CN112575003A - 本氏烟hakai基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法 - Google Patents

本氏烟hakai基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112575003A
CN112575003A CN202011497195.7A CN202011497195A CN112575003A CN 112575003 A CN112575003 A CN 112575003A CN 202011497195 A CN202011497195 A CN 202011497195A CN 112575003 A CN112575003 A CN 112575003A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nbhakai
hakai
plant
gene
yfp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011497195.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112575003B (zh
Inventor
李方方
何浩
周雪平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to CN202011497195.7A priority Critical patent/CN112575003B/zh
Publication of CN112575003A publication Critical patent/CN112575003A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112575003B publication Critical patent/CN112575003B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法，所述病毒为茄果花叶病毒，HAKAI基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。本发明通过农杆菌转化的方法，将HAKAI基因导入目的植物中，获得了本氏烟HAKAI基因过表达植物。获得的本氏烟HAKAI过表达植物能够显著减轻茄果花叶病毒的侵染。

Description

本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物 培育方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种抑制茄果花叶病毒侵染的转基因植物。
背景技术
茄果花叶病毒(Pepino mosaic virus,PepMV)属于马铃薯X病毒属病毒。1974年首次在秘鲁凤果中分离得到该病毒。在此之后，欧洲、北美、南美、南非及亚洲地区都有发现该病毒，现已成为温室番茄的重要病害。PepMV主要侵染番茄、茄子、马铃薯等茄科蔬菜，也能侵染苋属植物、金盏花、南茼蒿、田旋花、小花锦葵、光烟草、龙葵、苦苣菜、墙生藜、白酒草、野生剑生菜、罗勒、酸模属植物、水蒜芥、蒲公英等植物。
PepMV侵染番茄后，可导致番茄果实斑驳、变色、裂果、叶片花叶、扭曲、起泡、叶茎维管组织坏死，甚至全株死亡，严重影响番茄的产量和品质。PepMV具有高度传染性，可以通过污染的工具、手和衣物以及植物间直接接触等方式进行传播，一旦发生将很难遏制。目前该病毒已在我国云南地区普遍发生。
农业卫生预防是生产中控制PepMV的重要措施。但是由于该病毒具有高度传染性，这就使得农业卫生措施预防病毒成为挑战，尤其是在密集的大田和保护地。交叉保护是预防病毒的另一重要手段。但是由于该病毒基因型分化等原因，效果有限，甚至还会出现病毒症状更重的情况。此外，生产上缺少抗PepMV的植物遗传材料。因此，目前还没有有效的控制PepMV的方法。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用。
本发明的第二目的是提供一种本氏烟HAKAI高表达植物的培育方法。
本发明发现了本氏烟中HAKAI基因是一个抗病基因。通过农杆菌转化的方法，将HAKAI基因导入目的植物中，获得的本氏烟HAKAI高表达植物能够显著减轻PepMV的侵染，有效控制该病毒的危害。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述病毒为茄果花叶病毒。所述HAKAI基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。
具体的，是通过农杆菌转化的方法，将HAKAI基因导入目的植物中，获得的本氏烟HAKAI高表达植物能够显著减轻茄果花叶病毒的侵染，抑制茄果花叶病毒造成的病害。
一种抗茄果花叶病毒的HAKAI转基因植物的培育方法：通过农杆菌转化的方法，将HAKAI基因导入目的植物中，获得本氏烟HAKAI基因高表达植物。
具体包括以下步骤：
(1)本氏烟草叶片取样，Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)18(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')引物反转录获得cDNA；
(2)使用引物对NbHAKAI-F与NbHAKAI-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA为模板进行PCR扩增，克隆得到NbHAKAI，
NbHAKAI-F：atgcttcagatccggctaag；
NbHAKAI-R：gtcctggctgcttccataac；
(3)将NbHAKAI构建到带有YFP荧光标签的载体上，获得YFP-NbHAKAI重组质粒；
(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有YFP-NbHAKAI重组质粒的农杆菌；
(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；
(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对35S-F与NbHAKAI-R，如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定植物中转入了外源YFP-NbHAKAI的转录本；
