CN114606260A

CN114606260A - 一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法

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Publication number: CN114606260A
Application number: CN202210301753.0A
Authority: CN
Inventors: 周杰; 邹金萍; 喻景权
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-03-24
Filing date: 2022-03-24
Publication date: 2022-06-10
Anticipated expiration: 2042-03-24
Also published as: CN114606260B

Abstract

本发明公开了一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法，在含有Mi‑1基因的番茄中沉默或敲除HSP17.6b基因，或抑制HSP17.6b基因表达；所述Mi‑1基因的碱基序列如SEQ ID NO：15所示；所述HSP17.6b基因选自以下两种中任意一种：a、碱基序列如SEQ ID NO：1所示；b、碱基序列与SEQ ID NO：1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA分子。

Description

一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法。

背景技术

RKN(根结线虫，RKNs；Meloidogyne spp.)是一种毁灭性的寄生虫，可在易感宿主的受感染根部寄生从而破坏植物的维管系统，使它们生长不良，通过分泌效应分子来启动和维持宿主根内的摄食细胞，在4-6周内完成其生命周期，对植物造成伤害。

植物通过激活模式触发免疫(PTI)和效应器触发免疫(ETI)来响应根结线虫。在之前的研究中提出了植物免疫系统的锯齿模型，病原体诱导的植物防御反应的两个分支：模式触发免疫和效应器触发免疫。PTI是一种由微生物或病原体相关分子模式(PAMP)诱导的基础防御反应，可以有效抵抗大多数不适应的病原体，从而在病原体感染期间导致植物的基础免疫。抗性R蛋白激活的ETI是第二种免疫反应，通常与识别病原体分泌的毒力效应物有关。ETI比PTI更强，并且通常以称为过敏反应的局部程序性细胞死亡(PCD)达到高潮。

在过去的研究中已经鉴定了许多限制植物病原体建立和传播的R基因，大多数编码结构相似的核苷酸结合位点，富含Leu(亮氨酸)的重复(NBS-LRR)蛋白。第一个分离的R基因是Mi-1，它起源于番茄(Solanumlycopersicum)并赋予对RKN和马铃薯蚜虫的种族特异性抗性。随后，从棉花(Gossypiumhirsutum；GHNTR1)、马铃薯(Solanumtuberosum；Rmc)、胡椒(Capsicum annuum)中克隆或定位了RKN R基因；Me。来自番茄的抗性基因(R基因)，Mi-1，属于核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列(NBS-LRR)类，激活ETI。番茄中的Mi-1在RKN感染后12小时诱导HR，阻断摄食位点的形成，从而抑制RKN的发育，Mi基因还与未知的无毒(Avr)蛋白的直接或间接相互作用引发了激活防御反应的级联信号转导途径。研究发现R蛋白需要共伴侣蛋白复合物HSP90-SGT1-RAR1才能实现正确的折叠、成熟和稳定。热休克蛋白90(HSP90)是高等植物中高度保守的蛋白质，是SKP1(SGT1)的G2等位基因的抑制子，并且是RAR1所必需的。HSP90参与真核细胞中许多关键信号蛋白的组装、成熟和稳定，并且通常以同源二聚体形式存在。HSP90同源二聚体和SGT1都与许多R蛋白相互作用，因此，HSP90、SGT1或RAR1的功能丧失将降低R蛋白的功能，例如MLA1、MAL6、Rx、RPM1、RPS5、Mi-1和I-2，从而损害植物免疫力。此外，转录分析表明，编码热休克转录因子(Hsfs)和热休克蛋白(Hsps)的几个基因在易感基因型中被诱导以响应线虫感染。然而，关于Hsfs和Hsps在线虫抗性中作用的研究仅限于HSP90，它是Mi-1.2介导的对RKNs的抗性所必需的，在病原体攻击期间充当R蛋白信号复合物的伴侣。

目前，关于Hsfs和Hsps在线虫抗性中的作用研究仅限于HSP90，Mi-1促进RKN抗性的分子机制仍不清楚。深入研究番茄对根结线虫的抗性机制，培育抗性强的品种，是目前研究的热点。所以研究植物对根结线虫的抗性机制，为抗性品种选育提供理论依据，具有十分重要的科学依据。

