JPH0428354B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、安定化された、酵素の水溶性架橋重
合体に関する。 本発明に係る酵素は、アクロモバクター・リテ
イカスから産生されるリシルエンドぺプチダーゼ
（アクロモバクター・プロテアーゼ、以下PLP
と称す。特開昭54−119085号公報参照。）である。 酵素反応は広く利用されているが、通常酵素は
基質水性溶液に溶解した状態で使用され、反応終
了後酵素回収は至難であると共に、反応生成物の
分離精製も容易でない。更に元来、酵素は決して
安定でなく、中性域で常温付近、常圧下に使用さ
れ、回収によつて著しく損耗する。広い温度域及
び広いPH域で安定、各種の溶剤中に於いても使用
でき、簡易に安定に回収できる、という要求は
PLPに於いても当然の要求であつた。 PLPは、土壌から分離されたアクロモバクタ
ー・リテイカスM497−１が産出する菌体外酵素
で、副島、正木らによつて発見され、アグリカル
チユラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリ
ー第42巻（1978年）1442頁、及び特開昭54−
119085のアクロモバクター・プロテアーゼと同
一の酵素である。至適温度は約45℃、カゼインを
基質とした場合、プロテアーゼ活性の至適PHは
8.5〜10.5、ゲル過法による分子量は27，000、
等電点PH6.9、ジイソプロピルフオスフオフロリ
ド及びトシル−Ｌ−リシンクロロメチルケトンに
よつて強く阻害を受け、トシル−Ｌ−フエニルア
ラニンクロロメチルケトン、エチレンジアミンテ
トラアセテート、オルソフエナンスロリン及びｐ
−クロロマーキユリーベンゾエートで阻害されな
いセリン酵素であり、Ｌ−リジンのカルボキシル
基に於けるエステル結合及びアミド結合を特異的
に水解、それ故にブタインシユリンからヒトイン
シユリンの半合成に於いて有用であること周知で
ある。 勿論従来の上記半合成はPLPが単量体の形で
液相反応で使用され、得られたヒトインシユリン
に夾雑が絶対に許されぬ故に、多大の労力と時間
とをかけて、分離の工程が実施され、他方その間
にPLPは失活して回収品の再使用は全く不可と
なり、結局大きい経済的負担が強要されることに
なるものであつた。 これに対し、酵素固定化の概念をPLPに適用
する試みがあり、それなりの利点を見出すことに
なつたが、固定化の結果不溶性になるので、酵素
反応は懸濁状態などで行われねばならず、反応を
円滑ならしめる為に、相応の工夫及び熟練が必要
であること当然である。これらの工夫及び熟練の
内容としては、なるべく均一な懸濁状態を得るた
めの有効な攪拌、接触時間を長くするためのカラ
ムの改善、適当な有機溶剤の比較的多量の併用、
酵素の大過剰使用などがあるが、不利益を免れな
い。 本発明者らは、これらの不利を一挙に解決する
技術の開発を目的として鋭意研究の結果、固定化
によらないPLPの安定化、而も得られたものは
水溶性であると共に、分子量の大きい差を利用し
て分離精製が極めて簡単に行い得る。新規な
PLP架橋重合体の発明を完成した。通常、酵素
を何らかの方法によつて重合すると、その活性部
位が変化し、その酵素活性が低下するのである
が、本発明重合体では全く活性低下がなく、極め
て意外な有用な結果が得られた。 即ち、本発明は、PLPを多官能性有機化合物
を用いて架橋重合させて得られる、重合前と同等
の酵素作用を有し、且つ 分子量：約40万〜約70万 PH安定性：少くともPH７〜11に於て安定 熱安定性：少くとも40℃まで安定 なる物性を有するPLPの水溶性架橋重合体の発