35S-F：gacgcacaatcccactatcc；
NbHAKAI-R：gtcctggctgcttccataac；
以上样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Western blot确定植物表达了带YFP荧光标签的YFP-NbHAKAI；对以上阳性植株留种。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
本发明发现了本氏烟中HAKAI基因是一个抗病基因，并克隆了该基因，通过农杆菌转化的方法，将HAKAI基因导入目的植物中，获得的本氏烟HAKAI高表达转基因植物。获得的HAKAI转基因植物能够显著减轻茄果花叶病毒的侵染，抑制茄果花叶病毒造成的病害。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法作进一步说明。
附图说明
图1为YFP-NbHAKAI载体构建及表达鉴定。其中，(A)YFP-NbHAKAI载体构建示意图，CaMV 35S promoter为花椰菜花叶病毒35S启动子，能够启动下游融合基因YFP(黄色荧光蛋白)—NbHAKAI(克隆的目标基因)的表达，NOS为转录终止位点；(B)YFP-NbHAKAI农杆菌浸润RFP-H2B(细胞核发出红光，用于作为细胞核定位的标志基因)转基因本氏烟36小时，共聚焦观察YFP-NbHAKAI瞬时荧光，Merge栏为YFP、RFP与明场的叠加；(C)YFP-NbHAKAI农杆菌浸润RFP-H2B转基因本氏烟，取样提取蛋白，Western blot分析本氏烟叶片中的YFP-NbHAKAI表达量，蛋白大小90kDa左右，Mock为野生型本氏烟，rbcL(The large Rubisco subunit)用于表示上样量的水平。
图2为YFP-NbHAKAI转基因植物的鉴定。其中，(A)PCR检测培养成功的转基因YFP-NbHAKAI植物DNA，目的条带约为1500bp；(B)Western blot分别分析来自于本氏烟野生型、YFP-NbHAKAI转基因不同株系Line 4、line 18植物叶片中的蛋白表达量，蛋白大小90kDa左右，rbcL用于表示上样量的水平；(C)T1代YFP-NbHAKAI转基因植物与野生型本氏烟表型对比，Wt为野生型本氏烟，Line 4与Line 18为YFP-NbHAKAI转基因本氏烟两个不同株系。
图3为YFP-NbHAKAI转基因植物对茄果花叶病毒(PepMV)的抗性分析。其中，(A)PepMV接种野生型本氏烟及YFP-NbHAKAI转基因不同株系Line 4、Line 18后10天的症状图。(B)RT-qPCR分析PepMV接种野生型本氏烟及YFP-NbHAKAI转基因不同株系Line 4、Line 18后10天系统叶片病毒RNA积累量，结果显示YFP-NbHAKAI转基因植物能够明显降低PepMV的RNA积累量。(C)Western blot检测PepMV接种野生型本氏烟及YFP-NbHAKAI转基因不同株系Line 4、line 18后10天系统叶病毒外壳蛋白(CP)，rbcL用于表示上样量水平。结果显示YFP-NbHAKAI转基因植物能够明显降低PepMV的蛋白积累量
具体实施方式
一种抗茄果花叶病毒的HAKAI转基因植物的培育方法，具体包括以下步骤：
(1)本氏烟草叶片取样，使用Trizol法抽提RNA，去除基因组DNA后，使用oligo(dT)18(5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3')引物反转录获得cDNA；oligo(dT)18引物序列如SEQ IDNO:5所示。
(2)使用引物对NbHAKAI-F与NbHAKAI-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA为模板进行PCR扩增克隆，凝胶回收得到纯化的NbHAKAI，
NbHAKAI-F：atgcttcagatccggctaag；
NbHAKAI-R：gtcctggctgcttccataac；
(3)通过酶切连接的方法将NbHAKAI连接到带有YFP荧光标签的载体上，获得YFP-NbHAKAI重组质粒，如图1A所示，为载体构建的示意图，该载体包含CaMV 35S promoter：花椰菜花叶病毒35S启动子，能够启动下游融合基因YFP(黄色荧光蛋白)—NbHAKAI(克隆的目标基因)的表达，NOS为转录终止位点；
(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入干净的电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，立即加入预冷的LB液体培养基，28℃恢复，2小时后涂布到抗性培养基上生长48小时，筛选获得带有YFP-NbHAKAI重组质粒的农杆菌。
(5)挑取阳性单菌落转入液体抗性培养基中，28℃，200rpm过夜培养，调节农杆菌OD值至1.0，接种转基因RFP-H2B(细胞核发出红光，用于作为细胞核定位的标志基因)本氏烟植物，36小时后共聚焦观察其瞬时荧光，如图1B所示，YFP-NbHAKAI以小颗粒状的结构定位于细胞核与细胞质中，农杆菌浸润RFP-H2B(细胞核发出红光，用于作为细胞核定位的标志基因)转基因本氏烟36小时，共聚焦观察YFP-NbHAKAI瞬时荧光，Merge栏为YFP、RFP与明场的叠加；(C)YFP-NbHAKAI农杆菌浸润RFP-H2B转基因本氏烟，取样提取蛋白，Westernblot分析本氏烟叶片中的YFP-NbHAKAI表达量，蛋白大小90kDa左右，Mock为野生型本氏烟，rbcL(The large Rubisco subunit)用于表示上样量的水平。上述接种叶取样，Westernblot检测YFP-NbHAKAI蛋白的表达，如图1C所示，表明YFP-NbHAKAI蛋白能够正确的表达；
(6)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；
(7)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对35S-F与NbHAKAI-R，如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定转基因植物中转入了外源YFP-NbHAKAI的转录本，如图2A所示，Line 4和Line18均能检测到NbHAKAI转录本；
