WO2011149016A1 - 血栓溶解酵素含有複合体 - Google Patents

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tpa
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thrombolytic enzyme
activity
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能彦 斎藤
田畑　泰彦
啓之 川田
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公立大学法人奈良県立医科大学
国立大学法人京都大学
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Definitions

  • the present invention relates to a complex containing a thrombolytic enzyme.
  • the present invention also relates to a method for producing the complex and a composition containing the complex.
  • the present invention also relates to a thrombus treatment system comprising the complex and an ultrasonic irradiation device.
  • thrombus for example, acute myocardial infarction, cerebral infarction, thromboembolic disease, etc.
  • thromboembolic disease a serious disease that may cause sudden death.
  • Several types of treatments have already been developed, but extensive research is being conducted to establish better treatments.
  • Rapidness is required for the acute treatment of these diseases, particularly acute myocardial infarction and cerebral infarction.
  • acute myocardial infarction coronary artery recurrent therapy using a catheter is currently the mainstream in Japan. While recanalization with catheters has a high resumption rate, not only does it waste time for transportation to tertiary hospitals, securing medical staff after transportation, etc., but also the use of labor costs and high material costs, etc. There are many disadvantages from the viewpoint of medical economy.
  • thrombolytic therapy by intravenous administration with tissue plasminogen activator (tPA) has been tried before, but the reopening efficiency is limited to about 60%, and severe bleeding such as cerebral hemorrhage
  • tPA tissue plasminogen activator
  • thrombolytic therapy with tPA has very attractive advantages of rapidity and medical economy, but due to the inadequate effect of lysis itself and the disadvantage of bleeding side effects, Currently, its use is extremely limited.
  • Patent Document 1 describes that by using a specific compound in combination with a thrombolytic agent (tPA), the half-life of tPA can be extended, the activity can be suppressed, and the reduction of bleeding can be achieved. Has been.
  • tPA thrombolytic agent
  • An object of the present invention is to provide a technique capable of controlling a thrombolytic agent so as to have high activity only at a thrombus site and reducing side effects.
  • the inventors surprisingly administer a complex comprising gelatin, a thrombolytic enzyme, and a metal ion, or a complex comprising cationized gelatin, thrombolytic enzyme, and PEGylated gelatin into the body. And it discovered that thrombolytic enzyme activity could be expressed in a desired site
  • PEG represents “polyethylene glycol”.
  • Term A-1 A complex comprising gelatin, a thrombolytic enzyme, and a metal ion.
  • Term A-2 The complex according to Item A-1, wherein the thrombolytic enzyme is a tissue-type plasminogen activator.
  • Term A-3 Item 3.
  • Term A-4 Item 4.
  • Term A-5 Item 5.
  • Item A- for the treatment of at least one thrombotic vascular occlusion disease selected from the group consisting of acute myocardial infarction, cerebral infarction, pulmonary thromboembolism, acute lower limb artery occlusion, and artificial hemodialysis arteriovenous shunt occlusion
  • thrombotic vascular occlusion disease selected from the group consisting of acute myocardial infarction, cerebral infarction, pulmonary thromboembolism, acute lower limb artery occlusion, and artificial hemodialysis arteriovenous shunt occlusion
  • the complex according to any one of 1 to A-7.
  • a liquid composition comprising the composite according to any one of Items A1 to A-8.
  • Term A-10
  • Item is for the treatment of at least one thrombotic vascular occlusion disease selected from the group consisting of acute myocardial infarction, cerebral infarction, pulmonary thromboembolism, acute lower limb arterial occlusion, and artificial hemodialysis arteriovenous shunt occlusion
  • Term A-11-1. And (i) a step of mixing gelatin and a thrombolytic enzyme in a liquid, and (ii) a step of mixing a metal salt or a metal salt solution with the mixed solution obtained in (i). 8. A method for producing a composite according to any one of 7 above.
  • Term A-11-2 The liquid composition according to A-9.
  • Term A-11-1 The liquid composition according to A-9.
  • Term A-11-1. a step of mixing gelatin and a thrombolytic enzyme in a liquid
  • a metal salt or a metal salt solution with the mixed solution obtained in (i). 8.
  • Item A-8 or A- comprising: (i) mixing gelatin and thrombolytic enzyme in a liquid; and (ii) mixing a metal salt or a metal salt solution with the mixed solution obtained in (i). 10.
  • Term A-12 The production method according to Item A-11-1 or A-11-2, wherein the mixing ratio of gelatin and thrombolytic enzyme is about 0.1 to 50 mol of gelatin per mol of thrombolytic enzyme.
  • Term A-13 The mixing ratio of the metal ion and the thrombolytic enzyme is about 10 to 1000 mol of metal ion with respect to 1 mol of thrombolytic enzyme, Item A-11-1, A-11-2, or A-12 Manufacturing method.
  • Term A-14 The mixing ratio of the metal ion and the thrombolytic enzyme is about 10 to 1000 mol of metal ion with respect to 1 mol of thrombolytic enzyme, Item A-11-1, A-11-2, or A-12 Manufacturing method.
  • the step of transvascularly administering the complex according to any one of Items A-1 to A-8, or the liquid composition according to Item A-9 or A-10 to a subject, and an affected area where a thrombus exists A method of treating a thrombus, comprising a step of irradiating ultrasonic waves only to the blood.
  • Term A-15-1 Use of the complex according to any one of Items A-1 to A-8 or the liquid composition according to Item A-9 or A-10 as a medicine.
  • Term A-15-2 Use of the complex according to any one of Items A-1 to A-8 or the liquid composition according to Item A-9 or A-10 as a therapeutic agent for thrombotic vascular occlusion disease.
  • Term A-16 Item 11.
  • Term A-18-1 Item 9.
  • a thrombus treatment system comprising the complex according to any one of Items A-1 to A-8 and a device including means for irradiating the complex with ultrasonic waves.
  • An apparatus comprising: a liquid composition according to Item A-9 or A-10; and a means for irradiating ultrasonic waves to the composite according to any one of Items A-1 to A-8 included in the composition Including a thrombus treatment system.
  • Term B-1 A complex comprising cationized gelatin, thrombolytic enzyme, and PEGylated gelatin.
  • Term B-2 The cationized gelatin has a —COOH group which the gelatin has the following formula (I): —CO—NH— (CH 2 ) a —NH 2 (I) [Wherein, a represents an integer of 1 to 10]
  • Term B-3 A complex comprising: a liquid composition according to Item A-9 or A-10; and a means for irradiating ultrasonic waves to the composite according to any one of Items A-1 to A-8 included in the composition Including a thrombus treatment system.
  • the functional group of PEGylated gelatin has the following formula (II): R— (OCH 2 CH 2 ) n —Z— (CH 2 ) m —Y— (II) [Where, R is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, Z is —O— or —OC (O) —, Y is —CO—NH—, —NH—CO—, or —SS—, n represents an integer of 1 to 2000, and m represents an integer of 0 to 3.
  • PEGylated gelatin has a —NH 2 group that gelatin has the following formula (II): R— (OCH 2 CH 2 ) n —Z— (CH 2 ) m —Y— (II) [Where, R is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, Z is —O— or —OC (O) —, Y is —CO—NH—, n represents an integer of 1 to 2000, and m represents an integer of 0 to 3.
  • thrombolytic enzyme is a tissue-type plasminogen activator.
  • a liquid composition comprising the complex according to any one of Items B-1 to B-8.
  • Term B-10. Item is for the treatment of at least one thrombotic vascular occlusion disease selected from the group consisting of acute myocardial infarction, cerebral infarction, pulmonary thromboembolism, acute lower limb arterial occlusion, and artificial hemodialysis arteriovenous shunt occlusion
  • Item 9 A thrombus treatment system comprising the complex according to any one of Items B-1 to B-8 and a device including means for irradiating the complex with ultrasonic waves.
  • An apparatus comprising: a liquid composition according to Item B-9 or B-10; and a means for irradiating the composite according to any one of Items B-1 to B-8 included in the composition with ultrasonic waves Including a thrombus treatment system.
  • Term B-12-1 Item B-1 to B-8, comprising the steps of (i) mixing cationized gelatin and thrombolytic enzyme in a liquid, and (ii) mixing PEGylated gelatin with the mixed solution obtained in (i). The manufacturing method of the composite_body
  • Item B-9 or B-10 comprising: (i) mixing the cationized gelatin and the thrombolytic enzyme in a liquid; and (ii) mixing the PEGylated gelatin with the mixed solution obtained in (i).
  • the manufacturing method of the liquid composition as described in any one of.
  • Term B-13 The production according to Item A-12-1 or A-12-2, wherein the mixing ratio of cationized gelatin and thrombolytic enzyme is about 0.1 to 50 mol of cationized gelatin per mol of thrombolytic enzyme. Method. Term B-14.
  • Item A-12-1, A-12-2, or A wherein the mixing ratio of PEGylated gelatin and thrombolytic enzyme is about 0.1 to 50 mol of PEGylated gelatin to 1 mol of thrombolytic enzyme.
  • Term B-15. The step of transvascularly administering the complex according to any one of Items B-1 to B-8, or the liquid composition according to Item B-9 or B-10 to a subject, and an affected area where a thrombus exists
  • a method for treating a thrombotic vascular occlusion disease comprising a step of irradiating ultrasonic waves only to the thrombotic vascular occlusion disease.
  • Term B-16-1 The step of transvascularly administering the complex according to any one of Items B-1 to B-8, or the liquid composition according to Item B-9 or B-10 to a subject, and an affected area where a thrombus exists.
  • Item B-16-2 Use of the complex according to any one of Items B-1 to B-8 or the liquid composition according to Item B-9 or B-10 as a medicine.
  • Item B-16-2 Use of the complex according to any one of Items B-1 to B-8 or the liquid composition according to Item B-9 or B-10 as a therapeutic agent for a thrombotic vascular occlusion disease.
  • Item B-17 Use of the complex according to any one of Items B-1 to B-8, or a liquid composition according to Item B-9 or B-10, for use in the treatment of a thrombotic vascular occlusion disease.
  • Item B-18 Use of the complex according to any one of Items B-1 to B-8 or the liquid composition according to Item B-9 or B-10 in the manufacture of a medicament for the treatment of a thrombotic vascular occlusion disease.
  • a greater thrombolytic activity can be obtained only in the affected area. it can.
  • side effects at the site where no thrombus is present can be reduced, and greater thrombolytic activity can be obtained only at the site where the thrombus is present, so that a superior thrombolytic therapeutic effect can be obtained.
  • the complex of the present invention also has an effect of suppressing a decrease in the activity of the thrombolytic enzyme in blood. Therefore, since the amount of thrombolytic enzyme to be administered can be reduced, side effects can also be reduced in this respect.
  • first form complex when a complex comprising gelatin, a thrombolytic enzyme, and a metal ion (hereinafter also referred to as “first form complex”) is administered into the blood, the complex is contained in the complex.
  • the amount of tPA that collects around the thrombus site is greater than when an amount of tPA is simply administered into the blood. That is, the first form complex of the present invention has a property of collecting around the thrombus-existing site (accumulation ability to thrombus). Due to this property, by using the first form composite of the present invention, tPA can be more efficiently operated only around the thrombus site.
  • N 4, mean ⁇ SD, * P ⁇ 0.05 vs gelatin-tPA (PBS), t test
  • the result of having measured the molecular size of the gelatin of various molecular weight and the mixture of tPA and Zn is shown.
  • N 3, mean ⁇ SD
  • the result of having investigated the tPA activity inhibitory effect of the complex of gelatin of various molecular weight, tPA, and Zn is shown.
  • N 4, mean ⁇ SD, * P ⁇ 0.05 vs tPA / PBS, t test
  • the result of having investigated the activity of the gelatin-tPA-Zn complex in a BSA solution is shown.
  • N 4, mean ⁇ SD, * P ⁇ 0.05 vs tPA / BSA, ttest
  • the result of having investigated the stability in gelatin of a gelatin-tPA-Zn mixture is shown.
  • (N 4, mean ⁇ SD), (* P ⁇ 0.05 vs tPA / PBS, t test), (** P ⁇ 0.05, t test), (N.S. no significant difference)
  • the result of having examined the influence of ultrasonic irradiation on the activity of gelatin-tPA-Zn mixture is shown.
  • N 4, mean ⁇ SD, * P ⁇ 0.05 vs tPA, t test
  • the SDS-PAGE analysis result of the gel filtration fraction of a gelatin-tPA-Zn mixture is shown.
  • FIG. 3 shows the results of measuring tPA activity by administering blood to a model rabbit after administering tPA or gelatin-tPA-Zn complex.
  • PI-9 indicates gelatin having an isoelectric point of 9.
  • part of a model pig are shown.
  • (B) is a coronary angiography photograph 60 minutes after a thrombolysis experiment in an acute myocardial infarction model pig.
  • N 3, mean ⁇ SD
  • the result of having investigated the tPA activity inhibitory effect of E10-tPA-PEGgelatin is shown.
  • N 4, mean ⁇ SD, * P ⁇ 0.05 vs tPA, t test
  • the result of having examined the influence of ultrasonic irradiation on the activity of E10-tPA-PEGgelatin is shown.
  • N 4, mean ⁇ SD, * P ⁇ 0.05 vs tPA, t test
  • the result of the cytotoxicity test of E10-tPA-PEGgelatin is shown.
  • RI-labeled tPA or gelatin-tPA-Zn mixture prepared using RI-labeled tPA was intravenously administered to thrombosis model mice, and the RI activity of the thrombotic artery after 10 minutes was measured (specific) Specifically, it shows the RI activity ratio with the contralateral normal blood vessel).
  • 2 is a graph comparing the binding of tPA, gelatin, and gelatin-tPA-Zn complexes to von Willebrand Factor (vWF). In this graph, the vWF binding property (vertical axis) is shown as a ratio when the binding property of the anti-vWF antibody to vWF is 1.
  • the present invention includes a complex (first form complex) comprising gelatin, a thrombolytic enzyme, and a metal ion.
  • Gelatin is obtained by acid or alkali hydrolysis from the skin, bones, tendons and other parts of various animal species including cattle, or collagen or substances used as collagen.
  • gelatin used in the first form composite of the present invention commercially available gelatin can be used, but basic gelatin prepared by acid treatment of collagen is preferable.
  • type I collagen is preferable.
  • the origin of collagen is preferably pig skin and tendon.
  • the gelatin used for the first form composite preferably has an isoelectric point (IP) of about 8 to 10, particularly preferably about 9.
  • IP isoelectric point
  • the molecular weight is not particularly limited, but is preferably about 2,000 to 200,000, more preferably about 10,000 to 200,000, and further preferably about 10,000 to 100,000.
  • IP isoelectric point
  • the measurement of the isoelectric point (IP) of gelatin was carried out by preparing a gelatin solution, putting a cation and an anion resin therein, removing excess ions, and then measuring the pH value indicated only by the gelatin solution, The pH value is the isoelectric point. More specifically, the measurement is made by the PAGI method (“Method for Deriving Gelatin for Photography; Tenth Edition (2006 Version), Method for Photographic Gelatin Testing Method Joint Edition” edited by “8. Isoionic Points”). .
  • the molecular weight of gelatin is a value measured by gel permeation chromatography, and more specifically, PAGI method (“photographic gelatin test method; 10th edition (2006 version), photographic gelatin test method joint deliberation) This is a value measured by the method described in “20-2. Average molecular weight” in “Edition”. The same applies to the isoelectric point and molecular weight (average molecular weight) of the PEGylated gelatin and cationized gelatin described in this specification.
  • Such basic gelatin can be purchased from Nitta Gelatin, for example.
  • a known thrombolytic enzyme can be used.
  • An example is plasminogen activator.
  • Specific examples include urokinase and tissue type plasminogen activator (tPA).
  • tPA tissue type plasminogen activator
  • Particularly preferred is tPA.
  • Examples of tPA include alteplase, monteplase, and pamiteplase.
  • thrombolytic enzymes are commercially available and can be purchased and used as appropriate.
  • those sold as thrombolytic drugs can be used preferably.
  • urokinase can be purchased from Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd. and the like.
  • TPA can be purchased from Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd., Mitsubishi Tanabe Pharma Co., Ltd., Eisai Co., Ltd., Astellas Pharma Co., Ltd.
  • Such a thrombolytic enzyme is described in detail, for example, in “Today's therapeutic agent 2008 (Nan-Edo)”.
  • a divalent metal ion can be preferably used.
  • zinc ion, magnesium ion, calcium ion, etc. are mentioned. Of these, zinc ions are preferred.
  • the first form complex of the present invention may contain components other than gelatin, thrombolytic enzyme, and metal ions as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the first form complex of the present invention is preferably a complex substantially consisting of gelatin, thrombolytic enzyme, and metal ion.
  • the first form composite of the present invention can be produced, for example, by dissolving gelatin, a thrombolytic enzyme, and a metal salt in a solvent and mixing them.
  • the solvent is preferably an aqueous solution or water. Further, a buffered aqueous solution is more preferable.
  • the pH is preferably about 6-8.
  • the first form complex can be preferably prepared by dissolving gelatin, a thrombolytic enzyme, and a metal salt in physiological saline, particularly PBS (phosphate buffered physiological saline), and mixing them.
  • gelatin and thrombolytic enzyme specifically, the gelatin and thrombolytic enzyme described above can be used.
  • Metal salts are used to mix metal ions with gelatin and thrombolytic enzymes.
  • the metal salt is preferably a divalent metal salt that dissolves in water to generate a divalent metal ion.
  • zinc salts, magnesium salts, and calcium salts are preferable.
  • the metal salt may be an inorganic acid salt or an organic acid salt.
  • examples of inorganic acid salts include chloride salts, sulfate salts, nitrate salts, and the like.
  • examples of the organic acid salt include acetate, oxalate, maleate, and fumarate.
  • a zinc salt is particularly preferable, and specifically, zinc chloride, zinc sulfate, zinc acetate, zinc oxalate and the like can be preferably used.
  • the mixing ratio of gelatin and thrombolytic enzyme is not particularly limited.
  • an excessive amount of gelatin may be added to the thrombolytic enzyme in molar conversion. More specifically, for example, about 0.1 to 50 mol, preferably about 1 to 20 mol, more preferably about 10 to 20 mol of gelatin may be mixed with 1 mol of thrombolytic enzyme.
  • the mixing ratio of the metal ion and the thrombolytic enzyme is not particularly limited.
  • An excess of metal ions may be added to the thrombolytic enzyme in terms of mole. More specifically, for example, about 10 to 1000 moles, preferably about 100 to 1000 moles of metal ions may be mixed with 1 mole of thrombolytic enzyme.
  • the metal salt may be added into the gelatin and thrombolytic enzyme mixed solution, or the metal salt solution obtained by dissolving the metal salt into the gelatin and thrombolytic enzyme mixed solution. May be added.
  • the method for producing the first form composite of the present invention includes (i) a step of mixing gelatin and a thrombolytic enzyme in a liquid, and (ii) a step of adding and mixing a metal salt or a metal salt solution. (That is, a step of mixing a metal salt or a metal salt solution with the mixed solution obtained in (i)) is preferable.
  • the mixing ratio (molar ratio) of thrombolytic enzyme, gelatin, and metal ions is preferably the value described above.
  • gelatin and thrombolytic enzyme complex When gelatin and thrombolytic enzyme are mixed in a solution, they interact with each other to form a gelatin-thrombolytic enzyme complex (gelatin-thrombolytic enzyme complex). Further, by adding and mixing metal ions, the metal ions are interacted and adsorbed to the gelatin-thrombolytic enzyme complex by electric charges, and gelatin-, thrombolytic enzyme, and metal ions are contained. A thrombolytic enzyme-metal ion complex is obtained.
  • the complex is the first form complex of the present invention.
  • gelatin-tPA-zinc ion complex can be produced by mixing gelatin and tPA in PBS and then adding zinc acetate / PBS solution and mixing.
  • tPA has an isoelectric point of 6 to 7
  • tPA is negatively charged in an aqueous solution in a neutral region. Therefore, if the isoelectric point of the gelatin used is 7 or more, in the aqueous solution, an electrostatic interaction acts between the negative charge of tPA and the positive charge of gelatin to form a complex with each other.
  • gelatin having a negative charge and isoelectric point 5 or a succinylated negative charge gelatin derivative is adsorbed on the surface of the composite having a positive charge by electrostatic interaction. .
  • the gelatin-thrombolytic enzyme-metal ion complex thus obtained exists in a dissolved state in the solution.
  • the first form complex can be separated from the solution by a known separation means and further purified. Examples of separation and purification means include column chromatography and gel chromatography.
  • the particle size of the first form composite is usually 50 to 250 nm, preferably about 80 to 200 nm.
  • the particle diameter is a value measured at 37 ° C. by dynamic light scattering (DLS) using DLS-7000 (Otsuka Electronics).
  • the activity of the thrombolytic enzyme is suppressed by metal ions. Then, by irradiating the complex with ultrasonic waves, the activity of the thrombolytic enzyme recovers when the binding of the complex breaks and the thrombolytic enzyme is released. Moreover, when the first form complex is administered into the blood, the amount of tPA that collects around the thrombus is greater than when the same amount of tPA as contained in the complex is simply administered into the blood. . That is, the first form complex of the present invention has a surprising property (capability of accumulating in a thrombus) that actively gathers around the site of the thrombus.
  • the first form complex can be preferably used as a drug delivery system (DDS) for treating diseases caused by thrombus. That is, when the complex is administered into a blood vessel (transvascular administration), the complex is collected around the thrombus-existing site through the blood vessel. After that, by irradiating only the affected part where the thrombus exists, a larger thrombolytic activity can be efficiently obtained only in the affected part. That is, the first form complex of the present invention can be a very excellent DDS that has the ability to accumulate in a thrombus and that can express tPA activity only at a site irradiated with ultrasonic waves.
