ES2274044T3 - Eliminacion de plasmina (plasminogeno) de soluciones de proteinas. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento in vitro para eliminar o aislar específicamente plasminógeno o plasmina en presencia de fibrinógeno a partir de una mezcla que contiene plasminógeno o plasmina poniendo en contacto la mezcla con un aminoácido rígido en el que el grupo amino del aminoácido y el grupo carboxílico del aminoácido están separados 6-8 Angstroms, preferiblemente aproximadamente 7 Angstroms y el aminoácido rígido está covalentemente unido a un soporte por medio del grupo amino del aminoácido.
Description
Eliminación de plasmina (plasminógeno) de
soluciones de proteínas.
La presente invención se refiere a una resina y
un procedimiento in vitro para la eliminación específica de
plasmina o plasminógeno y sus derivados a partir de disoluciones de
proteína, en el que la disolución de proteína resultante se puede
usar para administración intravenosa y para aplicaciones locales, es
decir, soporte de matriz para liberación sostenida y curación de
heridas, bien como un componente activo único o bien como un
componente activo combinado con otros fármacos aceptables,
farmacéuticos. La eliminación de plasmina o plasminógeno
preservaría la integridad de la función de la disolución de
proteínas para periodos de incubación más largos. Esta invención se
refiere también a la producción de plasmina/plasminógeno altamente
purificada/o para uso terapéutico.
El plasminógeno o su molécula activa plasmina
(de ahora en adelante plasmina/plasminógeno), contaminan muy
profundamente disoluciones de proteínas, especialmente aquellas
extraídas a partir de fluidos animales u órganos animales. La
presencia de plasmina/plasminógeno en una disolución de proteína
presenta una amenaza múltiple para su aceptación como un producto
farmacéutico estable, debido a la actividad proteolítica conocida de
la molécula en diversas proteínas y péptidos en enlaces peptídicos
arginil y lisil (Weinstein M.J., Doolittle R.F. Differential
Specificities of the thrombina, plasmin and trypsin with regard to
synthetic and natural substrates and inhibitors RF Biochim Biopliys
Acta. 1972 258-577-90 y Ling
C.M., Summaria L., Robbins KC. Mechanism of formation
plasmin(ogen) activator for human plasmin. J Biol. Chem.
1965. 240: 4212-B); y aminoácidos básicos, su
actividad estimuladora en varios tejidos, especialmente el tejido
nervioso central y su papel en unión (Chen ZL, Stricland S
Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmin catalyced
degradation of liminin. Cell. 1997. 91: 917-25)
y probablemente transporte de priones en la sangre de mamíferos
Fisher (MB, Roeckl C., Parizek P, Schwarz HP. Aguzzi A Binding of
disease associated prion protein to plasmin(ogen).
Nature, 2000, 408: 479-83).
Se desarrollaron varios procedimientos
cromatográficos para la purificación de plasmina/plasminógeno a
partir de disoluciones de proteínas y así, eliminar
plasmina/plasminógeno de la disolución de proteínas.
Estos procedimientos se basan esencialmente en
dos principios. El primer grupo se basa en varias etapas de
purificación consecutivas que utilizan la solubilidad diferencial,
el punto isoeléctrico, o la distribución de tamaños moleculares
Alkjaerisig N. (The purification and properties of human
plasmin(ogen). Biochem. J. 1963, 93:
171-182). Dado que su objetivo principal fue
purificar plasmina/plasminógeno, estos procedimientos distorsionaron
totalmente la composición de la disolución de proteínas. El segundo
grupo de experimentos está basado en una purificación de afinidad
de una etapa. La purificación se basa en unión de
plasmina/plasminógeno a diversos ligandos ácidos
\omega-amino-carboxílicos
sintéticos que pueden unirse en los sitios de unión a lisina en la
cadena pesada de la/del plasmina/plasminógeno. Estos sitios,
consisten en 5 puentes disulfuro de triple lazo con homología de
secuencia interna conocida como los dominios proteicos de triple
lazo unidos por puentes disulfuro de plasmina/plasminógeno,
localizados en la cadena pesada de plasmina/plasminógeno en el
extremo NH_{2} y lejos del sitio catalítico situado en la cadena
ligera en el extremo COOH, unen fibrina/fibrinógeno. Otra
posibilidad para cromatografía de afinidad es unir
plasmina/plasminógeno por medio del sitio catalítico, una unión
potencialmente menos específica dado que puede unir muchas proteínas
tales como serina proteasas que tienen afinidad igual o inferior a
enlaces peptídicos arginil y lisil y aminoácidos básicos. En
resumen, se pudo concluir que en general, la cromatografía de
afinidad de plasmina/plasminógeno se lleva a cabo mediante un
ligando dado que se parece químicamente e iónicamente a ácido
\omega-amino-carboxílico o al
sustrato del sitio catalítico de plasmina. El ligando se une a la
resina a través de un separador o engarce adecuado. Sin embargo una
resina de afinidad ideal para la eliminación de
plasmina/plasminógeno no es esencialmente la misma resina hallada
ideal para la purificación de plasmina/plasminógeno. Tales resinas
contendrían un ligando que uniría plasmina/plasminógeno a alta
afinidad y tendría afinidad muy baja por otras proteínas tales como
otras serina proteasas y especialmente afinidad muy baja por
fibrinógeno la cual es la proteína principal en la fracción de
plasma de Cohn o en crioprecipitado. También es importante que la
eliminación de plasmina/plasminógeno usando la cromatografía de
afinidad dada se pueda llevar a cabo en un amplio intervalo de
tampones y no restringirse a un cierto tampón que puede poner en
peligro la estabilidad y la integridad de proteínas en la
disolución, siendo aquellas una preocupación principal y no la/el
plasmina/plasminógeno.
La potencia antifibrinolítica (capacidad para
inhibir la unión de plasmina/plasminógeno a fibrinógeno con
afinidad alta) de los ácidos
\omega-amino-carboxílicos depende
de la presencia de grupo amino y carboxílico libre y de la
distancia entre el grupo COOH y los átomos de carbono a los cuales
se une el grupo NH_{2} (Markwardt 1978) tales como ácido
\varepsilon-aminocaproico (EACA), y
p-aminobenzamidina (PAMBA). La comparación entre
las actividades antifibrinolíticas de EACA y PAMBA mostró que la
última es aproximadamente tres veces más activa. Shimura y col.
(1984) diseñaron una resina en la cual
p-aminobenzamidina se unió a micropartículas de
polímero de vinilo hidrófilo por medio de un resto separador
(engarce). Usando esta resina, Shimura y col. fueron capaces de
separar plasmina y plasmina/plasminógeno mediante cromatografía de
afinidad de alta resolución. Los hechos de que
plasmina/plasminógeno no se pudiera eluir mediante ácido
6-aminohexanoico solo y que urea 3 M tuvo que
incluirse en el tampón de elución indicaron una interacción de dos
sitios de plasmina con su ligando inmovilizado es decir, los sitios
de unión a lisina en la cadena pesada y el sitio catalítico en la
cadena ligera. Esto puede explicar el hallazgo por otros
investigadores de que p-aminobenzamidina elimina también
algunas otras
proteínas.
proteínas.
Otra resina, la lisina-resina,
se elabora y usa para la purificación por afinidad de
plasmina/plasminógeno. Sin embargo, la potencia antifibrinolítica
de lisina es muy baja y así, también su afinidad de unión. Se une
también a otras proteínas y su especificidad es dependiente de
tampón.
