un efecto in vitro incluso en presencia de suero al 10%, entonces es muy probable que este fenómeno particular sea fisiológicamente relevante. Por tanto, a continuación se determinó si PALP e Ins todavía pueden potenciar el metabolismo de la glucosa en presencia de suero al 10%, y si los efectos de preparaciones preparadas 20 a partir de diversos lotes de PALP comercial eran comparables.
Ejemplo 19. Efecto de preparaciones de PALP e Ins sobre el contenido en glucosa del medio de incubación para células L1 diferenciadas.
Los datos mostrados en la figura 15 son para un experimento en el que se compararon los efectos de cuatro preparaciones diferentes preparadas a partir de diversos lotes de PALP obtenida 25 comercialmente sobre la pérdida de D-[14C]glucosa del medio de incubación en cultivos de células L1 diferenciadas con el efecto de Ins.
Se prepararon preparaciones a partir de cuatro lotes separados de PALP obtenida comercialmente (preparaciones 1 a 4), comprendiendo las preparaciones PALP 1,5 U/ml en DMEM libre de glucosa y libre de suero. Se trataron previamente células L1 diferenciadas durante 30 minutos con 30 DMEM libre de PALP , con la preparación 1 , 2 , 3 ó 4 , o con Ins 50 nM en DMEM libre de glucosa y libre de suero (■), seguido de la adición de 0,5 Ci de D-[14C]glucosa durante 10 horas. Los datos mostrados en la figura 15 son el contenido en [14C]glucosa del medio de incubación al final de la incubación (tiempo = 10 horas), en comparación con el contenido en [14C]glucosa al inicio de la incubación (tiempo = 0 horas; □), y representan la media D.E. de tres determinaciones en un 35 experimento (se repitió el experimento una vez con resultados similares).
Aunque las cuatro preparaciones de PALP potenciaron claramente la pérdida de D-[14C]glucosa del medio, hubo algo de variabilidad en sus efectos respectivos que parecía ir más allá del error experimental. De nuevo, Ins 50 nM fue más eficaz que cualquiera de las preparaciones de PALP comercial. 40
Ejemplo 20. Exploración de las diferencias en el efecto sobre el metabolismo de la glucosa para diversas preparaciones de PALP.
Los datos mostrados en la figura 16 son para un experimento en el que se exploraron adicionalmente las diferencias potenciales en los efectos sobre el metabolismo de la glucosa en células L1 diferenciadas entre las cuatro preparaciones de PALP comercial. Se trataron previamente células L1 45 diferenciadas (en medio que contenía FBS al 10%) durante 30 min. con DMEM libre de PALP (□), o con preparación 1 , 2 , 3 ó 4 de PALP comercial (1,5 U/ml), o Ins 50 nM en DMEM libre de glucosa y libre de suero (■), seguido por la adición de 0,5 Ci de D-[14C]glucosa durante 6 horas. Los datos son la media D.E. de tres determinaciones en un experimento (se repitió el experimento una vez con resultados similares). 50
De nuevo, aunque cada preparación de PALP potenció la síntesis tanto de [14C]glucógeno como de [14C]lípido total, la preparación que disminuyó el contenido del medio en D-[14C]glucosa al máximo (PALP 1 en la figura 15) también fue la más eficaz en la estimulación de la síntesis de [14C]glucógeno y [14C]lípido total (figura 16).
Además de demostrar la variabilidad en las acciones de diversos lotes de PALP obtenida comercialmente, los datos en las figuras 15 y 16 también indican que PALP ejerce efectos considerables sobre el metabolismo de la glucosa en células L1 incluso en presencia de suero al 10%. Se observaron tales efectos de PALP en presencia de suero al 10% sólo si se usaban células 8-12 días tras finalizar el tratamiento de diferenciación. 5
Ejemplos 21 y 22. Efecto de PALP purificada homogénea sobre el metabolismo de la glucosa en células L1 diferenciadas.
En los experimentos descritos en los ejemplos 21 y 22, se usó PALP purificada homogénea para demostrar que los efectos de PALP comercial parcialmente purificada que se observaron en ejemplos anteriores estaban provocados de hecho por la actividad de la enzima PALP y no por una proteína 10 contaminante.
Se preparó PALP purificada homogénea mediante el procedimiento de purificación completa descrito en el ejemplo 1. La PALP purificada homogénea usada en los experimentos de los ejemplos 21 y 22 produce una única banda en una separación electroforética, tal como se muestra en el carril 5 de la figura 1. 15
Ejemplo 21. Efecto de PALP purificada homogénea sobre el contenido en glucosa del medio de incubación en células L1 diferenciadas.