  • DDS drug delivery system
  • the first form composite of the present invention it is possible to reduce side effects at a site where no thrombus is present and to efficiently obtain a larger thrombolytic activity only at the site where the thrombus is present.
  • the therapeutic effect of thrombolysis can be obtained.
  • the frequency is about 0.5 ⁇ 2.0 MHz, preferably about 1.0 MHz
  • the intensity is 0.5 ⁇ 2.0W / cm 2
  • the irradiation time is not particularly limited, but for example, irradiation may be performed for about 10 to 120 minutes, preferably about 30 minutes.
  • a device for performing such ultrasonic irradiation for example, a known device capable of ultrasonic irradiation satisfying the above conditions can be used.
  • an Ito ultrasonic therapy device KUS-2S type, Ito Ultrashort Corporation
  • a plurality of (for example, 2 to 4) ultrasonic irradiation apparatuses may be arranged and used simultaneously.
  • the affected part where the thrombus exists can be identified by, for example, a known angiography.
  • Thrombotic diseases include thrombotic vascular occlusion diseases, and are not particularly limited.
  • acute myocardial infarction, cerebral infarction, pulmonary thromboembolism, acute lower limb arterial occlusion, artificial hemodialysis arterial vein A shunt blockage etc. can be illustrated.
  • the first form complex can be preferably used for the treatment of such diseases (thrombolytic treatment). More specifically, for example, to dissolve coronary thrombus in acute myocardial infarction, to dissolve pulmonary artery thrombus in acute pulmonary embolism, or to improve dysfunction associated with acute phase of ischemic cerebrovascular disorder Can do.
  • the administration target of the first form complex includes not only humans suffering from the above-mentioned diseases but also other mammals suffering from the above-mentioned diseases. Examples include pets and livestock (dogs, cats, monkeys, horses, cows, sheep, pigs, etc.).
  • transvascular administration is preferable. Specific examples include intravenous administration. Transvascular administration can be performed using, for example, a syringe or infusion.
  • the dose and the administration rate can be appropriately set in consideration of the thrombolytic enzyme unit (IU) contained in the first form complex.
  • the appropriate dosage and rate of thrombolytic enzyme for humans can be appropriately set based on the information described in the package insert when using commercially available products. For example, it is described in detail in “Today's therapeutic agent 2008 (Nan-Edo)”.
  • tPA Monteplase: trade name [Clearcter (registered trademark)]
  • molecular weight of about 68000, Eisai Co., Ltd. it is usually possible to administer about 10,000 to 30000 IU / kg per adult day.
  • the administration rate is preferably about 60 to 1,000,000 IU / min, more preferably about 800,000 IU / min.
  • the dose and the administration rate are preferably set based on the total amount of all the enzymes in addition to the thrombolytic enzyme contained in the first form complex, when the enzyme is administered separately.
  • the dosage and administration rate are set based on the amount of thrombolytic enzyme contained in the entire liquid composition.
  • the gelatin-thrombolytic enzyme-metal ion complex (first form complex) exists in a dissolved state in the solution. Therefore, the solution can be used as a liquid composition as it is.
  • the liquid composition can be used as a pharmaceutical composition.
  • the liquid composition can be used as, for example, an injection (solution, suspension, etc.) or an infusion.
  • the liquid composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier as long as the effects of the present application are not impaired.
  • a carrier is not particularly limited as long as it is usually used in pharmaceutical preparations and does not impair the effects of the present application.
  • diluents such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, excipients and the like can be mentioned.
  • excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, xylitol, mannitol, erythritol, sorbitol, calcium carbonate, crystalline cellulose, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution
  • Binders such as starch solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, dry starch, sodium alginate, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, monoglycerides of stearic acid, etc. it can.
  • a colorant, a preservative, and other pharmaceuticals can be contained in the liquid composition.
  • the liquid composition can be appropriately produced by a known method.
  • it can be produced by dissolving the first form complex and, if necessary, other carriers in a liquid suitable for biological administration (particularly transvascular administration) such as physiological saline.
  • the first form complex concentration in this case can also be set as appropriate.
  • the present invention also includes a thrombus treatment system comprising a first form complex and a device provided with means for irradiating the complex with ultrasonic waves.
  • the present invention also relates to a thrombus treatment system comprising a liquid composition containing the above-mentioned first form composite and a device comprising means for irradiating ultrasonic waves to the first form composite contained in the liquid composition. Is also included.
  • an ultrasonic irradiation apparatus the above-mentioned thing is mentioned, for example.
  • the present system can reduce side effects at a site where no thrombus is present and can obtain a greater thrombolytic activity only at the site where the thrombus is present. A therapeutic effect can be obtained. .
  • the present invention relates to a method for treating thrombolysis comprising the steps of (I) transvascular administration of a first form complex or a liquid composition comprising the same, and (II) irradiating ultrasonic waves to a thrombus existing site. Is also included.
  • the above-mentioned conditions can be applied to the conditions used for the method, such as the dose, the administration subject, and the ultrasonic irradiation conditions.
  • the present invention also includes a complex comprising cationized gelatin, thrombolytic enzyme, and PEGylated gelatin.
  • the said composite body may be called a 2nd form composite body.
  • Gelatin is obtained by acid or alkali hydrolysis from the skin, bones, tendons and other parts of various animal species including cattle, or collagen or substances used as collagen.
  • Cationic gelatin and PEGylated gelatin are chemically modified gelatins obtained by chemically modifying gelatin, respectively.
  • any chemically modified gelatin commercially available gelatin can be used.
  • Cationized gelatin is a positively charged gelatin.
  • the cationized gelatin can be produced, for example, by replacing a carboxyl group (—COOH group) of gelatin with a group having an amino group by chemical modification.
  • the group having an amino group is preferably a group having an amino group at the terminal.
  • gelatin and a known alkyldiamine, alkyltriamine, or alkyltetramine are subjected to a dehydration condensation reaction to form an amide bond between the carboxyl group of gelatin and the amino group of the amine, and the carboxyl group is converted to an amino group. Substitution with a group having a group can produce a cationized gelatin.
  • alkyldiamine is preferably used.
  • Particularly preferred alkyldiamines include the following general formula (1): NH 2 — (CH 2 ) a —NH 2 (1) [Wherein, a represents an integer of 1 to 10]
  • the alkyldiamine represented by these is mentioned.
  • a represents an integer of 1 to 10, preferably an integer of 1 to 8.
  • alkyl diamine examples include ethylene diamine, 1,3-propane diamine, 1,4-butane diamine, 1,5-pentane diamine, 1,6-hexane diamine, and the like.
  • the group having an amino group is preferably a group obtained by dehydration condensation of a carboxyl group and an alkyldiamine.
  • Such a dehydration condensation reaction can be easily performed by a known method.
  • gelatin and alkyldiamine can be dissolved in a buffer solution and reacted in the presence of a dehydrating condensing agent.
  • An example of the reaction temperature is about 25 to 45 ° C., and an example of the reaction time is about 1 to 24 hours.
  • a buffer solution a phosphate buffer solution (about pH 5) can be illustrated, for example.
  • various carbodiimides can be used as the dehydrating condensing agent. Specifically, for example, 1-methyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) can be exemplified.
  • Gelatin has a plurality of carboxyl groups, but the cationized gelatin used in the present invention is one in which a part of the carboxyl group of gelatin is substituted with a group having the amino group as long as it has a positive charge. However, all may be replaced.
  • the degree of substitution of the carboxyl group those in which 20% or more of the carboxyl groups of gelatin are substituted are preferred, those in which 30% or more are substituted are more preferred, and those in which 40% or more are substituted are more preferred.
  • the origin of collagen is preferably derived from bovine bone.
  • the isoelectric point (IP) is preferably about 8 to 10, particularly preferably about 9.
  • the molecular weight is not particularly limited, but is preferably about 2,000 to 200,000, more preferably about 10,000 to 200,000, and further preferably about 10,000 to 100,000.
  • PEGylated gelatin can be produced, for example, by reacting a functional group of gelatin (particularly an amino group, hydroxyl group, thiol group, or carboxyl group) with a PEGylating modifier. That is, PEGylated gelatin can be obtained by, for example, modifying a functional group (particularly an amino group, hydroxyl group, thiol group, or carboxyl group) of gelatin with PEG.
  • PEGylation modifiers are commercially available and can be purchased and used.
  • Preferable PEGylation modifiers include SUNBRIGHT (registered trademark) series (NOF CORPORATION) PEG derivatives.
  • the PEGylated gelatin has a functional group (especially an amino group, a hydroxyl group, a thiol group, or a carboxyl group) possessed by gelatin having the following general formula (2): -(OCH 2 CH 2 ) n- (2) [Wherein n represents an integer of 1 to 2000] And a group having a group represented by formula (hereinafter also referred to as “PEG unit-containing group”).
  • n represents an integer of 1 to 2000, preferably an integer of 2 to 1500, and more preferably an integer of 100 to 1500.
  • PEGylated gelatin has a structure in which a functional group of gelatin is substituted with a PEG unit-containing group.
  • Preferred PEG unit-containing groups include, for example, the following general formula (II): R— (OCH 2 CH 2 ) n —Z— (CH 2 ) m —Y— (II) [Where, R is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, Z is —O— or —OC (O) —, Y is —CO—NH—, —NH—CO—, or —SS—, m represents an integer of 0 to 3. n is the same as above. ] The group represented by these is mentioned.
  • R is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms (preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4 carbon atoms), and specifically includes, for example, a methyl group, an ethyl group, Examples thereof include a propyl group, a butyl group, and an isopropyl group. In particular, a methyl group and an ethyl group are preferable.
  • Z is —O— or —OC (O) —, preferably —OC (O) —.
  • Y is —CO—NH—, —NH—CO—, or —SS—. Y is determined according to the functional group of gelatin and the type of PEGylation modifier used.
  • Y when the amino group of gelatin is chemically modified using a PEGylation modifier having an NHS (N-hydroxysuccinimide) group, Y is —CO—NH—.
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • Y when the carboxyl group of gelatin is chemically modified using a PEGylation modifier having an amino group, Y is —NH—CO—.
  • thiol group of gelatin when the thiol group of gelatin is chemically modified using a PEGylation modifier having a thiol group, Y is —SS—.
  • PEGylation modifiers include the following general formula (3): R— (OCH 2 CH 2 ) n —Z— (CH 2 ) m —X (3) [Wherein X is an amino group, a thiol group, or a group
  • NHS-activated PEG derivatives of SUNBRIGHT (registered trademark) CS, GS, AS, and HS types can be used.
  • SUNBRIGHT (registered trademark) PA and EA type PEG derivatives can be used as the PEG derivative in which X in the general formula (3) is an amino group.
  • a PEG derivative in which X in the general formula (3) is a thiol group a SUNBRIGHT (registered trademark) SH type PEG derivative can be used as a PEG derivative in which X in the general formula (3) is a thiol group.
  • a known method can be preferably used as a method of reacting the amino group of gelatin with the NHS activated PEG derivative.
  • a method of dissolving gelatin and an NHS activated PEG derivative in a suitable solvent (for example, DMSO) and mixing them, and allowing to stand at room temperature (for example, 20 to 30 ° C.) for about 1 to 12 hours can be exemplified.
  • a suitable solvent for example, DMSO
  • room temperature for example, 20 to 30 ° C.
  • Known methods can also be used for a method of reacting a carboxyl group of gelatin and a PEG derivative having an amino group, and a method of reacting a thiol group of gelatin and a PEG derivative having a thiol group.
  • the type of functional group modified with PEG may be one type or two or more types. One type is preferred.
  • gelatin used for producing PEGylated gelatin acidic gelatin prepared by alkali treatment of collagen is preferable.
  • type I collagen is preferable.
  • the origin of collagen is preferably derived from bovine bone.
  • the isoelectric point (IP) is preferably about 4 to 6, and particularly preferably about 5.
  • the molecular weight is not particularly limited, but is preferably about 1000 to 100,000, more preferably about 1000 to 10,000, and further preferably about 1000 to 5000.
  • Such acidic gelatin can be purchased from Nitta Gelatin, for example.
  • a known thrombolytic enzyme can be used.
  • An example is plasminogen activator.
  • Specific examples include urokinase and tissue type plasminogen activator (tPA).
  • tPA tissue type plasminogen activator
  • Particularly preferred is tPA.
  • Examples of tPA include alteplase, monteplase, and pamiteplase.
  • thrombolytic enzymes are commercially available and can be purchased and used as appropriate.
  • those sold as thrombolytic drugs can be used preferably.
  • urokinase can be purchased from Mochida Pharmaceutical Co., Ltd., Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd. and the like.
  • TPA can be purchased from Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd., Mitsubishi Tanabe Pharma Co., Ltd., Eisai Co., Ltd., Astellas Pharma Co., Ltd.
  • Such a thrombolytic enzyme is described in detail, for example, in “Today's therapeutic agent 2008 (Nan-Edo)”.
  • the complex of the present invention may contain components other than cationized gelatin, thrombolytic enzyme, and PEGylated gelatin as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the second form composite of the present invention can be produced by dissolving and mixing cationized gelatin, thrombolytic enzyme, and PEGylated gelatin in a solvent.
  • a solvent water is preferable.
  • it is more preferable that it is a buffer solution.
  • the pH is preferably maintained at about 6-8.
  • the second form complex can be preferably prepared by dissolving and mixing cationized gelatin, thrombolytic enzyme, and PEGylated gelatin in physiological saline, particularly PBS (phosphate buffered physiological saline).
  • the mixing ratio of cationized gelatin and thrombolytic enzyme is not particularly limited.
  • an excess of the cationized gelatin may be added to the thrombolytic enzyme in molar conversion.
  • 0.1 to 50 mol, preferably about 1 to 20 mol of cationized gelatin may be mixed with 1 mol of thrombolytic enzyme.
  • the mixing ratio of PEGylated gelatin and thrombolytic enzyme is not particularly limited.
  • PEGylated gelatin may be added in excess of the thrombolytic enzyme in terms of mole. More specifically, for example, 0.1 to 50 mol, preferably about 1 to 20 mol of PEGylated gelatin may be mixed with 1 mol of thrombolytic enzyme.
  • the order of mixing the cationized gelatin, the thrombolytic enzyme, and the PEGylated gelatin it is preferable to first mix the cationized gelatin and the thrombolytic enzyme and then add and mix the PEGylated gelatin.
  • the method for producing the second form composite of the present invention includes (i) a step of mixing cationized gelatin and a thrombolytic enzyme in a liquid, and (ii) a step of further adding PEGylated gelatin and mixing ( That is, a production method including a step of mixing PEGylated gelatin with the mixed solution obtained in (i)) is preferable.
  • the cationized gelatin and the thrombolytic enzyme complex are formed by the interaction of the respective charges. Further, by adding PEGylated gelatin and mixing, PEGylated gelatin interacts with and adsorbs on the cationized gelatin-thrombolytic enzyme complex by charge, and cationized gelatin, thrombolytic enzyme, and PEGylated gelatin are mixed. A cationized gelatin-thrombolytic enzyme-PEGylated gelatin complex is obtained.
  • the complex is the second form complex of the present invention.
  • a second form complex having a form in which PEGylated gelatin is coated with a cationized gelatin-thrombolytic enzyme complex is preferable.
  • complex can be manufactured by mixing in said order.
  • PEG is present on the complex surface, and a stealth effect can be expected.
  • the stealth effect is an effect that prevents the drug from being captured by an organ such as the liver when the drug is administered into the body. This effect can be obtained by binding PEG to the drug.
  • a cationized gelatin-tPA-PEGylated gelatin complex can be produced by mixing cationized gelatin and tPA in PBS and then adding PEGylated gelatin and mixing.
  • tPA has an isoelectric point of 6 to 7
  • tPA is negatively charged in an aqueous solution in a neutral region. Therefore, if the isoelectric point of the gelatin used is 7 or more, in the aqueous solution, an electrostatic interaction acts between the negative charge of tPA and the positive charge of gelatin to form a complex with each other.
  • the above complex can also be produced when cationized gelatin having a higher positive charge by chemically modifying the carboxyl group of gelatin is used. Since the prepared composite has a positive charge, gelatin having a negative charge of isoelectric point 5 or a negatively charged gelatin derivative having a functional group chemically modified (that is, PEGylated gelatin) is positively charged by electrostatic interaction. Is adsorbed on the surface of the composite. Thus, PEGylated gelatin can coat the cationized gelatin-thrombolytic enzyme complex.
  • the cationized gelatin-thrombolytic enzyme-PEGylated gelatin complex thus obtained exists in a dissolved state in the solution.
  • the second form complex can be separated from the solution by a known separation means and further purified. Examples of separation and purification means include column chromatography and gel chromatography.
  • the particle size of the second form composite is usually about 100 to 400 nm, preferably about 150 to 300 nm.
  • the particle diameter is a value measured at 37 ° C. by dynamic light scattering (DLS) using DLS-7000 (Otsuka Electronics).
  • the second form complex In the second form complex, the activity of the thrombolytic enzyme is suppressed by cationized gelatin. Then, by irradiating the complex with ultrasonic waves, the activity of the thrombolytic enzyme recovers when the binding of the complex breaks and the thrombolytic enzyme is released. Therefore, the second form complex can also be preferably used as a drug delivery system (DDS) for treating diseases caused by thrombus. That is, by administering the complex into a blood vessel (transvascular administration) and then irradiating only the affected area where the thrombus exists, greater thrombolytic activity can be obtained only in the affected area. it can. As a result, side effects at the site where no thrombus is present can be reduced, and greater thrombolytic activity can be obtained only at the site where the thrombus is present, so that a superior thrombolytic therapeutic effect can be obtained.
  • DDS drug delivery system
  • the frequency is about 0.5 ⁇ 2.0 MHz, preferably about 1.0 MHz
  • the intensity is 0.5 ⁇ 2.0W / cm 2
  • the irradiation time is not particularly limited, but for example, irradiation may be performed for about 10 to 120 minutes, preferably about 30 minutes.
  • a device for performing such ultrasonic irradiation for example, a known device capable of ultrasonic irradiation satisfying the above conditions can be used.
  • an Ito ultrasonic therapy device KUS-2S type, Ito Ultrashort Corporation
  • a plurality of (for example, 2 to 4) ultrasonic irradiation apparatuses may be arranged and used simultaneously.
  • the affected part where the thrombus exists can be identified by, for example, a known angiography.
  • Thrombotic diseases include thrombotic vascular occlusion diseases, and are not particularly limited.
  • acute myocardial infarction, cerebral infarction, pulmonary thromboembolism, acute lower limb arterial occlusion, artificial hemodialysis arterial vein A shunt blockage etc. can be illustrated.
  • the second form complex can also be preferably used for the treatment of such diseases (thrombolytic treatment). More specifically, for example, for the dissolution of coronary thrombus in acute myocardial infarction, for the dissolution of pulmonary artery thrombus in acute pulmonary embolism, or for the improvement of dysfunction associated with the acute phase of ischemic cerebrovascular disorder Can do.
  • the administration target of the second form complex includes not only humans suffering from the above-mentioned diseases but also other mammals suffering from the above-mentioned diseases. Examples include pets and livestock (dogs, cats, monkeys, horses, cows, sheep, pigs, etc.).
  • transvascular administration is preferable. Specific examples include intravenous administration. Transvascular administration can be performed using, for example, a syringe or infusion.
  • the dose and the administration rate can be appropriately set in consideration of the thrombolytic enzyme unit (IU) contained in the second form complex.
  • IU thrombolytic enzyme unit
  • the appropriate dosage and rate of thrombolytic enzyme for humans can be appropriately set based on the information described in the package insert when using commercially available products. For example, it is described in detail in “Today's therapeutic agent 2008 (Nan-Edo)”.
  • tPA Monteplase: trade name [Clearcter (registered trademark)], molecular weight of about 68000, Eisai Co., Ltd.
  • the administration rate is preferably about 60 to 1,000,000 IU / min, more preferably about 800,000 IU / min.
  • the dose and the administration rate are preferably set based on the total amount of all the enzymes in addition to the thrombolytic enzyme contained in the second form complex when the enzyme is separately administered.
  • the dosage and administration rate are set based on the amount of thrombolytic enzyme contained in the entire liquid composition.
  • the liquid composition can be used as a pharmaceutical composition.
  • the liquid composition can be used as, for example, an injection (solution, suspension, etc.) or an infusion.
  • the liquid composition may contain a pharmaceutically acceptable carrier as long as the effects of the present application are not impaired.
  • a carrier is not particularly limited as long as it is usually used in pharmaceutical preparations and does not impair the effects of the present application.
  • diluents such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, excipients and the like can be mentioned.
  • excipients such as lactose, sucrose, sodium chloride, glucose, urea, starch, xylitol, mannitol, erythritol, sorbitol, calcium carbonate, crystalline cellulose, water, ethanol, propanol, simple syrup, glucose solution
  • Binders such as starch solution, carboxymethylcellulose, shellac, methylcellulose, dry starch, sodium alginate, sodium bicarbonate, calcium carbonate, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sodium lauryl sulfate, monoglycerides of stearic acid, etc. it can.
  • a colorant, a preservative, and other pharmaceuticals can be contained in the liquid composition.
  • the liquid composition can be appropriately produced by a known method.
  • it can be produced by dissolving the second form complex and, if necessary, other carriers in a liquid suitable for biological administration (particularly transvascular administration) such as physiological saline.
  • the second form complex concentration in this case can also be set as appropriate.
  • the present invention also includes a thrombus treatment system comprising a second form complex and a device provided with means for irradiating the complex with ultrasonic waves.
  • the present invention also relates to a thrombus treatment system comprising a liquid composition containing the above-mentioned second form composite and a device comprising means for irradiating ultrasonic waves to the second form composite contained in the liquid composition. Is also included.
  • an ultrasonic irradiation apparatus the above-mentioned thing is mentioned, for example.