Moroz L.A. Gilmore NJ Fibrinolysis in normal
plasma and blood: evidence for significant mechanisms independent of
the plasminogen-plasmin system, Blood, 1976, 48,
531-45 describe una preparación de plasma libre de
plasmina/plasminógeno mediante cromatografía de afinidad. En base a
los procedimientos empleados los autores comunican acerca de
observaciones que indican que los procedimientos los cuales culminan
en la generación de la enzima fibrinolítica plasmina juegan al menos
un papel menor en la actividad fibrinolítica espontánea o basal
medible en plasma humano normal. El ácido tranexámico se usó
conjuntamente con otros inhibidores de proteasa como inhibidores de
plasmina para medir actividad fibrinolítica. Para preparación del
plasma libre de plasmina/plasminógeno se empleó el procedimiento de
Deutsch y Meltz, Science 170; 1095-1096,
1997.
Iwamoto en Thrombos. Diathes. Heamorrh.
(Stuttg.), 1975, 33, 573 describe unión específica de un ácido
tranexámico a plasmina. Aunque ácido tranexámico se identifica como
un ligando poderoso de plasmina, se indica que el efecto
antifibrinolítico de ácido tranexámico es un resultado no sólo de la
unión a plasmina/plasminógeno, sino también de la potenciación de
cooperación de las antiplasminas naturales. Por lo tanto alguien
concluiría que la unión de ácido tranexámico a un soporte sólido no
sólo eliminará plasmina/plasminógeno de plasma sino también las
antiplasminas naturales. Alguien sugeriría también que la unión de
ácido tranexámico a un soporte sólido puede ser causa de formación
de agregados (conglomerados) con inhibidores de plasmina. Esta
comprensión se basa en la discrepancia, la cual se puede encontrar
cuando comparar la actividad antifibrinolítica del ácido
\varepsilon-aminocaproico y del ácido tranexámico
da como resultado el 98 y el 91% de inhibición en plasma estimulado
por uroquinasa frente a plasma que ha sido sangre oral heparinizada
(65 y 39% para ácido \varepsilon-aminocaproico y
ácido tranexámico, respectivamente -cf. Tablas 2 y 7 en la
publicación de Moroz y col.). Alguien esperaría que debido a su
alta razón de unión el ácido tranexámico y el ácido
\varepsilon-aminocaproico serían buenos
candidatos para ligandos de alta afinidad. Sin embargo, alguien
esperaría también que estos ligandos bloquearían una columna de
afinidad como una unión resultado de complejos de plasmina e
inhibidor de plasmina.
La figura 1 muestra un gel de gradiente
SDS-PAGE (5-12% de poliacrilamida)
de 7 \mug de proteínas eluidas mediante los dos procedimientos
(descritos en el material y procedimiento) con tres resinas
diferentes -TEA-Sefarosa,
Lys-Ceramic Hyper DF y Lys-Sefarosa
4B. Carriles 1- Glu plasminógeno; 2- fibrinógeno; 3- albúmina; 4-
inmunoglobulina G; 5- marcador de peso molecular; picos de elución
de: 6- TEA usando procedimiento; 7- TAE usando procedimiento 2; 8-
lisina Ceramic Hyper DF mediante procedimiento 1; 9-
lisina-sefarosa mediante procedimiento 1; 10- lisina
Ceramic Hyper DF mediante procedimiento 1; 11-
lisina-sefarosa mediante procedimiento 1.
La presente invención se basa en el resultado de
que un aminoácido rígido se encontró sorprendentemente que era
capaz de unir específicamente plasmina/plasminógeno. "Unir
específicamente" en el contexto de la descripción de la
invención significa que fuera de una mezcla que contiene proteínas,
tales como plasmina/plasminógeno y fibrinógeno, se retira
sustancialmente la/el plasmina/plasminógeno mientras que el
fibrinógeno se mantiene casi sin afectar en la mezcla.
Preferiblemente al menos del 85 al 99% de la/del
plasmina/plasminógeno se elimina y al menos el 85% del fibrinógeno
permanece en la mezcla. Más preferiblemente plasmina/plasminógeno se
elimina al menos del 98,0% al 99,9% o el fibrinógeno permanece del
95% al 99%.
El grupo amino del aminoácido y el grupo
carboxílico del aminoácido están separados 6-8
Angstroms, preferiblemente aproximadamente 7 Angstroms y el
aminoácido rígido está unido covalentemente a un soporte por medio
del grupo amino del aminoácido. Se prefieren en particular ácido
tranexámico en su configuración trans y ácido
4-aminometilbiciclo-[2.2.2.]-octano-1-carboxílico
(EMBOCA).
Se encontró sorprendentemente que en el primer
lugar el ácido \varepsilon-aminocaproico no
trabaja como ácido tranexámico y que una vez que el ácido
tranexámico se une a una superficie sólida pierde toda su capacidad
de unión a plasmina/plasminógeno extra (llamada cooperación) y la
resina elimina sólo plasmina/plasminógeno de plasma o productos de
plasma. Si el ácido \varepsilon-aminocaproico se
ancla a la columna su actividad plasminógeno extra permanece aún y
une aún fibrinógeno y otras proteínas de plasma mientras que la
actividad de plasmina/plasminógeno extra de ácido tranexámico de
acuerdo con la invención está totalmente abolida. Sin embargo, la
afinidad de la resina de ácido tranexámico a la/el
plasmina/plasminógeno no está afectada.
El aminoácido rígido se ancla a un separador
apropiado, en particular más largo de 3 átomos de carbono, y el
soporte y el material de afinidad puede reducir
plasmina/plasminógeno de una mezcla que contiene proteínas sin que
alterar adicionalmente la composición de la disolución de proteínas.
La eliminación se puede hacer en presencia de diversos tampones. El
procedimiento de la invención también es adecuado para fabricar
fracciones puras de elución de plasmina/plasminógeno del soporte de
afinidad.
La invención pertenece a un procedimiento para
eliminar o aislar específicamente plasmina/plasminógeno en
presencia de fibrinógeno a partir de una mezcla que contiene
plasmina/plasminógeno poniendo en contacto la mezcla con un
aminoácido rígido en el que el grupo amino del aminoácido y el grupo
carboxílico del aminoácido están separados 6-8
Angstroms, preferiblemente aproximadamente 7 Angstroms y el
aminoácido rígido está covalentemente unido al soporte por medio
del grupo amino del aminoácido.
Preferiblemente, en el procedimiento de acuerdo
con la invención la mezcla se selecciona del grupo que consta de
fluidos corporales tales como sangre; fracciones de sangre,
crioprecipitado, cultivos celulares, extractos de tejidos animales,
tales como pulmones bovinos, intestinos bovinos o gelatina de
extractos óseos animales, seroalbúmina bovina así como grasas
inmiscibles en agua derivadas de animales, tales como lanolina
(PC-fosfatidilcolina).
El procedimiento de la invención se puede usar
para obtener plasmina/plasminógeno a partir de las mezclas
respectivas. Después de poner en contacto la mezcla con por ejemplo
un material cromatográfico que tiene unido el aminoácido rígido, el
plasminógeno se pude eluir a partir del material de afinidad sólido.