Los datos para este ejemplo se muestran en la figura 17. Se incubaron células L1 diferenciadas en placas de 12 pocillos en DMEM libre de glucosa que contenía suero al 10% durante 10 horas con 0,5 Ci de D-[14C]glucosa en ausencia o presencia de PALP purificada homogénea 200 nM , o Ins 20 50 nM (■), seguido por la determinación de D-[14C]glucosa en el medio. Los datos mostrados en la figura 17 son el contenido en [14C]glucosa del medio de incubación al final de la incubación (tiempo = 10 horas), en comparación con el contenido en [14C]glucosa al inicio de la incubación (tiempo = 0 horas; □), y representan la media D.E. de tres determinaciones en un experimento.
PALP purificada homogénea a 200 nM redujo eficazmente el contenido del medio en D-25 [14C]glucosa, aunque su efecto fue algo menor que el de insulina 50 nM. Los efectos de PALP purificada sobre la captación de glucosa fueron comparables a los efectos de la mejor preparación de PALP comercial demostrada en el ejemplo 19 (figura 15).
Ejemplo 22. Efecto de PALP purificada homogénea sobre la captación y el metabolismo de la glucosa para células L1 diferenciadas. 30
Los datos para este ejemplo se muestran en la figura 18. Se usó PALP homogénea para demostrar que los efectos observados de PALP sobre la captación y el metabolismo celular de D-[14C]glucosa a partir de los ejemplos anteriores estaban mediados de hecho por la enzima PALP. Se incubaron células L1 diferenciadas en placas de 12 pocillos en DMEM libre de glucosa que contenía suero al 10% durante 6 horas con 0,5 Ci de D-[14C]glucosa en ausencia (□) o presencia de PALP purificada 35 homogénea 200 nM , o Ins 50 nM (■). Los datos son la media D.E. de tres determinaciones en un experimento.
PALP homogénea aumentó el contenido celular en D-[14C]glucosa 1,4 veces, aumentó la síntesis de [14C]glucógeno 1,95 veces y aumentó el [14C]lípido total 2,45 veces. De nuevo, los efectos de PALP purificada homogénea fueron comparables a los efectos de las preparaciones de PALP comerciales 40 menos puras demostradas en el ejemplo 20 (figura 16). En general, parece claro que los efectos reproducibles de PALP se garantizan de la mejor manera si PALP se purifica hasta la homogeneidad.
Ejemplo 23. Efecto de -antitripsina sobre los niveles de glucosa en la prueba de tolerancia a la glucosa.
La -antitripsina es el principal contaminante de la PALP obtenida comercialmente [Q.B.-She, J.J. Mukherjee, K.S. Crilly, y Z. Kiss, “-antitrypsin can increase insulin-induced mitogenesis in various 45 fibroblast and epithelial cell lines”. FEBS Letters 473, 33-36 (2000)]. Por tanto, se realizó un experimento para determinar si -antitripsina tiene efectos similares a PALP en los niveles de glucosa en sangre. Se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa tal como se describió generalmente en el ejemplo 2. En el experimento, se administró -antitripsina altamente purificada o bien por vía intraperitoneal o bien por vía subcutánea a una cantidad de 2 mg/ratón, 24 horas antes de la administración de glucosa. 50
La -antitripsina no disminuyó el nivel de glucosa en sangre (datos no mostrados). Esta observación indica que -antitripsina no medió el efecto sobre los niveles de glucosa en sangre que se observaron para la administración de PALP comercial.
Ejemplo 24. El anticuerpo contra PALP bloquea los efectos de PALP purificada homogénea sobre el metabolismo de la glucosa.
Incluso la preparación de PALP purificada homogénea usada en los ejemplos 21 y 22 todavía podría contener una cantidad muy pequeña de un contaminante activo que escapó de la detección. Para descartar esta posibilidad, se usó un anticuerpo específico contra PALP (anti-PALP de conejo policlonal 5 de Zymed Laboratories, South San Francisco, California) para bloquear el efecto de la enzima PALP.
Los datos del experimento se muestran en la figura 19. Se incubaron células L1 diferenciadas en placas de 12 pocillos en DMEM libre de glucosa que contenía suero al 10% durante 6 horas en ausencia (□) o presencia de 30 g/ml de anticuerpo contra PALP , 15 g/ml de PALP purificada homogénea o 30 g/ml de anticuerpo contra PALP + 15 g/ml de PALP purificada homogénea (■). Los datos son la 10 media D.E. de tres determinaciones independientes en un experimento.