  • the present system can reduce side effects at a site where no thrombus is present and can obtain a greater thrombolytic activity only at the site where the thrombus is present. A therapeutic effect can be obtained.
  • the present invention relates to a method for treating thrombolysis comprising the step of (i) transvascular administration of the second form complex or a liquid composition comprising the same, and (ii) the step of irradiating the thrombus-existing site with ultrasound. Is also included.
  • the above-mentioned conditions can be applied to the conditions used for the method, such as the dose, the administration subject, and the ultrasonic irradiation conditions.
  • the present invention will be described in detail, but the present invention is not limited to the following examples.
  • a general experimental textbook for example, MolecularoleCloning: A Laboratory Manual Vol 3 (Cold Spring Harbor Laboratory)
  • the molecular weight may be described as MW.
  • the isoelectric point may be described as PI.
  • the tPA used in the following examples is Monteplase (trade name [Clearector (registered trademark)], molecular weight of about 68000, Eisai Co., Ltd.).
  • the Ito ultrasonic therapy device was used for ultrasonic irradiation.
  • ultrasonic treatment may be referred to as US (abbreviation of UltraSonication).
  • a complex prepared from gelatin, tPA, and zinc may be referred to as a “gelatin-tPA-Zn complex”.
  • a complex prepared from cationized gelatin, tPA, and PEGylated gelatin may be referred to as “cationized gelatin-thrombolytic enzyme-PEGylated gelatin complex”.
  • tPA showed 48% activity of tPA alone in the presence of 500 mM Zn.
  • pH of each Zn aqueous solution was 8 to 9, and there was no influence of pH, so that the activity of tPA was lowered by the action of Zn.
  • the tPA activity inhibitory effect of the mixed solution thus prepared was evaluated by the fibrin plate method.
  • the fibrin plate method was performed as follows. After adding 10 ml of 0.4% ⁇ ⁇ human fibrinogen (Sigma-Aldrich) /0.17 M borate buffer (pH 7.8) to Petri dish, add 0.2 ml of 50 U / ml / plasminogen (EMD Biosciences) and stirring Further, 0.2 ⁇ ml of 100 ⁇ U / ml thrombin (EMD Biosciences) was added, stirred well and allowed to stand at room temperature for 30 minutes to form a fibrin plate.
  • tPA alone refers to a sample in which 1 mg of tPA is dissolved in 2 ml of PBS.
  • Cytotoxicity test of various metal ions A cytotoxicity test (WST-8 assay) was conducted on zinc acetate, calcium acetate and magnesium acetate. Specifically, it was performed as follows. L929 cells were seeded at 5000 cells / well in a 96-well plate and pre-cultured with 10% FCS Eagle's MEM (E-MEM) for 24 hours. After changing the medium, each metal solution / PBS (pH 7.4) (final concentration 0-20) mM) was added.
  • E-MEM FCS Eagle's MEM
  • the metal solution / PBS was prepared by dissolving zinc acetate, magnesium acetate or calcium acetate in PBS.
  • any metal ion such as zinc ion, magnesium ion or calcium ion has almost no cytotoxicity up to a concentration of at least about 0.5 mM.
  • gelatin-Zn complex was measured using a sample prepared by mixing gelatin (20 mg) and tPA (1 mg) in 1.5 ml of PBS and reacting with shaking at 37 ° C for 30 minutes. It was. Furthermore, the sample prepared as follows was used for the measurement of gelatin-tPA-Zn complex. That is, gelatin (20 mg) and tPA (1 mg) were mixed in 1.5 ml of PBS, reacted while shaking at 37 ° C. for 30 minutes, and acetic acid was added to the reaction solution to a final concentration of 5 mM. A sample was prepared by adding 0.5 ml of zinc and reacting at 37 ° C with shaking for 30 minutes.
  • the stability of the gelatin-tPA-Zn complex was evaluated by measuring the tPA activity by the fibrin plate method as described above.
  • As a control a sample in which only tPA was dissolved in a 40 mg / ml BSA solution was used.
  • the measurement sample was divided into two, and one was irradiated with ultrasonic waves at 1 MHz for 5 minutes.
  • the stability of the gelatin-tPA-Zn complex was evaluated by measuring the tPA activity by the fibrin plate method as described above.
  • a sample in which only tPA was dissolved in PBS or a 20% mouse serum solution (mouse serum diluted 5-fold with PBS) was used.
  • the tPA activity which was about 78% in 20% serum was recovered by ultrasonic irradiation. That is, the complex was found to have a tPA protective action in the presence of serum. Furthermore, the degree of tPA activity recovered by ultrasonic irradiation was larger as the gelatin-tPA-Zn complex using gelatin having a large molecular weight. In particular, in the gelatin-tPA-Zn complex using gelatin having a molecular weight of 100,000, the tPA activity was recovered to almost 100% by ultrasonic irradiation.
  • the reaction was stopped by adding a 10% citric acid solution, and the absorbance at 405 nm was measured.
  • TPA concentration was calculated using tPA as a standard.
  • the Zn concentration contained in each fraction was measured with an atomic absorption spectrophotometer (Simazu). Each fraction was diluted with 5 mg / ml BSA solution, and the absorbance of Zn was measured by furnace measurement. Zn concentration was calculated using zinc acetate as a standard.
  • FIG. 10 shows the result of SDS-PAGE analysis. Moreover, the measurement result of the protein amount of each fraction, tPA density
  • concentration here is the density
  • contact was performed for 48 hours, and after replacement of the medium, 2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2, 4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium (WST-8, Nacalai Tesque) ) Reagents were added, and after 2 hours, the absorbance of the supernatant at 450 nm was measured with a VERSAmax microplate reader (Molecular Devices). The data was calculated assuming that the cell viability when adding PBS instead of the sample (Control) was 100%.
  • mice were 125 I labeled tPA by stability in blood and evaluation of pharmacokinetics ⁇ method> Chloramine T method was used to separated the 125 I- labeled tPA using a PD-10 column.
  • 125 I-labeled tPA (1 mg) were mixed in 1.5 ml of PBS and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • 0.5 ml of zinc acetate was added to the reaction solution so that the final concentration was 5 mM, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 30 minutes. This mixed solution was diluted 10,000 times with PBS to obtain a sample for administration.
  • ddY mice female, 6 weeks old
  • 100 ⁇ l of sample was administered from the tail vein.
  • Orbital blood was collected after 1, 15, 30, and 60 minutes, and radioactivity was measured with a gamma counter (ARC-301B, Aloka).
  • the amount of tPA in the blood was converted from the body weight of the mouse, and the amount of remaining tPA in the blood was calculated with the amount of tPA administered as 100%.
  • the radioactivity of tPA to be administered was taken as 100%, and the ratio in blood relative to it was calculated.
  • 60 minutes after administration whole blood was collected and organs were removed, and the radioactivity was measured in the same manner to evaluate the pharmacokinetics.
  • a femoral artery thrombus occlusion model rabbit (hereinafter simply referred to as a model rabbit) was prepared by the following procedure. Rabbits were male and Japanese white rabbits weighing 2.5-3.0 kg, purchased from SLC and used. 1) Anesthesia was performed by intravenous administration of 25 mg / kg of pentobarbital sodium (Kyoritsu Seiyaku: trade name somnopentyl) from rabbit ear vein for 10 minutes.
  • Thrombolysis experiment using model rabbit> Using the model rabbit prepared as described above, the thrombolytic effect of gelatin-tPA-Zn complex was examined by the following procedure. 1) Angiography was performed 1 hour after the right femoral artery thrombotic occlusion, and the right femoral artery occlusion was reconfirmed. 2) Intravenous administration of tPA at 27,500 units / kg (tPA alone group) or gelatin-tPA-Zn complex was carried out via the ear vein at tPA 27,500 units / kg (DDS alone group and DDS + US group). Specifically, the tPA alone group was administered with tPA dissolved in PBS.
  • the gelatin-tPA-Zn complex solution prepared as described above was administered to the DDS group.
  • percutaneous ultrasonic irradiation (1 MHz, 0.8 W / cm 2 ) was started on the proximal part of the right femoral artery occlusion immediately after the gelatin-tPA-Zn complex solution was injected.
  • Angiography was performed every 15 minutes to confirm the thrombolytic state.
  • An angiogram 60 minutes after administration of tPA or DDS is shown in FIG.
  • FIG. 6 the schematic diagram about the positional relationship of a thrombus obstruction
  • the tPA activity in the collected blood was measured by the chromozyme method (described below).
  • a Chromozym t-PA kit (Roche Applied Science: Cat. No. 11 093 037 001) was used. The results are shown in FIG.
  • the gelatin-tPA-Zn complex when the gelatin-tPA-Zn complex is administered, the thrombolytic effect cannot be obtained unless ultrasonic irradiation is performed, and the thrombolytic effect is not obtained until ultrasonic irradiation is performed. It was. That is, it was confirmed that the gelatin-tPA-Zn complex can express the tPA activity and dissolve the thrombus only at the site irradiated with ultrasonic waves.
  • tPA activity of each blood sample was measured as follows. First, plasma was separated from the collected blood sample. Then, tPA activity in each plasma was measured by the chromozyme tPA (synthetic substrate: Roche Applied Science: Cat. No. 11 093 037 001) method. Specifically, the following procedure was used. 1) Each plasma specimen was diluted 20-fold with 100 mM Tris buffer (pH 8.5, containing 0.15% Tween 80). 2) A 10-fold amount of 0.4 mM chromozyme tPA solution (100 ⁇ l to 10 ⁇ l of sample) of a 20-fold diluted sample was mixed and reacted in a thermostat at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Tris buffer pH 8.5, containing 0.15% Tween 80
  • An acute myocardial infarction model pig (hereinafter simply referred to as a model pig) was prepared by the following procedure. 1) A 6Fr introducer sheath was inserted from the right femoral artery. 2) A guiding catheter was inserted through the introducer sheath and placed in the left coronary artery. 3) A transcutaneous 2.5 ⁇ 10 mm cutting balloon was inserted to the middle of the left circumflex, and after dilation at 4 to 6 atmospheres, the left circumflex endothelium was scratched over about 2 cm. 4) After removing the balloon, a peripheral coronary artery protective balloon (Park Surge: Medtronic, Inc.
  • the DDS group was administered with a 2-fold diluted gelatin-tPA-Zn complex solution prepared as described above. 3)
  • transthoracic ultrasound irradiation (1 MHz, 0.8 W / cm 2 ) was started from the front chest immediately after the DDS solution injection.
  • ultrasonic irradiation was performed by combining four ultrasonic probes used in the rabbit model.
  • Angiography was performed every 15 minutes to confirm the thrombolytic state.
  • the thrombus was dissolved in the group (DDS group) in which the gelatin-tPA-Zn complex solution was administered and irradiated with ultrasonic waves. Further, as shown in FIG. 17A, in the gelatin-tPA-Zn complex, the tPA activity was suppressed until the ultrasonic irradiation, and the tPA activity was recovered by the ultrasonic irradiation.
  • the amino group introduction rate of the cationized gelatin was measured by the 2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonate method (TNBS) method. ⁇ -alanine was used for the calibration curve.
  • the molecular size of the cationized gelatin was measured at 37 ° C. using DLS-7000 (Otsuka Electronics) by dynamic light scattering (DLS).
  • the surface potential was measured at room temperature using ELS-7000AS (Otsuka Electronics) by electrophoretic light scattering (ELS).
  • E-MEM 10% FCS Eagle's MEM
  • This sensor chip was set in AFFINIX Q (Initium Co., Ltd.), and the electrode was immersed in PBS to stabilize the frequency for 30 minutes. Gelatin or cationized gelatin was added so that the final concentration was 0 to 4 ⁇ 10 ⁇ 7 M, and the amount of change in vibration frequency was measured. Based on the measured values, dissociation constant (K D ) and change in frequency (B max ) at the maximum binding were obtained using analysis software AQUA (Initium Co., Ltd.).
  • TPA Activity Inhibitory Effect by Cationized Gelatin ⁇ Method>
  • the surface potential of gelatin alone was -1.8 mV, and the surface potential of cationized gelatin alone was 7.1-12.2 ⁇ mV.
  • the surface potential of gelatin was -3.0.
  • the surface potential of mV and cationized gelatin changed from 2.7 to 5.4 mV.
  • the surface potential increased as the amino group introduction rate increased.
  • the surface potential tended to decrease at an amino group introduction rate of 36.6% or more. .
  • PEGylated gelatin Preparation of PEGylated gelatin and examination of PEG introduction rate PEGylated gelatin was prepared by introducing PEG into the amino group of gelatin. A method for producing the PEGylated gelatin will be described. An outline of the manufacturing method is shown in FIG. PEGylated gelatin may be referred to as PEGgelatin or PEG-introduced gelatin.
  • Fluorescamine method ⁇ Principle> Since fluorescamine reacts with an amine to form a fluorescent derivative, it is used to detect proteins and amino groups.
  • ⁇ Method> Mix 125 ⁇ l of 20 ig / ml PEG-introduced gelatin aqueous solution with 625 ⁇ l of phosphate buffer (pH 8), add 0.3 mg / ml fluorescamine / 1,4-dioxic acid 250 ⁇ l and stir well for 2 minutes did. 200 ml each of the reaction solution was placed in a 96-well plate, and fluorescence was measured at an excitation wavelength of 390 nm and a fluorescence wavelength of 475 nm using a microplate reader. ⁇ -alanine was used for the calibration curve.
  • TNBS method ⁇ Principle> 2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) reacts with amines to form orange derivatives, which are used to detect proteins and amino groups.
  • TNBS 2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid
  • ⁇ Method> 20 ⁇ g / ml gelatin (MW10 5 , PI 9, Nitta gelatin), cationized gelatin, or 200 ⁇ l of PEG-introduced gelatin in PBS (pH 7.4), 4 wt% NaHCO 3 200 ⁇ l and 1 mg / ml
  • the mixture was mixed with 200 ⁇ l of a TNBS aqueous solution and allowed to stand at 37 ° C. for 2 hours. 200 ⁇ l each of the reaction solution was placed in a 96-well plate, and the absorbance at 415 nm was measured using a microplate reader. ⁇ -alanine was used for the calibration curve.
  • the PEG introduction rate of each PEG-introduced gelatin was as shown in FIG. 25, and the same results were obtained by both the fluorescamine method and the TNBS method.
  • the PEG introduction rate when the amount of PEG used was small was higher than the theoretical value.
  • the PEG introduction rate was almost the same regardless of the amount used.
  • the reaction between PEG-introduced gelatin and TNBS was carried out in the presence of Triton (5%, 10%), a neutral surfactant, and the same results were obtained.
  • the type of PEG-introduced gelatin is indicated by the expression “gelatin molecular weight ⁇ PEG introduced amount (mol)”.
  • 3100-0.87 indicates PEG-introduced gelatin introduced at a ratio of 0.87 mol of PEG to 1 mol of gelatin having a molecular weight of 3100.
  • each notation may indicate each PEGylated gelatin.
  • E10-tPA-PEG-introduced gelatin mixture molecular size and surface potential ⁇ Method> E10 (20 mg) and tPA (1 mg) were mixed in 1.5 ml PBS and shaken at 37 ° C. for 30 minutes. Reacted. Next, PEGylated gelatin (10000-2.8, 5 mg) /0.5 ml of PBS was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes with shaking. The molecular size and surface potential of the E10-tPA-PEGgelatin mixture were measured by DLS and ELS as described above.
  • E 10 (20 mg) and tPA (1 mg) were mixed in 1.5 ml of PBS and incubated at 37 ° C for 30 minutes The reaction was carried out with shaking. Next, PEGylated gelatin (10000-2.8, 5 mg) /0.5 ml of PBS was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes with shaking. This mixture was irradiated with ultrasonic waves at 1 MHz for 5 minutes, and tPA activity was evaluated by the fibrin plate method in the same manner as described above.
  • E10-tPA-PEG-introduced gelatin complex ⁇ Method> E 10 (20 mg) and tPA (1 mg) were mixed in 1.5 ml of PBS and reacted at 37 ° C for 30 minutes with shaking. It was. Next, PEG-introduced gelatin (10000-2.8, 5 mg) /0.5 ml of PBS was added and reacted at 37 ° C. with shaking for 30 minutes. The reaction solution was diluted to each concentration to obtain a measurement sample.
  • L929 cells were seeded at 5000 cells / well in a 96-well plate, HUVECs were seeded at 10000 cells / well, pre-cultured with 10% FCS E-MEM for 24 hours, and after medium replacement, each concentration of sample / PBS (pH 7.4) was added. did. Thereafter, contact was performed for 48 hours, WST-8 was added after medium exchange, and after 2 hours, the absorbance at 450 nm of the supernatant was measured with a VERSAmax microplate reader. The data was calculated assuming that the cell viability when adding PBS instead of the sample (Control) was 100%.
  • E10-tPA-PEG-introduced short-chain gelatin mixture in serum ⁇ Method> E 10 (20 mg) and tPA (1 mg) were mixed in 1.5 ml PBS and shaken at 37 ° C for 30 minutes. It was made to react while finally. Next, PEG-introduced gelatin (10000-2.8, 5 mg) /0.5 ml of PBS was added and reacted at 37 ° C. with shaking for 30 minutes. Thereafter, the mice were allowed to stand at 37 ° C. for 90 minutes in mouse serum (10%, 50%). Furthermore, the ultrasonic irradiation sample was irradiated with ultrasonic waves at 1 MHz for 5 minutes. The tPA activity was evaluated by the fibrin plate method as described above.
  • This mixed solution was diluted 10,000 times with PBS to obtain a sample for administration.
  • a ddY mouse female, 6 weeks old was anesthetized with diethyl ether, and 100 ml of sample was administered from the tail vein.
  • Orbital blood was collected after 1, 15, 30, and 60 minutes, and radioactivity was measured with a gamma counter (ARC-301B, Aloka).
  • the amount of tPA in the blood was converted from the body weight of the mouse as described above, and the amount of remaining tPA in the blood was calculated with the amount of tPA administered as 100%. Further, 60 minutes after administration, whole blood was collected and organs were removed, and the radioactivity was measured in the same manner to evaluate the pharmacokinetics.
  • a mouse femoral artery thrombus occlusion model was prepared by iron chloride injury.
  • a method for producing an arterial thrombus occlusion model by this iron chloride injury is well known. Specifically, it was produced as follows. First, after incising both thighs of the mouse, both femoral arteries were exfoliated and exposed. Next, a 10% ferric chloride solution was sufficiently infiltrated into a filter paper having a length of 1.0 mm and a width of 5 mm. Then, the exposed portion of the left femoral artery of the mouse was covered with a filter paper infiltrated with ferric chloride, and the paper was removed after 5 minutes to induce left femoral artery thrombotic occlusion.
  • the mouse was anesthetized (50 mg / kg of pentobarbital sodium was administered intraperitoneally).
  • the first form complex has the property of collecting around the thrombus existing site (that is, the ability to accumulate in the thrombus).
  • gelatin-tPA-Zn complex has the ability to accumulate in thrombus.
  • the vWF binding amount was calculated as a ratio to the binding amount when the anti-vWF antibody was coated (that is, 0.5 ⁇ g: assuming that the total amount of vWF used was bound). In other words, the vWF binding property was calculated as a ratio when the binding property of the anti-vWF antibody to vWF was 1.
  • the calibration curve is specifically coated with vWF antibody, reacted with 50 ⁇ l of vWF solution of each concentration (0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 ⁇ g / ml), and measured the absorbance, Each vWF solution was prepared by comparing the concentration and absorbance.
  • the vWF used was obtained by first performing 40% ammonium sulfate fractionation using human frozen plasma as a raw material, then removing fibronectin by fibronectin affinity chromatography, and further performing size cut by gel filtration. Is.
  • the vWF concentration calculated from the absorbance using the calibration curve was 12 ⁇ g / ml. Therefore, when the vWF binding amount was calculated (50 ⁇ l was reacted, 12 ⁇ g / ml ⁇ 50 ⁇ l) 0.6 ⁇ g.
  • Von Willebrand factor is known to be one of the components of thrombus.
  • the gelatin used in this experiment has the ability to bind to von Willebrand factor, and the gelatin-tPA-Zn complex also has the ability to bind to von Willebrand factor equivalent to gelatin, Was confirmed.