明である。 本発明水溶性PLP架橋重合体は、PLPを、多
官能性有機化合物等を以て架橋重合したもの、ス
ペーサーとしてポリアミンを併用して同じく架橋
重合したもの、または水溶性蛋白を併用して同じ
く架橋重合したものであり、何れの場合も得られ
た本発明水溶性架橋重合体は、分子量約40万〜約
70万、水溶性にして、広範囲の環境条件に於いて
極めて安定、且つ重合前のPLPと全く同等の酵
素作用を、より広範囲の反応条件に於いて発揮す
る。また本発明重合体を、更に適宜担体を選んで
固定化することも自由である。 PLPの架橋重合に当つては、PLPの反応液中
最終濃度は、通常0.2〜20重量％、より好ましく
は１〜15重量％に調整される。酵素濃度を小さく
すると本発明架橋重合体の収率が低下し、実用性
に乏しくなり、この範囲以上に大きくすると、成
績体は水溶性を失う。このように調整された
PLP水性溶液に、本発明の架橋剤、スペーサー、
及び水溶性蛋白を第１表記載何れかの組み合せで
使い、反応させ本発明PLP水溶性架橋重合体を
得る。

【表】 ○：使用する −：使用せず
本発明架橋剤は、グルタルアルデヒド等のポリ
アルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナート、
ヘキサメチレンジイソチオシアナート、トルエン
ジイソシアナート等のポリイソシアナートなどが
通常使用され、約１〜５％濃度で使用するのが好
ましい。高濃度に過ぎると反応急激となつて不溶
化等を来たし、低濃度に過ぎると収率低下を来た
す。本発明スペーサーは、スペルミン、スペルミ
ジンなどのポリアミンが例示され、本発明水溶性
蛋白は、アルブミン、水溶性ゼラチンなどの蛋白
が、特に工業的に安価に供給されるので好まし
い。第１表記載の何れかの組み合せを行い、これ
ら混合物を、通常中性付近、30℃程度で、数分乃
至30時間インキユベートし、架橋重合反応後に、
透析によつて素材を除去するか、ゲル過する
か、限外過するか、超遠心分離するか、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動を利用するか、アンホ
ラインなどの等電点電気泳動を利用するか、何れ
の場合も容易に目的物を単離することができる。
斯く得られた本発明PLP架橋重合体は、直ちに
酵素反応に使用するもよし、30℃以下で適当なPH
緩衝液中に保存するもよし、凍結乾燥品として保
存するもよし、何れの場合も適宜必要に応じて極
めて有効な酵素反応活性を発揮する。更に自体公
知の方法で固定化するのに供することもでき、固
定化酵素として有効に使用することも可能であ
る。 本発明水溶性PLP架橋重合体は極めて高い活
性と特異性を示し、またPH安定性、熱安定性、各
種媒体中の安定性は、重合前のPLPに比べて著
しく高い。後述実施例１で得られる水溶性架橋重
合体について、第２，３，４表にそれら安定性
を、重合前のPLPと比較して記載する。

【表】

【表】

【表】 ここに酵素の活性は、次のようにして測定し
た。0.2モル２−アミノ−２−メチル−１，３−
プロパンジオール緩衝液（PH9.5）2.6mlに、2.5ミ
リモルベンゾイルリジン−ｐ−ニトロアニリド水
溶液0.3mlを加え、30℃で予備加温後、酵素0.1ml
を添加し、正確に25分間30℃で反応させる。反応
後45％酢酸水溶液1.0mlを加えて反応を停止させ、
次いでその反応液を波長405nmで比色測定して吸
光度を求める。酵素単位としては、30℃に於い
て、１分間当り１マイクロモルのｐ−ニトロアニ
リンを生成する酵素量を１単位μとした。酵素力
価の算出は次式によつた。 活性（μ／ml）＝△○Ｄ／min×１／9.62×4.0／0.1 ×希釈倍率 また本発明架橋重合体0.144μ含有液0.1ml、第
５表記載の各基質2.5ミリモル含有液0.3ml、0.2モ
ル２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジ
オール緩衝液（PH9.5）2.6mlの混液を30℃で反応
させ、以下上記活性測定法によつて、各基質に対
する活性を測定すると、第５表の結果が得られ
た。

【表】 これから明らかな通り、本発明PLP水溶性架
橋重合体は、リジンのカルボキシル基の結合に強
く作用し、アルギニンについては殆ど作用せず、
またその他のアミノ酸の結合を水解することはな
い。 本発明PLP架橋重合体を使用する場合、これ
と基質とを混合して最適条件で反応させた後、ゲ
ル過或はイオン交換体等によつて、本発明架橋
重合体を回収する。このように容易な分離回収
は、本発明の利点の一つであると共に、回収でき
た本発明架橋重合体は、その酵素活性に全く損耗
を来たしていないので、繰返し使用することがで
きる。 このような特異的活性とその安定性の故に、ア
ミノ酸配列決定の際のペプチドの酵素分解、リシ
ルペプチドの分解と合成などに利用できるのは当
然であり、本発明者は、本発明架橋重合体を用い
て、ヒトインシユリンの半合成法を確立した。 ブタインシユリンをヒトインシユリンに転換す
る方法については、ルツテンベルグ著サイエンス
第177巻（1972年）623頁、ガイガー等著フイジオ
ロジカル・ケミストリイ第357巻（1976年）759頁
等の化学法、日特開昭54−135789、日特開昭55−
18799等の酵素法があるが、前者は煩雑で副生物
多く低収率であり、後者は若干の改善をなした
が、酵素の使用量及びその回収の困難、または有
機溶媒の使用ということから、工業的に高価であ
ることを免れない。 本発明のPLPの水溶性架橋重合体を利用する
ことによりヒトインシユリンの半合成を有利に行
うことができる。本発明PLP架橋重合体が水溶
性であるため、均一系で反応できること、及び極
めて安定性高いため、酵素作用の活性を損うこと
なく、回収及び繰返し使用が可能であること、若
しくは水単独でも、水と混和できる有機溶媒を広
範囲に併用する系でも、高収率に酵素反応が行わ
れる。更に本発明架橋重合体が高分子量であるた
め、反応系から例えば分子篩ゲル過法で簡易に
とり出すことができるので、目的物の分離精製
も、本発明架橋重合体の回収も極めて有利であ
る。 ヒトインシユリンの半合成に、本発明架橋重合
体を利用するのに、反応は二種類ある。その一つ
は、ブタインシユリン、カルボキシル基が保護さ
れたまたはされないＬ−スレオニン（以下Thr−
ORと表示する、Ｒは水素または、置換された若
しくはされないアルキルかアラルキル）、及び本
発明PLP架橋重合体を反応させ、ぺプチド交換
反応によつてThr−ORをB₃₀に有するヒトインシ
ユリン誘導体を製造し、公知方法でヒトインシユ
リンにする方法、他の一つは、ブタインシユリン
と本発明架橋重合体をインキユベートして、B₃₀
を切断して得たデスアラニンインシユリン（以下
DAIと称す）を得、次いでDAIとThr−ORと本
発明架橋重合体をインキユベートし、Thr−OR
をB₃₀に有するヒトインシユリン誘導体（以下
B₃₀RO−Thr−Ｉと称す）を製造し、公知方法で
ヒトインシユリンにする方法である。 何れの場合も、反応溶媒は水単独でも、また原
料の溶解性を増すために水と混和する有機溶媒の
一種以上を併用しても良い。有機溶媒の併用の量
については特に制限はない。使用される有機溶媒
としては、例えばメタノール、エタノール、イソ
プロパノール、エチレングリコール、メチルセロ
ソルブ、アセトン、ジオキサン、ジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド等がある。これら
溶媒中の本発明PLP水溶性架橋重合体の安定性
を、重合前のPLPと比較して示せば第６表の通
りであり、活性低下の懸念は全くない。

【表】 Thr−ORのＲとしては、水素、メチル、エチ
ル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ベンジル等が例
示される。反応温度は50℃以下とするが、好まし
くは20〜40℃である。反応系のPHは４〜10、特に
５〜８が好ましい。ブタインシユリンまたはDAI
に対するThr−ORのモル濃度比は、大きい方が
望ましいが、通常１：５〜１：1000程度にすれば
よい。反応液の緩衝剤としては、トリスヒドロキ
シメチルアミノメタン、クエン酸、リン酸塩緩衝
液等が用いられる。反応液中本発明PLP架橋重
合体の濃度は、0.1〜10mg／ml程度が良く、反応
時間は通常３〜72時間、多くの場合６〜24時間で
ある。 得られたB₃₀RO−Thr−は、ペプチド合成で
通常行われる公知の方法、例えばＲがｔ−ブチル
の場合、即ちB₃₀Bu^tＯ−Thr−のときは、アニ
ソール・トリフルオロ酢酸処理によつて、ｔ−ブ
チルが除去され、ヒトインシユリンにされる。
Thr−ORのＲが水素、即ちスレオニンを使用し
ても、ペプチド変換の反応が進行することは、ラ
ベル化されたスレオニンを用いる実験で確認され
たが、成績体と原料ブタインシユリンとの分離精
製が容易でなく、勧められない。 本発明のPLPの水溶性架橋重合体を利用して
半合成されたヒトインシユリンは、通常の方法に
よつて製剤化され、例えば糖尿病治療剤として患
者に投与される。本発明が斯業に貢献することは
極めて大きい。以下に実施例の若干を示すが、こ
れら実施例は本発明を限定するものではない。尚
架橋重合を示す例で、１回の重合の収率を示して
いるが、重合に消費されなかつたPLPは、再び
次の架橋重合に付されるので、穏和な重合条件で
損耗されることなく、無駄なく本発明水溶性架橋
重合体を与えることになる。 実施例 １ PLP10mg（比活性3.6u／mg）とグルタルアルデ
ヒド12mgを含有する0.01Mリン酸塩緩衝液（PH
7.2）１mlとを、４℃で20時間攪拌反応後、反応
液をセフアデツクスＧ−100のカラム（φ1.5×87
cm）によるゲル過に付し、カラム容積比約0.3
の位置に、水溶性PLP架橋重合体17.3単位（比活
性（ｕ／OD₂₈₀）1.37）収率48％を収得。その諸
性質は以下の通りである。 （） 分子量 約45万（セフアデツクスＧ−200を用いるゲル
過法による。） （） PH安定性 緩衝液としてブリトン・ロビンソン緩衝液（PH
２〜12）を用い、30℃で１時間保持した後活性測
定した結果、図１の結果を得たことから、PH７〜
11.5に於いて安定。 （） 熱安定性 0.2M2−アミノ−２−メチル−１，３−プロパ
ンジオール緩衝液（PH9.5）を用いて各温度で１
時間保持し、図２の通り40℃迄安定。 （）ミカエリス定数（Km値） PH9.5，30℃でベンゾイルリジン−ｐ−ニトロ
アニリドを基質とした場合、0.15mM。 （） 至適PH ブリトン・ロビンソン緩衝液（PH２〜12）を用
い、30℃で各PHに於ける活性測定を行つた結果、
9.5付近を得た。 （） 至適温度 各温度に於ける活性測定の結果、40℃付近。 実施例 ２ PLP5mg（比活性3.8u／mg）とスペルミン0.2mg
とを、グルタルアルデヒド６mgを含有する0.01M
リン酸塩緩衝液（PH7.2）0.5ml中、４℃で20時間
反応後、実施例１と同様にして水溶性PLP架橋
重合体8.36単位（比活性（ｕ／OD₂₈₀）0.797）収
率44％を収得。その諸性質は以下の通り（測定法
は実施例１と同じ）。 （） 分子量 約50万 （） PH安定性 PH７〜11.5に於いて安定。 （） 熱安定性 42℃迄安定。 実施例 ３ PLP5mg（比活性3.8u／mg）と水溶性ゼラチン
（田辺製薬(株)製NP−2000）４mgを、0.01Mリン酸
塩緩衝液（PH7.2）0.2mlに溶解後、グルタルアル
デヒド６mgを含有する同上緩衝液0.3mlを加え、
25℃で50分間反応、以下実施例１と同様にして水
溶性PLP架橋重合体5.89単位（比活性（ｕ／
OD₂₈₀）0.702）収率31％を収得。前記測定法で得
る諸性質は以下の通り。 （） 分子量 約60万（この値は、セフアロー
ス6Bを用いるゲル過法による。） （） PH安定性 PH６〜11に於いて安定。 （） 熱安定性 40℃まで安定。 実施例 ４ PLP5mg（比活性2.09u／mg）、牛アルブミン
11.6mg、及びスペルミン0.1mgを、0.01Mリン酸塩
緩衝液（PH7.2）0.2mlに溶解、グルタルアルデヒ
ド６mg含有同上緩衝液0.3mlを添加後４℃で４時
間攪拌反応、以下実施例１と同様にして水溶性
PLP架橋重合体4.50単位（比活性ｕ／OD₂₈₀）
0.18）収率43％を収得。分子量は実施例２の法、
他は実施例１と同様に測定すれば （） 分子量 約65万 （） PH安定性 PH４〜11.5に於いて安定。 （） 熱安定性 42℃まで安定。 実施例 ５ PLP（比活性3.8u／mg）５mgを、0.01Mリン酸
塩緩衝液（PH7.2）0.35mlに溶解し、ヘキサメチ
レンジイソシアナート２mgを含有するアセトン溶
液0.05ml及びスペルミン0.2mgを含有する0.01Mリ
ン酸塩緩衝液（PH7.2）溶液0.1mlを添加、室温で
１時間攪拌反応させた後、実施例１と同様にし
て、水溶性PLP架橋重合体2.8単位（比活性
（ｕ／OD₂₈₀）0.737）、収率14.7％を収得。その諸
性質は以下の通りである。 （） 分子量 約45〜50万（実施例１の（）と同方法）。 （） PH安定性 PH７〜11.0で安定（同じく（）と同方法）。 （） 熱安定性 42℃迄安定（同じく（）と同方法）。 参考例 １（固定化） 常法によりブロムシアンで活性化したセフアロ
ース4B（フアルマシヤ社製）0.5g（湿重量）と、
実施例１で得られた水溶性PLP架橋重合体5.58単
位とを、0.025Mホウ酸ナトリウム緩衝液（PH
8.5）２ml中４℃で20時間反応、取固形物を順
次、0.025Mホウ酸ナトリウム緩衝液（PH8.5）、
1M食塩含有同上緩衝液（PH8.5）、1M食塩含有
0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（PH5.0）、1.5％グリ
シン含有0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液、及び
0.01Mトリス−塩酸緩衝液（PH８）で洗浄、PLP
架橋重合体の固定化酵素0.5g（湿重量）（活性
0.862単位／0.5湿担体）を収得。 参考例 ２（固定化） 実施例１で得られた水溶性PLP架橋重合体5.34
単位を含有する0.01Mリン酸塩緩衝液（PH5.5）
２mlに、予め活性化したアンバーライトCG−50
（ローム・アンド・ハース社製）1g（湿重量）を
加えて懸濁、40℃で攪拌し乍ら１−エチル−３−
〔３−（ジメチルアミノ）プロピル〕カルボジイミ
ド塩酸塩100mg含有同上緩衝液２mlを徐々に加え、
更に同温度で15時間反応、取固形物を順次、同
上緩衝液、1M食塩含有同上緩衝液、及び2mMト
リス−塩酸緩衝液（PH8.0）で洗浄、PLP架橋重
合体の固定化酵素1.0g（湿重量）（活性0.66単位／
1g湿担体）を収得。 参考例 ３（インシユリンへの適用） ブタインシユリン100mg（濃度2mM）と、5M
酢酸3.5mlで中和したthr−OBu^t（Thr−ORに於い
てＲ＝第三級ブチル）3.08g（濃度2M）に、エタ
ノール・ジメチルホルムアミド（１容：１容）混
液を40％含む2M酢酸緩衝液（PH5.5）を加えて溶
解、全容を8.5mlとする。実施例１で得た水溶性
PLP架橋重合体の濃縮液10アミダーゼ活性単
位／ml液0.3mlを加え、一夜37℃に保つ。高速液
体クロマトグラフイによる確認により、B₃₀Bu^t
Ｏ−Thr−が収率65％で生成。 反応混液をそのまま超微細粒のセフアデツクス
G100のカラム（φ4×200cm）にかけ、0.5M酢酸
緩衝液（PH5.0）でゲル過し、酵素画分、イン
シユリン画分、Thr−OBu^t画分に分画する。酵
素画分は濃縮して、或は凍結乾燥後粉末にして、
Thr−OBu^t画分は凍結乾燥して、何れも再使用
できるが、酵素画分即ち水溶性PLP架橋重合体
の活性回収率は95％。 インシユリン画分は凍結乾燥した後0.01Mトリ
ス緩衝液（PH7.4）と7M尿素溶液で緩衝化した
DEAEセフアデツクスA25のカラム（φ2×25cm）
にかけ、上記緩衝液を４℃で800ml流した後、食
塩濃度を0.3Mまで直線的に濃度勾配をつけた溶
出を行い、0.08〜0.13M画分と0.17〜0.21M画分
とを採る。両画分を直ちに３〜４日間冷所で
0.01M酢酸アンモニウム溶液に対して透析した
後、凍結乾燥して前者画分からB₃₀Bu^tＯ−Thr−
の粉末55mgを収得。収率55％。 この粉末50mgにアニソール0.2mlを含むトリフ
ルオロ酢酸２mlを加え、30分間室温に保つた後、
窒素気流中でトリフルオロ酢酸を除き、1M酢酸
２mlを加えた後エーテル15mlでアニソールを抽出
する。酢酸部を凍結乾燥してヒトインシユリン43
mgを収得。 本品はスラブゲル電気泳動、高速液体クロマト
グラフイによつて標品と同定、ヒトインシユリン
であることを確認すると共に、6N塩酸で24時間
110℃処理して加水分解し、アミノ酸分析で下記
の通り理論値と一致することを認めた。

【表】 参考例 ４（インシユリンへの適用） ブタインシユリン200mg（濃度0.87mM）を
0.1M炭酸水素アンモニウム（PH8.3）40mlに溶
解、実施例１で得た水溶性PLP架橋重合体粉末
４mgを添加、37℃で24時間反応、生成するアラニ
ン量をアミノ酸オキシダーゼ法及びニンヒドリン
法で定量し、98％及び92％のブタインシユリンか
らDAIへの転換率を知る。 反応混液の凍結乾燥物と、5M酢酸7.0mlで中和
したThr−OBu^t6.2g（濃度2M）とを、エタノー
ル、ジメチルホルムアミド（１容：１容）混液を
40％含有する0.5Mトリス緩衝液（PH6.5）10mlに
溶解、一夜37℃に保つ。高速液体クロマトグラフ
イで測定したB₃₀Bu^tＯ−Thr−生成率は75％。
参考例２と同様にゲル過、イオン交換クロマト
グラフイを行い、B₃₀Bu^t−Thr−の120mgを得、
他方水溶性PLP架橋重合体の活性回収率92％を
収得。 得られたB₃₀Bu^tＯ−Thr−は、高速液体クロ
マトグラフイ及びポリアクリルアミドゲル電気泳