Aunque el anticuerpo contra PALP solo no tuvo ningún efecto sobre el metabolismo de la glucosa, el anticuerpo contra PALP bloqueó claramente los efectos estimulantes de PALP purificada homogénea sobre la captación de D-[14C]glucosa, así como la síntesis de [14C]glucógeno y [14C]lípido total. Por tanto, este experimento proporciona una prueba concluyente de que los efectos sobre el 15 metabolismo de la glucosa observados con preparaciones de PALP comerciales y preparaciones de PALP purificadas homogéneas estaban mediados de hecho por la enzima PALP.
Basándose en estos datos, puede llegarse a la conclusión de que en los experimentos in vivo notificados (ejemplos 2-8), los efectos inhibitorios de PALP comercial sobre la elevación del nivel de glucosa en sangre estaban mediados por la enzima PALP. Por tanto, la presente invención puede 20 proporcionar un nuevo tratamiento eficaz para la diabetes que cumpliría cada criterio enumerado anteriormente. En particular, los experimentos presentados en los ejemplos indican que los regímenes de tratamiento incluyendo la administración de PALP no provocarían ningún aumento de peso y podrían disminuir la pérdida de peso. Además, los experimentos presentados indican que el agente activo (PALP) actúa mediante mecanismo(s) que es/son independiente(s) de las acciones de la insulina, y que el agente 25 activo es metabólicamente estable, lo que permite su uso menos frecuente. Finalmente, los resultados sugieren que PALP puede prolongar la vida de pacientes gravemente diabéticos.
La invención descrita en el presente documento incluye fosfatasa alcalina placentaria humana purificada para su uso en un medicamento. La invención incluye además fosfatasa alcalina placentaria humana purificada para su uso en un medicamento para el tratamiento de la diabetes. La invención 30 incluye el uso de fosfatasa alcalina placentaria humana purificada para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes. La invención incluye además el uso de fosfatasa alcalina placentaria humana purificada para la fabricación de un medicamento para reducir el nivel de glucosa en sangre. También se incluye como parte de la invención el uso de fosfatasa alcalina placentaria humana purificada para la fabricación de un medicamento para reducir el aumento de peso o inducir la pérdida de peso. 35
Claims (11)
- REIVINDICACIONES
- 1. PALP (fosfatasa alcalina placentaria) humana purificada, o un derivado fisiológicamente activo de la misma, para su uso en el tratamiento de la diabetes, mediante lo cual el derivado se selecciona de fragmentos de PALP que demuestran eficacias similares o más eficaces que PALP nativa. 5
-
- 2. PALP humana purificada, o un derivado fisiológicamente activo de la misma, para su uso en la reducción de los niveles de glucosa en plasma mediante lo cual el derivado se selecciona de fragmentos de PALP que demuestran eficacias similares o más eficaces que PALP nativa.
-
- 3. PALP humana purificada, o un derivado fisiológicamente activo de la misma, y un medicamento antidiabético para su uso en el tratamiento de la diabetes, en el que la fosfatasa alcalina 10 placentaria humana, o un derivado fisiológicamente activo de la misma, y el medicamento antidiabético han de usarse simultáneamente, por separado o de manera secuencial, mediante lo cual el derivado se selecciona de fragmentos de PALP que demuestran eficacias similares o más eficaces que PALP nativa.
-
- 4. PALP humana purificada y medicamento antidiabético para su uso según la reivindicación 3, 15 siendo el medicamento antidiabético un secretagogo de insulina, una biguanida, un inhibidor de -glucosidasa, una tiazolidindiona, NN2211, o insulina.
-
- 5. PALP o un derivado fisiológicamente activo de la misma para su uso según las reivindicaciones 1 ó 2, siendo el derivado activo un producto de digestión con proteasa de PALP humana, mediante lo cual el derivado se selecciona de fragmentos de PALP que demuestran eficacias similares o 20 más eficaces que PALP nativa.
-
- 6. PALP o un derivado fisiológicamente activo de la misma para su uso según la reivindicación 5, en los que la proteasa es bromelina.
-
- 7. PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma para su uso según la reivindicación 1 ó 2, o PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la 25 misma y un medicamento antidiabético para su uso según la reivindicación 3, en forma de una preparación junto con una solución salina fisiológica como vehículo.
-
- 8. PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma, o PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma y un medicamento antidiabético para su uso según la reivindicación 7, en los que la preparación incluye PALP humana incluida 30 dentro de liposomas.
-
- 9. PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma para su uso según la reivindicación 1 ó 2, o PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma y un medicamento antidiabético para su uso según la reivindicación 3, extrayéndose la PALP humana de tejidos. 35
-
- 10. PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma para su uso según la reivindicación 1 ó 2, o PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma y un medicamento antidiabético para su uso según la reivindicación 3, siendo la PALP humana PALP derivada de manera recombinante.
-
- 11. PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma para su uso según la 40 reivindicación 1 ó 2, o PALP humana purificada o un derivado fisiológicamente activo de la misma y un medicamento antidiabético para su uso según la reivindicación 3, siendo la PALP humana PALP humana sintética.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US441992 | 1995-05-16 | ||
| US10/317,916 US7048914B2 (en) | 2002-12-12 | 2002-12-12 | Placental alkaline phosphatase to control diabetes |
| US317916 | 2002-12-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2354976T3 true ES2354976T3 (es) | 2011-03-21 |
Family
ID=32506246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03796758T Expired - Lifetime ES2354976T3 (es) | 2002-12-12 | 2003-12-05 | Fosfatasa alcalina placentaria para controlar la diabetes. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7048914B2 (es) |
| EP (1) | EP1733734B1 (es) |
| AT (1) | ATE480256T1 (es) |
| DE (1) | DE60334147D1 (es) |
| DK (1) | DK1572230T3 (es) |
| ES (1) | ES2354976T3 (es) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004054609A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-07-01 | Zoltan Laboratories | Placental alkaline phosphatase to control diabetes |
| US7048914B2 (en) * | 2002-12-12 | 2006-05-23 | Zoltan Laboratories | Placental alkaline phosphatase to control diabetes |
| US20080279843A1 (en) * | 2003-12-09 | 2008-11-13 | Essential Skincare, Llc | Method For Improving Insulin Sensitivity By Administering an Inhibitor of Antitrypsin |
| AU2005210581B2 (en) | 2004-02-04 | 2010-06-24 | Am-Pharma B.V. | Use of alkaline phosphatase for the detoxification of LPS present at mucosal barriers |
| US20110142817A1 (en) * | 2004-02-04 | 2011-06-16 | Pharmaaware Sepsis B.V. | Means and method for treating and/or preventing necrotizing enterocolitis |
| US7557081B2 (en) * | 2004-05-27 | 2009-07-07 | Essential Skincare, Llc | Alpha-1-acid glycoprotein for the treatment of diabetes |
| US20070149440A1 (en) * | 2005-12-28 | 2007-06-28 | Essential Skincare, Llc | Transferrin and transferrin-based compositions for diabetes treatment |
| US20070148140A1 (en) * | 2005-12-28 | 2007-06-28 | Zoltan Laboratories Llc | Compositions and methods to enhance viability and function of islet cells |
| WO2007075199A1 (en) * | 2005-12-28 | 2007-07-05 | Zoltan Laboratories Llc | Use of alkaline phosphatase to maintain healthy tissue mass in mammals |
| EP1952823A1 (en) * | 2007-01-30 | 2008-08-06 | AM-Pharma B.V. | The use of alkaline phosphatase in the treatment of reduced renal function |
| US20090317372A1 (en) * | 2008-06-20 | 2009-12-24 | Zoltan Kiss | Small molecules for the reduction of high blood glucose level |
| JP2010031006A (ja) * | 2008-07-17 | 2010-02-12 | Novartis Ag | 有機化合物の使用 |
| US20100215635A1 (en) * | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Zoltan Kiss | Small molecules to induce weight loss or to reduce weight gain |
| US20130251701A1 (en) * | 2010-10-22 | 2013-09-26 | Zoltan Kiss Consulting | Alkaline phosphatase to correct insulin resistance, hyperinsulinemia, and dyslipidemia |
| US8679480B2 (en) * | 2011-06-20 | 2014-03-25 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method to inhibit neuropathic pain by intrathecal injection of protein phosphatases |
| KR102166110B1 (ko) | 2014-01-24 | 2020-10-16 | 에이엠-파마 비.브이. | 키메라 알칼리성 포스파타제-유사 단백질 |
| CN106459143A (zh) | 2014-01-24 | 2017-02-22 | 安-法玛公司 | 碱性磷酸酶的下游处理 |
| AU2016229976B2 (en) | 2015-03-06 | 2021-11-11 | Theriva Biologics, Inc. | Safe and effective beta-lactamase dosing for microbiome protection |
| EP3600257B8 (en) | 2017-03-21 | 2023-06-21 | Theriva Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase formulations |
| EP3737750B1 (en) | 2018-01-09 | 2024-06-05 | Theriva Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase agents for treatment of neurodevelopmental disorders |
| EP3773686B1 (en) | 2018-03-20 | 2023-06-07 | Theriva Biologics, Inc. | Alkaline phosphatase agents for treatment of radiation disorders |
| EP3768302A4 (en) | 2018-03-20 | 2021-12-15 | Synthetic Biologics, Inc. | INTESTINAL ALKALINE PHOSPHATASE FORMULATIONS |
| CA3146738A1 (en) | 2019-07-18 | 2021-01-21 | Synthetic Biologics, Inc. | Intestinal alkaline phosphatase-based treatments of metabolic disorders |
| WO2022150034A1 (en) * | 2021-01-06 | 2022-07-14 | Zoltan Laboratories, Llc | Placental alkaline phosphatase for starting early treatment of cancer patients exhibiting no detectable loss of body and muscle weight as yet to prevent or reduce the loss of muscle proteins |
| US20240165209A1 (en) * | 2021-02-16 | 2024-05-23 | Zoltan Laboratories, Llc | Placental alkaline phosphatase for reducing the loss of red blood cells, white blood cells, and platelets in chemotherapy treated cancer patients |
Family Cites Families (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4030995A (en) | 1976-07-13 | 1977-06-21 | Sigma Chemical Company | Alkaline phosphatase isoenzyme determination |
| GB1594389A (en) * | 1977-06-03 | 1981-07-30 | Max Planck Gesellschaft | Dressing material for wounds |
| IT1108964B (it) | 1978-01-20 | 1985-12-16 | Sclavo Inst Sieroterapeut | Composizione adatta all'analisi della fosfatasi alcalina e metodo utilizzante la stessa |
| US4265233A (en) * | 1978-04-12 | 1981-05-05 | Unitika Ltd. | Material for wound healing |
| DE3007226A1 (de) | 1980-02-27 | 1981-09-10 | Erich 2400 Lübeck Hofacker | Arzneikapsel |
| SU1138410A1 (ru) | 1982-09-10 | 1985-02-07 | Астраханский государственный медицинский институт им.А.В.Луначарского | Способ выделени термостабильной плацентарной щелочной фосфатазы |
| US4818540A (en) * | 1985-02-25 | 1989-04-04 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Transdermal fertility control system and process |
| JPS61277626A (ja) | 1985-05-31 | 1986-12-08 | Sugiura Shinyaku Kaihatsu Kenkyusho:Kk | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼを高濃度に含有する胎盤エキスおよびその製法 |
| DE3836971C1 (es) * | 1988-10-31 | 1990-05-17 | Weck, Wolfgang, Dr.Med., 6990 Bad Mergentheim, De | |
| SU1814764A3 (ru) | 1990-04-20 | 1995-03-20 | Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения АН СССР | Способ получения средства для лечения гнойно-некротических ран |
| EP0526630A4 (en) | 1991-02-22 | 1993-08-11 | Amgen Inc. | Use of gm-csf and g-csf to promote accelerated wound healing |
| CA2137275A1 (en) * | 1992-06-03 | 1993-12-09 | Richard L. Eckert | Bandage for continuous application of biologicals |
| WO1995005455A1 (en) * | 1993-08-13 | 1995-02-23 | Rijksuniversiteit Te Groningen | Pharmaceutical composition comprising phosphatase or a derivative thereof |
| US5707624A (en) * | 1994-06-03 | 1998-01-13 | The Regents Of The University Of Michigan | Treatment of Kaposi's sarcoma by inhibition of scatter factor |
| US5932779A (en) | 1996-06-10 | 1999-08-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Screening methods for compounds useful in the regulation of body weight |
| US6005000A (en) * | 1996-08-22 | 1999-12-21 | Oxis International, Inc. | 5,5-Disubstituted-3, 4-dihydroxy-2(5H)-furanones and methods of use therefor |