  • the first morphological complex has binding properties to the von Willebrand factor that is present in the thrombus. This suggests the possibility of having an accumulation capacity of

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Abstract

　本発明は、血栓部位のみで高い活性を有するよう血栓溶解剤をコントロールし、副作用を低減できるような技術を提供することを課題とする。本発明により、ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンを含んでなる複合体、又はカチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチンを含んでなる複合体が提供される。

Description

血栓溶解酵素含有複合体
　 　本発明は血栓溶解酵素を含む複合体に関する。また、本発明は当該複合体の製造方法、及び当該複合体を含む組成物にも関する。さらに、本発明は当該複合体及び超音波照射装置からなる血栓治療システムにも関する。
　血栓により血管が閉塞して発症する疾患（例えば、急性心筋梗塞、脳梗塞、血栓性塞栓症等）は、突然死をきたす虞もある重篤な疾患である。既に何種類かの治療方法が開発されているが、よりよい治療法の確立に向け、広く研究が行われている。
　これらの疾患、特に急性心筋梗塞、脳梗塞に対する急性期治療には、迅速性が要求される。急性心筋梗塞では、現在我が国では、カテーテルによる冠動脈再開通療法が主流である。カテーテルによる再開通療法は再開通率が高率である半面、３次病院への搬送、搬送後の医療スタッフの確保等に時間を浪費するだけでなく、人件費や高額材料費の使用等、医療経済性の観点からは短所も多い。一方、組織プラスミノーゲン活性化因子（tPA）による静脈内投与による血栓溶解療法は、以前試みられていたが、再開通効率が約60％に留まることや、脳出血等の重篤な出血性の副作用を合併することにより、我が国では殆ど実施されていないのが現状である。また、脳梗塞においても、出血性梗塞の副作用を最小限にする目的から、tPAによる血栓溶解療法は発症後２時間以内の症例にしか適応となっていない。
　このように、tPAによる血栓溶解療法は、迅速性と医療経済性という極めて魅力的な利点を有しているが、溶解そのものの効果が不十分である点と、出血性の副作用の欠点により、現在ではその使用が極めて限られている。
　tPAの迅速性及び医療経済性さらには簡便性を担保しつつ、高効率で安全な新しい血栓溶解療法の開発が望まれている。この目的のためには、静脈内投与されているときには血栓溶解活性が抑制され、目的の部位にて溶解活性を賦活化する方法が求められる。
　このような観点から、特許文献１には、特定の化合物と血栓溶解剤（tPA）とを組み合わせて用いることで、tPAの半減期を延長させ、活性を抑制し出血の減少を達成できることが記載されている。
　しかし、血栓部位のみで高い活性を有するよう血栓溶解剤をコントロールし、副作用を低減できるような技術はまだ確立していない。
特開２００４－３４６０６７号公報
　本発明は、血栓部位のみで高い活性を有するよう血栓溶解剤をコントロールし、副作用を低減できるような技術を提供することを課題とする。
　本発明者らは、驚くべき事に、ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンを含んでなる複合体、又はカチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチンを含んでなる複合体を体内へ投与し、超音波を照射することで、所望の部位にて血栓溶解酵素活性を発現させることができることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。なお、本明細書で「ＰＥＧ」は「ポリエチレングリコール」を表す。
　すなわち、本発明は例えば以下の項に記載の発明を包含する。
項Ａ－１．
ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンを含んでなる複合体。
項Ａ－２．
血栓溶解酵素が、組織型プラスミノーゲン活性化因子である、項Ａ－１に記載の複合体。
項Ａ－３．
金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、及びカルシウムイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、項Ａ－１又はＡ－２に記載の複合体。
項Ａ－４．
ゼラチンが、等電点が８～１０のゼラチンである、項Ａ－１～Ａ－３のいずれかに記載の複合体。
項Ａ－５．
ゼラチンが、重量平均分子量１００００～２０００００のゼラチンである、項Ａ－１～Ａ－４のいずれかに記載の複合体。
項Ａ－６．
粒子径が５０～２５０ｎｍである、項Ａ－１～Ａ－５のいずれかに記載の複合体。
項Ａ－７．
血栓への集積能を有する、項Ａ－１～Ａ－６のいずれかに記載の複合体。
項Ａ－８．
急性心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓塞栓症、急性下肢動脈閉塞、及び人工血液透析の動静脈者シャント閉塞からなる群より選択される少なくとも１種の血栓性血管閉塞疾患の治療用の項Ａ－１～Ａ－７のいずれかに記載の複合体。
項Ａ－９．
項Ａ１～Ａ－８のいずれかに記載の複合体を含む液状組成物。
項Ａ－１０．
急性心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓塞栓症、急性下肢動脈閉塞、及び人工血液透析の動静脈者シャント閉塞からなる群より選択される少なくとも１種の血栓性血管閉塞疾患の治療用である、項Ａ－９に記載の液状組成物。
項Ａ－１１－１．
（i）ゼラチンと血栓溶解酵素を液中で混合する工程、及び、（ii）金属塩又は金属塩溶液を（i）で得た混合溶液と混ぜる工程、を含む、項Ａ－１～Ａ－７のいずれかに記載の複合体の製造方法。
項Ａ－１１－２．
（i）ゼラチンと血栓溶解酵素を液中で混合する工程、及び、（ii）金属塩又は金属塩溶液を（i）で得た混合溶液と混ぜる工程、を含む、項Ａ－８又はＡ－９に記載の液状組成物の製造方法。
項Ａ－１２．
ゼラチンと血栓溶解酵素の混合割合が、血栓溶解酵素１モルに対して、ゼラチン０．１～５０モル程度である、項Ａ－１１－１又はＡ－１１－２に記載の製造方法。
項Ａ－１３．
金属イオンと血栓溶解酵素との混合割合が、血栓溶解酵素１モルに対して、金属イオン１０～１０００モル程度である、項Ａ－１１－１、Ａ－１１－２、又はＡ－１２に記載の製造方法。
項Ａ－１４．
項Ａ－１～Ａ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ａ－９又はＡ－１０に記載の液状組成物を、対象に経血管投与する工程、及び、血栓が存在する患部に対してのみ超音波を照射する工程、を含む、血栓治療方法。
項Ａ－１５－１．
項Ａ－１～Ａ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ａ－９又はＡ－１０に記載の液状組成物の、医薬としての使用。
項Ａ－１５－２．
項Ａ－１～Ａ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ａ－９又はＡ－１０に記載の液状組成物の、血栓性血管閉塞疾患治療薬としての使用。
項Ａ－１６．
血栓性血管閉塞疾患の治療における使用のための、項Ａ－１～Ａ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ａ－９又はＡ－１０に記載の液状組成物。
項Ａ－１７．
血栓性血管閉塞疾患の治療のための医薬の製造における、項Ａ－１～Ａ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ａ－９又はＡ－１０に記載の液状組成物の使用。
項Ａ－１８－１．
項Ａ－１～Ａ－８のいずれかに記載の複合体と、当該複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置を含む、血栓治療システム。
項Ａ－１８－２．
項Ａ－９又はＡ－１０に記載の液状組成物と、当該組成物が含む項Ａ－１～Ａ－８のいずれかに記載の複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置を含む、血栓治療システム。
項Ｂ－１．
カチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチンを含んでなる複合体。
項Ｂ－２．
カチオン化ゼラチンが、ゼラチンが有する－ＣＯＯＨ基が下式（Ｉ）：
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ２　　　（Ｉ）
〔式中、ａは１～１０の整数を示す〕
で表される基へ置換されたゼラチンである、
項Ｂ－１に記載の複合体。
項Ｂ－３．
カチオン化ゼラチンが、ゼラチンが有する－ＣＯＯＨ基の４０％以上が下式（Ｉ）：
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ２　　　（Ｉ）
〔式中、ａは１～１０の整数を示す〕
で表される基へ置換されたゼラチンである、
項Ｂ－２に記載の複合体。
項Ｂ－４．
ＰＥＧ化ゼラチンが、ゼラチンが有する官能基が下式（ＩＩ）：
Ｒ－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－Ｚ－（ＣＨ２）ｍ－Ｙ－　　（ＩＩ）
〔式中、
Ｒは、炭素数１～８の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基であり、
Ｚは、－Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－であり、
Ｙは、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－、又は－Ｓ－Ｓ－であり、
ｎは１～２０００の整数を示し、ｍは０～３の整数を示す〕
で表される基へ置換されたゼラチンである、
項Ｂ－１～Ｂ－３のいずれかに記載の複合体。
項Ｂ－５．
ＰＥＧ化ゼラチンが、ゼラチンが有する－ＮＨ２基が下式（ＩＩ）：
Ｒ－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－Ｚ－（ＣＨ２）ｍ－Ｙ－　　（ＩＩ）
〔式中、
Ｒは、炭素数１～８の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基であり、
Ｚは、－Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－であり、
Ｙは、－ＣＯ－ＮＨ－であり、
ｎは１～２０００の整数を示し、ｍは０～３の整数を示す〕
で表される基へ置換されたゼラチンである、
項Ｂ－４に記載の複合体。
項Ｂ－６．
血栓溶解酵素が、組織型プラスミノーゲン活性化因子である、項Ｂ－１～Ｂ－５のいずれかに記載の複合体。
項Ｂ－７．
ＰＥＧ化ゼラチンがカチオン化ゼラチン及び血栓溶解酵素を被覆してなる、項Ｂ－１～Ｂ－６のいずれかに記載の複合体。
項Ｂ－８．
急性心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓塞栓症、急性下肢動脈閉塞、及び人工血液透析の動静脈者シャント閉塞からなる群より選択される少なくとも１種の血栓性血管閉塞疾患の治療用の項Ｂ－１～Ｂ－７のいずれかに記載の複合体。
項Ｂ－９．
項Ｂ－１～Ｂ－８のいずれかに記載の複合体を含む液状組成物。
項Ｂ－１０．
急性心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓塞栓症、急性下肢動脈閉塞、及び人工血液透析の動静脈者シャント閉塞からなる群より選択される少なくとも１種の血栓性血管閉塞疾患の治療用である、項Ｂ－９に記載の液状組成物。
項Ｂ－１１－１．
項Ｂ－１～Ｂ－８のいずれかに記載の複合体と、当該複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置からなる、血栓治療システム。
項Ｂ－１１－２．
項Ｂ－９又はＢ－１０に記載の液状組成物と、当該組成物が含む項Ｂ－１～Ｂ－８のいずれかに記載の複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置を含む、血栓治療システム。
項Ｂ－１２－１．
（i）カチオン化ゼラチンと血栓溶解酵素を液中で混合する工程、及び、（ii）ＰＥＧ化ゼラチンを（i）で得た混合溶液と混ぜる工程、を含む、項Ｂ－１～Ｂ－８のいずれかに記載の複合体の製造方法。
項Ｂ－１２－２．
（i）カチオン化ゼラチンと血栓溶解酵素を液中で混合する工程、及び、（ii）ＰＥＧ化ゼラチンを（i）で得た混合溶液と混ぜる工程、を含む、項Ｂ－９又はＢ－１０に記載の液状組成物の製造方法。
項Ｂ－１３．
カチオン化ゼラチンと血栓溶解酵素の混合割合が、血栓溶解酵素１モルに対して、カチオン化ゼラチン０．１～５０モル程度である、項Ａ－１２－１又はＡ－１２－２に記載の製造方法。
項Ｂ－１４．
ＰＥＧ化ゼラチンと血栓溶解酵素との混合割合が、血栓溶解酵素１モルに対して、ＰＥＧ化ゼラチン０．１～５０モル程度である、項Ａ－１２－１、Ａ－１２－２、又はＡ－１３に記載の製造方法。
項Ｂ－１５．
項Ｂ－１～Ｂ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ｂ－９又はＢ－１０に記載の液状組成物を、対象に経血管投与する工程、及び、血栓が存在する患部に対してのみ超音波を照射する工程、を含む、血栓性血管閉塞疾患治療方法。
項Ｂ－１６－１．
項Ｂ－１～Ｂ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ｂ－９又はＢ－１０に記載の液状組成物の、医薬としての使用。
項Ｂ－１６－２．
項Ｂ－１～Ｂ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ｂ－９又はＢ－１０に記載の液状組成物の、血栓性血管閉塞疾患治療薬としての使用。
項Ｂ－１７．
血栓性血管閉塞疾患の治療における使用のための、項Ｂ－１～Ｂ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ｂ－９又はＢ－１０に記載の液状組成物。
項Ｂ－１８．
血栓性血管閉塞疾患の治療のための医薬の製造における、項Ｂ－１～Ｂ－８にいずれかに記載の複合体、あるいは項Ｂ－９又はＢ－１０に記載の液状組成物の使用。
　本発明の複合体を血管内へ投与（経血管投与）し、その後、血栓が存在する患部に対してのみ超音波を照射することで、当該患部でのみ、より大きな血栓溶解活性を得ることができる。これにより、血栓が存在しない部位での副作用を低減するとともに、血栓存在部位でのみより大きな血栓溶解活性を得ることができるため、従来に比べ優れた血栓溶解治療効果を得ることができる。
　また、血液中に血栓溶解酵素を単独で投与しても、血液中に存在する様々なタンパク質及び酵素等の影響を受け、その活性は大きく低下してしまう。しかし、本発明の複合体であれば、血液中での血栓溶解酵素の活性低下を抑制する効果も奏する。従って、投与すべき血栓溶解酵素量を低減させることもできるため、この点でも副作用を低減することが出来る。
　さらに驚くべき事に、ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンを含んでなる複合体(以下「第一形態複合体」ともいう）を血中に投与した場合、当該複合体に含まれるのと同量のtPAを単に血中に投与した場合よりも、血栓存在部位周辺に集まるｔＰＡ量が多くなる。つまり、本発明の第一形態複合体は、血栓存在部位周辺へと集まる性質（血栓への集積能）を有する。この性質により、本発明の第一形態複合体を用いることで、より一層効率よくｔＰＡを血栓部位周辺のみで働かせることができる。
tPA活性に対するZnの影響を検討した結果示す。（n=3, mean ± SD） ゼラチン-tPAの活性に対する金属イオンの影響を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs ゼラチン-tPA, t test） 金属イオンの細胞毒性試験の結果を示す。（L929, n=6, mean ± SD） ゼラチン-tPAの活性に対するZn濃度と超音波照射の影響を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs ゼラチン-tPA(PBS), t test） 種々の分子量のゼラチンおよび、tPAとZnとの混合体の分子サイズを測定した結果を示す。（n=3, mean ± SD） 種々の分子量のゼラチンとtPA、Znとの複合体のtPA活性抑制効果を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA/PBS, t test） BSA溶液中におけるゼラチン-tPA-Zn複合体の活性を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA/BSA, ttest） ゼラチン-tPA-Zn混合体の血清中での安定性を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD）,（* P < 0.05 vs tPA/PBS, t test）,（** P < 0.05, t test）,（N.S. 有意差無し） ゼラチン-tPA-Zn混合体の活性に対する超音波照射の影響を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA, t test） ゼラチン-tPA-Zn混合体のゲル濾過画分のSDS-PAGE解析結果を示す。(M, Maker; G, gelatin; 1-20; fraction number) ゼラチン-tPA-Zn混合体のゲル濾過画分のタンパク定量（A）、tPA活性（B）、Zn含有量（C）を測定した結果を示す。（n=3, mean ± SD） ゼラチン-tPA-Zn混合体の細胞毒性試験の結果を示す。▽は動物実験での複合体使用濃度を示す。（L929細胞, n=6, mean ±SD, * P < 0.05 vs control (PBS), t test） ゼラチン-tPA-Zn混合体の血中安定性（A）と体内動態（B）を示す。（n=6, mean ±SD, * P < 0.05 vs tPA, t test） 超音波照射部位、採血部位、及び血栓部位の位置関係を示す。 モデルウサギの右大腿動脈閉塞部近位部の血管造影図を示す。「tPA単独群」はtPAのみを投与後60分の造影図を示す。「DDS単独群」はDDSの投与のみでUS処理を行っていない状態での投与後60分の造影図を示す。「DDS+US群」はDDS投与直後からUS処理を行った状態で投与後60分の造影図を示す。超音波照射により初めてtPA活性が回復し、血栓を溶解することができる一方、超音波照射なし（DDS単独群）では、tPA活性が回復しないので血栓が溶解しないことがわかる。 モデルウサギにtPA又はゼラチン-tPA-Zn複合体を投与した後、採血を行い、tPA活性をを測定した結果を示す。なお、PI-9は等電点９のゼラチンを示す。 ブタ血中tPA活性の検討結果（Ａ）及びモデルブタの心筋梗塞部位の造影図（Ｂ）を示す。（Ｂ）は急性心筋梗塞モデルブタでの血栓溶解実験６０分後の冠動脈造影写真である。 カチオン化ゼラチンの製造方法の一例の概要を示す。 ゼラチンおよびカチオン化ゼラチンの細胞毒性試験の結果を示す。（L929細胞, n=6, mean ± SD, * P < 0.05 vs control (PBS), t test） ゼラチンおよびカチオン化ゼラチンのtPA活性抑制効果を検討した結果を示す。（n=3, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA, t test） カチオン化ゼラチン-tPA複合体の分子サイズおよび表面電位を測定した結果を示す。（n=3, mean ± SD, * P < 0.05 vs E10(アミノ基導入率36.6%), t test） E10-tPAの混合比のtPA活性抑制に対する効果を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA, t test） E10-tPA複合体に対する超音波照射の影響を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA, t test） ＰＥＧ化ゼラチンの製造方法の一例の概要を示す。 PEG化ゼラチンのPEG導入率を検討した結果を示す。（n=3, mean ± SD） E10-tPA-PEGgelatinのtPA活性抑制効果を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA, t test） E10-tPA-PEGgelatinの活性に対する超音波照射の影響を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA, t test） E10-tPA-PEGgelatinの細胞毒性試験の結果を示す。（A:L929細胞, B:HUVEC, n=6, mean ± SD, * P < 0.05 vs control (PBS), t test） E10-tPA-PEGgelatinの血清中での安定性を検討した結果を示す。（n=4, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA (PBS), t test） E10-tPA-PEGgelatinの血中安定性（A）と体内動態（B）を示す。（n=6, mean ± SD, * P < 0.05 vs tPA (E10+tPA+PEGgelatin), ‡P < 0.05 vs tPA (E10+tPA), t test） RIラベルしたtPA、又はRIラベルしたtPAを用いて作成したゼラチン-tPA-Zn混合体を、血栓症モデルマウスに静脈内投与し、10分後の血栓側動脈のRI活性を測定した結果（具体的には、対側正常血管とのRI活性比）を示す。 、tPA、ゼラチン、及びゼラチン-tPA-Zn複合体の、von Willebrand Factor（vWF）に対する結合性を比較したグラフを示す。当該グラフでは、vWF結合性（縦軸）は、抗vWF抗体のvWFへの結合性を１とした場合の比で示している。
　以下、本発明について、さらに詳細に説明する。本発明に係る複合体は、二形態存在するため、以下形態ごとに説明する。
  第一形態
　本発明は、ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンを含んでなる複合体（第一形態複合体）を包含する。
　ゼラチンは、牛を始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの部分あるいはコラーゲンあるいはコラーゲンとして用いられている物質から酸又はアルカリ加水分解して得られる。本発明の第一形態複合体に用いるゼラチンとしては、市販されているゼラチンを用い得るが、好ましくは、コラーゲンを酸処理して調製した塩基性ゼラチンである。コラーゲンの中でも、Ｉ型コラーゲンが好ましい。コラーゲンの由来は、豚の皮膚、腱であることが好ましい。
　また、第一形態複合体に用いるゼラチンは、等電点（ＩＰ）が８～１０程度であることが好ましく、９程度であることが特に好ましい。さらに、分子量（重量平均分子量）は特に制限されないが、好ましくは２０００～２０００００程度であり、より好ましくは１００００～２０００００程度であり、さらに好ましくは１００００～１０００００程度である。
　なお、ゼラチンの等電点（ＩＰ）の測定は、ゼラチン溶液を調製し、そこにカチオン、アニオン樹脂を入れて、余計なイオンを除去した後、ゼラチン溶液のみが示すｐＨ値を測定して、当該ｐＨ値を等電点とする。より具体的には、ＰＡＧＩ法（「写真用ゼラチン試験法；第１０版（２００６年版）、写真用ゼラチン試験法合同審議会　編」の「８．等イオン点」に記載の方法）により測定する。また、ゼラチンの分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定される値であり、より具体的には、ＰＡＧＩ法（「写真用ゼラチン試験法；第１０版（２００６年版）、写真用ゼラチン試験法合同審議会　編」の「２０－２．平均分子量」に記載の方法）で測定される値である。これは、本明細書に記載のＰＥＧ化ゼラチン、カチオン化ゼラチンの等電点及び分子量（平均分子量）についても、同じである。