Los, conocidos como tales, principios de extracción en fase sólida
se puede aplicar aquí también. La/el plasmina/plasminógeno se puede
eluir mediante una disolución que contiene un ligando, el cual
compite con los sitios de unión del aminoácido rígido, por ejemplo
ácido tranexámico, en la proteína de plasmina/plasminógeno. Tales
ligandos son típicamente \varepsilon-aminoácidos,
preferiblemente lisina. Por ejemplo, lisina se puede emplear en
concentraciones del 85% en peso al 99% en peso. También es posible
otra concentración, especialmente cuando la fuerza iónica del medio
de elución se equilibra mediante otros ingredientes por ejemplo
electrolitos.
La/el plasmina/plasminógeno que eluye de la fase
sólida se puede hacer libre del tampón de elución mediante un
procedimiento, el cual extrae los componentes de tampón por ejemplo
diálisis. La/el plasmina/plasminógeno obtenible de acuerdo con el
procedimiento de la invención se caracteriza por pureza muy alta. La
propiedad singular viene a ser evidente a partir de los datos:
Como se puede ver a partir de la tabla sumaria,
cuando las resinas comercialmente disponibles con ligandos
inmovilizados por lisina y la resina TEA se usaron bajo condiciones
cromatográficas optimizadas, la recuperación y actividad específica
de la/del plasmina/plasminógeno fue mayor con la resina TEA (tabla
sumaria 1). Es también digno de atención que la resina TEA es mucho
más eficiente en eliminar plasmina/plasminógeno (como se indica por
la prueba para Glu-plasmina/plasminógeno) del plasma
crio-reducido, que la resina de lisina (tabla
sumaria 2).
La pureza de los eluidos se valoró mediante
electroforesis de gel SDS. Los eluidos de las tres resinas
diferentes (TEA-Sefarosa,
Lys-Ceramic Hyper DF y Lys-Sefarosa
4B) se sometieron a SDS-PAGE cargando un gradiente
al 5-12% de acrilamida y cargando 7 \mug de
proteína por carril. El gel resultante teñido con Azul de Coomassie
se muestra en figura 1.
La figura 1 muestra un gel de gradiente
SDS-PAGE (5-12% de poliacrilamida)
de 7 \mug de proteínas eluidas mediante los dos procedimientos
(descritos en el material y procedimiento) con tres resinas
diferentes -TEA-Sefarosa,
Lys-Ceramic Hyper DF y Lys-Sefarosa
4B. Carriles 1- Glu plasminógeno; 2- fibrinógeno; 3- albúmina; 4-
inmunoglobulina G; 5- marcador de peso molecular; picos de elución
de: 6- TEA usando procedimiento; 7- TAE usando procedimiento 2; 8-
Lisina Ceramic Hyper DF mediante procedimiento 1; 9-
lisina-sefarosa mediante procedimiento 1; 10- Lisina
Ceramic Hyper DF mediante procedimiento 1; 11-
lisina-sefarosa mediante procedimiento 1.
Las bandas de proteína resultantes y la pureza
del producto correlacionan bien con la actividad específica de
plasmina/plasminógeno como se indica en la tabla sumaria 1. Esto
indica que el uso de la resina TEA-Sefarosa dio
como resultado una/un plasmina/plasminógeno altamente purificado con
sólo contaminación menor con albúmina. Parece que no se necesita
purificación adicional para usar este producto para las indicaciones
clínicas.
El sujeto de la presente invención es también un
soporte que tiene unido covalentemente un aminoácido rígido en el
que el grupo amino del aminoácido y el grupo carboxílico del
aminoácido están separados 6-8 Angstroms,
preferiblemente aproximadamente 7 Angstroms.
El soporte para llevar a cabo el procedimiento
de la invención es preferiblemente un material cromatográfico el
cual es capaz de unir un aminoácido rígido en el que el grupo amino
del aminoácido y el grupo carboxílico del aminoácido están
separados 6-8 Angstroms, preferiblemente
aproximadamente 7 Angstroms. La distancia entre el grupo amino y el
grupo carboxílico se mantiene sustancialmente constante mediante la
constitución rígida del aminoácido. La rigidez del aminoácido se
puede generar mediante anillos alicíclicos, preferiblemente mediante
un anillo ciclohexano, en el que el grupo amino y el grupo
carboxilo están dispuestos en posición 1,4 del anillo alicíclico.
También están dentro del alcance de la invención sistemas
aromáticos, por ejemplo ácidos benzoicos sustituidos o ácido
acético sustituido con anilina.
De acuerdo con la invención el soporte
preferiblemente ha unido aminoácidos seleccionados del grupo
constituido por ácido tranexámico y EMBOCA.
El material cromatográfico a emplearse de
acuerdo con el procedimiento de la invención es por ejemplo un
material hidrófilo tal como agarosa, celulosa, vidrio de poro
controlado, geles de sílice, dextranos o un polímero artificial
orgánico tal como basado en poliestirenos de poliacrilamidas. Los
materiales típicos están comercialmente disponibles bajo los
nombres comerciales Sephacryl® (Pharmacia, Suecia), Ultragel®
(Biosepara, Francia), TSK-Gel Toyopearl® (Toso
Corp., Japan), HEMA (Alltech Ass.) (Deerfield II, EE.UU.), Eupergit®
(Rohm Pharma, Darmstad, Alemania). También se puede usar materiales
basados en azlactonas (3M, St. Paul, Minn., EE.UU.). Se prefieren
particularmente Agarosa® o Sefarosa®. Estos materiales están
comercialmente disponibles por ejemplo a partir de Sigma, San
Luís.
\global\parskip0.950000\baselineskip
En una realización preferida, el procedimiento
de acuerdo con la invención se lleva a cabo empleando un material
cromatográfico particulado o un material de bloque monolítico. El
material particulado se puede suspender en un medio apropiado y la
suspensión resultante se puede usar por ejemplo en una columna
cromatográfica. Sin embargo, el procedimiento de la invención se
puede llevar a cabo en una tanda. Adicionalmente, los polímeros se
pueden usar como material particulado o también en forma de
membranas.
El ácido tranexámico está unido al soporte
preferiblemente por medio de un engarce, en particular un engarce
bifuncional, entre el soporte y el ácido tranexámico. Si se usa un
engarce bifuncional, se puede seleccionar del grupo constituido por
N-hidroxisuccinimida, DAPA, CNBr, epoxi,
diaminopropilamina (DADPA), 1,6-diaminohexano,
ácido succínico,
1,3-diamino-2-propanol,
etilendiamina (EDA), TNB, piridildisulfuro, yodoacetamida, soporte
activado de maleimida o combinaciones de los mismos.
El soporte para llevar a cabo el procedimiento
de la invención se modifica preferiblemente por un resto el cual
reacciona con grupos amino primarios o secundarios.
De acuerdo con el procedimiento de la invención
la mezcla se incuba con el soporte durante un periodo de tiempo
suficiente, y eluye con una disolución acuosa neutral que contiene
sales de sodio, sales de calcio, tampones salinos después de poner
en contacto la mezcla con el soporte que tiene unido ácido
tranexámico. Subsiguientemente, la plasmina o plasminógeno se puede
eluir con una disolución acuosa que contiene una cantidad suficiente
de lisina o un equivalente el cual compite con el ácido tranexámico
covalentemente unido.
La invención se refiere a una mezcla derivada de
fuentes naturales que está sustancialmente libre de
plasmina/plasminógeno y plasmina.
En particular, la mezcla es sangre, un derivado
de sangre o fracción se sangre, crioprecipitado.