動によつて同定される。 参考例 ５（インシユリンへの適用） 5M酢酸3.5mlで中和したThr−OBu^t3.1g（濃度
2M）の2M酢酸緩衝液（PH5.1）溶液５mlに、ブ
タインシユリン100mg（濃度2mM）を溶解、実施
例１で得た水溶性PLP架橋重合体の濃縮液10ア
ミダーゼ活性単位／ml液0.3mlを加え、一夜37℃
に保つ。高速液体クロマトグラフイによるB₃₀
Bu^tＯ−Thr−生成率は60％。 参考例３と同様に精製し、B₃₀Bu^tＯ−Thr−の
収量50mg、水溶性PLP架橋重合体の活性回収率
は89％。 参考例 ６（インシユリンへの適用） ブタインシユリン100mg（濃度2mM）と、5M
酢酸3.5mlで中和したThr−OBu^t3.1g（濃度2M）
の2M酢酸緩衝液（PH5.1）溶液５mlを、メタノー
ル、ジメチルスルホキシド（１容：１容）混液を
40％含む2M酢酸緩衝液（PH5.5）を加えて溶解、
全容を8.5mlにする。これに実施例２で得た水溶
性PLP架橋重合体２mgを加え、一夜37℃に保つ。
反応率は60％。参考例３と同様にしてB₃₀Bu^tＯ
−Thr−の収量50mg、触媒の活性回収率は93
％。 参考例 ７（インシユリンへの適用） 実施例３で得た水溶性PLP架橋重合体の濃縮
液15アミダーゼ活性単位／ml液0.3mlと、参考例
４で得たDAI100mg（濃度2mM）と、5M酢酸3.5
mlで中和されたThr−OBu^t3.1g（濃度2M）とを、
エタノール・ジメチルホルムアミド（１容：１
容）混液を40％含有する0.5Mトリス緩衝液（PH
6.5）５mlに溶解、一夜37℃に保つ。反応率は68
％。参考例３と同様にしてB₃₀Bu^tＯ−Thr−の
収量55mg、触媒の活性回収率は88％。 参考例 ８（インシユリンへの適用） 参考例１の方法で得た固定化PLP架橋重合体
4.5単位、参考例４の方法で得た中間体DAI100mg
（濃度2.0mM）、及び5M酢酸3.5mlで中和された
Thr−OBu^t3.1g（濃度2M）を、エタノール及びジ
メチルホルムアミド17％を含有する2M酢酸ナト
リウム緩衝液（PH7.0）５mlと混合し、37℃で一
夜攪拌反応、過して目的物B₃₀Bu^tＯ−Thr−
を得。高速液体クロマトグラフイによる生成率は
65％、固定化PLP架橋重合体の活性回収率は85
％。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に於ける本発明PLP架橋重
合体のPH安定性を示すグラフ、第２図は同じく熱
安定性を示すグラフである。 ―― 本発明水溶性PLP架橋重合体 ‐‐‐‐ 重合前のPLP

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アクロモバクター・リテイカス産生リシルエ
   ンドぺプチダーゼ（アクロモバクター・プロテア
   ーゼ）を多官能性有機化合物を用いて架橋重合
   させて得られる、重合前と同等の酵素作用を有
   し、且つ 分子量：約40万〜約70万 PH安定性：少くともPH７〜11に於て安定熱安定
   性：少くとも40℃まで安定 なる物性を有するアクロモバクター・プロテアー
   ゼの水溶性架橋重合体。 ２ 水溶性蛋白の共存下に架橋重合させて得られ
   る特許請求の範囲第１項に記載の水溶性架橋重合
   体。 ３ スペーサーの共存下に架橋重合させて得られ
   る特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の水溶
   性架橋重合体。 ４ スペーサーがポリアミンである特許請求の範
   囲第３項に記載の水溶性架橋重合体。