　このような塩基性ゼラチンは例えば新田ゼラチン社等から購入することができる。
　血栓溶解酵素としては、公知のものを使用できる。例えばプラスミノーゲン活性化因子が挙げられる。具体的には、ウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）等が挙げられる。特にｔＰＡが好ましい。なお、ｔＰＡとしては、例えばアルテプラーゼ、モンテプラーゼ、パミテプラーゼ等が挙げられる。
　このような血栓溶解酵素は、市販されており、適宜購入して用いることができる。特に血栓溶解薬として販売されているものを好適に用い得る。例えば、ウロキナーゼは持田製薬株式会社、わかもと製薬株式会社等から購入できる。また、ｔＰＡは協和発酵キリン株式会社、田辺三菱製薬株式会社、エーザイ株式会社、アステラス製薬株式会社等から購入できる。このような血栓溶解酵素については、例えば「今日の治療薬２００８（南江堂）」等に詳細に記載されている。
　金属イオンとしては、二価の金属イオンを好ましく用いることができる。例えば亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等が挙げられる。なかでも亜鉛イオンが好ましい。
　本発明の第一形態複合体は、本発明の効果を損なわない限り、ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオン以外の成分も含まれてよい。本発明の第一形態複合体は、好ましくは、実質的にゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンからなる複合体である。
　本発明の第一形態複合体は、例えば、溶媒にゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属塩を溶解させて混合することで製造することができる。溶媒としては水溶液又は水が好ましい。また、緩衝水溶液であることがより好ましい。ｐＨは、６～８程度であることが好ましい。例えば、生理食塩水、特にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属塩を溶解させて混合することで、好ましく第一形態複合体を調製できる。
　ゼラチン及び血栓溶解酵素としては、具体的には上述したゼラチン及び血栓溶解酵素を用いることができる。
　金属塩は、金属イオンをゼラチン及び血栓溶解酵素と混合させるために用いる。金属塩としては、水に溶解して二価の金属イオンを生じる二価金属塩が好ましい。中でも、亜鉛塩、マグネシウム塩、カルシウム塩が好ましい。また、金属塩は、無機酸塩でも有機酸塩でもよい。例えば、無機酸塩としては、塩化物塩、硫酸塩、硝酸塩等が例示できる。また、有機酸塩としては、酢酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩等が例示できる。金属塩としては、特に亜鉛塩が好ましく、具体的には塩化亜鉛、硫酸亜鉛、酢酸亜鉛、シュウ酸亜鉛等を好ましく用い得る。
　ゼラチンと血栓溶解酵素の混合割合は、特に制限はされない。血栓溶解酵素に複数のゼラチンを吸着させるため、モル換算で、血栓溶解酵素に対してゼラチンを過剰に加えてもよい。より具体的には、例えば、血栓溶解酵素１モルに対して、ゼラチン０．１～５０モル程度、好ましくは１～２０モル程度、より好ましくは１０～２０モル程度を混合すればよい。
　また、金属イオンと血栓溶解酵素との混合割合も、特に制限はされない。モル換算で、血栓溶解酵素に対して金属イオンを過剰に加えてもよい。より具体的には、例えば、血栓溶解酵素１モルに対して、金属イオン１０～１０００モル程度、好ましくは１００～１０００モル程度を混合すればよい。なお、金属イオンを混合するため、例えば、金属塩をゼラチン及び血栓溶解酵素混合溶液中へ加えてもよいし、金属塩を溶解して得た金属塩溶液をゼラチン及び血栓溶解酵素混合溶液中へ加えてもよい。
　ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンを混合する順番としては、まずゼラチンと血栓溶解酵素を混合した後、さらに金属イオンを加えて混合するのが好ましい。即ち、本発明の第一形態複合体を製造する方法としては、（i）ゼラチンと血栓溶解酵素を液中で混合する工程、及び（ii）さらに金属塩又は金属塩溶液を加えて混合する工程（すなわち、金属塩又は金属塩溶液を（i）で得た混合溶液と混ぜる工程）、を含む製造方法が好ましい。血栓溶解酵素、ゼラチン、金属イオンの混合割合（モル比）は、前述した値が好ましい。
　ゼラチンと血栓溶解酵素を溶液中で混合すると、それぞれの持つ電荷により相互作用して、ゼラチンと血栓溶解酵素の複合体（ゼラチン－血栓溶解酵素複合体）が形成される。そして、さらに金属イオンを加えて混合することで、ゼラチン－血栓溶解酵素複合体に金属イオンが電荷により相互作用して吸着し、ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンが含まれてなる、ゼラチン－血栓溶解酵素－金属イオン複合体が得られる。当該複合体が、本発明の第一形態複合体である。
　例えば、ゼラチンとtPAをPBS中で混合し、さらに酢酸亜鉛/PBS溶液を加えて混合することで、ゼラチン－tPA－亜鉛イオン複合体を製造できる。
　より具体的に説明すると、ｔＰAの等電点が６～７であることから、ｔＰAは中性領域の水溶液中では負に帯電している。そこで、用いるゼラチンの等電点が７以上であれば、水溶液中では、ｔＰＡのもつ負電荷とゼラチンの正電荷の間に静電的相互作用が働き、お互いの複合体が形成される。
　なお、ゼラチンのカルボキシル基を化学修飾して、より正電荷を高めたカチオン化ゼラチンを用いる場合にも、上記の複合体が作製され得る。(カチオン化ゼラチンについては、下記第二形態複合体についての記載において、詳説する。)
　作製された複合体は正電荷をもつため、負電荷をもつ等電点が５のゼラチンあるいはサクシニル化された負電荷ゼラチン誘導体は、静電相互作用により正電荷をもつ複合体表面に吸着される。
　このようにして得られるゼラチン－血栓溶解酵素－金属イオン複合体（第一形態複合体）は、溶液の中に溶解した状態で存在する。第一形態複合体を、公知の分離手段により当該溶液内より分離し、更に精製することもできる。分離及び精製手段としては、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等が挙げられる。
　また、第一形態複合体の粒子径は、通常５０～２５０ｎｍ、好ましくは８０～２００ｎｍ程度である。当該粒子径は、ＤＬＳ－７０００（大塚電子）を用いて動的光散乱法（ＤＬＳ）により３７℃で測定される値である。
　当該第一形態複合体では、金属イオンにより血栓溶解酵素の活性が抑制されている。そして、当該複合体に超音波を照射することにより、複合体の結合が切れて血栓溶解酵素が放出されると血栓溶解酵素の活性は回復する。しかも、当該第一形態複合体を血中に投与した場合、当該複合体に含まれるのと同量のtPAを単に血中に投与した場合よりも、血栓存在部位周辺に集まるｔＰＡ量が多くなる。つまり、本発明の第一形態複合体は、血栓存在部位周辺へと積極的に集まるという驚くべき性質（血栓への集積能）を有する。よって、第一形態複合体は、血栓が原因で発症する疾患を治療するための、薬物伝達システム（ＤＤＳ）として好ましく用いることができる。すなわち、当該複合体を血管内へ投与（経血管投与）すると、当該複合体が血管を通って血栓存在部位周辺へと集まる。その後、血栓が存在する患部に対してのみ超音波を照射することで、当該患部でのみ、より大きな血栓溶解活性を効率よく得ることができる。すなわち、本発明の第一形態複合体は、血栓への集積能を有する上、超音波を照射した部位のみでｔＰＡ活性を発現させることができるという、非常に優れたＤＤＳたりうる。本発明の第一形態複合体を用いることにより、血栓が存在しない部位での副作用を低減するとともに、血栓存在部位でのみ、より大きな血栓溶解活性を効率よく得ることができるため、従来に比べ優れた血栓溶解治療効果を得ることができる。
　またさらに、血液中に血栓溶解酵素を単独で投与しても、血液中に存在する様々なタンパク質及び酵素等の影響を受け、その活性は大きく低下してしまう。しかし、本発明の第一形態複合体であれば、血液中での血栓溶解酵素の活性低下を抑制する効果も奏する。従って、投与すべき血栓溶解酵素量を低減させることもできるため、この点でも副作用を低減することが出来る。
　強い超音波によりタンパク質である血栓溶解酵素が変性したり、超音波照射部位（例えば皮膚や皮下組織）に熱傷などの組織傷害を来す虞があるため、強力な超音波を照射することは好ましくない。例えば、血栓が存在する患部に対し、周波数は0.5～2.0ＭＨｚ程度、好ましくは1.0ＭＨｚ程度、強度は0.5～2.0W/cm2程度、好ましくは1.0W/cm2程度で照射することができる。照射時間は特に制限されないが、例えば10～120分程度、好ましくは30分程度照射するようにすればよい。
　このような超音波照射をするための装置としては、例えば、上記条件を満たす超音波照射が可能な公知の装置を用いることができる。例えば、イトー超音波治療器（KUS-2S型、伊藤超短波株式会社）等が例示できる。また、ヒトを含めた大型の哺乳動物に超音波照射する場合、当該超音波照射装置を複数個（例えば２～４個）並べて同時に用いてもよい。
　また、血栓が存在する患部は、例えば公知の血管造影法により特定できる。
　血栓が原因で発症する疾患としては、血栓性血管閉塞疾患が挙げられ、特に制限はされないが、例えば急性心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓塞栓症、急性下肢動脈閉塞、人工血液透析の動静脈者シャント閉塞等が例示できる。このような疾患の治療（血栓溶解治療）に第一形態複合体は好ましく用いることができる。より具体的には、例えば、急性心筋梗塞における冠動脈血栓の溶解のため、急性肺塞栓症における肺動脈血栓の溶解のため、又は虚血性脳血管障害急性期に伴う機能障害の改善のため、用いることができる。
　なお、第一形態複合体の投与対象には、上述の疾患を患ったヒトはもちろん、上述の疾患を患ったその他の哺乳動物も含まれる。例えば、ペット及び家畜（イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタなど）が含まれる。
　投与方法としては、経血管投与が好ましい。具体的には、静脈内投与挙げられる。経血管投与は、例えば注射器や点滴などを用いて行い得る。
　投与量及び投与速度としては、第一形態複合体に含まれる血栓溶解酵素の単位（IU）に留意し、適宜設定することができる。ヒトに関して適当な血栓溶解酵素の投与量及び投与速度については、市販されているものを用いる場合は、添付文書に記載された情報に基づいて適宜設定することができるし、そのような情報は、例えば「今日の治療薬２００８（南江堂）」等にも詳細に記載されている。例えば、血栓溶解酵素としてtPA（モンテプラーゼ：商品名〔クリアクター（登録商標）〕、分子量約68000、エーザイ株式会社）を用いる場合、通常成人一日あたり10000～30000IU/kg程度を投与することができる。また、投与速度は、好ましくは６０～１００万ＩＵ／分程度、より好ましくは８０万ＩＵ／分程度である。
　なお、投与量及び投与速度については、第一形態複合体に含まれる血栓溶解酵素以外にも別途当該酵素が投与される場合は、それら全ての酵素の合計量に基づいて設定されるのが好ましい。例えば、下述のように第一形態複合体が溶解した液状組成物の形態で投与がなされる場合、当該液状組成物全体に含まれる血栓溶解酵素量に基づいて投与量及び投与速度は設定される。
　投与にあたっては、当該複合体が溶解した液状組成物として投与を行うのが好ましい。また、上述の製造法であれば、ゼラチン－血栓溶解酵素－金属イオン複合体（第一形態複合体）は、溶液の中に溶解した状態で存在する。従って、当該溶液をそのまま液状組成物として用いることもできる。
　当該液状組成物は医薬組成物として用い得る。また、当該液状組成物は、例えば、注射剤（液剤、懸濁剤等）や点滴剤として使用できる。
　当該液状組成物は本願の効果を損なわない限り薬学的に許容し得る担体を含んでもよい。このような担体としては、医薬製剤に通常使用され、本願の効果を損なわないものであれば、特に制限されない。例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤、賦形剤等が挙げられる。より具体的には、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、キシリトール、マンニトール、エリスリトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、結晶セルロース等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の崩壊剤等を使用できる。更に必要に応じて着色剤、保存剤等や他の医薬品を当該液体組成物中に含有させることもできる。
　当該液状組成物は、公知の方法によって適宜製造することができる。例えば、生理食塩水等の生体投与（特に経血管投与）に適する液に第一形態複合体、及び必要に応じてその他の担体を溶解させて製造することができる。この場合の第一形態複合体濃度も、適宜設定できる。
　本発明は、第一形態複合体と、当該複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置からなる、血栓治療システムも包含する。また、本発明は、上述の第一形態複合体を含む液状組成物と、当該液状組成物が含む第一形態複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置からなる、血栓治療システムも包含する。このような超音波照射装置としては、例えば上記のものが挙げられる。また、上述のように、本システムであれば、血栓が存在しない部位での副作用を低減するとともに、血栓存在部位でのみより大きな血栓溶解活性を得ることができるため、従来に比べ優れた血栓溶解治療効果を得ることができる。　　　　　
　またさらに、本発明は、（Ｉ）第一形態複合体又はこれを含む液状組成物を経血管投与する工程、及び（ＩＩ）血栓存在部位に超音波を照射する工程を含む、血栓溶解治療方法をも包含する。投与量、投与対象、超音波照射条件等、当該方法に用いる条件は、上述した条件を適用できる。
　第二形態
　本発明は、カチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチンを含んでなる複合体をも包含する。なお、当該複合体を第二形態複合体と呼ぶことがある。
　ゼラチンは、牛を始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの部分あるいはコラーゲンあるいはコラーゲンとして用いられている物質から酸又はアルカリ加水分解して得られる。
　カチオン化ゼラチン及びＰＥＧ化ゼラチンは、それぞれゼラチンを化学修飾して得られる化学修飾ゼラチンである。いずれの化学修飾ゼラチンを製造するにあたっても、市販されているゼラチンを用い得る。
　カチオン化ゼラチンは正電荷を帯びたゼラチンである。カチオン化ゼラチンは、例えばゼラチンが有するカルボキシル基（－ＣＯＯＨ基）を、化学修飾によりアミノ基を有する基へと置換することで製造することができる。該アミノ基を有する基は、末端にアミノ基を有する基であることが好ましい。具体的には、例えばゼラチンと公知のアルキルジアミン、アルキルトリアミン、又はアルキルテトラミンを脱水縮合反応させて、ゼラチンのカルボキシル基及び当該アミンのアミノ基とでアミド結合を形成させ、該カルボキシル基を、アミノ基を有する基へと置換して、カチオン化ゼラチンを製造することができる。中でもアルキルジアミンを用いるのが好ましい。特に好ましいアルキルジアミンとしては、下記一般式（１）：
ＮＨ２－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ２　　　（１）
〔式中、ａは１～１０の整数を示す〕
で表されるアルキルジアミンが挙げられる。ここでａは１～１０の整数を、好ましくは１～８の整数を示す。
　用い得るアルキルジアミンとして、より具体的には、例えばエチレンジアミン、１，３－プロパンジアミン、１，４－ブタンジアミン、１，５－ペンタンジアミン、１，６－ヘキサンジアミン等を例示できる。
　従って、前記アミノ基を有する基としては、カルボキシル基とアルキルジアミンとを脱水縮合して得られる基が好ましく、以下の一般式（Ｉ）：
－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－ＮＨ２　　　（Ｉ）
〔式中、ａは前記に同じ〕
で表される基がより好ましい。
　このような脱水縮合反応は、公知の方法により容易に行うことができる。例えば、ゼラチン及びアルキルジアミンを緩衝液に溶解させ、脱水縮合剤の存在下で反応させることで行い得る。反応温度としては例えば２５～４５℃程度、反応時間としては１～２４時間程度が例示できる。また、緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液（ｐＨ５程度）が例示できる。脱水縮合剤としては、例えば各種カルボジイミドを用い得る。具体的には、例えば１－メチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が例示できる。
　ゼラチンは複数のカルボキシル基を有するが、本発明に用いるカチオン化ゼラチンは、正電荷を帯びたものであれば、ゼラチンの有するカルボキシル基の一部が前記アミノ基を有する基へと置換されたものでもよく、全部が置換されたものでもよい。カルボキシル基の置換度としては、ゼラチンの有するカルボキシル基の２０％以上が置換されたものが好ましく、３０％以上が置換されたものがより好ましく、４０％以上が置換されたものがさらに好ましい。
　カチオン化ゼラチンを製造するために用いるゼラチンとしては、コラーゲンを酸処理して調製した塩基性ゼラチンが好ましい。コラーゲンの中でも、Ｉ型コラーゲンが好ましい。また、コラーゲンの由来は、ウシの骨由来であることが好ましい。また、等電点（ＩＰ）が８～１０程度であることが好ましく、９程度であることが特に好ましい。さらに、分子量（重量平均分子量）は特に制限されないが、好ましくは２０００～２０００００程度であり、より好ましくは１００００～２０００００程度であり、さらに好ましくは１００００～１０００００程度である。
　ＰＥＧ化ゼラチンは、例えばゼラチンの有する官能基（特にアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、又はカルボキシル基）をＰＥＧ化修飾剤と反応させて製造することができる。すなわち、ＰＥＧ化ゼラチンは、例えばゼラチンの有する官能基（特にアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、又はカルボキシル基）をＰＥＧ化修飾して得ることができる。このようなＰＥＧ化修飾剤は、多く市販されており、それらを購入して用いることができる。好ましいＰＥＧ化修飾剤としては、SUNBRIGHT（登録商標）シリーズ（NOF CORPORATION）のＰＥＧ誘導体を例示できる。
　ＰＥＧ化ゼラチンは、ゼラチンの有する官能基（特にアミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、又はカルボキシル基等）を、以下の一般式（２）：
－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－　　　（２）
〔式中、ｎは１～２０００の整数を示す〕
で表される基を有する基（以下「ＰＥＧユニット含有基」ともいう）へ置換させたものである。ここでｎは１～２０００の整数を、好ましくは２～１５００の整数を、さらに好ましくは１００～１５００の整数を示す。
　つまり、ＰＥＧ化ゼラチンは、ゼラチンの有する官能基がＰＥＧユニット含有基に置換された構造を持つ。
　好ましいＰＥＧユニット含有基としては、例えば以下の一般式（ＩＩ）：
Ｒ－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－Ｚ－（ＣＨ２）ｍ－Ｙ－　　（ＩＩ）
〔式中、
Ｒは、炭素数１～８の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基であり、
Ｚは、－Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－であり、
Ｙは、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－、又は－Ｓ－Ｓ－であり、
ｍは０～３の整数を示す。ｎは前記に同じ。〕
で表される基が挙げられる。
　ここで、Ｒは、炭素数１～８（好ましくは１～６、より好ましくは１～４）の直鎖もしくは分岐鎖を有するアルキル基であり、具体的には、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基等が例示できる。特にメチル基、エチル基が好ましい。
　また、Ｚは－Ｏ－又は－ＯＣ（Ｏ）－であり、－ＯＣ（Ｏ）－が好ましい。
　また、Ｙは、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－ＣＯ－、又は－Ｓ－Ｓ－である。Ｙは、ゼラチンの有する官能基と用いたＰＥＧ化修飾剤の種類に応じて決定される。
　例えば、ＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide）基を有するＰＥＧ化修飾剤を用いて、ゼラチンのアミノ基を化学修飾した場合、Ｙは－ＣＯ－ＮＨ－である。また、例えばアミノ基を有するＰＥＧ化修飾剤を用いて、ゼラチンのカルボキシル基を化学修飾した場合、Ｙは－ＮＨ－ＣＯ－である。また、例えばチオール基を有するＰＥＧ化修飾剤を用いて、ゼラチンのチオール基を化学修飾した場合、Ｙは－Ｓ－Ｓ－である。
　このようなＰＥＧ化修飾剤としては、例えば以下の一般式（３）：
Ｒ－（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－Ｚ－（ＣＨ２）ｍ－Ｘ　　（３）
〔式中、Ｘはアミノ基、チオール基、又は基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
を示す。
Ｒ、Ｚ、ｎ、ｍは前記に同じ。〕
で表されるＰＥＧ誘導体が挙げられる。
このようなＰＥＧ誘導体は、公知であるか、公知の手法を用いて製造することができる。さらに、このようなＰＥＧ誘導体として、市販品を購入して用いることもできる。例えば、上記一般式（３）のＸが基
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
であるＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体として、SUNBRIGHT（登録商標）ＣＳ、ＧＳ、ＡＳ、及びＨＳタイプのＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体を用いることができる。また例えば、上記一般式（３）のＸがアミノ基であるＰＥＧ誘導体として、SUNBRIGHT（登録商標）ＰＡ及びＥＡタイプのＰＥＧ誘導体を用いることができる。また例えば、上記一般式（３）のＸがチオール基であるＰＥＧ誘導体として、SUNBRIGHT（登録商標）ＳＨタイプのＰＥＧ誘導体を用いることができる。
　また、ゼラチンのアミノ基とＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体を反応させる方法としては、公知の方法を好ましく用い得る。例えば、適当な溶媒（例えばＤＭＳＯ）にゼラチン及びＮＨＳ活性化ＰＥＧ誘導体を溶解させて混和し、室温（例えば２０～３０℃）で１～１２時間程度静置する方法が例示できる。ゼラチンのカルボキシル基とアミノ基を有するＰＥＧ誘導体を反応させる方法、及びゼラチンのチオール基とチオール基を有するＰＥＧ誘導体を反応させる方法、についても、公知の方法を用い得る。
　ＰＥＧ化ゼラチンにおいて、ＰＥＧ化修飾された官能基の種類は、１種でもよく、２種以上であってもよい。好ましくは１種である。
　ＰＥＧ化ゼラチンを製造するために用いるゼラチンとしては、コラーゲンをアルカリ処理して調製した酸性ゼラチンが好ましい。コラーゲンの中でも、Ｉ型コラーゲンが好ましい。また、コラーゲンの由来は、ウシの骨由来であることが好ましい。また、等電点（ＩＰ）が４～６程度であることが好ましく、５程度であることが特に好ましい。さらに、分子量は特に制限されないが、好ましくは１０００～１０００００程度であり、より好ましくは１０００～１００００程度であり、さらに好ましくは１０００～５０００程度である。
　このような酸性ゼラチンは例えば新田ゼラチン社等から購入することができる。
　血栓溶解酵素としては、公知のものを使用できる。例えばプラスミノーゲン活性化因子が挙げられる。具体的には、ウロキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）等が挙げられる。特にｔＰＡが好ましい。なお、ｔＰＡとしては、アルテプラーゼ、モンテプラーゼ、パミテプラーゼ等が挙げられる。
　このような血栓溶解酵素は、市販されており、適宜購入して用いることができる。特に血栓溶解薬として販売されているものを好適に用い得る。例えば、ウロキナーゼは持田製薬株式会社、わかもと製薬株式会社等から購入できる。また、ｔＰＡは協和発酵キリン株式会社、田辺三菱製薬株式会社、エーザイ株式会社、アステラス製薬株式会社等から購入できる。このような血栓溶解酵素については、例えば「今日の治療薬２００８（南江堂）」等に詳細に記載されている。
　本発明の複合体は、本発明の効果を損なわない限り、カチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチン以外の成分も含まれてよい。
　本発明の第二形態複合体は、溶媒にカチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチンを溶解させて混合することで製造することができる。溶媒としては水が好ましい。また、緩衝液であることがより好ましい。ｐＨは、６～８程度に保たれることが好ましい。例えば、生理食塩水、特にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にカチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチンを溶解させて混合することで、好ましく第二形態複合体を調製できる。
　カチオン化ゼラチンと血栓溶解酵素の混合割合は、特に制限はされない。血栓溶解酵素に複数のカチオン化ゼラチンを吸着させるため、モル換算で、血栓溶解酵素に対してカチオン化ゼラチンを過剰に加えてもよい。また、具体的には、例えば、血栓溶解酵素１モルに対して、カチオン化ゼラチン０．１～５０モル、好ましくは１～２０モル程度を混合すればよい。
　また、ＰＥＧ化ゼラチンと血栓溶解酵素との混合割合も、特に制限はされない。モル換算で、血栓溶解酵素に対してＰＥＧ化ゼラチンを過剰に加えてもよい。また、具体的には、例えば、血栓溶解酵素１モルに対して、ＰＥＧ化ゼラチン０．１～５０モル、好ましくは１～２０モル程度を混合すればよい。
　カチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチンを混合する順番としては、まずカチオン化ゼラチンと血栓溶解酵素を混合した後、さらにＰＥＧ化ゼラチンを加えて混合するのが好ましい。即ち、本発明の第二形態複合体を製造する方法としては、（i）カチオン化ゼラチンと血栓溶解酵素を液中で混合する工程、及び（ii）さらにＰＥＧ化ゼラチンを加えて混合する工程（すなわち、ＰＥＧ化ゼラチンを（i）で得た混合溶液と混ぜる工程）、を含む製造方法が好ましい。
　カチオン化ゼラチンと血栓溶解酵素を溶液中で混合すると、それぞれの持つ電荷により相互作用して、カチオン化ゼラチンと血栓溶解酵素の複合体（カチオン化ゼラチン－血栓溶解酵素複合体）が形成される。そして、さらにＰＥＧ化ゼラチンを加えて混合することで、カチオン化ゼラチン－血栓溶解酵素複合体にＰＥＧ化ゼラチンが電荷により相互作用して吸着し、カチオン化ゼラチン、血栓溶解酵素、及びＰＥＧ化ゼラチンが含まれてなる、カチオン化ゼラチン－血栓溶解酵素－ＰＥＧ化ゼラチン複合体が得られる。当該複合体が、本発明の第二形態複合体である。
　なお、ＰＥＧ化ゼラチンがカチオン化ゼラチン－血栓溶解酵素複合体を被覆した形態を有する第二形態複合体が好ましい。上記の順で混合を行うことにより、当該第二形態複合体を製造し得る。当該第二形態複合体では、複合体表面にＰＥＧが存在することになり、ステルス効果が期待できる。ステルス効果とは、薬剤を体内に投与した際、肝臓等の臓器により当該薬剤が捕らえられることを回避する効果である。薬物にＰＥＧを結合させることで当該効果が得られる。
　例えば、カチオン化ゼラチンとtPAをPBS中で混合し、さらにＰＥＧ化ゼラチンを加えて混合することで、カチオン化ゼラチン－tPA－ＰＥＧ化ゼラチン複合体を製造できる。
　より具体的に説明すると、ｔＰAの等電点が６～７であることから、ｔＰAは中性領域の水溶液中では負に帯電している。そこで、用いるゼラチンの等電点が７以上であれば、水溶液中では、ｔＰＡのもつ負電荷とゼラチンの正電荷の間に静電的相互作用が働き、お互いの複合体が形成される。ゼラチンのカルボキシル基を化学修飾して、より正電荷を高めたカチオン化ゼラチンを用いる場合にも、上記の複合体が作製される。作製された複合体は正電荷をもつため、負電荷をもつ等電点が５のゼラチンあるいは官能基が化学修飾された負電荷ゼラチン誘導体（すなわちＰＥＧ化ゼラチン）は、静電相互作用により正電荷をもつ複合体表面に吸着される。このため、ＰＥＧ化ゼラチンはカチオン化ゼラチン－血栓溶解酵素複合体を被覆し得る。
　このようにして得られるカチオン化ゼラチン－血栓溶解酵素－ＰＥＧ化ゼラチン複合体（第二形態複合体）は、溶液の中に溶解した状態で存在する。第二形態複合体を、公知の分離手段により当該溶液内より分離し、更に精製することもできる。分離及び精製手段としては、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等が挙げられる。
　また、第二形態複合体の粒子径は、通常１００～４００ｎｍ、好ましくは１５０～３００ｎｍ程度である。当該粒子径は、ＤＬＳ－７０００（大塚電子）を用いて動的光散乱法（ＤＬＳ）により３７℃で測定される値である。
　当該第二形態複合体では、カチオン化ゼラチンにより血栓溶解酵素の活性が抑制されている。そして、当該複合体に超音波を照射することにより、複合体の結合が切れて血栓溶解酵素が放出されると血栓溶解酵素の活性は回復する。よって、第二形態複合体も、血栓が原因で発症する疾患を治療するための、薬物伝達システム（ＤＤＳ）として好ましく用いることができる。すなわち、当該複合体を血管内へ投与（経血管投与）し、その後、血栓が存在する患部に対してのみ超音波を照射することで、当該患部でのみ、より大きな血栓溶解活性を得ることができる。これにより、血栓が存在しない部位での副作用を低減するとともに、血栓存在部位でのみより大きな血栓溶解活性を得ることができるため、従来に比べ優れた血栓溶解治療効果を得ることができる。
　またさらに、血液中に血栓溶解酵素を単独で投与しても、血液中に存在する様々なタンパク質及び酵素等の影響を受け、その活性は大きく低下してしまう。しかし、本発明の第二形態複合体であれば、血液中での血栓溶解酵素の活性低下を抑制する効果も奏する。従って、投与すべき血栓溶解酵素量を低減させることもできるため、この点でも副作用を低減することが出来る。
　強い超音波によりタンパク質である血栓溶解酵素が変性したり、超音波照射部位（例えば皮膚や皮下組織）に熱傷などの組織傷害を来す虞があるため、強力な超音波を照射することは好ましくない。例えば、血栓が存在する患部に対し、周波数は0.5～2.0ＭＨｚ程度、好ましくは1.0ＭＨｚ程度、強度は0.5～2.0W/cm2程度、好ましくは1.0W/cm2程度で照射することができる。照射時間は特に制限されないが、例えば10～120分程度、好ましくは30分程度照射するようにすればよい。
　このような超音波照射をするための装置としては、例えば、上記条件を満たす超音波照射が可能な公知の装置を用いることができる。例えば、イトー超音波治療器（KUS-2S型、伊藤超短波株式会社）等が例示できる。また、ヒトを含めた大型の哺乳動物に超音波照射する場合、当該超音波照射装置を複数個（例えば２～４個）並べて同時に用いてもよい。
　また、血栓が存在する患部は、例えば公知の血管造影法により特定できる。
　血栓が原因で発症する疾患としては、血栓性血管閉塞疾患が挙げられ、特に制限はされないが、例えば急性心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓塞栓症、急性下肢動脈閉塞、人工血液透析の動静脈者シャント閉塞等が例示できる。このような疾患の治療（血栓溶解治療）に第二形態複合体も好ましく用いることができる。より具体的には、例えば、急性心筋梗塞における冠動脈血栓の溶解のため、急性肺塞栓症における肺動脈血栓の溶解のため、又は虚血性脳血管障害急性期に伴う機能障害の改善のため、用いることができる。
　なお、第二形態複合体の投与対象には、上述の疾患を患ったヒトはもちろん、上述の疾患を患ったその他の哺乳動物も含まれる。例えば、ペット及び家畜（イヌ、ネコ、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタなど）が含まれる。
　投与方法としては、経血管投与が好ましい。具体的には、静脈内投与挙げられる。経血管投与は、例えば注射器や点滴などを用いて行い得る。
　投与量及び投与速度としては、第二形態複合体に含まれる血栓溶解酵素の単位（IU）に留意し、適宜設定することができる。ヒトに関して適当な血栓溶解酵素の投与量及び投与速度については、市販されているものを用いる場合は、添付文書に記載された情報に基づいて適宜設定することができるし、そのような情報は、例えば「今日の治療薬２００８（南江堂）」等にも詳細に記載されている。
　例えば、血栓溶解酵素としてtPA（モンテプラーゼ：商品名〔クリアクター（登録商標）〕、分子量約68000、エーザイ株式会社）を用いる場合、通常成人一日あたり10000～30000IU/kg程度を投与することができる。また、投与速度は、好ましくは６０～１００万ＩＵ／分程度、より好ましくは８０万ＩＵ／分程度である。
　なお、投与量及び投与速度については、第二形態複合体に含まれる血栓溶解酵素以外にも別途当該酵素が投与される場合は、それら全ての酵素の合計量に基づいて設定されるのが好ましい。例えば、下述のように第二形態複合体が溶解した液状組成物の形態で投与がなされる場合、当該液状組成物全体に含まれる血栓溶解酵素量に基づいて投与量及び投与速度は設定される。
　投与にあたっては、当該複合体が溶解した液状組成物として投与を行うのが好ましい。また、上述の製造法であれば、第二形態複合体は、溶液の中に溶解した状態で存在する。従って、当該溶液をそのまま液状組成物として用いることもできる。
　当該液状組成物は医薬組成物として用い得る。また、当該液状組成物は、例えば、注射剤（液剤、懸濁剤等）や点滴剤として使用できる。
　当該液状組成物は本願の効果を損なわない限り薬学的に許容し得る担体を含んでもよい。このような担体としては、医薬製剤に通常使用され、本願の効果を損なわないものであれば、特に制限されない。例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤、賦形剤等が挙げられる。より具体的には、例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、キシリトール、マンニトール、エリスリトール、ソルビトール、炭酸カルシウム、結晶セルロース等の賦形剤、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース等の結合剤、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド等の崩壊剤等を使用できる。更に必要に応じて着色剤、保存剤等や他の医薬品を当該液体組成物中に含有させることもできる。
　当該液状組成物は、公知の方法によって適宜製造することができる。例えば、生理食塩水等の生体投与（特に経血管投与）に適する液に第二形態複合体、及び必要に応じてその他の担体を溶解させて製造することができる。この場合の第二形態複合体濃度も、適宜設定できる。
　本発明は、第二形態複合体と、当該複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置からなる、血栓治療システムも包含する。また、本発明は、上述の第二形態複合体を含む液状組成物と、当該液状組成物が含む第二形態複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置からなる、血栓治療システムも包含する。このような超音波照射装置としては、例えば上記のものが挙げられる。また、上述のように、本システムであれば、血栓が存在しない部位での副作用を低減するとともに、血栓存在部位でのみより大きな血栓溶解活性を得ることができるため、従来に比べ優れた血栓溶解治療効果を得ることができる。
　またさらに、本発明は、（i）第二形態複合体又はこれを含む液状組成物を経血管投与する工程、及び（ii）血栓存在部位に超音波を照射する工程を含む、血栓溶解治療方法をも包含する。投与量、投与対象、超音波照射条件等、当該方法に用いる条件は、上述した条件を適用できる。
　以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。また、以下の実験にあたり、一般的な実験教科書（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual Vol 3 (Cold Spring Harbor Laboratory)）参考にしてもよい。なお、以下分子量をＭＷと記載することがある。また、等電点をＰＩと記載することがある。また、以下で使用したPI = 9の種々の分子量のゼラチン（MW：2000、3000、5000、20000、50000、100000）、又はPI = 5のゼラチン（MW：100000）は、いずれも新田ゼラチンから購入した。また、以下の各例で使用したtPAは、モンテプラーゼ（商品名〔クリアクター（登録商標）〕、分子量約68000、エーザイ株式会社）である。
　超音波照射にはイトー超音波治療器を用いた。また、以下超音波処理のことをＵＳ（UltraSonicationの略）と表記することがある。
　細胞（L929細胞、HUVEC）は、和光純薬株式会社から購入した。
　また、ゼラチン、tPA、及び亜鉛から調製された複合体を「ゼラチン-tPA-Zn複合体」と表記することがある。また、カチオン化ゼラチン、tPA、及びＰＥＧ化ゼラチンから調製された複合体を「カチオン化ゼラチン－血栓溶解酵素－ＰＥＧ化ゼラチン複合体」と表記することがある。
　＜ゼラチンと酢酸亜鉛を用いたDDSの創製（第一形態複合体）＞
　tPA活性に対するZnの影響
　＜方法＞　0.2mg/mlのtPAと酢酸亜鉛水溶液（終濃度0～500mM）を混合したときのtPAの活性を、tPAの人工基質であるChromozyme-tPA（Roche）を用いて評価した。データは酢酸亜鉛水溶液を添加しない場合のtPAの活性を100％としたときの相対活性で示した。
　＜結果＞　tPAは500mMのZn存在下で、tPAのみの48％の活性を示した。反応溶液のpHを確認したところ、いずれのZn水溶液の濃度においてもpH 8～9であり、pHによる影響はないため、Znの作用によってtPAの活性が低下することがわかった。
　ゼラチン-tPAの活性に対する種々の金属イオンの影響
　ゼラチン（MW105, PI=9, 20 mg）とtPA（クリアクター160万単位(IU）、エーザイ、1 mg）とを1.5 mlのPBS中で混合し、振とう機（TAITEC、BIO-SHAKER BR-15）を用いて、37℃、60～80回/分で30分間振とうしながら反応させた。当該反応溶液に終濃度が1-20 mMとなるように、酢酸亜鉛、酢酸マグネシウムまたは酢酸カルシウム水溶液（ナカライテスク）0.5 mlを添加し、さらに37℃で30分間振とうしながら反応させた。
　このようにして調製した混合溶液のtPA活性抑制効果をフィブリンプレート法によって評価した。フィブリンプレート法は、具体的には次のように行った。0.4% のヒト由来フィブリノーゲン（Sigma-Aldrich）/0.17 Mホウ酸バッファー（pH 7.8）10 mlをペトリディシュに入れ、50 U/ml のプラズミノーゲン（EMD Biosciences）0.2 ml を添加して攪拌した後、さらに100 U/ml のトロンビン（EMD Biosciences）を0.2 ml 添加し、よく攪拌して室温で30分静置することでフィブリンプレートを形成させた。このプレートに各混合溶液を5倍希釈したものを2 μl添加し、37℃ で1時間静置したときのクリアゾーン（フィブリン分解領域）の直径を測定し、面積を計算した。フィブリン分解活性が既知のプラスミンを用いて検量線を作成し、クリアゾーンの面積からフィブリン分解活性を計算した。データは、tPAのみの場合を100%として計算した。なお、tPAのみとは、2mlのPBSにtPAを1mg溶解させたサンプルである。
　結果を図２に示す。tPAのみの溶液と比較して、亜鉛濃度が高まるに従ってtPA活性が大きく抑制された。なお、ゼラチン-tPAの混合溶液と、tPAのみ溶解した液とでは、tPA活性がほぼ同じであることを確かめてある。従って、ゼラチン-tPA溶液は、亜鉛濃度が高まるに従ってtPA活性が大きく抑制されることがわかった。
　亜鉛濃度20 mMのときには、74％の抑制率を示した。マグネシウムおよびカルシウムにおいても濃度が高まるに従って、tPA活性が抑制された。ただし、カルシウムの場合は、５ｍＭ以上で白濁が生じた。
　以上の結果から、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、及びカルシウムイオンは、いずれもゼラチン-tPAの活性を抑制できることがわかった。また、これらのなかでは亜鉛が最も抑制効率が高いことがわかった。
　種々の金属イオンの細胞毒性試験
　酢酸亜鉛、酢酸カルシウムおよび酢酸マグネシウムについて、細胞毒性試験（WST-8 assay）を行った。具体的には、次のようにして行った。96穴プレートにL929細胞を5000 cells/well播種して10% FCS Eagle’s MEM（E-MEM）で24時間前培養し、培地交換後、各金属溶液/PBS（pH 7.4）（最終濃度0-20 mM）を添加した。その後、48時間接触させ、培地交換後に2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium（WST-8、ナカライテスク）試薬を添加し、2時間後に上精の450 nmの吸光度をVERSAmax マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で測定した。データは、各金属溶液のかわりにPBSを添加したとき（Control）の細胞生存率を100％として計算した。
　なお、金属溶液/PBSは、酢酸亜鉛、酢酸マグネシウムまたは酢酸カルシウムをＰＢＳに溶解させて調製した。
　結果を図３に示す。酢酸亜鉛を添加した場合は、0.75 mMから急激に細胞生存率が減少した。酢酸マグネシウムを添加した場合は、20 mMまで細胞毒性は認められなかった。酢酸カルシウムを添加した場合は、0.31 mMから細胞生存率が若干減少したが、極度の減少は認められなかった。
　従って、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンのいずれの金属イオンであっても、少なくとも0.5 mM程度の濃度までは細胞毒性ほとんど無いことがわかった。
　ゼラチン-tPAの活性に対する亜鉛濃度と超音波照射の影響の検討
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9, 20 mg）はtPA（1 mg）と1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。反応溶液に終濃度が1-20 mMとなるように、酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、さらに37℃で30分間振とうしながら反応させた。これらの混合溶液を一部採取し、周波数が1 MHz、強度が1W/cm2で5分間超音波照射した。混合溶液のtPA活性は、上記と同様にフィブリンプレート法によって評価した。
　結果を図４に示す。tPAのみ溶解した液と比較して、亜鉛濃度が高まるに従ってtPAの活性が抑制された。なお、ゼラチン-tPAの混合溶液と、tPAのみ溶解した液とでは、tPA活性がほぼ同じであることを確かめてある。従って、ゼラチン-tPA溶液は、亜鉛濃度が高まるに従ってtPA活性が大きく抑制されることがわかった。
　さらに、これらの混合溶液に超音波処理を行うと、抑制されていた活性が回復した。特に亜鉛濃度が5 mMの時に最も回復度合いが大きかった（図４）。
　ゼラチン、tPA、及び亜鉛を含む複合体の分子サイズの検討
　PI = 9の種々の分子量のゼラチン（MW：2000、3000、5000、20000、50000、100000）の分子サイズを測定した。また、ゼラチン、及び亜鉛を含む複合体（ゼラチン-Zn複合体）の分子サイズも測定した。さらに、ゼラチン、tPA及び亜鉛を含む複合体（ゼラチン-tPA-Zn複合体）の分子サイズも測定した。測定は、DLS-7000（大塚電子）を用い、動的光散乱法（DLS）によって37℃で行った。
　各種のゼラチンは1 mg/ml（PBS）のサンプルで測定を行った。また、ゼラチン-Zn複合体の測定には、ゼラチン（20 mg）及びtPA（1 mg）を1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させて調製したサンプルを用いた。さらに、ゼラチン-tPA-Zn複合体の測定には次のようにして調製したサンプルを用いた。すなわち、ゼラチン（20 mg）及びtPA（1 mg）を1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させ、さらに当該反応溶液に終濃度が5 mMとなるように酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、37℃で30分間振とうしながら反応させてサンプルを調製した。
　結果を表１及び図５に示す。ゼラチンに亜鉛を添加すると、分子量の比較的小さいゼラチンは凝集しやすい傾向があった。ゼラチン-tPA-Zn複合体の場合は、凝集は起こらなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　種々の分子量のゼラチンとZnによるtPA活性抑制効果の検討
　＜方法＞　PI = 9の種々の分子量のゼラチン（MW：2000、3000、5000、20000、50000、100000）、又はPI = 5のゼラチン（MW：100000）20 mgを、tPA（1 mg）と1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。反応溶液に終濃度が5 mMとなるように、酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、さらに37℃で30分間振とうしながら反応させた。混合溶液のtPA活性抑制効果は、上記と同様にフィブリンプレート法によって評価した。なお、コントロールとしてtPAのみをPBSに溶解させたサンプルを用いた。
　＜結果＞　結果を図６に示す。PI = 9又は５のいずれのゼラチンであっても、tPA活性抑制効果が認められた。特に、PI = 9のゼラチンの場合は、有意なtPA活性抑制効果が認められた。また、ゼラチンの分子量が小さくなるに従ってtPA活性抑制効果が高くなる傾向が認められた。分子量2000のゼラチンでは活性抑制率が75%であった。
　BSA中におけるゼラチン-tPA-Zn複合体の活性（高タンパク質存在下での脱着の影響の検討）
　＜方法＞　PI = 9のゼラチン（MW：2000、3000、5000、20000、50000、100000）20 mgは、tPA（1 mg）と1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。反応溶液に終濃度が5 mMとなるように、酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、さらに37℃で30分間振とうしながら反応させた。その後、各溶液に終濃度40 mg/mlとなるよう BSA（ウシ血清アルブミン）を溶解させ、90分間静置した。ゼラチン-tPA-Zn複合体の安定性は、上記と同様にフィブリンプレート法でtPA活性を測定することで評価した。なお、コントロールとしてtPAのみを40 mg/ml BSA溶液に溶解させたサンプルを用いた。
　＜結果＞　結果を図７に示す。BSA存在下では、ゼラチンの分子量の増加に伴い、ゼラチン-tPA-Zn複合体のtPA活性が減少した。また、当該減少の度合いは、ゼラチンの分子量の小さい範囲では大きく、ゼラチンの分子量の大きな範囲では緩やかであった。上記のように、PBS中のゼラチン-tPA-Zn複合体のtPA活性は、ゼラチンの分子量が大きいほど増加、すなわち、活性抑制率が減少していた。また、上記の複合体の分子サイズの測定結果から、分子量の小さいゼラチンを用いた場合にゼラチン-tPA-Zn複合体の分子サイズは大きくなる傾向が見られた。特に、ゼラチンの分子量の小さい範囲で分子サイズの変化が顕著であった。これらの結果から、BSA存在下での脱着の影響と混合体の分子サイズとの相関が示唆された。
　ゼラチン-tPA-Zn混合体のマウス血清中での安定性
　＜方法＞PI = 9のゼラチン（MW：2000、3000、5000、20000、50000、100000）20 mgは、tPA（1 mg）と1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。反応溶液に終濃度が5 mMとなるように、酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、さらに37℃で30分間振とうしながら反応させた。その後、当該反応液でマウス血清を5倍希釈した20%マウス血清を作製し、当該20％マウス血清を90分間、37℃で静置して測定サンプルとした。さらに、当該測定サンプルを２つに分け、一方に1 MHzで5分間超音波を照射した。ゼラチン-tPA-Zn複合体の安定性は、上記と同様にフィブリンプレート法でtPA活性を測定することで評価した。なお、コントロールとしてtPAのみをPBS又は20%マウスの血清溶液（マウス血清をPBSで5倍希釈した溶液）に溶解させたサンプルを用いた。
　＜結果＞　結果を図８に示す。tPA/PBS（tPAをPBSに溶解したサンプル）の場合、血清中でtPA活性が57%に減少していた。また、超音波照射を行ってもtPA活性に変化はなかった。分子量5000以下のゼラチンを用いて調製したゼラチン-tPA-Zn複合体は、tPA/PBSに比べてtPA活性が高かった。このことから、血清中では、tPA単独よりもゼラチン-tPA-Zn複合体とした方がtPA活性の減少を抑えられることがわかった。さらに、特に分子量20000以上のゼラチンを用いたゼラチン-tPA-Zn複合体では、20％血清中で78%程度であったtPA活性が、超音波照射によって回復した。つまり、当該複合体は、血清存在下でtPA保護作用を持つことがわかった。またさらに、超音波照射により回復するtPA活性の度合は、分子量の大きなゼラチンを用いたゼラチン-tPA-Zn複合体ほど大きかった。特に分子量100000のゼラチンを用いたゼラチン-tPA-Zn複合体では、超音波照射によってtPA活性がほぼ100％にまで回復した。
　上で検討したBSA中のtPA活性測定の結果、及び複合体の分子サイズ測定の結果と併せて考察すると、ゼラチンの分子量が小さくなるに従って、ゼラチンはタンパク質と結合しやすくなり、大きな凝集体を形成し、活性抑制効果も大きくなると考えられた。分子量が小さなゼラチンは、tPA以外のタンパク質との結合性も高いため、BSA中で脱着が起こりやすいと推測された。逆に分子量の大きなゼラチンの場合は、脱着が起こりにくいため、血清中においてもtPA保護作用を有すると考えられた。
　ゼラチン-tPA-Zn複合体の活性に対する超音波照射の影響
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9, 20 mg）をtPA（1 mg）と1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。反応溶液に、終濃度が5 mMとなるように酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、さらに37℃で30分間振とうしながら反応させた。この混合液に1 MHzで5分間超音波を照射し、上記と同様にtPA活性をフィブリンプレート法によって評価した。なお、コントロールとしてtPAのみをPBSに溶解させたサンプルを用いた。
　＜結果＞　ゼラチン-tPA-Zn混合体でのtPA活性（57%）は、超音波処理によってほぼ100％に回復した（図１０）。
　ゼラチン-tPA-Zn混合体のPD-10カラムによる分画と各フラクションの解析
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9, 20 mg）はtPA（1 mg）と1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。反応溶液に終濃度が5 mMとなるように、酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、さらに37℃で30分間振とうしながら反応させた。この混合溶液を、PD-10脱塩カラム（GE Healthcare）で0.5 mlずつ20フラクションに分画した。なお、PD-10脱塩カラムは、0.15％Kathon（防腐剤）入りの水溶液で膨潤されたSephadex G-25（Medium）が約8.3 ml 充填されたディスポーザブルゲル濾過カラムである。
　次に、これらの20フラクションをSDS-PAGE解析した。フラクション10 μlをDTT入りサンプルバッファーと混合し、7.5%のポリアクリルアミドゲルに供した。各フラクションのタンパク定量はブラッドフォード法によって行った。各フラクションのtPA活性はtPAの人工基質Chromozyme-tPAを用いて測定した。具体的には、次のようにして測定を行った。0.26mg/mlのChromozyme-tPA/ Tris-HCl (pH8.5), 0.15 % Tween 80溶液 150 mlに適切に希釈したフラクション液を15 ml加え、37℃で30分間振とうしながら反応させた。10% クエン酸溶液を添加して反応を止め、405 nmの吸光度を測定した。スタンダードとしてtPAを用い、tPA濃度を計算した。各フラクションに含まれるZn濃度は、原子吸光分光光度計（Simazu）で測定した。各フラクションを5 mg/ml BSA溶液で希釈して、ファーネス測定にてZnの吸光度を測定した。スタンダードとして酢酸亜鉛を用い、Zn濃度の計算を行った。
　＜結果＞　SDS-PAGE解析結果を図１０に示す。また、各フラクションのタンパク質量、tPA濃度、及びZn濃度の測定結果を図１１に示す。なお、以下フラクションを「Fr.」と表記することがある。
　SDS-PAGE解析の結果、Fr. 7－9にスメアーなゼラチンのバンドが確認できた。Fr. 11、12にはtPA（68 kDa）のバンドが確認できた（図１０）。また、Fr. 7、8のタンパク濃度が顕著に高いことが示された（図１１Ａ）。Fr. 7、8、11、12は高いtPA活性を示した（図１１Ｂ）。大部分のZnは結合していない画分に含まれていたが、ゼラチンが多く含まれているFr. 7、8およびtPAが含まれているFr. 11、12にZnが比較的多く含まれていることがわかった（図１１Ｃ）。これらの結果から、Fr. 7、8はゼラチンとtPA、Znの複合体、Fr.9、10はゼラチンとZnの複合体、Fr. 11、12はtPAとZnの複合体を含むと示唆された。以上から、ZnはゼラチンやtPAと結合していることが確認できた。
　　ゼラチン-tPA-Zn複合体の細胞毒性試験 
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9, 20 mg）はtPA（1 mg）と1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。反応溶液に終濃度が5 mMとなるように、酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、さらに37℃で30分間振とうしながら反応させた。96穴プレートにL929細胞を5000 cells/well播種して10% FCS Eagle’s MEM（E-MEM）で24時間前培養し、培地交換後、各濃度のサンプル/PBS（pH 7.4）を添加した。なお、ここでの濃度は各サンプル中のゼラチンの濃度である。その後、48時間接触させ、培地交換後に2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium（WST-8、ナカライテスク）試薬を添加し、2時間後に上清の450 nmの吸光度をVERSAmax マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で測定した。データは、サンプルのかわりにPBSを添加したとき（Control）の細胞生存率を100％として計算した。
　＜結果＞　ゼラチン-tPA-Zn複合体を添加すると、ゼラチン濃度300μg/mlから細胞生存率が減少した（図１２）。少なくとも、ゼラチン濃度200μg/mlまでは細胞毒性は問題ないことが分かった。
　マウスを用いた血中安定性および体内動態の評価
　＜方法＞　Chloramine T法によってtPAを125Iラベルし、PD-10カラムを用いて125I-ラベル化 tPA を分取した。ゼラチン（MW105, PI=9, 20 mg）と125I-ラベル化 tPA（1 mg）とを1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間反応させた。次に、反応溶液に終濃度が5 mMとなるように、酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、37℃で30分間反応させた。この混合液をPBSで10000倍希釈して投与サンプルとした。ddYマウス（メス、6週齢）をジエチルエーテルで麻酔後、尾静脈からサンプル100 μlを投与した。1、15、30、60分後に眼窩採血を行い、放射活性をガンマーカウンター（ARC-301B, Aloka）で測定した。血中のtPA量はマウスの体重から換算し、投与したtPA量を100％としてtPA血中残存量を算出した。具体的には、体重の８％が血液量であると仮定し、投与するｔＰＡの放射活性を１００％として、それに対する血液中の割合を算出した。また、投与60分後に全血採取および臓器の摘出し、同様に放射活性を測定し、体内動態の評価を行った。
　＜結果＞　tPAの場合は、投与後1分でtPA量が約70％に低下し、その後、徐々に低下した（図１３Ａ）。一方、ゼラチン-tPA-Zn複合体は、各採血時間で血中tPA量が有意に高かった。この結果から、tPAは、ゼラチンおよびZnと結合することで、血中安定性が向上することがわかった。また、投与後60分後の体内動態の結果（図１３Ｂ）から、ゼラチン-tPA-Zn複合体およびtPAのいずれにおいても、tPAは血液中に最も多く含まれていることがわかった。
　大腿動脈血栓閉塞モデルウサギを用いた検討
　生体内での、ゼラチン-tPA-Zn複合体による血栓溶解効果を検討するため、モデルウサギを作製し、検討を行った。
　＜大腿動脈血栓閉塞モデルウサギの作製＞
　以下の手順により、大腿動脈血栓閉塞モデルウサギ（以下単にモデルウサギと表記する）を作製した。なお、ウサギは体重が2.5～3.0kgの雄性、日本白色ウサギをSLCより購入して使用した。
１）ウサギ耳静脈からペントバルビタール・ナトリウム（共立製薬：商品名ソムノペンチル）25mg/kgを10分間で静脈内投与することにより麻酔を行った。
２）右側頚部を切開後，右頚動脈を露出させ，4Frイントロデューサー・シース（株式会社グッドマン）を右頚動脈から下行大動脈まで挿入した。
３）同イントロデューサー・シースから2.5～3.0x8.0mmのPTCAバルーン（株式会社グッドマン）を右大腿動脈まで挿入した。
４）PTCAバルーンを8気圧で拡張し，右大腿動脈内皮を約1.5cmにわたり擦過傷害した。
５）バルーンおよびシースを抜去後，右頚部を閉創した。
６）4週間後、１）と同様に麻酔を行い、左側頚部を切開し、左頚動脈から下行大動脈に4Frイントロデューサー・シースを挿入した。
７）血管造影により右大腿動脈の狭窄病変が存在することを確認した。
８）右大腿動脈末梢部を不完全結紮により血流を低下させた後に、３）及び４）と同様にして右大腿動脈狭窄病変を擦過傷害し、同部に閉塞性血栓を惹起させた。
９）血管造影により右大腿動脈閉塞が生じたことを確認し、モデルウサギとした。
　＜モデルウサギを用いた血栓溶解実験＞
　上述のようにして作製したモデルウサギを用いて、以下の手順でゼラチン-tPA-Zn複合体による血栓溶解効果を検討した。
１）右大腿動脈血栓性閉塞惹起1時間後に血管造影を行い，右大腿動脈閉塞を再確認した。
２）耳静脈よりtPAを 27,500単位/kg（tPA単独群）、もしくはゼラチン-tPA-Zn複合体をtPA 27,500単位/kg（DDS単独群およびDDS+US群）となるよう静脈内投与した。なお、具体的には、tPA単独群にはtPAをPBSに溶解したものを投与した。また、DDS群には前述のようにして作製したゼラチン-tPA-Zn複合体溶液を投与した。
３）DDS+US群では，ゼラチン-tPA-Zn複合体溶液注入直後より右大腿動脈閉塞部近位部に経皮的超音波照射（1MHz, 0.8W/cm2）を開始した。
４）15分毎に血管造影を行い，血栓溶解状態を確認した。tPAもしくはDDS投与60分後の血管造影図を図１５に示す。
５）また，静脈内投与後の血中tPA活性評価のために、静脈内投与前、投与直後（超音波照射前）、15分後、30分後、45分後、および60分後に右大腿動脈血栓閉塞近位部より血液を採取した。また、DDS群では、ゼラチン-tPA-Zn複合体溶液注入直後又は注入４５分後より右大腿動脈閉塞部近位部に経皮的超音波照射（1MHz, 1.0W/cm2）を開始した。なお、血栓閉塞部位、超音波照射部位、及び採血部位の位置関係についての模式図を図１４に示す。
６）採取した血液中のtPA活性をクロモザイム法（下記）により測定した。なお、測定には、Chromozym t-PAキット　（Roche Applied Science：Cat. No. 11 093 037 001）を用いた。結果を図１６に示す。
　図１５に示されるように、ゼラチン-tPA-Zn複合体を投与した場合、超音波照射を行わない場合には血栓溶解効果が得られず、超音波照射を行って初めて血栓溶解効果が得られた。すなわち、ゼラチン-tPA-Zn複合体は、超音波照射を行った部位のみでtPA活性を発現させ血栓を溶解させることができることが確認できた。
　さらに、図１６に示されるように、DDS群では、投与直後には、tPA活性がtPA単独群の50%以下に抑制され、超音波照射により回復することが確認できた。
　〔クロモザイム法〕
各血液検体のtPA活性は、以下のようにして測定した。まず、採取した血液検体より血漿を分離した。そして、各血漿中のtPA活性をクロモザイムtPA（合成基質：Roche Applied Science：Cat. No. 11 093 037 001）法により測定した。具体的には以下の手順により行った。
１）各血漿検体を100mMトリス緩衝液（pH 8.5, 0.15% Tween 80含有）により20倍希釈した。
２）20倍希釈検体の10倍量の0.4mM クロモザイムtPA溶液（検体10μlに対し100μl）を混和し、30分間37℃の恒温槽で反応させた。 
３）30分間反応後、10%クエン酸溶液を検体量の50倍量（検体10μlに対し50μl）を加えて反応を停止させた。
４）405nmの波長で吸光度を測定し、濃度既知のtPA/PBSにより作製した検量線を用いて、各検体のtPA活性（濃度）を求めた。
　急性心筋梗塞モデルブタを用いた検討
　生体内での、ゼラチン-tPA-Zn複合体による血栓溶解効果を検討するため、さらにモデルブタを作製し、検討を行った。
　＜急性心筋梗塞モデルブタの作製＞
　以下の手順により、急性心筋梗塞モデルブタ（以下単にモデルブタと表記する）を作製した。
１）右大腿動脈より6Frイントロデューサー・シースを挿入した。
２）イントロデューサー・シースからガイディングカテーテルを挿入し、左冠動脈に留置した。
３）経カテーテル的に2.5x10mmカッティングバルーンを左回旋枝中間部まで挿入し、4～6気圧で拡張後、左回旋枝内皮を約2cmにわたり擦過傷害した。
４）バルーン抜去後、冠動脈末梢保護バルーン（パークサージ：Medtronic, Inc. Minneapolis, USA）を擦過傷害遠位部まで挿入した。同部で4mmまで拡張し、約30分間血流を低下させることにより血栓性閉塞を惹起した。
５）冠動脈造影により左回旋枝の閉塞を確認し、モデルブタとした。
　＜モデルブタを用いた血栓溶解実験＞
　上述のようにして作製したモデルブタを用いて、以下の手順でゼラチン-tPA-Zn複合体による血栓溶解効果を検討した。
１）左回旋枝血栓性閉塞惹起30分後に冠動脈造影を行い、左回旋枝閉塞を再確認した。
２）耳静脈よりtPA 55,000単位/kg（tPA単独群）もしくはゼラチン-tPA-Zn複合体をtPA 55,000単位/kg（DDS群）となるよう静脈内投与した。なお、具体的には、tPA単独群にはtPAをPBSに溶解したものを投与した。また、DDS群には前述のようにして作製したゼラチン-tPA-Zn複合体溶液を２倍希釈したものを投与した。
３）DDS群では、DDS溶液注入直後より前胸部より経胸壁的超音波照射（1MHz, 0.8W/cm2）を開始した。この際、ブタ心臓はウサギ心臓より大きいため、心臓全体への超音波照射を目的として、ウサギモデルで使用した超音波探触子4個組み合わせて超音波照射を行った。
４）15分毎に血管造影を行い，血栓溶解状態を確認した。
５）また、血中tPA活性評価のために、静脈内投与前、投与直後（超音波照射前）、15分後、30分後、45分後、および60分後に右大腿動脈より血液を採取した。
６）採取した血液中のtPA活性をクロモザイム法（下記）により測定した。結果を図１７（Ａ）に示す。また、４）で確認した血栓溶解状態の写真を図１７（Ｂ）に示す。
　図１７（Ｂ）に示すように、ゼラチン-tPA-Zn複合体溶液を投与して超音波を照射した群（ＤＤＳ群）では、血栓が溶解していた。また、図１７（Ａ）に示すように、ゼラチン-tPA-Zn複合体では超音波照射まではtPA活性が抑制されており、超音波照射によりtPA活性が回復した。
　＜カチオン化ゼラチンとPEG導入ゼラチンを用いたDDSの創製（第二形態複合体）＞
　カチオン化ゼラチンの作製とキャラクタリゼーション
ゼラチンのカルボキシ基をアミノ基に置換してカチオン化ゼラチンを作製し、その性質を検討した。以下に詳細を記載する。また、カチオン化ゼラチンの製造方法の概要を図１８に示す。
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9, 新田ゼラチン）5 gを含む100 mM リン酸緩衝液(PBS, pH 5.0)　250 mlに、様々な量のエチレンジアミン（和光純薬、ゼラチンのカルボキシル基に対するモル比率：0.5, 3, 10, 20, 30, 40, 50）を添加して、塩酸を用いて反応液のpHを5に調製した。その後、40℃で18時間攪拌しながら反応させ、ミリQ水で2日間透析を行った。透析液は凍結乾燥し、カチオン化ゼラチンを得た。
　カチオン化ゼラチンのアミノ基導入率は、2, 4, 6-トリニトロベンゼンスルホン酸 （TNBS）法で測定した。検量線にはβ-アラニンを用いた。カチオン化ゼラチンの分子サイズは、動的光散乱法（DLS）によってDLS-7000（大塚電子）を用いて37℃で測定した。表面電位は、電気泳動光散乱法（ELS）によってELS-7000AS（大塚電子）を用いて室温で測定した。
　＜結果＞　アミノ基導入率の増加に伴って、ゼラチンの分子サイズが増大する傾向が認められた（表２）。未処理のゼラチンの表面電位は-1.8 mV、カチオン化ゼラチンの表面電位は7.1～12.2 mVであり、アミノ基導入率の増加とともに上昇した。なお、以下各種カチオン化ゼラチンを表２に示すCodeで記載することがある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　カチオン化ゼラチンの細胞毒性試験
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9）、及び上述のようにして製造したカチオン化ゼラチン（E0.5－E30）について、細胞毒性試験（WST-8 assay）を行った。96穴プレートにL929細胞を5000 cells/well播種して10% FCS Eagle’s MEM（E-MEM）で24時間前培養し、培地交換後、サンプル/PBS（pH 7.4）（最終濃度0.75 mg/ml）を添加した。その後、48時間接触させ、培地交換後に2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2, 4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium（WST-8、ナカライテスク）試薬を添加し、2時間後に上清の450nmの吸光度をVERSAmax マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で測定した。データは、サンプルのかわりにPBSを添加したとき（Control）の細胞生存率を100％として算出した。
　＜結果＞　ゼラチンの細胞生存率は約90%、E0.5－E10（アミノ基導入率：4.8－36.6%）ではほとんど細胞毒性を示さなかった（図１９）。しかしながら、アミノ基導入率が46%以上のカチオン化ゼラチンでは若干細胞毒性があることがわかった。
　1.3. カチオン化ゼラチンとtPAの結合性
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9）およびカチオン化ゼラチン（E0.5、3、10、50）について、tPAとの結合性をQCM（水晶発振子マイクロバランス法）で解析した。具体的には次のように行った。センサーチップの金電極をピランハ（過酸化水素水:濃硫酸=1:3）で洗浄および乾燥した後、50 mg/mlのtPA/PBSを2 ml添加し、30分間乾燥させ、固相化した。
　このセンサーチップをAFFINIX Q （株式会社イニシアム）にセットし、電極をPBSに浸して30分間振動数を安定化させた。終濃度が0 ～ 4×10-7Mとなるように、ゼラチンまたはカチオン化ゼラチンを添加し、振動数の変化量を測定した。測定値を基に、解析ソフトAQUA（株式会社イニシアム）を用いて、解離定数（KD）と最大結合時の振動数変化（Bmax）を得た。
　＜結果＞　ゼラチンと比較すると、カチオン化ゼラチンの方KD値が小さくなり、tPAとの結合性が高まる傾向が認められた（表３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　カチオン化ゼラチンによるtPA活性抑制効果
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9）またはカチオン化ゼラチン（E0.5－E30）によるtPA活性抑制効果をフィブリンプレート法によって評価した。具体的には次のように行った。0.4% のヒト由来フィブリノーゲン（Sigma-Aldrich）/0.17 M ホウ酸バッファー（pH 7.8）10 mlをペトリディシュに入れ、50 U/ml のプラズミノーゲン（EMD Biosciences）0.2 ml を添加して攪拌した後、さらに100 U/ml のトロンビン（EMD Biosciences）を0.2 ml 添加し、よく攪拌して室温で30分静置することでフィブリンプレートを形成させた。ゼラチンまたはカチオン化ゼラチン（20 mg）は、tPA（クリアクター160万単位(IU)、エーザイ、1 mg）と2 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。フィブリンプレートに5倍希釈した混合溶液を2 ml添加し、37℃ で1時間静置したときのクリアゾーンの直径を測定し、面積を計算した。プラスミンを用いた検量線からフィブリン分解活性を計算した。データは、tPAのみの場合を100%として算出した。
　＜結果＞　カチオン化ゼラチンのアミノ基導入率の増大に伴い、tPA活性が抑制される傾向が認められた（図２０）。最も活性抑制効果が高かったのはアミノ基導入率36.6％のE10であった。アミノ基導入率36.6％以上で活性抑制効果が減少する傾向が認められた。
　カチオン化ゼラチン-tPA複合体の分子サイズおよび表面電位
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9）またはカチオン化ゼラチン（E0.5－E30）と、tPAとの混合体の分子サイズおよび表面電位を、DLSおよびELSで上記と同様に測定した。ゼラチンまたはカチオン化ゼラチン（20 mg）は、tPA（1 mg）と2 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。