Un derivado de sangre es en particular un factor
de coagulación de sangre derivado o una mezcla de factores de
coagulación de sangre, tales como FVIII, FIX, fibrinógeno,
fibronectina, \alpha_{1}-antitripsina,
antitrombina III, factor de von Willebrand, albúmina,
inmunoglobulina.
Adicionalmente, un soporte que tiene ácido
tranexámico covalentemente unido está sometido también a la presente
invención. El soporte de la invención es preferiblemente un
material cromatográfico, más preferiblemente un material
cromatográfico hidrófilo tal como dextranos o un polímero artificial
orgánico tal como se menciona anteriormente. Un soporte muy
preferido es Agarosa® o Sefarosa® al cual se une ácido
tranexámico.
El material cromatográfico el cual forma el
soporte puede ser un material particulado o un material de bloque
monolítico. El último se describe en Hermanson y col., incorporados
mediante referencia (Hermanson GT, Mallia AK y Smith PK 1992
"Inmobilization Affinity Ligand Techniques" página 454
Academic Press Inc. San Diego, EE.UU.).
En otra realización preferida de la invención el
ácido tranexámico se une al soporte por medio de un engarce entre
el soporte y el ácido tranexámico. Esto es ventajoso cuando el
soporte no tiene grupos funcionales que sean capaces de unir
covalentemente ácido tranexámico. Después el soporte se hace
funcional primero y después se hace reaccionar con un engarce el
cual es capaz de unir ácido tranexámico. Los brazos separadores o
correas separadoras son moléculas de bajo peso molecular que se
usan como engarces intermedios entre un soporte o matriz y ligando
de afinidad el cual está de acuerdo con la invención teniendo el
aminoácido una estructura rígida y el grupo amino
6-7 Angstrom separado del grupo carbonilo.
Preferiblemente, los separadores comprenden dos grupos funcionales
en ambos extremos para acoplamiento fácil a ligando y soporte. El
separador es típicamente un compuesto hidrocarburo que tiene dos
grupos funcionales en sus extremos. Uno de los dos extremos se ancla
covalentemente a la matriz usando reacciones convencionales o
conocidas per se. El segundo extremo está covalentemente
unido al ligando usando otro procedimiento de acoplamiento.
Preferiblemente, el ligando es un ligando
bifuncional tal como N-hidroxisuccinimida, DAPA,
CNBr, epoxi, diaminopropilamina (DADPA),
1,6-diaminohexano, ácido succínico,
1,3-diamino-2-propanol,
etilendiamina (EDA), TNB, piridildisulfuro, yodoacetamida, soporte
activado de maleimida o combinaciones de los mismos.
Dado que muchos soportes funcionalizados están
disponibles comercialmente, puede ser ventajoso empezar con un
soporte el cual está modificado por un resto el cual reacciona con
grupos amino primarios o secundarios.
El procedimiento de la invención se describe
adicionalmente en mayor detalle usando como ejemplo la preparación
de un crioprecipitado libre de plasmina/plasminógeno el cual puede
ser el material de partida para numerosos productos derivados de la
sangre.
El crioprecipitado se somete a cromatografía de
afinidad con un ligando inmovilizado para dar una fracción
adsorbida y una fracción no adsorbida. La sustancia, la cual se
puede eluir a partir de la fracción adsorbida, es
plasmina/plasminógeno.
El ligando inmovilizado puede ser cualquier
análogo, el cual puede interaccionar con los sitios de unión a
lisina de plasmina/plasminógeno. El procedimiento de preparación de
ligandos inmovilizados que se usan de acuerdo con la invención se
describe más adelante. Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero
no limitativos.
Ejemplo
1
Una serie de ligandos de ácido
\varepsilon-aminocarboxílico en combinación con
diversos separadores en varias resinas se pueden bien producir o
bien comprar (si están comercialmente disponibles) para evaluar la
eliminación de plasmina/plasminógeno a partir de disoluciones
derivadas de plasma. La siguiente tabla resume todas las
combinaciones estudiadas (los números debajo de las resinas se
refieren a la sección donde se describe la síntesis para cada
combinación más adelante):
El siguiente procedimiento se usó para la
inmovilización de diaminodipropilamina (DADPA) en 4% de agarosa
(Pierce), la reacción tuvo lugar en un gel separador que detiene
amina que se modifica después con un anhídrido.
Se lavaron 25 ml de gel
DADPA-Agarosa con agua purificada, y después el gel
se suspendió en un volumen igual de agua purificada. La mezcla en
suspensión se agitó lentamente durante 1 hora a temperatura
ambiente, mientras que se le añaden 2,5 g de anhídrido succínico.
Al final de la agitación, el gel succinilado se lavó secuencialmente
con agua purificada, NaCl 1 M y de nuevo con agua purificada
eliminando el exceso de ácido succínico no reaccionado.
Una prueba negativa con TNBS (Sigma) indicó que
todas las aminas de DADPA se bloquearon exitosamente con ácido
succínico.
El DADPA succinilado inmovilizado se lavó con
250 ml de agua purificada, después el exceso de agua se succionó
seco hasta una torta húmeda y se transfirió a un vaso de
precipitados de 500 ml. El gel se resuspendió en 25 ml, tampón MES
0,1 M, pH 4,7 y se agitó lentamente mientras que se añadieron 0,25 g
de p-aminobenzamidina (Sigma) y 0,75 g de EDC
(Pierce). El pH de la mezcla de reacción se mantuvo a 4,7 durante 1
hora añadiendo continuamente NaOH 0,5 M. La mezcla de reacción se
dejó reposar después durante toda una noche a temperatura ambiente
bajo mezclado lento continuo.
El gel se lavó sucesivamente con 0,5 ml de cada
uno de los siguientes: agua purificada, acetato de sodio 0,1 M, pH
4,7, bicarbonato de sodio 0,5 M y agua purificada.
Se almacenó p-aminobenzamidina
inmovilizada hasta usar en azida de sodio al 0,02% a 4ºC.
3) Arginina-4% de
agarosa
La síntesis de arginina-4% de
agarosa se prefirió de acuerdo con el procedimiento anterior,
p-aminobenzamidina-4% de agarosa
(véase 2).
4) Ácido tranexámico (TEA) -4% de
agarosa
La síntesis de ácido tranexámico
(TEA)-4% de agarosa se prefirió de acuerdo con el
procedimiento anterior,
p-aminobenzamidina-4% de agarosa
(véase 2).
5)
Arginina-sefarosa
4B
El siguiente procedimiento se usó para
inmovilizar arginina o ácido tranexámico en
CNBr-sefarosa 4B (Pharmacia) como el gel separador.
Las síntesis de los dos ligandos a dos concentraciones diferentes
(10 mmol o 0,01 mmol/ml de gel seco) fueron similares, como se
mencionan en esta sección y en la sección siguiente
(5-6).
Se suspendieron 2,5 g de
CNBr-sefarosa 4B activada en 50 ml de HCl 1 mM. El
gel se hinchó durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido por
lavado de 15 minutos con 500 ml de HCl 1 mM sobre un filtro de
vidrio sinterizado.
La arginina se disolvió en 12,5 ml de tampón de
acoplamiento, NaHCO_{3} 0,1 M a pH 8,3 que contiene NaCl 0,5 M.
La disolución de acoplamiento que contiene el ligando se mezcló con
el gel en un tubo de plástico seguido por enrollamiento durante
toda una noche a 4ºC.
