KR100375159B1 - 팔미토일 보효소 ａ를 이용한 포유동물의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 팔미토일 보효소 Ａ를 이용한 사람의 혈청알부민(HSA)의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 팔미토일 보효소 A를 사람의 혈청알부민에 처리함에 따라서, HSA는 팔미토일 보효소 A와의 결합에 의하여 삼차구조가 변형되고, 삼차구조가 변형된 HSA는 생체내 존재하는 환원제인 티오리독신(Trx)을 이용하여 지질과산화물을 효과적으로 제거할 수 있는 강력한 과산화효소 활성을 지닌다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 팔미토일 보효소 A의 처리에 의하여 유도된 삼차구조가 변형된 사람의 혈청알부민은 항산화제로서 의약품 및 식품에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

팔미토일 보효소 Ａ를 이용한 포유동물의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법{A Method for Enhancing Peroxidase Acitivity of Mammal Serum Albumin by Palmitoyl Coenzyme A}

본 발명은 팔미토일 보효소 Ａ를 이용한 사람의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 팔미토일 보효소 Ａ(palmitoyl coenzyme A)를 사람의 혈청알부민에 처리하여 이들이 결합함으로써 사람의 혈청알부민의 삼차구조를 변형시켜, 사람의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 활성산소종 및 지질과산화물(lipid peroxide)은 산화적 스트레스(oxidative stress)를 야기시켜, 동맥경화증, 당뇨, 파킨슨 병(Parkinson's disease), 치매, 노화 등의 퇴행성 질환뿐 아니라, 암을 유발한다고 알려져 있다. 따라서, 이러한 활성산소종 및 지질과산화물에 의하여 야기되는 산화적 스트레스를 방어하기 위하여 생체내에 여러가지 과산화효소(peroxidase)가 존재하는데, 혈장내에 항산화효소인 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase), 수퍼옥사이드 디스무타제(superoxide dismutase) 및 카탈라제(catalase) 등이 이에 해당한다.

최근에, 이들 항산화를 담당하는 효소이외에, 혈장 단백질의 대부분을 차지하는 사람의 혈청알부민(human serum albumin, 이하, 'HSA'라 함)이 글루타티온 또는 시스테인을 이용하여 미미하게나마 과산화물을 분해할 수 있다로 알려져 있다(참조: Cha M. K., and Kim I. H.,Biochem. Biophys. Res, Commun., 222:619-625, 1996; Hurst, R.et al.,Biochem. J.,338:723-728, 1999). 그러나, HSA가 산화효소로 작용하기에는 그 활성이 너무 미약하여, 항산화제로 사용할 수 있도록 구조적으로 변화시켜 미미한 과산화효소 활성을 증가시킬 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구되었다.

이에, 본 발명자들은 팔미토일 보효소 A가 세포내의 대사조절 및 신호전달 체계에 중요한 조절인자로 작용하는 것에 착안하여, 팔미토일 보효소 A가 HSA에 작용할 수 있는지의 여부 및 팔미토일 보효소 A에 의하여 HSA의 과산화효소 활성에 어떠한 변화가 일어나는지 연구한 결과, 팔미토일 보효소 A가 HSA의 리간드로 작용하여 HSA의 삼차구조를 변화시킴으로써 HSA의 과산화효소 활성이 현저히 증가되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 팔미토일 보효소 Ａ를 사람의 혈청알부민에 처리하는 단계를 포함하는 사람의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 팔미토일 보효소 A의 결합에 의한 사람의 혈청알부민(HSA)의 형광스펙트럼의 변화를 나타낸다.

도 2는 카르복실기가 변형된 사람의 혈청알부민(CM-HSA)의 농도에 따른 과산화효소 활성을 나타내는 그래프이다.

도 3은 티오리독신(Trx)계에 연계된 사람의 혈청알부민(CM-HSA)의 리놀레산 과산화물(LOOA)에 대한 과산화효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 팔미토일 보효소 A의 존재하에 티오리독신(Trx)계에 연계된 HSA의 리놀레산 과산화물(LOOA)에 대한 과산화효소 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 아실기의 탄소수의 변화에 따른 아실 보효소 A가 미치는 사람의 혈청알부민(HSA)의 리놀레산 과산화물(LOOA)에 대한 과산화효소 활성에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.