发明内容

Mi-1的温敏性已成为番茄应对根结线虫病的障碍，其内在机制一直未见报道。有文献报道一些抗病蛋白和R复合体相关因子如热激转录因子HSFA1在不同温度下会发生从细胞质向细胞核的转移，也有研究表明R蛋白可能与调控温度响应的关键蛋白如热激蛋白等发生互作。本研究通过对感性品种(Moneymaker)和带有Mi-1基因的抗性品种(Motelle)同时进行高温(28℃)和接种线虫处理，发现常温和高温条件下RKN侵染感性品种导致HSP17.6b的表达上调，而在抗性品种中，常温下RKN侵染HSP17.6b的表达受到抑制，高温下HSP17.6b的表达反而上调。

感性品种(Moneymaker)和抗性品种(Motelle)均可通过ucdavis种子库(网站链接：https://tgrc.ucdavis.edu/)联系获取。在ucdavis种子库Miscellaneous stockslist-2020中，抗性品种Motelle的编号为LA2823，感性品种Moneymaker的编号为LA2706。

本发明提供了一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法。

一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法，在含有Mi-1基因的番茄中沉默或敲除HSP17.6b基因，或抑制HSP17.6b基因表达；

所述Mi-1基因的碱基序列如SEQ ID NO：15所示；

所述HSP17.6b基因选自以下两种中任意一种：

a、碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

b、碱基序列与SEQ ID NO：1所示序列有90％以上同源性且编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA分子。

在一优选例中，所述含有Mi-1基因的番茄为抗性品种Motelle，在ucdavis种子库中编号为LA2823。

在一优选例中，所述根结线虫为南方根结线虫。

在一优选例中，所述温敏抗性指温度大于25℃时番茄对根结线虫的抗性。

在一优选例中，所述提高番茄根结线虫温敏抗性的方法具体包括步骤：

(1)构建hsp17.6b crispr载体的根癌农杆菌工程菌；

(2)将含hsp17.6b根癌农杆菌工程菌介导转化目标番茄外植体，制备得到hsp17.6b基因突变体植株。

在一优选例中，所述提高番茄根结线虫温敏抗性的方法还包括步骤：

(3)将所述hsp17.6b基因突变体植株进行接种根结线虫胁迫处理，观察植株根结数目和表型。

在一优选例中，步骤(3)中，所述接种根结线虫胁迫处理具体为：当hsp17.6b基因突变体植株长至五叶一心时，接种根结线虫。

在一优选例中，接种的根结线虫为处于J2期、具有侵染活力的南方根结线虫。

在一优选例中，所述接种根结线虫胁迫处理的时间为4周。

本发明构建了HSP17.6b转基因植株，提出了一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法，研究过程为在抗性植物Motelle中敲除和过表达番茄HSP17.6b基因，包括步骤：

1、构建hsp17.6b突变体植株：

1)构建含番茄HSP17.6b基因CRISPR/Cas9载体(hsp17.6b crispr载体)的根癌农杆菌工程菌A；

2)将根癌农杆菌工程菌A介导转化目标番茄外植体，制备得到hsp17.6b突变体植株；

2、构建HSP17.6b过表达植株：

1)构建含番茄HSP17.6b基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌B；

2)将根癌农杆菌工程菌B介导转化目标植物外植体，制备得到HSP17.6b基因过表达植株；

3、对hsp17.6b突变体植株和HSP17.6b基因过表达植株接种线虫处理，观察并分析抗性。

本发明是关于碱基序列如SEQ ID NO：1所示的HSP17.6b基因编码的蛋白在调控植物根结线虫抗性中的至少一种应用。具体表现为根结数目增加或减少以及根结线虫抗性增强或降低。

高温下对hsp17.6b突变体植株接种根结线虫后，根结数目减少，抗性增强；在抗性植株Motelle中过表达HSP17.6b基因，接种根结线虫后，根结数目明显增多，抗性减弱。

本发明所提供的培育抗根结线虫侵染的方法，具体如下：

培育具有根结数目减少和/或植株对根结线虫抗性增强目的性状的转基因植物，包括如下步骤：

a)28℃条件下，对hsp17.6b突变体植株和HSP17.6b基因过表达植株接种线虫处理；

b)将hsp17.6b突变体植株和HSP17.6b基因过表达植株与未处理的目标植物和处理的抗性植株相比，得到增强/减弱的目的性状的转基因植物。

所述根癌农杆菌工程菌A的制备方法如下：

(受体番茄材料：Motelle)

(a)从野生型番茄幼嫩叶片中提取总RNA；

(b)将步骤(a)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA；

(c)在CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计番茄HSP17.6B基因的靶序列，为了对基因的大片段进行删除编辑，设计引物sgRNA-HSP17.6b-F1(SEQ ID NO：3)，sgRNA-HSP17.6b-R1(SEQ ID NO：4)，sgRNA-HSP17.6b-F2(SEQ ID NO：5)，sgRNA-HSP17.6b-R2(SEQ ID NO：6)。本体系用的U6启动子，所以分别在sgRNA识别序列两端加上接头序列，理论上，当两个sgRNA同时发挥作用时，它们之间的大片段将被删除。

将合成的sgRNA正反向引物进行退火形成含有粘性末端接头的双链sgRNA，稀释200倍后与经过BbsI酶切过的sgRNA-Cas9骨架载体进行16℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄(Amp⁺)的LB固体培养基37℃过夜培养后，挑取单克隆，用M13F通用引物和退火时的下游引物进行菌液PCR，阳性单克隆进行测序鉴定，获得阳性sgRNA-HSP17.6b-1、sgRNA-HSP17.6b-2克隆。

以AtU6-F-KpnI为前引物，AtsgR-R-EcoRI为后引物，以阳性载体sgRNA-HSP17.6b-2为模板，扩增第二个sgRNA序列，然后连入含有sgRNA-HSP17.6b-1和Cas9序列的骨架载体。将测序正确的阳性质粒sgRNA-HSP17.6b-1-sgRNA-HSP17.6b-2用HindIII和EcoRI双酶切，将回收的sgRNA-HSP17.6b-1-sgRNA-HSP17.6b-2片段和线性化的pCAMBIA1300进行过夜连接，转化到DH5α感受态中，在含有50mg/L卡那霉素的固体LB培养基中37℃过夜培养，挑单克隆培养，用1300-seq-R和AtUBQ-seq-R引物进行菌液PCR鉴定阳性克隆后测序。将阳性质粒命名为pCAMBIA1300-sgRNA-HSP17.6b-1-sgRNA-HSP17.6b-Cas9。

(d)将步骤(c)获得的CRISPR/Cas9载体pCAMBIA1300-sgRNA-HSP17.6b-sgRNA-HSP17.6b-Cas9转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄HSP17.6b基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌A。

所述根癌农杆菌工程菌B的制备方法如下：

(受体番茄材料：Motelle)

质粒：PFGC1008-HA

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101。

采用Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit，将1μg番茄总RNA反转录成cDNA。根据HSP17.6b基因的编码序列，设计扩增出完整序列的引物，使用特异性前引物和后引物克隆得到基因片段，构建到PFGC1008-HA载体中并转化大肠杆菌。所用引物序列及酶切位点见表1，构建好的载体经测序确认无误后，转入到农杆菌GV3101中。

本发明中根结数目的观察方法如下：

采用酸性品红染色法，用于根结线虫感染的根系表型观察。具体方法为：

(1)将根结线虫侵染过的番茄根系用自来水冲洗干净后，用1.5％的次氯酸钠溶液浸泡5～10分钟，以除去根系内杂质；

(2)用自来水冲洗至无刺鼻味，以免影响后续染色效果；

(3)吸干根系水分，在加热煮沸的3.5％的酸性品红溶液中染色；

(4)将根系转移到常温酸性甘油中；

(5)48h后进行拍照和根结数统计。

南方根结线虫的培养与接种处理的步骤为：

(1)用普通栽培番茄在沙壤土中繁殖线虫，室温维持在22～26℃。2个月左右番茄根系形成肉眼可见的根结块。

(2)将收获的根结用1.5％的次氯酸钠水溶液浸泡15min后用水清洗3-5次。

(3)将根系绞碎，匀浆混合液依次过80目、200目、325目筛子，最后在500目筛子上富集根结线虫虫卵。

(4)将卵悬浮液吸冲洗至10cm×10cm的方形培养皿，置于28℃恒温培养箱中，期间注意保持吸水纸呈湿润状态。

(5)2～3天后，接种线虫，每株约接种2000条J2期线虫。

植株栽培在河沙和蛭石1:1混合的塑料杯中。生长条件为：日夜温度23℃/20℃，14h光周期和600μmol m^-2s^-1光照强度。

处理以番茄抗性品种Motelle为空白对照。

线虫处理结束后与相同种植条件下未进行线虫处理的对照组进行比对，观察HSP17.6b基因转基因植株与其空白对照植株间的差异。

附图说明

图1为番茄HSP17.6b基因CRISPR/Cas9载体构建及基因敲除测序结果。

图2为35S：HSP17.6b过表达载体的构建及HSP17.6b过表达转基因阳性植株的验证。其中WT为番茄Motelle；OE为HSP17.6b过表达植株；OE-HSP17.6b-1和OE-HSP17.6b-2为HSP17.6b过表达植株的两个株系。

图3为HSP17.6b在温度胁迫和根结线虫侵染下的基因表达。

图4为接种根结线虫4周后的根结线虫表型观察，植株根部代表性的酸性品红染色结果，标尺＝1cm。

图5为对图4的根结数量统计结果。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下述实施例中所用实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。根结线虫均为南方根结线虫。

实施例1

番茄hsp17.6b突变体植株构建及检测

1.番茄总RNA提取

采用Tiangen Plant total RNA extraction kit提取番茄幼嫩叶片的总RNA，其步骤为：

(1)取0.1g根样在液氮中磨碎，加1mL裂解液RZ，涡旋混匀；

(2)4℃，12000rpm离心5min，去上清，转入新的离心管中；

(3)加入200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温放置3min；

(4)4℃，12000rpm离心10min，样品会分为三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在上层水相中，把水相转移到新管中；

(5)加入0.5倍体积的无水乙醇混合均匀，转入吸附柱CR3，4℃，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液；

(6)加入500μL去蛋白液RD，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；

(7)向吸附柱CR3中加入600μL漂洗液RW，室温静止2min，4℃，12000rpm离心30s，弃废液；

(8)重复操作步骤(7)；

(9)将吸附柱放入2mL收集管中，4℃，12000rpm离心2min，去除残余废液；

(10)吸附柱于超净台吹干5min后，转入一个新的无RNase离心管中，加入50μLRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃，12000rpm离心2min；

(11)用紫外分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀检验RNA样品含量与纯度。

2.基因克隆和根癌农杆菌工程菌A构建

采用Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit，将1μg番茄总RNA反转录成cDNA。在CRISPR-P网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计番茄HSP17.6B基因的靶序列，为了对基因的大片段进行删除编辑，设计引物sgRNA-HSP17.6b-F1(SEQ ID NO：3)，sgRNA-HSP17.6b-R1(SEQ ID NO：4)，sgRNA-HSP17.6b-F2(SEQ ID NO：5)，sgRNA-HSP17.6b-R2(SEQ ID NO：6)。本体系用的U6启动子，所以分别在sgRNA识别序列两端加上接头序列，理论上，当两个sgRNA同时发挥作用时，它们之间的大片段将被删除。

将上述步骤获得的CRISPR/Cas9载体pCAMBIA1300-sgRNA-HSP17.6b-sgRNA-HSP17.6b-Cas9转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄HSP17.6b基因CRISPR/Cas9载体的根癌农杆菌工程菌A。

所用引物序列如下：

sgRNA-HSP17.6b-F1：CTGGTCTCTATTGaacaaagcaccagtggtctagtg(SEQ ID NO：3)

sgRNA-HSP17.6b-R1：CTGGTCTCTGTTTGCATTGCATAACTGAAtgcaccagccgggaa(SEQ IDNO：4)

sgRNA-HSP17.6b-F2：GCTGGTCTCTAAACgttttagagctagaaatagcaagtta(SEQ ID NO：5)

sgRNA-HSP17.6b-R2:GCTGGTCTCTAAACGACATTCATCCTTCTCCTACtgcaccagccgggaa(SEQ ID NO：6)

3.构建番茄hsp17.6b突变体植株

通过农杆菌介导侵染番茄子叶，将目的载体pCAMBIA1300-sgRNA-hsp17.6b-1-sgRNA-hsp17.6b-2-Cas9转化进番茄子叶，利用潮霉素初步筛选出候选转基因植株。以潮霉素基因序列的正向引物和反向引物配对，PCR扩增方法筛选所获得的转基因植株。关于培养基的制备及无菌苗的培养方法与上述过表达植株相同，转化再生时采用含有目的载体质粒的根癌农杆菌工程菌A菌液，通过生根培养、移栽，最后得突变体植株。

4.番茄hsp17.6b突变体植株的PCR检测

使用专用引物检测靶基因序列的变化情况。引物如下，检测片段长度，可以根据PCR产物条带的大小及测序结果筛选出HSP17.6b敲除转基因植株中的纯合突变体。PCR检测结果送测，图1为番茄HSP17.6bCRISPR/Cas9敲除植株测序结果。

所用引物序列：

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO：7)

M36-R：ggtattggtttatctcatcggaactgca(SEQ ID NO：8)

实施例2

番茄HSP17.6b过表达植株构建及检测

1.基因克隆和根癌农杆菌工程菌B构建

按照上述方法，提取番茄RNA，采用Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit，将1μg番茄总RNA反转录成cDNA。以所得cDNA为模板，HSP17.6b-OE-F(SEQ ID NO：9)和HSP17.6b-OE-R(SEQ ID NO：10)为引物(含AscI和SalI限制性酶切位点)对HSP17.6b基因进行PCR扩增，得到番茄HSP17.6b基因的CDs；将CaMV 35S启动子驱动的植物转化载体pFGC1008-HA，用AscI和SalI限制性内切酶进行酶切使其线性化，然后进行片段与载体的同源重组，构建番茄HSP17.6b过表达载体，命名为pFGC1008-HSP17.6b-HA。

由北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示，所编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示，结果表明所克隆的序列与solgenomics中公布的序列(Solyc06g076560)一致。

将获得的过表达载体pFGC1008-HSP17.6b-HA转入根癌农杆菌GV3101中，获得含番茄HSP17.6b基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌B。

所用引物序列及酶切位点如下：

表1 HSP17.6b过表达载体构建所用引物

2.构建番茄HSP17.6b基因过表达植株

通过农杆菌介导侵染番茄子叶，将目的载体pFGC1008-HSP17.6b-3HA转化进番茄子叶，利用潮霉素初步筛选出候选转基因植株。以潮霉素基因序列的正向引物和反向引物配对，PCR扩增方法筛选所获得的转基因植株。

3.转基因植株的检测

利用Western Blot在蛋白水平检测HSP17.6b过表达植株。

取0.3g番茄根于液氮中研磨成粉末，加入适量的蛋白提取液(50mM Tris-HCl，pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100，1mM phenylmethylsulphonyl fluoride(PMSF)和0.2％β-mercaptoethanol)混合成匀浆，在冰上放置15min，4℃，12000g离心20min，取上清。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。蛋白变性后用10％的SDS-PAGE胶分离。SDS-PAGE胶分离蛋白转移至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的TBS缓冲液(20mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，0.1％Tween 20)室温封闭1h，用HA单克隆抗体(Abcam，ab187915)室温孵育1h，再用羊抗鼠(Millipore，AP124P)的HRP二抗室温孵育1h，最后用鲁米诺化学发光检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific，34080)检测。Western Blot结果见图2。

实施例3

温度胁迫和RKN侵染后HSP17.6b在Moneymaker和Motelle中的表达

具体方法如下：

将Moneymaker和Motelle均分为四组，分别为：1)25℃常温不做处理；2)25℃常温接种RKN；3)28℃高温；4)28℃高温接种RKN；

当番茄长至五叶一心时，对实验组进行接种线虫处理，每株约接种2000条J2期线虫，24h后取根样进行qRT-PCR检测HSP17.6b的表达水平。

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)使用Roche

480II实时荧光检测系统，并使用SYBR Green RT-PCR Kit荧光染料试剂盒(南京诺唯赞)进行基因表达分析，引物见表2。在20μL反应体系中包含10μL 2×SYBR Green Supermix，0.4μL正义及反义端的引物(10μM)，1μL cDNA模板以及8.2μL ddH₂O。PCR反应条件为：95℃3min；95℃变性10S，58℃退火30S，40个循环。在每个循环的延伸末期采集荧光数据。番茄Actin基因作为内参。基因相对表达量参照Livak和Schmittgen(Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and the 22DDCT method,Methods,2001,25:402～408)的方法计算。试验均为三次重复的结果。qRT-PCR结果见图3。

表2实时荧光定量PCR引物

实施例4

HSP17.6b在Mi-1介导的根结线虫的抗性中的作用

28℃条件下，对Motelle(抗性植株)，hsp17.6b突变体植株和HSP17.6b基因过表达植株接种线虫处理，每株约接种2000条J2期线虫，4周后，对根结数目进行统计并用酸性品红染色后拍表型(图4、图5)。

Mi-1的温敏性已成为番茄应对根结线虫病的障碍，虽然已知几种HsfAs的转录是由植物中的各种生物胁迫因子诱导的，在之前的研究中发现HsfA1a和Wfi1参与易感番茄中Mi-1.2触发的HSP90的积累和基础防御。但关于HSPs在植物病原体防御中的作用的证据很少。在这里，通过基因表达分析我们发现了一个编码小热激蛋白基因HSP17.6b，常温和高温下，HSP17.6b在感性品种Moneymaker中均能被根结线虫诱导表达；在抗性材料Motelle中，常温下RKN侵染抑制了HSP17.6b的基因表达，而高温下RKN侵染反而提高了HSP17.6b的表达(图3)。为了进一步探究其功能，通过转基因手段获得了以抗性材料Motelle为背景的hsp17.6b突变体植株和HSP17.6b基因过表达植株，首次对其接种根结线虫，通过酸性品红染色，发现Motelle和HSP17.6b基因过表达植株对根结线虫抗性反应大大减弱，而hsp17.6b突变体植株对根结线虫表现出很强的抗性，说明HSP17.6b可能为Mi-1基因潜在的负调控因子，综上，本发明提出一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 465

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 1

atgtctctga tcccaagaat tttcggcgat cgacgaagca gcagcatgtt cgatccattt 60

tcaattgacg tatttgatcc attcagggaa ttaggcttcc caggtaccaa ttcaggggag 120

agctctgcat ttgccaacac acgaatagac tggaaggaaa ctccagaagc tcatgtgttc 180

aaggctgatc ttccagggct taagaaggag gaagtcaaag tggaagtcga ggaggatagg 240

gttcttcaga tcagcggaga gaggaacgtg gagaaggaag ataagaatga caagtggcat 300

cgcgtggagc gaagcagcgg gaaattcatg aggagattta gacttccgga gaatgcaaag 360

atggatcaag ttaaggcttc aatggagaac ggagtgctta ctgttactgt tccaaaagaa 420

gaggtgaaga agcctgaggt caagtccatt gagatttctg gttaa 465

<210> 2

<211> 154

<212> PRT

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 2

Met Ser Leu Ile Pro Arg Ile Phe Gly Asp Arg Arg Ser Ser Ser Met

1 5 10 15

Phe Asp Pro Phe Ser Ile Asp Val Phe Asp Pro Phe Arg Glu Leu Gly

20 25 30

Phe Pro Gly Thr Asn Ser Gly Glu Ser Ser Ala Phe Ala Asn Thr Arg

35 40 45

Ile Asp Trp Lys Glu Thr Pro Glu Ala His Val Phe Lys Ala Asp Leu

50 55 60

Pro Gly Leu Lys Lys Glu Glu Val Lys Val Glu Val Glu Glu Asp Arg

65 70 75 80

Val Leu Gln Ile Ser Gly Glu Arg Asn Val Glu Lys Glu Asp Lys Asn

85 90 95

Asp Lys Trp His Arg Val Glu Arg Ser Ser Gly Lys Phe Met Arg Arg

100 105 110

Phe Arg Leu Pro Glu Asn Ala Lys Met Asp Gln Val Lys Ala Ser Met

115 120 125

Glu Asn Gly Val Leu Thr Val Thr Val Pro Lys Glu Glu Val Lys Lys

130 135 140

Pro Glu Val Lys Ser Ile Glu Ile Ser Gly

145 150

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctggtctcta ttgaacaaag caccagtggt ctagtg 36

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggtctctg tttgcattgc ataactgaat gcaccagccg ggaa 44

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctggtctct aaacgtttta gagctagaaa tagcaagtta 40

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctggtctct aaacgacatt catccttctc ctactgcacc agccgggaa 49

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtattggtt tatctcatcg gaactgca 28

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggcgcgcc atgtctctga tcccaagaat 30

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgcgtcgac accagaaatc tcaatggac 29

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggtcggaat gggacagaag 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcagtcagg agaacagggt 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctctgcatt tgccaacac 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccgctgatct gaagaaccc 19

<210> 15

<211> 3756

<212> DNA

<213> 番茄(Lycopersicon esculentum)

<400> 15

atggaaaaac gaaaagataa tgaagaagca aacaactcat tggtgttatt ttctgctctt 60

agcaaggaca ttgccgatgt tctggttttc ctagagaatg aggaaaatca aaaatctctt 120

gacaaagatg aagttgaaaa tctaaaattg aaaatggcat ttatttgtac atatgttcag 180

ctttcttatt ccgattttga gcagtttgaa gatataatga cgagaaaaag acaacaggtt 240

gagaatctgc ttcaatcact tttggatgat gatgtcctta ctagcctcac cagtaatatg 300

gatgactgta tcagcttgta tcatcgttct tataaatcag atgccatcat gatggatgag 360

caattggact tcctcctctt gaatctgtat catctatcca agcatcacgc tgaaaagata 420

tttcctggag tgactcaata tgaagttctt cagaatgtat gtggcaacct aagagatttc 480

catgggttga tagtgaatgg ttgcattaag catgagatgg ttgagaatgt cttacctctg 540

tttcaactga tggctgaaag agtaggacac ttcctttggg aggataagac tgatgaagac 600

tcggatgagg atgatcagaa tgatagagac tctcgactct tccagctaac acatctactc 660

ttgaagattg ttccaactga actggaggtt atgcacatat gttatacaaa tttgaaagct 720

tcaacttcag cagaagttgg acgcttcatt aagaagctcc tggaaacctc accggatatt 780

ctcagagaat atatcattca actacaagag catatgataa ctgttattcg ccctagcact 840

tcaggggctc gaaacattca tgtcatgatg gaattcctat tacttattct ttctgatatg 900

cccaaggact ttattcatca tgacaaactt tttgatctct tggctcatgt cggagtactt 960

accagggagg tatcaactct tgtacgtgac ttggaagaga aattaaggaa taaagagggt 1020

aataaccaaa caaattgtgc aaccctagac ttgctggaaa atattgaact cctcaagaaa 1080

gatctcaaac atgtttatct gaaagccccg gattcatctc aatgttgctt ccccatgagt 1140

gatggaccac tcttcatgca tcttttacac atgcacttaa atgatttgct agattctaat 1200

gcttattcaa tttctttgat aaaggaagaa atcgagttgg tgaaacaaga cctggaattc 1260

ataagatcat tctttgtgga tgctgagcaa ggattgtata aagatatctg ggcacgtgtc 1320

ctagatgtgg cttatgaggc aaaagatgtc atagattcaa ttattgttcg agataatggt 1380

ctcttacatc ttattttctc acttcccatt accataaaga agatcaaact tatcaaagaa 1440

gagatctctg ctttagatga gagcattccc aaggacagag gtctaatcgc tgtgaactct 1500

cccaagaaac cagttgagag aaagtcattg acaactaata aaataattgt aggttttgag 1560

gaggagacga acttgatact tagaaagctc accagtggac cggcagatct agatgtcatt 1620

tcgatcactg gtatgccggg ttcaggtaaa actactttgg catacaaagt atacaatgat 1680

aagtcagttt ctagccattt cgaccttcgt gcatggtgca cggtcgacca aggatgtgat 1740

gagaagaagt tgttgaataa aattttcaat caagttagtg actcagattc aaaattgagt 1800

gagaatattg atgttcctga taagctacgg aaacaactgt atggaaagag gtatcttatt 1860

gtcttagatg acgtgtggga gactactaca tgggatgagg tgacaagacc ttttcctgaa 1920

gctaagaaag gaagtagaat tattttgaca actcgagaaa aggaagtagc tttgcatgga 1980

aagctctaca ctgatcctct tgaccttcga ttgctaagac ctgatgaaag ttgggaatta 2040

ttagagaaaa gggcatttgg ggacgagagt tgccctgatg aactattaga tgtcggtaaa 2100

gaaattgccg aaaattgtaa agggcttcct ttggtggctg atctgattgc tggagtcatt 2160

gctgggaggg aaaagaaaag gagtgtgtgg cttgaagttc aaagtagttt gagttctttt 2220

attttgaaca gtgaagtgga agtgatgaaa gttatagaat taagttatga ccatttacca 2280

catcacctca agccatgctt gctgtatttt gcaagttttc cgaaggacac ttcattgaca 2340

atctatgagt ttaatgttta tttgggtgct gaaggatttg tgggaaaggc ggagatgaac 2400

agtatggaag aagtggtgaa gatttatatg gatgatttaa tttccagtag cttggtaatt 2460

tgtttcaatg agataggtga tgcactgaat ttccaaattc atgatcttgt gcatgacttt 2520

tgtttgataa aagcaagaaa ggaaaatttg tttgatcaga taagatcaag tgctccaaca 2580

gatttgttgc ctcgtcaaat taccattgat tatgatgatg atgaggagca ctttgggctt 2640

aattttgtca tttttgattc aaataagaaa aggcattctg gtaaacacat ctattctttg 2700

aggatttttg gagacgagct ggatgacagt ctttttgata catttcacct aagacacttg 2760

aggcttctta gagtgttggt cctggatacc tcttttatca tggtgaacga ttctttgctg 2820

aatgaaatat gcatgttgaa tcatttgagg tacttaagaa ttgggacaca agttaaatat 2880

ctgcctttgt ctttctcaaa cctctggaat ctagaattat tgtgggttga aaacaaagaa 2940

tcaaccttga tactattacc aagaatttgg gatcttgtaa agctgcgagt gctgttcgcg 3000

gatgcttgtt ctttctttga tatggatgca gatgaatcaa tattgatagc agaggacaca 3060

aagttagaga agttgagaat attaggggaa ctgttgattt cctattcgaa agatacaaag 3120

aatattttca aaaggtttcc caatcttcag atgcttcagt ttgaactcaa ggagtcatgg 3180

gattattcaa cagagcaaca ttggttcccg aaattggatt gcctaactga actagaaata 3240

ctcaatgtag gttttaaaag ttcaaacaca aaccacagtg ggtcctctgt aaagacaaat 3300

cggccgtggg attttcactt tccttcaaat ttgaaacaac tgtcattgca tgactttcct 3360

ctgacatccg attcactatc aacaatagcg agactgccca accttgaaga gttgtccctt 3420

tatgatgcaa tcatccaggg agaagaatgg aacatggggg aggaagacac ctttgagaat 3480

ctcaaatttt tgaacttgcg tctagcgact ctttccaagt gggaggttgg agaggaatcc 3540

ttccccaatc ttgagaagtt aaaactgcag ggatgtcgta agcttgagga gattccacct 3600

agttttggag atatttattc attgaaagtt atcaaaattg taaagagtcc tcaacttgaa 3660

gattctgctc tcaagattaa ggaatacgct gaagatatga gaggagggag cgagcttcag 3720

atccttggcc agaagaatat ccccttattt aagtag 3756

Claims

1.一种提高番茄根结线虫温敏抗性的方法，其特征在于，在含有Mi-1基因的番茄中沉默或敲除HSP17.6b基因，或抑制HSP17.6b基因表达；

所述Mi-1基因的碱基序列如SEQ ID NO：15所示；

所述HSP17.6b基因选自以下两种中任意一种：

a、碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有Mi-1基因的番茄为抗性品种Motelle，在ucdavis种子库中编号为LA2823。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根结线虫为南方根结线虫。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述温敏抗性指温度大于25℃时番茄对根结线虫的抗性。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，具体包括步骤：

(1)构建hsp17.6b crispr载体的根癌农杆菌工程菌；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述接种根结线虫胁迫处理具体为：当hsp17.6b基因突变体植株长至五叶一心时，接种根结线虫。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，接种的根结线虫为处于J2期、具有侵染活力的南方根结线虫。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述接种根结线虫胁迫处理的时间为4周。