Al final de la incubación, esta mezcla se lavó
de exceso de ligando con 10 volúmenes de gel de tampón de
acoplamiento a través de un filtro de vidrio sinterizado. La
disolución de proteínas se lavó con 3 ciclos de 50 ml de tampón a
valores de pH alternantes (tampón acetato 0,1 M de pH 4 que contiene
NaCl 0,5 M seguida por lavado con tampón de
Tris-HCl 0,1 M de pH 8 que contiene NaCl 0,5 M). La
arginina-sefarosa 4B inmovilizada se almacenó hasta
usar en azida de sodio 0,02% a 4ºC.
6) Ácido tranexámico
(TEA)-sefarosa
4B
Esta síntesis se hizo de acuerdo con el
procedimiento de arginina-sefarosa 4B anterior
(véase sección 5).
7)
Arginina-sefarosa
6B
La arginina a dos concentraciones diferentes (2
mmol o 0,2 mmol/ml de gel en seco) se acopló a la sefarosa 6B epoxi
inmovilizada comercialmente disponible (Pharmacia) como sigue:
Se suspendieron 2,5 g de sefarosa 6B
Epoxi-activada en 200 ml de agua purificada. El gel
se hinchó durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente
seguido por lavado durante 1 hora con 500 ml de agua purificada,
añadida en alícuotas, a través de un filtro de vidrio
sinterizado.
Se vertieron 20 ml de tampón de acoplamiento
(NaHCO_{3} 0,1 M pH 9,3 y NaCl 0,5 M) y el gel hinchado se vertió
en dos tubos que contenían Arginina. Las mezclas se mezclaron en un
tubo de plástico durante toda una noche a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, esta mezcla se lavó
de exceso de ligando con 5 volúmenes de gel de tampón de
acoplamiento a través de un filtro de vidrio sinterizado. El
producto se lavó con 3 ciclos de pH alternante (tampón de pH 4,0 de
acetato 0,1 M y tampón de NaCl 0,5 M seguidos por lavado con tampón
Tris-HCl de pH 8 0,1 M y NaCl 0,5 M). La
arginina-sefarosa 6B se almacenó hasta usar con
azida de sodio al 0,02% a 4ºC.
8) Ácido tranexámico
(TEA)-Sefarosa
6B
Esta síntesis se prefirió de acuerdo con el
procedimiento de aArginina-sefarosa 6B anterior
(véase sección 7).
9) Hidrogel de Ceramic HiperLDF
epoxi-activado de L-Lisina se compró
de
Sigma.
10) Se compró de Pharmacia
p-aminobenzamidina covalentemente anclada a sefarosa
6B.
Se usó crioprecipitado almacenado de plasma
humano que contenía 1 IU/ml de plasmina/plasminógeno para el
siguiente estudio.
Se descongelaron alícuotas de crioprecipitado
congelado a 37ºC y se dializaron frente a tampón BN1 (NaCl 0,12 M,
Tri Na-citrato 10 mM, CaCl_{2} 1 mM a pH 7,0).
Esta disolución de proteínas se filtró a través de un filtro de 5
\mum obteniendo una disolución transparente. Un cilindro de
jeringuilla de 5 ml con un diámetro de 8,36 mm se empaquetó con 1,5
ml (volumen húmedo) de las siguientes resinas de afinidad descritas
en el ejemplo 1: ácido
\varepsilon-aminocarboxílico inmovilizado
(sefarosa 6B que usa epoxi como un separador) y
L-lisina inmovilizada (Hidrogel de Ceramic HiperLDF
usa que epoxi como un separador). El procedimiento de
empaquetamiento optimizado fue como sigue: el gel empaquetado se
lavó con 4 volúmenes de i) agua purificada, ii) NaCl 1 M, iii) agua
purificada, iv) tampón TLN 0,1 (0,05 M de Tris, 0,02 M de Lisina,
NaCl 0,1 M, pH 9,0), v) tampón TLN 0,1 (0,05 M de Tris, 0,02 M de
Lisina y NaCl 1 M, pH 9,0) y vi) agua purificada. Todas las
muestras, tampones de carga y lavado se aplicaron al cilindro de
jeringuilla tras una centrifugación a 147,197 radianes/segundo
(1000 rpm) durante 1 minuto a 25ºC.
El equilibrado se llevó a cabo con 4 volúmenes
de BN1 y el crioprecipitado concentrado prefiltrado se cargó sobre
la resina (2:1 v/v, respectivamente) esta mezcla se incubó durante 1
hora a temperatura ambiente. Se recogieron alícuotas de los lavados
de "espín" no unidos en tubos de plástico después de cada
centrifugación. La resina se lavó con al menos 13 volúmenes de
columna de cualquier tampón de BN1 hasta que la densidad óptica
alcanzó 0,02. La elución de plasmina/plasminógeno se llevó a cabo
con tampón de TLN 1 tras llevarse a cabo mediante lavado con 4
volúmenes de lecho de NaCl 3 M. Las minicolumnas se cerraron
herméticamente y se almacenaron a 4ºC.
Las resinas, las cuales se degradaron durante el
procedimiento o eliminaron menos del 50% de la/del
plasmina/plasminógeno se excluyeron pronto del estudio. Los
resultados se resumen en la tabla 2.
La tabla superior muestra que los mejores
ligandos para eliminar plasmina/plasminógeno del crioprecipitado
que contenía geles de afinidad que eran lo suficientemente fuertes
para mantener la secuencia en la carga, lavados, y elución sin
colapsar o geles los cuales retuvieron más del 50% del fibrinógeno
cargado.
La tabla 3 ilustra tanto la eficiencia de
diversos tipos de gel en la eliminación de plasmina/plasminógeno
como su capacidad para retener fribrinógeno en un crioprecipitado
concentrado.
La/el plasmina/plasminógeno residual presente en
el crioprecipitado se adsorbió mediante las resinas mientras el
fibrinógeno no se adsorbió, volviendo así esencialmente libre la/el
plasmina/plasminógeno sobrenadante resultante.
El contenido en fibrinógeno se midió mediante
una prueba de tiempo de coagulación mientras que el contenido de
plasmina/plasminógeno se midió mediante ensayo cromogénico.
Las recuperaciones calculadas de
plasmina/plasminógeno y fibrinógeno a partir de geles de lisina
sirvieron como un estándar dorado para todos los otros ligandos de
gel usados. Los resultados, presentados en la tabla 2, indican que
sólo los ligandos TEA con separador epoxi proporcionaron eliminación
excelente de plasmina/plasminógeno y alta recuperación de
fibrinógeno (véase tabla 3).
La concentración elevada de TEA inmovilizado
proporcionó una eliminación superior de plasmina/plasminógeno y
recuperaciones similares de fibrinógeno según se comparan con
ligando unido a lisina: recuperaciones del 89% frente al 92% para
fibrinógeno y eliminación del 89% frente al 56% para
plasmina/plasminógeno, respectivamente. Todas las otras resinas
fueron mucho menos eficientes bien en eliminación de
plasmina/plasminógeno o bien en recuperación de fibrinógeno.
Se trató crioprecipitado con hidróxido de
aluminio adsorbiendo los factores de coagulación dependientes de
vitamina K, y después incubar con una mezcla de detergente
disolvente
(SD-Tri(n-butil)fosfato
al 1%, Tritón X-100 al 1%) durante 4 horas a 30ºC
inactivando virus con cubierta de lípidos. Los reactivos de SD se
eliminaron mediante extracción con aceite de ricino y cromatografía
de interacción hidrófoba, y la preparación se pasteurizó
subsiguientemente (10 horas a 60ºC) en presencia de sacarosa y
glicina como estabilizadores.