이하에서는, 본 발명의 팔미토일 보효소 Ａ에 의하여 사람의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법에 대하여, 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

팔미토일 보효소 A가 HSA의 리간드로 작용하여 HSA에 어떠한 변화를 유발하는지 알아보기 위하여, 형광 스펙트럼을 이용하여 팔미토일 보효소 A 또는 팔미트산의 처리에 의하여 유발되는 HSA의 구조적인 변화를 측정하였다. HSA는 18개의 티로신과 1개의 트립토판을 내재하고 있는 바, HSA를 팔미토일 보효소 A 또는 팔미트산과 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, 280nm의 파장으로 여기시켜 328nm의 파장에서 최대 형광을 나타내는 스펙트럼을 조사한 결과, 팔미토일 보효소 A와 반응시켰을 때 선택적으로 최대 형광 파장이 짧아지는 것을 확인할 수 있었다. 이에, 팔미토일 보효소 A가 HSA의 리간드로 작용하여 팔미토일 보효소 A가 HSA에 결합함으로써, HSA의 구조적인 변화를 유발함을 확인할 수 있었다.

한편, 종래 알려진 HSA의 리간드에 결합된 HSA는 카르복실기가 변형된 HSA(carboxyl group modified-HSA, 이하, 'CM-HSA'라 함)로 변화한다는 사실이 알려져 있으므로(참조: Bos O. J. M.,et al.,J. Biol. Chem.,264:953-959, 1989), 전기 팔미토일 보효소 A가 HSA의 리간드로 작용하는 결과에 근거하여, 팔미토일 보효소의 결합에 의하여 삼차구조가 변화된 HSA가 CM-HSA라는 가정하에 CM-HSA의 생리활성, 특히 CM-HSA가 산화작용에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위하여, 우선 HSA로부터 염다리를 제거하여 CM-HSA를 제조하였다. 이어, DDT의 존재하에 서 CM-HSA의 농도에 따른 과산화효소 활성을 리놀레산 과산화물(linoleic hyperoxide, 이하, 'LOOA'라 함)을 대상으로 알아본 결과, CM-HSA의 농도에 의존하여 CM-HSA의 리놀레산 과산화효소 활성이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.

이미, 본 발명자들은 HSA의 미미한 과산화효소 활성이 티올기를 함유한 금속 촉매 산화계(thiol metal-catalyzed oxidation system)에 의하여 이루어진다고 보고한 바가 있으므로(참조: Cha M. K., and Kim I. H.,Biochem. Biophys. Res,Commun.,222:619-625, 1996), HSA 및 팔미토일 보효소 A의 결합에 의해 HSA가 변화될 것으로 예상되는 구조인 CM-HSA의 과산화효소의 화학적 환원제에 의하여 그 활성이 증가되는지를 확인하기 위하여, 티올기를 함유한 금속 촉매 산화계인 디티오트레이톨(dithiothreitol, 이하, 'DDT'라 함) 존재하에서의 활성을 비교하였다. 아울러, 생체내에서 존재하는 환원제는 티오리독신(thioredoxin, 이하, 'Trx'이라 함)이므로, 실제 CM-HSA가 과산화효소 활성을 나타내는데 있어서, Trx를 사용하는지 여부에 대하여 측정하여 과산화효소 활성을 DDT의 경우와 비교해 본 결과, HSA는 과산화효소 활성을 나타내지 못하지만, 팔미토일 보효소 A와 결합함에 따라 예상되는 CM-HSA는 HSA의 과산화효소 활성보다 현저히 증가된 과산화효소 활성을 나타내며, 그 활성은 DDT를 이용하는 경우보다 강력함을 확인할 수 있었다.

또한, HSA의 리간드 결합 및 HSA의 과산화효소 활성에 있어서, 팔미토일 보효소 A와 HSA을 반응시켜 이들이 결합함에 따라서, Trx에 연계된 HSA의 과산화효소 활성이 증가하는지 알아본 결과, 팔미토일 보효소 A의 존재하에서 HSA가 CM-HSA와 유사한 항산화 특성을 가짐을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 결과와 상술한 결과를 종합하였을 때, 팔미토일 보효소 A의 존재하에 HSA의 삼차구조가 변형되어 CM-HSA로 변화됨으로써, 미미한 HSA의 과산화효소 활성에 변화가 일어나 Trx를 이용하여 과산화효소 활성이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.

한편, 팔미토일 보효소 A는 아실 보효소 A에 속하므로, 아실기의 탄소수의 변화에 따른 아실 보효소 A가 미치는 HSA의 과산화효소 활성에 대한 효과를 비교해 본 결과, 탄소수의 증가에 따라 HSA의 활성이 증가하지만, 탄소수가 16개인 팔미토일 보효소 A가 가장 강한 활성인자임을 알 수 있었는 바, 팔미토일 보효소 A가 HSA에 결합함에 따라서, HSA의 과산화효소 활성을 증가시킬 수 있음을 재확인할 수 있었다.

상술한 결과에 의하여, 팔미토일 보효소 A를 HSA에 처리하게 되면, HSA의 삼차구조가 변형되며, 삼차구조가 변형된 HSA는 생체내 존재하는 환원제인 Trx를 이용하여 지질과산화물을 효과적으로 제거할 수 있는 강력한 과산화효소 활성을 지님을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 CM-HSA는 HSA에 비하여 과산화효소 활성이 크게 증가되므로, CM-HSA는 항산화 작용을 가지는 의약품 및 식품첨가물로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 팔미토일 보효소 A에 의한 HSA의 구조변화

팔미토일 보효소 A가 HSA에 결합하여 구조변화를 일으킴으로써, HSA의 과산화효소 활성이 증가하는지를 알아보기 위하여, 우선, HSA를 사람의 혈장에서 정제한 후(참고문헌: Cha M. K., and Kim I. H.,Biochem. Biophys. Res, Commun.,222:619-625, 1996), pH 3.0에서 약용탄(charcoal)에 의하여 탈지화시켰다. 그런 다음, 0.2㎎/㎖의 HSA에 3μM의 팔미토일 보효소 A 또는 팔미트산을 가하여 실온에서 30분동안 반응시킨 후, 280nm의 파장으로 여기시켜 형광스펙트럼을 이용한 HSA의 구조변화를 조사하였다. 도 1은 팔미토일 보효소 A의 결합에 의한 HSA의 형광스펙트럼의 변화를 나타낸다. 이때, 스펙트럼 1은 팔미트산을 가하여 수득한 HSA의 스펙트럼이며, 스펙트럼 2는 HSA 자체가 나타내는 형광 스펙트럼이고, 스펙트럼 3은 팔미토일 보효소 A를 가하여 수득한 HSA의 형광 스펙트럼이다. 도 1에서 보듯이, 팔미토일 보효소 A의 존재하에 HSA의 형광 강도가 감소되는 반면에, 팔미트산의 존재하에서는 형광 강도가 증가됨을 확인할 수 있었으며, 팔미트산 및 팔미토일 보효소 A가 결합하는 경우 모두 HSA의 최대 형광 파장인 328nm에서 단파장쪽으로 이동하는 "청색이동(blue-shift)" 현상을 보였으므로, HSA는 팔미토일 보효소 A에 의하여 삼차구조가 변화됨을 확인할 수 있었다.

실시예 2: CM-HSA의 제조

HSA에 리간드가 결합함에 따라 HSA는 CM-HSA로 변화되는 것이 알려져 있으므로, 팔미토일 보효소 A가 결합함에 따라 HSA가 CM-HSA로 변화될 것으로 예상할 수 있다. 따라서, 변화가 예상되는 CM-HSA의 과산화효소 활성을 측정하기 위하여 사용될 CM-HSA를 제조하였다. 즉, HSA 2.5㎎/㎖를 6M 구아니디움염산(Sigma Chemical Co., U.S.A.)을 포함한 100mM의 pH 4.0 초산나트륨 완충액, 100mM의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, Sigma Chemical Co., U.S.A.), 1M의 히드록실아민(hydroxylamine, Sigma Chemical Co., U.S.A.)의 조건하에 실온에서 2시간 동안 반응시켜 CM-HSA를 제조하였다. 그런 다음, 20mM의 pH 7.4의 트리스-염산 완충용액 상에서 충분히 투석시켜, CM-HSA의 최종 농도가 30㎎/㎖이 되도록 하였다.

실시예 3: CM-HSA의 농도에 따른 과산화효소 활성

HSA는 아주 약한 티올 의존성 항산화 작용을 가지므로, 팔미토일 보효소 A에 의하여 변형된 형태로 예상되는 CM-HSA의 티올 의존성 항산화 작용의 여부를 알아보기 위하여, CM-HSA의 과산화물에 대한 작용을 티올 환원제인 DDT의 존재하에서 측정하였다: 즉, 100mM의 pH 7.4 트리스-염산, 0.5mM DDT(Amersham Life Science, U.K.) 및 50μM 리놀레산 과산화물을 함유한 반응용액에 각각 0.125㎎/㎖, 0.25㎎/㎖ 또는 0.5㎎/㎖의 CM-HSA물을 가하여 반응시켜 CM-HSA를 가하지 않은 대조군과 비교하였다. 도 2는 CM-HSA의 농도에 따른 과산화효소 활성을 나타내는 그래프이다: 이때, 곡선 1은 CM-HSA를 가하지 않은 대조군을 나타내며, 곡선 2는 0.125㎎/㎖의 CM-HSA를 가한 경우, 곡선 3은 0.25㎎/㎖의 CM-HSA를 가한 경우, 곡선 4는 0.5㎎/㎖의 CM-HSA를 가한 경우를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, DDT의 존재하에 CM-HSA의 농도에 의존하여 CM-HSA의 리놀레산 과산화효소 활성이 증가함을 확인할 수 있었다.

실시예 4: Trx에 연계된 HSA 또는 CM-HSA의 과산화효소 활성 측정

티올 환원제 DDT 대신 생체내에 존재하는 Trx를 이용한 HSA 또는 CM-HSA의 과산화효소 활성을 알아보기 위하여, 100mM의 pH 7.4 트리스-염산, 0.8μM Trx, 0.3μM Trx Reductase, 50mM NADPH, 250μM NADPH, 50μM 리놀레산 과산화물을 포함한 반응액을 사용하여 FOX법(참조: Wolff S. P.,Methods Enzymol., 233:182-189, 1994)에 의하여 측정하였다. 이때, 지방산 보효소 A를 첨가하여 HSA의 활성을 측정하는 경우에는, 지방산 보효소 A를 미리 HSA에 첨가하여 30분동안 실온에 반응시킨 후, 잔여 LOOA의 양을 전기 FOX 방법을 이용하여 측정하였다. 또한, Trx계에 의한 환원력을 이용하여 나타나는 HSA의 과산화효소 활성은 반응동안 산화된 NADPH의 양을 340 nm에서 흡광도의 변화를 측정함으로써 확인하였다. 도 3은 Trx계에 연계된 CM-HSA의 LOOA 과산화효소 활성을 나타낸 그래프이다. 도 3에서 보듯이, CM-HSA는 기질인 LOOA의 농도가 증가됨에 따라 포화 경향을 보이면서, 그 속도가 증가되는 전형적인 효소 반응 양상을 보였다. 따라서, CM-HSA는 LOOA에 대한 과산화효소 활성은 Trx와 연계되어 나타나는 효소반응임을 알 수 있었는 바, 팔미토일 보효소 A에 의하여 변화되리가 예상되는 CM-HSA가 Trx와 연계하여 LOOA에 대한 과산화효소 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 팔미토일 보효소 A에 의한 HSA의 과산화효소 활성

HSA의 리간드 결합 및 HSA의 과산화효소 활성에 있어서, 실제적으로 팔미토일 보효소 A와 HSA의 결합에 따라서, Trx에 연계된 HSA의 과산화효소 활성이 증가하는지 측정하였다. 즉, 팔미트산(palmatic acid), 보효소 A(coenzyme A), 라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 팔미토일카르니틴(palmitoylcarnitine) 및 팔미토일 보효소 A와 같이 생체내에 존재하는 리간드의 효과를 HSA의 LOOA 과산화효소 활성을 FOX법에 의하여 측정하기 위하여, 100mM의 pH 7.4 트리스-염산, 0.8μM의 Trx, 0.3μM의 Trx Reductase, 250μM의 NADPH, 250μM의 팔미토일 보효소 A, 0.25㎎/㎖의 HSA 및 50μM의 LOOA를 포함한 반응액 50㎕와 FOX I 시약 0.1㎖을 첨가하여 30분동안 실온에서 반응시켜 560nm의 흡광도로 측정하였다.

도 4는 팔미토일 보효소 A의 존재하에, Trx계에 연계된 HSA의 과산화효소 활성을 나타낸 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 팔미토일 보효소 A의 존재하에 Trx계에 연계된 LOOA 과산화효소 활성의 증가는 HSA의 활성에 8배에 달함을 확인할 수 있었다. 아울러, 팔미토일 보효소 A 대신에 팔미트산 또는 보효소 A를 첨가하여 HSA의 LOOA의 환원으로 기인된 NADPH의 농도감소는 관찰할 수 없었다. 이러한 결과에 의하여, HSA의 LOOA의 항산화 활성을 증가시키기 위해서는 팔미트산 및 보효소 A의 부분이 모두 필요함을 나타내었는 바, 팔미토일 보효소 A의 존재하에서만 HSA가 CM-HSA와 유사한 항산화 특성을 가지므로, 팔미토일 보효소 A에 의하여 변화되리가 예상한 HSA의 CM-HSA로 변화는 실제적으로 일어나는 삼차구조의 변화이며, 이러한 CM-HSA가 미미한 HSA의 과산화효소 활성보다 현저히 증가한 과산화효소 활성을 나타내므로, 항산화제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

이어, 아실 보효소 A내의 아실기의 탄소수가 HSA의 활성 증가에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 탄소수가 다른 아실 보효소 A 250μM을 100mM의 pH 7.4 트리스-염산, 0.8μM의 Trx, 0.3μM의 TR, 0.25㎎/㎖의 HSA 및 50μM의 NADPH를 포함한 반응액 50㎕와 FOX 시약 1㎖을 혼합하여, 실온에서 30분동안 반응시켜 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 5는 아실기의 탄소수의 변화에 따른 아실 보효소 A가 미치는 HSA의 LOOA 과산화효소 활성에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 탄소수의 증가에 따라 HSA의 활성이 증가하지만, 탄소수가 16개인 팔미토일 보효소 A가 가장 강력한 활성인자임을 확인할 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 팔미토일 보효소 Ａ를 이용한 사람의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 팔미토일 보효소 A를 사람의 혈청알부민에 처리함에 따라서, HSA는 팔미토일 보효소 A와의 결합에 의하여 삼차구조가 변형되고, 삼차구조가 변형된 HSA는 생체내 존재하는 환원제인 Trx를 이용하여 지질과산화물을 효과적으로 제거할 수 있는 강력한 과산화효소 활성을 지닌다는 사실을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 팔미토일 보효소 A의 처리에 의하여 유도된 삼차구조가 변형된 사람의 혈청알부민은 항산화제로서 의약품 및 식품에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (2)

1. 팔미토일 보효소 Ａ를 사람을 제외한 포유동물의 혈청알부민에 처리하는 단계를 포함하는 사람을 제외한 포유동물의 혈청알부민의 과산화효소 활성을 증가시키는 방법.
2. 제 1항에 있어서,

   팔미토일 보효소 A를 사람을 제외한 포유동물의 혈청알부민에 처리하여

   삼차구조가 변형된 사람을 제외한 포유동물의 혈청알부민이

   티오리독신을 이용하여 과산화효소 활성이 증가되는 것을 특징으로 하는

   방법.