35S-F：gacgcacaatcccactatcc；
NbHAKAI-R：gtcctggctgcttccataac；
(8)以上样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Westernblot检测，确定植物表达了带YFP荧光标签的YFP-NbHAKAI，如图2B所示，Line 4和Line 18均能检测到YFP-NbHAKAI蛋白，对以上阳性植株留种；
(9)播种本氏烟野生型及YFP-NbHAKAI转基因植物株系Line 4、line 18。生长4周后，如图2C所示，分别接种PepMV。接种10天后观察病毒症状，如图3A所示，相对于野生型本氏烟，YFP-NbHAKAI转基因植物两个株系表现出的病毒症状更轻。qRT-PCR检测系统叶病毒RNA积累量，转基因两个株系的病毒RNA积累量显著低于野生型本氏烟，如图3B所示。Western blot检测病毒外壳蛋白(CP)，如图3C所示，转基因两个株系的病毒蛋白积累量显著低于野生型本氏烟。
实验结果表明：通过农杆菌遗传转化的方法获得的本氏烟HAKAI过表达植物能够显著减轻茄果花叶病毒的侵染，抑制茄果花叶病毒造成的病害。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
<130> DS201-049
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1494
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcttcaga tccggctaag caaaccagcc agtgagagtg gtggaggtgc taagtcttta 60
ccttcagaca gtattacagt tgcttgtcct gatcaccttg ttttagctga tcttcctgta 120
gccaagagcc ttggttcagc aaatactgct tctgtactca agactgttgg ccgcaggtct 180
cgtcgccaac ttggtgaacg agtacatttt tgtgtccgtt gtgactttcc aattgctatt 240
tacggacgtc tgagtccatg tgaacatgcc ttctgtttag attgtgccag gagtgattct 300
ctttgctacc tctgtgatga acgcattcag aagattcaga caattaaatt gatggaaggg 360
atcttcatct gtgcagctcc gcattgtctc aagtcctttc tgaagaagac tgaatttgaa 420
tctcatattc atgagaacca cggtgatctc cttcatcaaa ctgcagaaaa ggatggaaat 480
gtttcggagt ctgccagtgc tagaaaacca gctgcctcag attctacagt gcaagcacca 540
cctaggcccc tattttctcc gagttcaggt tcccaggtac atgatcgtga agacaaagct 600
catcattctc aaactagaga ccaacagcct cctaggcttg tcatgcaacc aaagccaaca 660
ccacctttcg ctgggtcaat ccaaaatcat ccgttagagc aacagtccga tagtaatcct 720
cctccaggct ttgaaaggcc tggcagccag aaccggtttc ctcagcaaag ttttgacaca 780
cagggcgcac tgcggcctga gccaggtcaa tttccagaca agcaacaagg gattataggg 840
ggttcccctt ttcctgaata tcctatgcac atgacccaac ctcatggctt tgcagtgcct 900
atgagttcga atccaggctt ggctcctcaa tttggttatc ctcagtttgc acccgatgga 960
gcccaaccat tttatggtgc cccgtttgag atgcctaggc cagactcaac tcctgaaatg 1020
ggatcagaac aagggtcttt gctaggtttt ccacccggtg ctgcaggaaa tatgaatttt 1080
acagaaaatt accctcgacc atggaatatg gggcagtcgg ttgggccttt tgagcccacc 1140
gcagttcaac ctcctgggga tggttttgta aatgccgctg atcctcaagg aagaccagtg 1200
tttttccaag gagactatgg aagaaatgcc ggtgtaatgc cctcaaatct gccacctcca 1260
ccttcagcca accgaggatt ggaaggcgga cagaggggaa attcaatgga cagcagagat 1320
agcaaaggta tattgatgcc gcaacctatg gcccttcctc cacccccgcc tttacctcat 1380
cccaggtcac aacttcaaag aggaggcagg cactactctg atgcaaatca tgatgggcag 1440
ggctttggtt ggcaacacga gaagcgtgat agttatggaa gcagccagga ctag 1494
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcttcaga tccggctaag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcctggctg cttccataac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacgcacaat cccactatcc 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tttttttttt tttttttt 18