| US6414036B1 (en) * | 1999-09-01 | 2002-07-02 | Van Beek Global/Ninkov Llc | Composition for treatment of infections of humans and animals |
| US6627425B1 (en) | 2000-06-02 | 2003-09-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Human glucose-6-phosphatase molecules and uses thereof |
| US7011965B2 (en) | 2001-03-09 | 2006-03-14 | Regents Of The University Of Minnesota | Compositions and methods for stimulating wound healing and fibroblast proliferation |
| US7048914B2 (en) * | 2002-12-12 | 2006-05-23 | Zoltan Laboratories | Placental alkaline phosphatase to control diabetes |
| WO2004054609A1 (en) * | 2002-12-12 | 2004-07-01 | Zoltan Laboratories | Placental alkaline phosphatase to control diabetes |
| US7374754B2 (en) * | 2003-09-02 | 2008-05-20 | Essential Skincare, Llc | Use of placental alkaline phosphatase to promote skin cell proliferation |
| WO2007075199A1 (en) * | 2005-12-28 | 2007-07-05 | Zoltan Laboratories Llc | Use of alkaline phosphatase to maintain healthy tissue mass in mammals |
-
2002
- 2002-12-12 US US10/317,916 patent/US7048914B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-05-20 US US10/441,992 patent/US7014852B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-05 DK DK03796758.5T patent/DK1572230T3/da active
- 2003-12-05 AT AT03796758T patent/ATE480256T1/de active
- 2003-12-05 EP EP06018710.1A patent/EP1733734B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-05 ES ES03796758T patent/ES2354976T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-12-05 DE DE60334147T patent/DE60334147D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2009
- 2009-01-28 US US12/361,310 patent/US7858085B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-11-17 US US12/948,146 patent/US8603464B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040115185A1 (en) | 2004-06-17 |
| DE60334147D1 (de) | 2010-10-21 |
| US7858085B2 (en) | 2010-12-28 |
| DK1572230T3 (da) | 2011-01-03 |
| EP1733734B1 (en) | 2020-01-22 |
| US7048914B2 (en) | 2006-05-23 |
| ATE480256T1 (de) | 2010-09-15 |
| US7014852B2 (en) | 2006-03-21 |
| EP1733734A3 (en) | 2011-09-28 |
| US20090130080A1 (en) | 2009-05-21 |
| US8603464B2 (en) | 2013-12-10 |
| EP1733734A2 (en) | 2006-12-20 |
| US20040120940A1 (en) | 2004-06-24 |
| US20110123513A1 (en) | 2011-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2354976T3 (es) | Fosfatasa alcalina placentaria para controlar la diabetes. | |
| US7501116B2 (en) | Placental alkaline phosphatase to control diabetes | |
| CA2437940C (en) | Methods of treating diabetes mellitus | |
| US8410081B2 (en) | Treatment of cystic fibrosis | |
| ES2569248T3 (es) | Tratamiento para la lipodistrofia | |
| US6416794B1 (en) | Methods and compositions for treating cataracts using substances derived from yeast or saltbush | |
| CN101897970A (zh) | 用于治疗糖尿病的组合物和方法 | |
| KR20180095100A (ko) | 약제학적 조성물, 치료 방법 및 이의 용도 | |
| JP2019142907A (ja) | トレハロースの非経口投与によるタンパク質凝集ミオパシーおよび神経変性疾患の治療 | |
| KR100969634B1 (ko) | 글루코사민 또는 글루코사민 유도체를 포함하는 아토피성피부염 치료용 조성물 및 이를 사용하여 아토피성 피부염을치료하는 방법 | |
| US20160303150A1 (en) | Deuterated trehalose formulations and uses thereof | |
| ES2360235T3 (es) | Sulfatidas para tratar trastornos autoinmunes. | |
| US7947313B2 (en) | Compositions for diabetes treatment and prophylaxis | |
| Quagliata et al. | Therapeutic applications of thymosin peptides: a patent landscape 2018-present | |
| JP2001139483A (ja) | 薬用人蔘からなる脳細胞または神経細胞保護剤 | |
| ES2528361T3 (es) | Agente antitumoral | |
| KR102206998B1 (ko) | Lgi3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 | |
| CN1913879B (zh) | 用于治疗糖尿病的组合物和制药用途 | |
| KR20210063198A (ko) | Lgi3 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 고지혈증 및 지방간의 예방, 치료, 또는 개선용 조성물 | |
| WO2024036044A1 (en) | Compositions and methods for treating and preventing metabolic disorders | |
| Hariprasad | Pharmacological Evaluation of Novel Drugs in Rat Models of Peripheral Neuropathy | |
| Maria et al. | Considerations Regarding the Therapeutic Conduct in Pregnancy Associated Diabetes Mellitus |