Después de la pasteurización, la sacarosa y la
glicina se eliminaron mediante diafiltración. Se añadieron como
estabilizadores ácido tranexámico (TEA) y clorhidrato de arginina
como estabilizadores antes de la filtración estéril. Las alícuotas
del producto estabilizado se guardaron a -30ºC hasta usarse.
Se descongelaron alícuotas de crioprecipitado de
virus inactivos, se congelaron a 37ºC y se dializaron frente a
tampón BN1 (compuesto de NaCl 0,12 M, Tri Na-citrato
0,01 M, CaCl_{2} 1 mM, a pH 7,0) o alternativamente contra tampón
fosfato 25 mM. La disolución posterior se filtró a través un filtro
de 5 \mum de profundidad dando una disolución transparente.
Una columna de 10 mm de diámetro (Biorad,
EE.UU.) se empaquetó con bien 6 ml (en volumen húmedo) de TEA
inmovilizado (TEA sefarosa 6B) o lisina inmovilizada (Ceramic
HiperDF/sefarosa 4B) y se lavó con 4 volúmenes de cada una de las
siguientes disoluciones en secuencia: i) agua purificada, ii) NaCl 1
M, iii) agua purificada, iv) tampón de TLN 0,1 (NaCl 0,1 M, lisina
0,02 M, 0,05 M de Tris pH 9,0), v) tampón de TNF 1 (NaCl 1 M, 0,02 M
de lisina, 0,05 M de Tris pH 9,0) y iv) agua purificada. La
equilibración se llevó a cabo con 4 volúmenes de BN1 o
alternativamente con tampón fosfato. El crioprecipitado filtrado se
cargó dentro de la columna a un caudal de 100 \mul/minuto.
Se recogieron muestras del material no ligado en
tubos de plástico y la resina se lavó con 16 volúmenes de columna
de bien tampón BN1 o bien tampón fosfato. La elución de
plasmina/plasminógeno se llevó a cabo con tampón de TLN 1 seguido
por lavado con cuatro volúmenes de disolución de NaCl 3 M, cuatro
volúmenes de agua purificada y cuatro volúmenes de etanol al 25%
suplementados con NaCl 1 M.
La tabla 4 ilustra la efectividad de eliminación
de plasmina/plasminógeno mediante diferentes clases de resina y la
recuperación de fibrinógeno. El contenido en fibrinógeno se midió
mediante el ensayo de tiempo de coagulación (ensayo Clauss)
mientras el contenido de plasmina/plasminógeno se midió mediante un
ensayo cromogénico.
La comparación entre las diferentes resinas
indica que del 95,4% al 96,4% del contenido en fibrinógeno se
retuvo en el pico no unido cuando se usó el tampón BN1. En
contraste, la recuperación de fibrinógeno se bajó cuando se usó
tampón fosfato. Sorprendentemente, sólo la resina de TEA
inmovilizada proporcionó tanto eliminación de plasmina/plasminógeno
como alta recuperación de fibrinógeno.
Los resultados con resina de lisina también
demostraron la eficiencia incrementada con el tampón de BN1
comparado con el tampón de fosfato.
Se descongelaron alícuotas de crioprecipitado
inactivado de virus congeladas a 37ºC y se dializaron frente a
tampón BN1 (NaCl 0,12 M, Tri Na-citrato 0,01 mM,
CaCl_{2} 1 mM a pH 7,0) o alternativamente frente a tampón
fosfato 25 mM. La última disolución se filtró a través de un filtro
de 5 \mum de profundidad eliminando las sustancias
insolubles.
Una columna de 26 mm de diámetro (Pharmacia,
Suecia) se empaqueto con 50 ml (volumen húmedo) de TEA inmovilizado
(TEA, Sefarosa 6B) y se lavó con 4 volúmenes agua purificada y el
mismo volumen de tampón TLN 0,1 (NaCl 0,1 M, 0,02 M de lisina, 0,05
M Tris pH 9,0), tampón TLN (NaCl 1 M, 0,02 M de lisina, 0,05 M Tris
pH 9,0) y agua purificada. La equilibración se llevó a cabo con 4
volúmenes de tampón BN1 (NaCl, Tri Na-citrato,
CaCl_{2}, pH 7,0) y el BAC filtrado se hizo pasar a través de la
columna a un caudal de 700 \mul/ml.
Se recogieron muestras del material no unido en
un plato de plástico y la resina se lavó con al menos 3 volúmenes
de gel de BN1. La elución de plasmina/plasminógeno se llevó a cabo
con tampón TLN1 lavando seguidamente con NaCl 3 M.
Las fracciones no unidas de dos tandas se
almacenaron y guardaron a 4ºC hasta concentración. Finalmente, el
BAC se concentró hasta el volumen original mediante diafiltración
usando una membrana de límite 100 y frente a tampón B1 (glicina,
NaCl, Tri Na-citrato, CaCl_{2}, pH 7) seguida por
filtración a través de filtro de 0,45 \mum. Al filtrado se le
añadió un 2% de arginina.
Para las pruebas de estabilidad, el producto
resultante se filtró en condiciones de esterilidad a través de un
filtro de 0,2 \mum.
Como se indica en la tabla 5 usar una columna
más grande y larga incrementó la efectividad del ligando de TEA, la
recuperación de fibrinógeno fue del 100% y la eliminación de
plasmina/plasminógeno estuvo por debajo del nivel detectable del
ensayo cromogénico de plasmina/plasminógeno.
La comparación entre el producto antes y después
de la diafiltración reveló una pérdida del 33% del contenido en
fibrinógeno. Este fenómeno se puede explicar por problemas técnicos
los cuales se descubrieron sólo en pequeña escala. La resina de TEA
inmovilizada proporcionó, indudablemente, tanto excelente
eliminación de plasmina/plasminógeno como recuperación excelente de
fibrinógeno.
No se encontró ningún TEA residual tanto en la
disolución de proteína eluida como en el producto ultrafiltrado. El
análisis del nivel residual de ácido tranexámico se hizo mediante
HPLC.
Se hicieron cuatro tandas adicionales, para
eliminación de plasmina/plasminógeno, usando la misma resina y
condiciones de funcionamiento como ya se describió anteriormente
(ejemplo 4). En general, los resultados de todas las muestras
examinadas fueron similares a los primeros resultados anteriormente
mostrados.
No se encontró ningún TEA residual tanto en la
disolución de proteína eluida del producto ultrafiltrado
concentrado. El análisis del nivel residual de ácido tranexámico se
hizo mediante HPLC.
No se observaron adhesiones con cualesquiera
franjas antes de eliminación de plasmina/plasminógeno o después de
que se examinara en un modelo de rata.
El crioprecipitado antes y después de
eliminación de plasmina/plasminógeno se probó por degradación
mientras se incubó a temperatura ambiente. Los datos de porcentaje
de proteínas coagulables (mediante absorbancia por UV) en muestras
diferentes se proporcionan en la tabla 6.
Las pruebas de estabilidad se hicieron con
franjas las cuales se prepararon a partir de crioprecipitado antes
y después de eliminar la plasmina/el plasminógeno seguido por
incubación a 37ºC en presencia de tampón. Estas franjas se trataron
mediante la adición u omisión de glicina y/o arginina; los
resultados se resumen en tabla 7 más adelante.
\newpage
1. Los estudios descritos en los siguientes
ejemplos se llevaron a cabo en plasma crio-reducido,
congelado recién preparado almacenado de donantes normales, sanos.
Debido a la alta concentración de antiplasmina y a la pequeña
cantidad de plasmina en donantes normales sanos (1), la plasmina no
se puede detectar mediante un ensayo funcional (cromogénico)
(Schreiber AD, Kaplan AP, Austen KF. Plasma Inhibitors of the
components of the fibrinolytic pathway in man. J. Clin Invest
52: 1394-1401, 1973). Consecuentemente, es imposible
demostrar la eliminación, purificación y recuperación a partir de
una resina TEA de plasmina a partir de muestras de plasma de
donante sano. Sin embargo, un kit de ELISA comercial para la
detección de cantidades muy bajas de
glu-plasmina/plasminógeno y, como se encontró en
estudios previos, la resina TEA tiene igual afinidad por ambas
formas de plasmina/plasminógeno así como por plasmina (Fredenburg
JP, Neisheim ME. Lys-plasmin(ogen) is a
significant intermediate in the activation of
Glu-plasmin(ogen) during fibrinolysis in
vitro. J. Biol Chem 267. 26150-6. 1992 y
Miyashita C, Wenzel E., Heiden M. Plasmin(ogen): a brief
introduction into its biochemistry and function. Haemostasis 1:
7-13,
1988).
1988).
2. Así la medida de
glu-plasmina/plasminógeno se puede usar como un
indicador de la totalidad de plasmina/plasminógeno en el plasma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se llevaron a cabo estudios para determinar la
eficiencia de un TEA inmovilizado en sefarosa 4FF en eliminar
plasmina/plasminógeno de Plasma Congelado Recién Preparado (FFP)
crio-reducido que contenía 1 IU/ml de
plasmina/plasminógeno. Se descongelaron alícuotas de plasma
congelado recién preparado crio-reducido a 37ºC y se
filtraron a través de un filtro de 3 \mum de profundidad
eliminando proteínas insolubles.
Una columna de 10 mm de diámetro (Pharmacia,
Suecia) se empaquetó con 2 ml de (volumen húmedo) de TEA
inmovilizado y se lavó con 4 volúmenes de agua purificada y el
mismo volumen de tampón TLN-0,1 (NaCl 0,1 M, 0,02
M de lisina, 0,05 M de Tris pH 9,0), tampón TLN-1
(NaCl 1 M, 0,02 M de lisina, 0,05 M de Tris pH 9,0) y agua
purificada. Se llevó a cabo la equilibración con 4 volúmenes de
tampón BN1 (NaCl 0,12 M, 0,01 M Tri Na-citrato,
CaCl_{2} 1 mM, pH 7,0) y el plasma filtrado (-20 IU de
plasmina/plasminógeno) se hizo pasar a través de la columna a un
caudal de 1 ml/minuto.
El material que atraviesa el flujo se recogió y
congeló en una botella de plástico y la resina se lavó con al menos
3 volúmenes de columna de tampón BN1. La elución de
plasmina/plasminógeno se llevó a cabo con tampón
TLN-1 seguido por lavado con aproximadamente tres
volúmenes de disolución NaCl 3 M, dos volúmenes de agua purificada
y dos volúmenes de etanol al 20% + NaCl 1 M (procedimiento 1). En el
segundo procedimiento (procedimiento 2), se llevó a cabo el mismo
procedimiento como aquel usado para el procedimiento 1, pero con un
lavado adicional con NaCl 3 M antes de elución con
plasmina/plasminógeno.
Ensayo de detección de
Glu-plasmina/plasminógeno: el kit de ELISA
Glu-plasmina/plasminógeno de
Immunoclone® (American Diagnostica, Greenwich, CT, EE.UU.) usado en estos experimentos es un inmunoensayo en sandwich unido a enzimas específico para la determinación de niveles de plasmina/plasminógeno humanos nativos. La cuantificación límite del ensayo (de acuerdo con la curva de calibración más baja) en plasma o derivados de plasma es 0,063 \mug/ml.
Immunoclone® (American Diagnostica, Greenwich, CT, EE.UU.) usado en estos experimentos es un inmunoensayo en sandwich unido a enzimas específico para la determinación de niveles de plasmina/plasminógeno humanos nativos. La cuantificación límite del ensayo (de acuerdo con la curva de calibración más baja) en plasma o derivados de plasma es 0,063 \mug/ml.
Actividad de plasmina: un ensayo
fibrinolítico se llevó a cabo semicuantificando actividad de
plasmina en los eluidos. Brevemente, plasmina/plasminógeno libre de
fibrinógeno (Enzyme Research) se incubó con diversas
concentraciones de plasma almacenado normal (Unicalibratos, Stago) o
plasmina/plasminógeno purificado eluido a partir de las columnas
de afinidad, en la presencia de estreptoquinasa en exceso. El tiempo
al cual se completó la degradación del coágulo se registró y
comparó con la degradación de coágulo completa de la muestra.
Determinación de la proteína: la
totalidad de la proteína se ensayó usando el procedimiento de
Bradford (Bradford MM. A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities if protein utilizing the
pinciple of protein-dye binding. Anal. Biochem.
72: 248-54, 1976). Las tablas 8a y b muestran los
resultados de eliminación cromatográfica y purificación de
plasmina/plasminógeno de plasma humano mediante el ligando de TEA.
La tabla 8a resume los datos obtenidos en la purificación de
plasmina/plasminógeno. La tabla muestra que el procedimiento 2 dio
como resultado una purificación ligeramente mejor de
plasmina/plasminógeno que el procedimiento 1, con una purificación
de 576 veces y un rendimiento del 91,6%. La tabla 8b muestra que un
promedio del 99,5% de plasmina/plasminógeno se eliminó a partir de
la fracción no unida, justificada mayoritariamente mediante la
cantidad recuperada en el eluido (tabla 8a).
\vskip1.000000\baselineskip
Efecto de condiciones cromatográficas sobre la
efectividad de un ligando de lisina inmovilizada en la purificación
por afinidad de plasmina/plasmi-nógeno.
La purificación de afinidad que usa una resina
con un ligando de lisina inmovilizada se investigó usando dos
resinas de lisina comercialmente disponibles. Se usó un
procedimiento cromatográfico documentado en la bibliografía (véase
Robbins KC, Summaria L. Plasmin(ogen) and Plasmina.
Methods Enzymol. 45: 257-73, 1976. para
procedimiento 2 descrito más adelante) y además un procedimiento
desarrollado en el laboratorio de los inventores (procedimiento 1
más adelante).
Dos resinas de lisina inmovilizadas (ceramic
HyperDF producida por Biosepra y sefarosa 4B elaborada por
Pharmacia) se empaquetaron cada una de ellas en columnas de 10 mm
de diámetro (Pharmacia, Suecia). Cada columna contuvo 2 ml (volumen
húmedo) de resina.
Las alícuotas de plasma congelado recién
preparado criorreducido se descongelaron a 37ºC y se filtraron a
través de un filtro de 3 \mum de profundidad dando una disolución
transparente.
La etapa cromatográfica se llevó a cabo usando
uno de los procedimientos siguientes:
Procedimiento
1
La columna se lavó con 4 volúmenes de cada una
de las siguientes disoluciones: 1) agua purificada, 2)
TLN-0,1, 3) TLN-1 y 4) agua
purificada. La equilibración se llevó cabo con 4 volúmenes de BN1.
El plasma filtrado (40 ml) se cargó sobre la columna a un caudal de
1 ml/minuto. Las muestras del material que atraviesa el flujo se
recogieron en botellas de plástico y la resina se lavó con tampón
BN1. La elución de plasmina/plasminógeno se llevó a cabo con tampón
TLN-1 seguido por lavado con disolución de NaCl 3 M,
2 volúmenes de agua purificada y 2 volúmenes de etanol al 20% +
NaCl 1 M.
Procedimiento 2: (ref.
5)
Alícuotas de plasma congelado recién preparado
criorreducido (40 ml) se filtraron a través de un filtro de 3
\mum de profundidad. Se añadieron 4 ml de Tris 0,5 M, lisina 0,2
M, tampón NaCl 1 M, pH 9 a 40 ml de plasma filtrado.
La columna se lavó con 4 volúmenes de columna de
agua purificada y equilibrada con tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4. El
plasma diluido se hizo pasar a través de la resina a un caudal de 1
ml/minuto. Muestras del material no unido se recogieron en botellas
de plástico y la resina se lavó con tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4
hasta que la absorbancia del efluente a 280 nm alcanzó la línea
base. La/el plasmina/plasminógeno se eluyó después con ácido
\varepsilon-aminocaproico 0,2 M disuelto en tampón
fosfato 0,1 M, pH 7,4 y se recogió en un plato de plástico. La
elución fue seguida por lavado con aproximadamente 2 volúmenes de
disolución 3 M y agua purificada.
Las tablas 9a y 9b comparan la eliminación y
purificación de plasmina/plasminógeno mediante dos resinas de
lisina inmovilizada comercialmente disponibles diferentes usando dos
procedimientos de purificación diferentes con cada una de ellas.
Aunque hay relativamente poca diferencia en la recuperación de
plasmina/plasminógeno en los eluidos (9a), se puede ver que usando
el procedimiento 2 y la resina Ceramic HyperDF, se logra una
purificación mucho más elevada de plasmina/plasminógeno.
El resultado muestra que usando resina
lisina-ceramic Hyper DF y procedimiento
cromatográfico 2, se logró una purificación de 444 veces. Además,
la mayoría de la/del plasmina/plasminógeno en el material de partida
se recuperó en las fracciones pico (76,5% en la fracción no unida +
10,9% en el eluido, con sólo aproximadamente el 10% de la/del
plasmina/plasminógeno no justificada/o). Sin embargo, la eliminación
de la/del plasmina/plasminógeno a partir de la fracción no unida
fue sólo del 23,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (23)
1. Un procedimiento in vitro para
eliminar o aislar específicamente plasminógeno o plasmina en
presencia de fibrinógeno a partir de una mezcla que contiene
plasminógeno o plasmina poniendo en contacto la mezcla con un
aminoácido rígido en el que el grupo amino del aminoácido y el grupo
carboxílico del aminoácido están separados 6-8
Angstroms, preferiblemente aproximadamente 7 Angstroms y el
aminoácido rígido está covalentemente unido a un soporte por medio
del grupo amino del aminoácido.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que la mezcla se selecciona del grupo
constituido por fluidos corporales tales como sangre; fracciones de
sangre, crioprecipitado, cultivos celulares, extractos de tejidos
animales, tales como pulmones bovinos, intestinos bovinos o gelatina
de extractos óseos animales, seroalbúmina bovina así como grasas
inmiscibles en agua derivadas de animales, tales como lanolina
(PC-fosfatidilcolina).
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que el soporte es un material
cromatográfico.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 en el que el material cromatográfico es un material
hidrófilo tal como agarosa, celulosa, vidrio de poro controlado,
geles de sílice, dextranos o un polímero artificial orgánico tales
como los basados en poliestirenos de poliacrilamidas.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 en el que el material cromatográfico es agarosa o
sefarosa.
6. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3 en el que el material cromatográfico es un material
particulado o un material de bloque monolítico.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que el aminoácido rígido está unido al
soporte por medio de un engarce entre el soporte y el ácido
tranexámico.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7 en el que el engarce es un engarce bifuncional.
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 8 en el que el engarce bifuncional se selecciona del
grupo que consta de N-hidroxisuccinimida, DAPA,
CNBr, epoxi, diaminopropilamina (DADPA),
1,6-diaminohexano, ácido succínico,
1,3-diamino-2-propanol,
etilendiamina (EDA), TNB, piridildisulfuro, yodoacetamida, soporte
activado de maleimida o combinaciones de los mismos.
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que el soporte se modifica mediante un resto
el cual reacciona con grupos amino primarios o secundarios.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que subsiguientemente después de poner en
contacto la mezcla con el soporte que tiene unido ácido tranexámico
la mezcla se incuba con el soporte durante un periodo de tiempo
suficiente para unir plasminógeno o plasmina y se eluye con una
disolución neutra acuosa que contiene sales de sodio, sales de
calcio, sales tampón.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que subsiguientemente después de poner en
contacto la mezcla la plasmina o el plasminógeno se eluye con una
disolución acuosa que contiene una cantidad suficiente de un
ligando que compite con los sitios de unión a plasminógeno del
aminoácido rígido unido al soporte.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que el ligando es lisina.
14. Un soporte que tiene unido covalentemente un
aminoácido rígido en el que el grupo amino del aminoácido y el
grupo carboxílico del aminoácido están separados 6-8
Angstroms, preferiblemente aproximadamente 7 Angstroms.
15. El soporte de la reivindicación 14 en el que
el aminoácido se selecciona del grupo constituido por ácido
tranexámico y ácido
4-aminometilbiciclo-[2.2.2.]-octano-1-carboxílico.
16. El soporte de la reivindicación 14 ó 15 en
el que el soporte es un material cromatográfico.
17. El soporte de acuerdo con la reivindicación
14 en el que el material cromatográfico es un material hidrófilo
tal como agarosa, celulosa, vidrio de poro controlado, geles de
sílice, dextranos o un polímero artificial orgánico tal como los
basados en poliestirenos de poliacrilamidas.
18. El soporte de acuerdo con la reivindicación
14 en el que el material cromatográfico es agarosa o sefarosa.
19. El soporte de acuerdo con la reivindicación
14 en el que el material cromatográfico es un material particulado
o un material en bloque monolítico.
20. El soporte de acuerdo con la reivindicación
14 en el que el ácido tranexámico está unido al soporte por medio
de un engarce entre el soporte y el ácido tranexámico.
21. El soporte de acuerdo con la reivindicación
20 en el que el engarce es un engarce bifuncional.
22. El soporte de acuerdo con la reivindicación
21 en el que el engarce bifuncional se selecciona del grupo que
consta de N-hidroxisuccinimida, DAPA, CNBr, epoxi,
diaminopropilamina (DADPA), 1,6-diaminohexano, ácido
succínico,
1,3-diamino-2-propanol,
etilendiamina (EDA), TNB, piridildisulfuro, yodoacetamida, soporte
activado de maleimida o combinaciones de los mismos.
23. El soporte de acuerdo con la reivindicación
14 en el que el soporte se modifica mediante un resto el cual
reacciona con grupos amino primarios o secundarios.
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