Claims (5)

1.本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为茄果花叶病毒。
2.根据权利要求1所述本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述HAKAI基因的转录本序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求2所述本氏烟HAKAI基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：通过农杆菌转化的方法，将HAKAI基因导入目的植物中，获得的本氏烟HAKAI高表达植物能够显著减轻茄果花叶病毒的侵染。
4.一种抗茄果花叶病毒的HAKAI转基因植物的培育方法，其特征在于：通过农杆菌转化的方法，将HAKAI基因导入目的植物中，获得本氏烟HAKAI基因高表达植物。
5.根据权利要求4所述的HAKAI转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)本氏烟草叶片取样，使用Trizol法抽提RNA，使用oligo(dT)18引物，序列为5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'，如SEQ ID NO:5所示，反转录获得cDNA；
(2)使用引物对NbHAKAI-F与NbHAKAI-R，如SEQ ID NO:2-3所示，以cDNA为模板进行PCR扩增，克隆得到NbHAKAI，
NbHAKAI-F：atgcttcagatccggctaag；
NbHAKAI-R：gtcctggctgcttccataac；
(3)将NbHAKAI构建到带有YFP荧光标签的载体上，获得YFP-NbHAKAI重组质粒；
(4)将1μl重组质粒与100μl农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置2500V电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有YFP-NbHAKAI重组质粒的农杆菌；
(5)将带有重组质粒的农杆菌侵染烟草叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；
(6)继续培养的小苗生长稳定后，取叶片样品，使用CTAB法抽提DNA；利用引物对35S-F与NbHAKAI-R，如SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3所示，以提取DNA为模板进行PCR扩增，确定植物中转入了外源YFP-NbHAKAI的转录本；
35S-F：gacgcacaatcccactatcc；
NbHAKAI-R：gtcctggctgcttccataac；
以上样品抽提总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，再使用GFP抗体进行Western blot确定植物表达了带YFP荧光标签的YFP-NbHAKAI；对以上阳性植株留种。
CN202011497195.7A 2020-12-17 2020-12-17 本氏烟hakai基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法 Active CN112575003B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011497195.7A CN112575003B (zh) 2020-12-17 2020-12-17 本氏烟hakai基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011497195.7A CN112575003B (zh) 2020-12-17 2020-12-17 本氏烟hakai基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112575003A true CN112575003A (zh) 2021-03-30
CN112575003B CN112575003B (zh) 2022-02-15