　＜結果＞　表２に示したように、カチオン化ゼラチン単独の場合はアミノ基導入率の増加に伴って分子サイズが増大する傾向が認められた。一方、tPAとの混合体の場合は、アミノ基導入率36.6 %（E10）までは徐々に分子サイズが小さくなる傾向があり、アミノ基導入率が36.6%以上で増大した（図２１）。また、いずれのアミノ基導入率においても、カチオン化ゼラチン単独の場合と比較すると、tPAと混合することで分子サイズが小さくなった。
　また、ゼラチンのみの表面電位は-1.8 mV、カチオン化ゼラチンのみの表面電位は7.1～12.2 mVであったが、tPA（-9.7 mV）とコンプレックスを形成することにより、ゼラチンの表面電位は-3.0 mV、カチオン化ゼラチンの表面電位は2.7～5.4 mVに変化した。カチオン化ゼラチン単独の場合にはアミノ基導入率の増加に従って表面電位が上昇したが、tPAとコンプレックスを形成した場合には、アミノ基導入率36.6％以上で表面電位が下降する傾向が認められた。これらの傾向は上述のtPA活性抑制効果の結果と類似しており、コンプレックスの表面状態とtPA活性抑制効果との間に何らかの相関関係があることを示唆している。以下の実験では、細胞毒性がなく、tPA活性抑制効果の最も高かったE10（アミノ基導入率36.6%）を用いた。
　カチオン化ゼラチンE10とtPAの混合比の最適化
　＜方法＞　ゼラチン（MW105, PI=9）またはE10と、tPAとの混合比を変えてtPA活性抑制効果を評価した。ゼラチンまたはE10（10、20、40 mg）は、tPA（1 mg）と2 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。その後、上記と同様にtPA活性抑制効果をフィブリンプレート法によって評価した。
　＜結果＞　ゼラチンの場合は、いずれの混合重量比においても活性抑制効果が認められなかった（図２２）。E10：tPAが20:1のとき、活性抑制効果が最も高かった。E10：tPAが20:1のときと40:1のときとでは、有意差が認められなかった。したがって、E10：tPAが20:1の状態で十分結合していると考え、この混合比のサンプルを用いて、超音波照射によりtPA活性が回復するか評価した。
　E10-tPA複合体の活性に対する超音波照射の影響の検討
　＜方法＞　E 10（20 mg）とtPA（1 mg）とを2 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。この混合液に1 MHzで5分間超音波を照射し、上記同様にtPA活性をフィブリンプレート法によって評価した。
　＜結果＞　E10-tPA混合体に超音波を照射すると、活性がtPAのみと同程度まで回復することがわかった（図２３）。また、tPAのみに超音波照射を行った場合、超音波照射なしの場合と同様の活性を示し、超音波照射によるtPAの変性等の影響がないことを確認した。
　PEG化ゼラチンの作製とPEG導入率の検討
ゼラチンのアミノ基にＰＥＧを導入してＰＥＧ化ゼラチンを作製した。当該ＰＥＧ化ゼラチンの製造方法について記載する。また、製造方法の概要を図２４に示す。なお、ＰＥＧ化ゼラチンをPEGgelatin又はPEG導入ゼラチンと表記することがある。
　＜方法＞　PI=5のゼラチン（MW 3100, 10000）にPEG（MW 5000）の導入を行った。分子量3100のゼラチン1 mol当たりのアミノ基の量は0.87 molであるので、PEGの導入量を0.87 mol、0.5 mol、0.3 molとした。また、分子量10000のゼラチンについては、1 mol当たりのアミノ基の量は2.8 molであるので、PEGの導入量を2.8 mol、2 mol、1 molとした。1.0 x 10-5 molのゼラチンを10 gのdimethyl sulfoxide（DMSO) に室温で溶解させ、10 gのDMSOに溶解させた各濃度のsuccinimidyl succinate-methoxy PEG（MW 5000；SUNBRIGHT　ME-050CS：株式会社日本油脂（NOF CORPORATION））と室温で3時間攪拌しながら反応させた。その後、ミリQ水で2日間透析を行い、凍結乾燥し、PEG導入ゼラチン（PEGgelatin）を得た。PEGgelatinのPEG導入率はフルオレスカミン法とTNBS法で評価した。
　なお、フルオレスカミン法及びTNBS法の原理及び具体的な操作については下記の通りである。
　［フルオレスカミン法］
　〈原理〉フルオレスカミンがアミンと反応すると蛍光性の誘導体になるため、タンパク質やアミノ基の検出に用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　〈方法〉
　20 ig/mlのPEG導入ゼラチン水溶液125 μlをリン酸バッファー（pH 8）625 μlと混合し、0.3 mg/mlフルオレスカミン/1,4-ジオキ酸250 μlを添加して、2分間よく攪拌した。反応液を96穴プレートに200 mlずつ入れ、マイクロプレートリーダーを用いて励起波長390 nm、蛍光波長475 nmで蛍光を測定した。検量線にはβ-アラニンを用いた。
　［ＴＮＢＳ法］
　〈原理〉　2, 4, 6-トリニトロベンゼンスルホン酸 （TNBS）がアミンと反応するとオレンジ色の誘導体になるため、タンパク質やアミノ基の検出に用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　〈方法〉
　20 μg/mlのゼラチン（MW105, PI=9, 新田ゼラチン）、カチオン化ゼラチン、またはPEG導入ゼラチンのPBS（pH 7.4）溶液200 μlを、4 wt% NaHCO3200 μlおよび1 mg/ml TNBS水溶液200 μlと混合し、37℃で2時間静置した。反応液を96穴プレートに200 μlずつ入れ、マイクロプレートリーダーを用いて、415 nmの吸光度を測定した。検量線にはβ-アラニンを用いた。
　＜結果＞　各PEG導入ゼラチンのPEG導入率は図２５のようになり、フルオレスカミン法とTNBS法の両法で同様の結果を得た。いずれの分子量のゼラチンにおいても、PEGの使用量が少ない場合のPEG導入率が理論値よりも高かった。分子量3100のゼラチンの場合は、いずれの使用量でも同程度のPEG導入率であった。また、PEG導入ゼラチンとTNBSとの反応を中性の界面活性剤であるTriton（5%, 10%）存在下でも行ったが、同様の結果となった。PEG導入率が理論値よりも高かったのは、ＰＥＧ導入によってサンプルの測定溶液中の形態が変化し、これによって異なった値が出てしまったためと考えられた。本検討においては、フルオレスカミン法及びTNBS法の両法において同様のＰＥＧ導入率が算出される場合、その値をＰＥＧ導入率とした。
　なお、図２５において、ＰＥＧ導入ゼラチンの種類を「ゼラチン分子量－ＰＥＧ導入量（mol）」の表記で示した。例えば、3100－0.87は、分子量3100のゼラチン1molにPEG 0.87molの割合で導入したＰＥＧ導入ゼラチンを示す。以下この表記により各ＰＥＧ化ゼラチンを示すことがある。
　E10-tPAとPEG化ゼラチンによるtPA活性抑制効果
　＜方法＞　E 10（20 mg）とtPA（1 mg）とを1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。次に、PEG化ゼラチン（10000-2.8、10000-1、3100-0.87、または3100-0.3、5 mg）/PBS 0.5 mlを添加し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。上記と同様にtPA活性抑制効果をフィブリンプレート法によって評価した。
　＜結果＞　PEG化ゼラチンを添加すると、E10のみを用いた場合よりも、さらに10-20% tPA活性が抑制されることがわかった。PEG化ゼラチンの種類によって大きな差は認められなかったが、10000-2.8を用いた場合が最も抑制効果が高かった。
　そこで次に、10000-2.8の濃度を1 -10 mg（E10 : tPAの混合比20 mg : 1 mgに対して）としたときの活性抑制効果を同様にフィブリンプレート法で検討した。結果を図２６に示す。10000-2.8を5 mgとした場合が最も活性抑制効果が高く、tPAのみに対して55％の活性抑制率を示した。
　なお、「10000-2.8の濃度を1 -10 mg（E10 : tPAの混合比20 mg : 1 mgに対して）とした」とは、上記＜方法＞において5mg/PBS 0.5mlを用いたところを、1-10mg/ PBS 0.5ml用いるようにしたという意味である。
　E10-tPA-PEG導入ゼラチン混合体の分子サイズおよび表面電位
　＜方法＞　E 10（20 mg）とtPA（1 mg）とを1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。次に、PEG化ゼラチン（10000-2.8、5 mg）/PBS 0.5 mlを添加し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。E10-tPA-PEGgelatin混合体の分子サイズおよび表面電位をDLSおよびELSで上記と同様に測定した。
　＜結果＞　E10とtPAがコンプレックスを形成しているとき、192 nmの分子サイズとなった（表４）。PEG導入短鎖ゼラチン添加時の分子サイズは203 nmで、E10-tPAより若干大きくなることがわかった。また、E10とtPAがコンプレックスを形成することにより、表面電位が0に近づくことがわかった。さらにPEG導入短鎖ゼラチンが結合することで、表面電位がより0に近づくことが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　E10-tPA-PEG導入短鎖ゼラチン複合体の活性に対する超音波照射の影響
　＜方法＞　E 10（20 mg）とtPA（1 mg）とを1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。次に、PEG化ゼラチン（10000-2.8、5 mg）/PBS 0.5 mlを添加し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。この混合液に1 MHzで5分間超音波を照射し、上記と同様にtPA活性をフィブリンプレート法によって評価した。
　＜結果＞　E10-tPA-PEGgelatin複合体でのtPA活性（45%）は、超音波処理によってほぼ100％に回復した（図２７）。
　E10-tPA-PEG導入ゼラチン複合体の細胞毒性試験
　＜方法＞　E 10（20 mg）とtPA（1 mg）とを1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。次に、PEG導入ゼラチン（10000-2.8、5 mg）/PBS 0.5 mlを添加し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。当該反応液を各濃度に希釈して測定サンプルとした。L929細胞は96穴プレートに5000 cells/well、HUVECは10000 cells/well播種して10% FCS E-MEMで24時間前培養し、培地交換後、各濃度のサンプル/PBS（pH 7.4）を添加した。その後、48時間接触させ、培地交換後にWST-8を添加し、2時間後に上清の450 nmの吸光度をVERSAmax マイクロプレートリーダーで測定した。データは、サンプルのかわりにPBSを添加したとき（Control）の細胞生存率を100％として計算した。
　＜結果＞　
　L929細胞を用いた場合、E10単独およびE10-tPA-PEGgelatinで、0.5 mg/mlの濃度で約98%以上の細胞生存率を示したが、0.75 mg/ml以上の濃度では徐々に生存率が減少した（図２８Ａ）。E10が0.1 mg/mlまでの濃度では生存率が上昇した。一方、HUVECを用いた場合は、E10-tPA-PEGgelatinが2 mg/mlまで細胞毒性を示さなかった（図２８Ｂ）。
　E10-tPA-PEG導入短鎖ゼラチン混合体の血清中での安定性
　＜方法＞　E 10（20 mg）とtPA（1 mg）とを1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。次に、PEG導入ゼラチン（10000-2.8、5 mg）/PBS 0.5 mlを添加し、37℃で30分間振とうしながら反応させた。その後、マウスの血清（10%, 50%）中で90分間、37℃で静置した。さらに、超音波照射サンプルは、1 MHzで5分間超音波を照射した。上記と同様にtPA活性をフィブリンプレート法によって評価した。
　＜結果＞　結果を図２９に示す。tPAのみの場合、血清中でtPA活性が減少しており、超音波照射を行っても活性に変化はなかった。一方、E10-tPA-PEGgelatinの場合は、10％血清中で減少した活性が超音波照射によって回復したことから、10％の血清中でtPA保護作用を有することがわかった。50％血清中では、10％の血清中に比べて若干効果は低いながらも、同様にE10-tPA-PEGgelatinによる保護作用が認められた。
　マウスを用いた血中安定性および体内動態の評価
　＜方法＞　ペプチドや蛋白質をＲＩ標識する際に頻用されるChloramine T法（例えばJ Nucl Med 30:216-226,1989等を参照）によってtPAを125Iラベルし、PD-10カラムを用いて125I-ラベル化 t-PA を分取した。E 10（20 mg）と125I-ラベル化 t-PA（1 mg）とを1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間反応させた。次に、PEG導入ゼラチン（10000-2.8、5 mg）/PBS 0.5 mlを添加し、37℃で30分間反応させた。この混合液をPBSで10000倍希釈し、投与サンプルとした。ddYマウス（メス、6週齢）をジエチルエーテルで麻酔後、尾静脈からサンプル100 mlを投与した。1、15、30、60分後に眼窩採血を行い、放射活性をガンマーカウンター（ARC-301B, Aloka）で測定した。血中のtPA量は前述のようにマウスの体重から換算し、投与したtPA量を100％としてtPA血中残存量を計算した。また、投与60分後に全血採取および臓器の摘出し、同様に放射活性を測定し、体内動態の評価を行った。
　＜結果＞　結果を図３０に示す。E10-tPA-PEGgelatinの場合、血中の残存tPA量は直線的に減少した（図３０Ａ）。tPAの場合は、投与後1分でtPA量が約70％に低下し、その後、徐々に低下した。60分までの各採血時間において、E10-tPA-PEGgelatin およびE10-tPAの残存tPA量は、tPAのみの場合と比較して有意に高かった。これらの結果から、tPAはE10と結合して血中安定性を高め、さらにPEGgelatinが結合することで、より高い血中安定性を持つことがわかった。
　また、投与後60分後の体内動態の結果（図３０Ｂ）から、E10-tPA-PEGgelatin、E10-tPAおよびtPAのいずれにおいても、tPAは血液中に最も多く含まれていることがわかった。
　ゼラチン-tPA-Zn複合体の体内挙動の検討１
　ゼラチン-tPA-Zn複合体を投与した場合に、どのような挙動を示すのか、tPAをRI標識して当該RIを測定することにより検討した。具体的には、以下の手順により検討した。
　〔tPAの放射性ラベル化〕
　クロラミンT法により125Iラベル化したtPAの活性を、クロモザイム法により測定し，tPA活性が125Iラベル化により低下していないことを確認した。
tPA活性低下が無いことを確認後、上述の方法と同様にしてゼラチン-tPA-Zn複合体を調製した。すなわち、ゼラチン（MW105, PI=9, 20 mg）及びtPA（125Iラベル化済み、1 mg）を1.5 mlのPBS中で混合し、37℃で30分間振とうしながら反応させ、さらに当該反応溶液に終濃度が5 mMとなるように酢酸亜鉛0.5 mlを添加し、37℃で30分間振とうしながら反応させて検討用サンプルを調製した。
　〔マウス大腿動脈血栓閉塞モデル作成〕
　塩化鉄傷害によりマウス大腿動脈血栓閉塞モデルを作製した。この塩化鉄傷害により動脈血栓閉塞モデルを作製する方法はよく知られている。
具体的には、次のようにして作製した。まず、マウス両大腿部を切開後，両大腿動脈を剥離・露出させた。次に、１０％塩化第２鉄溶液を長さ1.0mm・幅5mmのフィルターペーパーに十分浸透させた。そして、露出させたマウス左大腿動脈の長さ5mmの部分を、塩化第２鉄を浸透させたフィルターペーパーで被覆し，5分後にペーパーを除去することにより左大腿動脈血栓性閉塞を惹起した。
　なお、当該操作を行うにあたり、マウスには麻酔を施した（ペントバルビタールナトリウム50mg/kgを腹腔内投与）。
　〔125Iラベル化tPAの血栓部位への集積率測定〕
　上記方法でマウスの左大腿動脈に血栓性閉塞を惹起した30分後に、125Iラベル化したtPA 27,500単位/kg（0.223mg/kg）又は125Iラベル化したtPA 27,500単位/kgを含有するゼラチン-tPA-Zn複合体を尾静脈より静脈内投与した。
当該投与10分後に、左右両大腿動脈の中枢部及び末梢部並びに側枝全てを結紮し、血管内部の血液を含めて採取し、左右両大腿動脈の放射能活性をガンマカウンターにより計測した。
　それぞれのマウス（すなわち、125Iラベル化したtPAを投与したマウス、及び125Iラベル化したtPAを含有するゼラチン-tPA-Zn複合体を投与したマウス）について、右大腿動脈（非血栓側、すなわち正常側）に対する左大腿動脈（血栓側）の放射能活性の比を算出した。そして、125Iラベル化tPA静脈内投与マウスと125Iラベル化tPA含有ゼラチン-tPA-Zn複合体静脈内投与マウス（それぞれn=7の平均）とで、放射能活性比を比較した。後者は前者に比べ、有意に比値が高かった。当該比較結果を図３１に示す。図３１中、**はP<0.01を示す。
　当該結果から、第一形態複合体は、血栓存在部位周辺へと集まる性質（すなわち、血栓への集積能）を有することが明らかになった。
　ゼラチン-tPA-Zn複合体の体内挙動の検討２
　ゼラチン-tPA-Zn複合体が、血栓への集積能を有する点について、さらに解析を進めた。
　96wellのプレートの各ウェルに抗vWF（von Willebrand Factor）抗体（抗ヒトvWF抗体：Dako）（1.0x10-12mol）、tPA（1.0x10-10mol）、ゼラチン（MW105, PI=9；以下当該ゼラチンをPI-9ゼラチンともいう）（1.0x10-10mol） 、又はゼラチン-tPA-Zn複合体（PI-9ゼラチンを1.0x10-10mol含有）をコーティングし（ｎ＝４）、その上にvWF10μg/mlを50μl（すなわちvWF 0.5μg）反応させ、さらにその後にHRP標識した抗vWF抗体（HRP標識抗ヒトvWF抗体：Dako）を結合させて、発色試薬o-フェニレンジアミン（OPD tablet：和光純薬）を用いて発色させた後に492nmの波長で吸光度を測定した。
　vWF抗体をプレートにコーティングした場合の吸光度を用いて検量線を作成し、tPA、PI-9ゼラチン、およびゼラチン-tPA-Zn複合体でコーティングした場合の吸光度を当該検量線に当てはめて、vWF結合量を算出した。そして、当該vWF結合量を、抗vWF抗体でコーティングした時の結合量（すなわち、0.5μg：用いたvWF全量が結合していると仮定）に対する比として算出した。言い換えれば、vWF結合性は、抗vWF抗体のvWFへの結合性を１とした場合の比として算出した。
　なお、当該検量線は、具体的には、vWF抗体をコーティングして、各濃度（0, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0μg/ml）のvWF溶液を50μl反応させ、吸光度を測定し、それぞれのvWF溶液の濃度と吸光度とを対比して、作成した。また、用いたvWFは、ヒト凍結血漿を原料として、まず４０％硫安分画を行い、その後フィブロネクチンアフィニティークロマトグラフィーでフィブロネクチンを除去し、その後さらにゲル濾過にてサイズカットをして精製して得たものである。
　PI-9ゼラチンをコーティングした場合には、吸光度から検量線を用いて算出したvWF濃度が12μg/mlであったため、vWF結合量を計算（50μl反応させているので、12μg/ml×50μl）すると、0.6μgであった。vWF抗体（1.0x10-12mol）でコーティングした場合のvWF結合量は上述のように0.5μgであり、PI-9ゼラチンのコーティングmol数（1.0x10-10mol）はvWF抗体の100倍であることから、PI-9に対するvWFの結合性は抗vWF抗体に比して0.6/0.5/100=0.012と算出された。ゼラチン-tPA-Zn複合体コーティングの場合も同様に計算したところ、ゼラチン-tPA-Zn複合体に対するvWFの結合性は抗vWF抗体に比して0.0104と算出された。一方、tPAコーティングの場合はvWFは全く結合しなかった（tPAに対するvWFの結合性は、抗vWF抗体に比して０であった）。結果を図３２に示す。なお、図３２では、ゼラチン-tPA-Zn複合体は「ＤＤＳ」と標記される。
　von Willebrand factorは、血栓の構成成分の一つであることが知られている。また、本実験結果から、本実験に用いたゼラチンがvon Willebrand factorへの結合能を有すること、及び、ゼラチン-tPA-Zn複合体もゼラチンと同等のvon Willebrand factorへの結合能を有すること、が確認された。
　以上のことから、第一形態複合体は、血栓に存在するvon Willebrand factorへの結合性を有しており、このために、経血管投与されると血栓存在部位周辺へと集まる性質（血栓への集積能）を有する可能性が示唆された。

Claims (15)

  1. ゼラチン、血栓溶解酵素、及び金属イオンを含んでなる複合体。
  2. 血栓溶解酵素が、組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA）である、請求項１に記載の複合体。
  3. 金属イオンが、亜鉛イオン、マグネシウムイオン、及びカルシウムイオンからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の複合体。
  4. ゼラチンが、等電点が８～１０のゼラチンである、請求項１～３のいずれかに記載の複合体。
  5. ゼラチンが、重量平均分子量１００００～２０００００のゼラチンである、請求項１～４のいずれかに記載の複合体。
  6. 粒子径が５０～２５０ｎｍである、請求項１～５のいずれかに記載の複合体。
  7. 血栓への集積能を有する、請求項１～６のいずれかに記載の複合体。
  8. 急性心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓塞栓症、急性下肢動脈閉塞、及び人工血液透析の動静脈者シャント閉塞からなる群より選択される少なくとも１種の血栓性血管閉塞疾患の治療用の請求項１～７のいずれかに記載の複合体。
  9. 請求項１～８のいずれかに記載の複合体を含む液状組成物。
  10. 急性心筋梗塞、脳梗塞、肺血栓塞栓症、急性下肢動脈閉塞、及び人工血液透析の動静脈者シャント閉塞からなる群より選択される少なくとも１種の血栓性血管閉塞疾患の治療用である、請求項９に記載の液状組成物。
  11. （i）ゼラチンと血栓溶解酵素を液中で混合する工程、及び、（ii）金属塩又は金属塩溶液を（i）で得た混合溶液と混ぜる工程、を含む、請求項１～８のいずれかに記載の複合体の製造方法。
  12. ゼラチンと血栓溶解酵素の混合割合が、血栓溶解酵素１モルに対して、ゼラチン０．１～５０モル程度である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 金属イオンと血栓溶解酵素との混合割合が、血栓溶解酵素１モルに対して、金属イオン１０～１０００モル程度である、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
  14. 請求項１～８のいずれかに記載の複合体を、対象に経血管投与する工程、及び、血栓が存在する患部に対してのみ超音波を照射する工程、を含む、血栓性血管閉塞疾患治療方法。
  15. 請求項１～８のいずれかに記載の複合体と、当該複合体に対して超音波を照射する手段を備えた装置からなる、血栓治療システム。
     
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