Family

ID=75135916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011497195.7A Active CN112575003B (zh) 2020-12-17 2020-12-17 本氏烟hakai基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112575003B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891801A (zh) * 2022-04-22 2022-08-12 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN114891827A (zh) * 2022-04-22 2022-08-12 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟mta基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN115807007A (zh) * 2022-11-07 2023-03-17 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟NbWhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN116622739A (zh) * 2023-06-25 2023-08-22 中国农业科学院植物保护研究所 番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用及转基因植物培育方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190185902A1 (en) * 2016-08-08 2019-06-20 Technology Innovation Momentum Fund (Israel) Limited Partnership Bacterial systems for analyzing ubiquitylated polypeptides
CN111328287A (zh) * 2017-07-04 2020-06-23 库瑞瓦格股份公司 新型核酸分子

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190185902A1 (en) * 2016-08-08 2019-06-20 Technology Innovation Momentum Fund (Israel) Limited Partnership Bacterial systems for analyzing ubiquitylated polypeptides
CN111328287A (zh) * 2017-07-04 2020-06-23 库瑞瓦格股份公司 新型核酸分子

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIA-DOLORES FERNANDEZ-GARCIA ET AL.: "Appraising the roles of CBLL1 and the ubiquitin/proteasome system for flavivirus entry and replication", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
MICHAEL M. GOODIN ET AL.: "Nicotiana benthamiana: Its History and Future as a Model for Plant–Pathogen Interactions", 《MPMI》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891801A (zh) * 2022-04-22 2022-08-12 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN114891827A (zh) * 2022-04-22 2022-08-12 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟mta基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN114891827B (zh) * 2022-04-22 2023-08-01 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟mta基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN114891801B (zh) * 2022-04-22 2023-08-15 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟Pelota基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN115807007A (zh) * 2022-11-07 2023-03-17 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟NbWhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN115807007B (zh) * 2022-11-07 2024-06-04 中国农业科学院植物保护研究所 本氏烟NbWhirly1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN116622739A (zh) * 2023-06-25 2023-08-22 中国农业科学院植物保护研究所 番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN116622739B (zh) * 2023-06-25 2023-11-28 中国农业科学院植物保护研究所 番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用及转基因植物培育方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112575003B (zh) 2022-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112575003B (zh) 本氏烟hakai基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN107936104B (zh) 牡丹PsMYB12转录因子及其编码基因与应用
CN112538488B (zh) 本氏烟NbSMG7基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN111424022B (zh) 大丽轮枝菌VdEG抗病原菌靶基因片段及其干扰载体和应用
CN110128514B (zh) 水稻孕穗期耐冷性相关蛋白CTB4b及编码基因与应用
CN111235165B (zh) 一种百合的易感真菌基因LrWRKY-S1及其应用
CN110317815A (zh) 一种调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及应用
CN115976040A (zh) 本氏烟NbTSG101基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN116622739B (zh) 番茄SlSUVH2或SlSUVH4基因在调控双生病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN113234729B (zh) 可显著提高棉花黄萎病抗性的基因GauRev2及其应用
CN113881700A (zh) 拟南芥AtSR33基因在抑制芜菁花叶病毒侵染中的应用
CN111621504B (zh) 一种茎瘤芥的抗逆基因BjuIBS及其应用
CN116694652B (zh) 大丽轮枝菌VdNRPS4基因抗病原菌靶基因片段及干扰载体和应用
CN114891827B (zh) 本氏烟mta基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN109628475B (zh) 油菜素内酯合成基因PaCYP724B1在调控植物分枝中的用途
CN116064572B (zh) 一种促进不定根发育的MdWOX11基因、蛋白及其应用
US20230123814A1 (en) Use of alr1 gene or alr1 protein of aluminum ion receptor in regulating plant aluminum resistance
CN111635905B (zh) 枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng6及应用
CN113831398A (zh) 一种PagARGOS蛋白、其编码基因及其应用
CN117126880B (zh) 本氏烟NbKTI1基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN112175049B (zh) 枣疯病植原体效应因子基因Zaofeng8及应用
CN113403326B (zh) 茶树CsERF3基因及其应用
CN116676319A (zh) Nbg3bp1基因在调控植物抗双生病毒中的应用及转基因植物培育方法
CN117736289B (zh) 豇豆脂质转运蛋白及其提高植物抗病毒抗性中的应用
CN115851820B (zh) 一株烟草脉斑驳病毒的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant