CN103146711B - 人工合成抗蚜虫基因asgna及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种人工合成抗蚜虫基因ASGNA，它包含17个核苷酸的5’非翻译区、21个核苷酸的3’非翻译区和一个长度为474bp开放读码框。其合成方法将雪花莲凝集素基因序列中的122位A改为T，290位G改为T，299位G改为A，350位A改为T，365位T改为C，434位G改为T，470位A改为T，482位G改为T，得到抗蚜虫基因ASGNA的核苷酸序列。人工合成抗蚜虫基因ASGNA在转化拟南芥获得抗蚜虫转基因植物中的应用。构建成的连接有抗蚜虫基因ASGNA的表达载体，转到拟南芥中表达，经过在转基因拟南芥上蚜虫生长以及趋避实验，结果表明，对蚜虫的平均抑制率为44%。

Description

人工合成抗蚜虫基因ASGNA及其合成方法和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及人工合成的抗蚜虫基因-ASGNA序列及编码的氨基酸序列。 

背景技术

蚜虫等某些刺吸式和咀嚼式同翅目的害虫是农业上极为重要的害虫之一，它们靠吸取植物汁液为食，不仅对农作物造成了严重的危害，而且还承担了植物病毒传播的优良媒介。如：2000年至2003年，我国河南省爆发了严重的植物病毒，多种作物受到侵袭，经济损失巨大，其中，蚜虫在病毒的传播中起了主导的作用。使用化学杀虫剂虽然可以在短时间内迅速杀死害虫，但是相继而来也产生了一系列的问题，例如污染环境、破坏生态平衡、杀死蚜虫天敌、危害人类健康，而且化学杀虫剂也极易使蚜虫产生抗性。植物抗蚜基因工程的研究为有效控制蚜虫的危害开辟了新的途径。 

常见的抗蚜基因主要分为两大类，一类是特异性抗蚜基因，如来源于大豆的Rag基因、从野生型莴苣中获得的Nr基因、来源于甜瓜中的Vat基因以及SdI基因和Mi基因等，这些抗蚜基因只针对特异的蚜虫种类有一定的作用。另一类是广谱性抗蚜基因，常见的有三大类：细胞分裂素基因、蛋白酶抑制剂基因和植物凝集素基因。该类抗蚜基因对蚜虫的作用范围广泛，没有专一性，其中植物凝集基因是迄今为止在抗蚜基因工程中研究的最为深入，对蚜虫的生长发育和繁殖能力有明显抑制作用的基因。 

植物凝集素（Lectin）是Stillmark于1888年首次在蓖麻籽萃取物中发现的，广泛存在于植物中，尤其在种子和营养器官中含量丰富。是一类具有特异性糖结合活性的天然植物蛋白，具有一个或多个可与单糖或寡糖特异的可逆结合的非催化结构域。雪花莲凝集素（Galanthus nivalis Agglutinin,GNA）是目前与害虫治理有关且研究的比较多的一种单子叶植物甘露糖结合凝集素。由四个相同的亚基组成的四聚体，富含Leu，Asn和Glu，并含有4个氨基酸残基。成熟的GNA是由4个分子量为12,500Da的单体组成的4聚体蛋白，含有12个甘露糖专一结合位点。每个单体具有3个相同的结合甘露糖位点，通过SDS-PAGE及蔗糖梯度离心证明了GNA的三维结构是由3个反向平行，4个β折叠通过Ω环相连组成的一个β桶。该凝集素对同翅目刺吸式口器的害虫有明显的抑制作用。当植物受到害虫的侵袭时，GNA从受害的植物细胞释放到害虫的消化道中，引发害虫产生毒性，完成其防御功能。在植物未受到侵袭时该凝集素不表现活性。与大多数的凝集素相比，雪花莲凝集 素不会对人畜和蚜虫的天敌产生毒害，因此，在植物基因工程中有着很好的应用前景。Down等人（1996）证实了GNA不仅能抑制马铃薯蚜虫的存活率，而且能抑制其繁殖率，在含0.1%浓度GNA的人工喂养条件下，马铃薯蚜虫的存活率下降了10%，繁殖率减少了65%，存活的虫体大小与对照相比也下降了40%。用过表达GNA的马铃薯进行试验，结果表明，当GNA的表达量占可溶性蛋白的0.3%-0.4%时，转基因植株对蚜虫的抑制率与人工喂养的实验结果一致，没有明显变化。但用含0.05%GNA的饲料喂养甘蔗蛴螬幼虫，结果表明，21天后幼虫生长受到抑制，28天后幼虫死亡率明显上升（Allsopp等，Entomologta Expertmentalis et Applwata80:409-414,1996）。目前转GNA的抗蚜小麦（徐琼芳等，麦类作物学报，2005,25(3)：7-10），抗蚜水稻（Nagadhara等，Theor Appl Genet,2004,109:1399-1405），抗蚜大白菜（杨广东等，园艺学报,2003,30(3):341-342），抗蚜烟草（Hider等，Transgenic Reserach，1995，(4)：18-25）等都表现出对蚜虫有抑制作用。 

对于GNA的杀虫机理目前已有一些初步的研究报道：Zhu等指出植物凝集素能结合到害虫消化道上皮细胞糖蛋白受体上，对害虫产生局部或系统毒害效果，从而抑制其生长，甚至将其杀死；有研究表明在褐飞虱的血淋巴中出现了GNA，说明GNA可以穿透中肠细胞壁进入循环系统，引起中毒反应。Du等研究发现GNA在褐飞虱的中肠中与400kd的铁蛋白受体相结合，破坏了寄主体内的铁平衡。另外，王庆军等证明了它还可在害虫的消化道内诱发病灶，促进消化道中细菌的繁殖，对害虫本身造成危害，抑制害虫生长、发育及繁殖。 

但是，在先前的报道中，表达GNA的转基因植株只能对蚜口密度产生50%的抑制率，并不能对所有蚜虫产生抑制作用，所以，GNA的蚜虫抑制率有待进一步提高。袁正强等人（2001，植物学报）对GNA基因进行了改造和转基因烟草抗蚜虫实验，结果表明蚜虫抑制率提高到了70%。此外，来源于雪花莲的植物凝集素基因虽然有较好的抗蚜性，但该基因在单子叶植物中高效表达，适合于单子叶植物转基因抗虫研究，而天然的GNA转入双子叶植物中，该基因表达量低，达不到预期的抗蚜效果，因此需要对天然GNA进行修饰改造，以使其适合拟南芥、棉花等双子叶植物的转基因应用。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术的缺点，提供一种适合双子叶植物-拟南芥的人工合成抗蚜虫基因ASGNA。 

本发明所要解决的另一个技术问题在于提供一种人工合成抗蚜虫基因ASGNA的方法。 

本发明所要解决的还有一个技术问题在于为抗蚜虫基因ASGNA提供一种用途。 

解决上述技术问题所采用的技术方案是：抗蚜虫基因ASGNA包含有17个核苷酸的5’ 非翻译区、21个核苷酸的3’非翻译区和一个长度为474bp开放读码框，其核苷酸序列如下： 

CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCT 

TGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTT 

TATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCT 

CCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCA 

AGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGA 

TCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTG 

GAAAGATTAAGCTTGTGACTGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTT 

抗蚜虫基因ASGNA的合成方法包括下述步骤： 

1、合成抗蚜虫基因ASGNA 

（1）合成抗蚜虫基因ASGNA 

雪花莲凝集素基因LEC GNA2（基因序列号为GenBank:M55556.1）的序列如下: 

CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCT 

TGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTT 

TATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCT 

CCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCGAACAAACCGATTTGGGCA 

AGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATAGGAATGTTGTGATCTACGGAACTGA 

TCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTG 

GAAAGATAAAGCTTGTGACGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAAT 

AAGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCG 

将雪花莲凝集素基因序列中的122位A改为T，290位G改为T，299位G改为A，350位A改为T，365位T改为C，434位G改为T，470位A改为T，482位G改为T，得到抗蚜虫基因ASGNA的核苷酸序列，根据此序列设计如下12条引物，其中P1，P2，P3，P4，P5，P6为上游引物，P7，P8，P9，P10，P11，P12为下游引物： 

P1:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTT 

P2:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATT 

P3:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTA 

P4:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCT 

P5:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACA 

P6:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGAT 

P7:AAATTGGTTTGTTAGATGGGTTGTACACCACGAGGTTCCCATCAGTCTGCATGCTGA 

P8:ATGCACACGTAATTCCCATTTTGGCCTCCAGTGTTGCTTGCCCAAATTGGTTTGTTAGA 

P9:AACGATCAGTTCCGTAGATCACAACGTTCCTATCCTTCTGAAGGATGCACACGTAAT 

P10:AGATGCGGGAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAGTAGCCCAACGATCAGTTCCGT 

P11:AAGCTTAATCTTTCCAGCAGTAGGATATTTCTCTGAGGGTGGAGATGCGGGAATTCCA 

P12:AAGTTAAAAGATCACCGGTCATTACTTTGCAGTCACAAGCTTAATCTTTCCAGCA 

上述12条引物由上海生工生物工程有限公司合成，全长的抗蚜虫基因ASGNA按下述方法连接合成： 

将10μmol/μL的P6上游引物与10μmol/μL的P7下游引物、Primer HS DNAPolymerase with GC Buffer（购大连于宝生物工程有限公司,货号：DR044A）、双蒸水按体积比为1:1:10:8加入PCR管中，72℃延伸40min，得到长度为97bp如下的核苷酸片段： 

TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAA 

CCCATCTAACAAACCAATTT 

用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P5引物为上游引物、P8引物为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P5引物、10μmol/μL的P8引物，Primer HS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入到PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得183bp的核苷酸片段如下： 

AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCT 

GCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACT 

GGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCAT 

用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P4引物作为上游引物、P9引物作为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P4引物、10μmol/μL的P9引物，PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得269bp的核苷酸片段如下： 

TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACA 

AGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTG 

GTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCA 

GAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTT 

用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P3引物为上游引物、P10引物为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P3引物、10μmol/μL的P10引物，Primer HS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得354bp的核苷酸片段如下： 

CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTAT 

CATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCC 

GTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGC 

AACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCG 

TTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCT 

用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P2引物为上游引物、P11引物为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P2引物、10μmol/μL的P11引物，PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得440bp的核苷酸片段如下： 

TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACT 

CTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGA 

CGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGA 

ACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGC 

ATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGG 

AATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTT 

用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P1引物为上游引物、P12引物为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P1引物、10μmol/μL的P12引物，PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得全长为512bp的核苷酸片段，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，得到抗蚜虫基因ASGNA。 

（2）-T Easy Vector与抗蚜虫基因ASGNA的连接 

用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段，并对扩增片段进行回收，取浓度为50ng/μL回收产物、10×PCR缓冲液，浓度为10μmol/μL dATP、活力单位为1U/UL TaqDNA聚合酶加入PCR管中，按7.5:1:0.5:1混合，72℃延伸30分钟，在5’端和3’端分别加脱氧腺苷酸—dA，用30mL质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA纯化试剂盒回收，用T4连接酶连接片段与-T Easy Vector，并转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，测序鉴定正确后命名为TEasy-ASGNA；大肠杆菌DH5α和-T Easy Vector购于Promega公司。 

上述人工合成的抗蚜虫基因ASGNA在转化拟南芥获得抗蚜虫转基因植物中的应用，其使用方法如下： 

1、pBI121-ASGNA双元表达载体的构建 

（1）带酶切位点XbaⅠ、ScaⅠ的抗蚜虫基因ASGNA的获得 

设计PCR扩增引物，引物序列为： 

F:ATTTCTAGACAACTACAAGTTACAAAATGG 

R:ATTGAGCTCAAGTTAAAAGATCACCGGT 

采用常规PCR方法扩增获得5’端带XbaⅠ酶切位点和3’端带ScaⅠ酶切位点的抗蚜虫基因ASGNA，与-T Easy Vector连接，按-T EasyVector试剂盒的操作步骤进行，获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，测序鉴定后命名为TEasy-XbaⅠ-ASGNA-ScaⅠ质粒。 

（2）表达载体pBI121与ASGNA的连接 

对pBI121载体及TEasy-XhoⅠ-ASGNA-XbaⅠ质粒分别用XbaⅠ和ScaⅠ进行双酶切，反应体系在37℃水浴2小时，30ml质量浓度为1.0%的琼脂糖凝胶分离条带并回收，pBI121双酶切后回收12858bp的片段，命名为pBI121-1，TEasy-XhoⅠ-ASGNA-XbaⅠ质粒双酶切后回收518bp条带，命名为ASGNA-1，具体回收步骤按DNA纯化试剂盒说明书进行。用T4DNA连接酶连接pBI121-1与ASGNA-1，连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含50mg/L的卡那霉素的LB筛选培养基上筛选阳性菌落，摇菌提取质粒，测序鉴定后命名为pBI121-ASGNA双元表达载体。 

上述载体构建过程中所用pBI121植物表达载体购于北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：MP-091，T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液、DNA胶回收试剂盒购于Promega公司，XbaI、SacI、10×M缓冲液缓冲液购于大连宝生物工程有限公司。 

2、转抗虫基因ASGNA拟南芥的获得 

将表达载体pBI121-ASGNA转入农杆菌GV3101中，在含有50mg/L卡那霉素的培养基上挑取含有目的基因的农杆菌单克隆，接种于10～20mL LB液体筛选培养基（含有50mg/L利福平,50mg/L庆大霉素,50mg/L卡那霉素）中，28℃200转/分钟培养24小时。取15mL活化的菌液接种于1～2L LB液体培养基（含有50mg/L利福平,50mg/L庆大霉素,50mg/L卡那霉素）中，28℃200转/分钟培养至600nm的吸光值为0.8-1.0。离心收集菌体，重悬于1～2L转化液中，转化液配比为：1/2×MS，5%蔗糖，1×B5有机，0.044μmol/L6-BA，50μl/L Silwet L-77（购于中科瑞泰生物科技有限公司，货号：Silwet），蒸馏水定容至1L，用0.4mol/L NaOH调pH至5.8。 

将野生拟南芥播种于蛭石上，用1/3MS培养液浇灌，置于温室，20～22℃、相对湿度为60%～70%、光照16小时，黑暗8小时，光照强度5000～7000Lux培养至盛花期时，将拟南芥倒浸于含农杆菌转化液的烧杯中，抽真空，维持0.05Mpa压力5分钟。取出拟南芥植株避光侧放24小时后扶正，继续培养待种子成熟。 

成熟的拟南芥种子经质量浓度为75%的乙醇，质量浓度为0.1%的氯化汞消毒后，用双蒸水冲洗，均匀铺在含有50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上，22℃，光照16小时，黑暗8小时，光照强度5000～7000Lux培养，培养1.5～2周后筛选阳性植株，移栽至蛭石上，用1/3MS培养液浇灌，置于温室，20～22℃、相对湿度为60%～70%、光照16小时，黑暗8小时，光照强度5000～7000Lux培养，生长30～40天，进行分子鉴定，鉴定为阳 性的植株，即为获得的转ASGNA拟南芥，转基因拟南芥植株具有抑制蚜虫生长，减少蚜虫在拟南芥植株上分布数量的作用。 

采用人工合成的抗蚜虫基因ASGNA，构建成连接有抗蚜虫基因ASGNA的表达载体，转到拟南芥中表达，经过在转基因拟南芥上蚜虫生长以及趋避实验，结果表明，对蚜虫的平均抑制率为44%，蚜虫对转ASGNA基因的拟南芥的趋避效应都要高于野生的拟南芥，说明转ASGNA基因的拟南芥对蚜虫有抗性。 

附图说明

图1是pBI121-ASGNA植物双元表达载体T-DNA区的结构示意图。 

图2是转抗蚜虫基因ASGNA拟南芥对蚜虫存活的抑制率曲线。 

图3是转抗蚜虫基因ASGNA拟南芥对蚜虫的趋避计数曲线。 

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。 

实施例1 

全长512bp的抗蚜虫基因ASGNA，包含17个核苷酸的5’非翻译区（1位核苷酸-17位核苷酸），21个核苷酸的3’非翻译区（492位核苷酸-512位核苷酸）和一个长度为474bp开放读码框（18位核苷酸-491位核苷酸），其核苷酸序列如下： 

CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCG 

CCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTT 

TGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAA 

GTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACG 

TGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCT 

GCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCAT 

CTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATT 

ACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTG 

ATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCAT 

CTCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATTAAGCTTGTGA 

CTGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTT 

上述抗蚜虫基因ASGNA的合成方法由下述步骤组成： 

1、合成抗蚜虫基因ASGNA 

（1）合成抗蚜虫基因ASGNA 

雪花莲凝集素基因LEC GNA2（基因序列号为GenBank:M55556.1）的序列如下: 

CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTG 

GTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTA 

CAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGG 

TCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCT 

GCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCGAACAAACCGA 

TTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATA 

GGAATGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTG 

GAATTCCCGCATCGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATAAAGCTTGTGA 

CGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAATA 

AGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCG 

将雪花莲凝集素基因序列中的122位A改为T，290位G改为T，299位G改为A，350位A改为T，365位T改为C，434位G改为T，470位A改为T，482位G改为T，得到抗蚜虫基因ASGNA的核苷酸序列，根据此序列设计如下12条引物,其中P1，P2，P3，P4，P5，P6为上游引物，P7，P8，P9，P10，P11，P12为下游引物： 

P1:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTT 

P2:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATT 

P3:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTA 

P4:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCT 

P5:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACA 

P6:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGAT 

P7:AAATTGGTTTGTTAGATGGGTTGTACACCACGAGGTTCCCATCAGTCTGCATGCTGA 

P8:ATGCACACGTAATTCCCATTTTGGCCTCCAGTGTTGCTTGCCCAAATTGGTTTGTTAGA 

P9:AACGATCAGTTCCGTAGATCACAACGTTCCTATCCTTCTGAAGGATGCACACGTAAT 

P10:AGATGCGGGAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAGTAGCCCAACGATCAGTTCCGT 

P11:AAGCTTAATCTTTCCAGCAGTAGGATATTTCTCTGAGGGTGGAGATGCGGGAATTCCA 

P12:AAGTTAAAAGATCACCGGTCATTACTTTGCAGTCACAAGCTTAATCTTTCCAGCA 

上述12条引物由上海生工生物工程有限公司合成，全长的抗蚜虫基因ASGNA按下述方法连接合成： 

将1μL浓度为10μmol/μL的P6上游引物与1μL浓度为10μmol/μL的P7下游引物、10μL PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer（大连宝生物工程有限公司，货号：DR044A）、8μL双蒸水加入PCR管中，72℃延伸40min，得到长度为97bp如下的核苷酸片段： 

TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGG 

AACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTT 

用30mL质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P5引物为上游引物、P8引物为下游引物，取1μL100ng/μL的模板、1μL浓度为10μmol/μL的P5引物、1μL浓度为10μmol/μL的P8引物，10μL PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、7μL双蒸水加入到PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得183bp 的核苷酸片段如下： 

AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGG 

TGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAA 

CCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTG 

CAT 

用30mL质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P4引物作为上游引物、P9引物作为下游引物，取1μL100ng/μL的模板、1μL浓度为10μmol/μL的P4引物、1μL浓度为10μmol/μL的P9引物，10μL PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、7μL双蒸水加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得269bp的核苷酸片段如下： 

TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGT 

CTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTG 

CTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAAT 

TTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAG 

GAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTT 

用30mL质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P3引物为上游引物、P10引物为下游引物，取1μL100ng/μL的模板、1μL浓度为10μmol/μL的P3引物、1μL浓度为10μmol/μL的P10引物，10μL PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、7μL双蒸水加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得354bp的核苷酸片段如下： 

CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTAC 

GGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAG 

CCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACT 

GATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGA 

GGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGA 

ACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCT 

用30mL质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P2引物为上游引物、P11引物为下游引物，取1μL100ng/μL的模板、1μL浓度为10μmol/μL的P2引物、1μL浓度为10μmol/μL的P11引物，10μL PrimerHS DNAPolymerase with GC Buffer、7μL双蒸水加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得440bp的核苷酸片段如下： 

TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTT 

TGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTA 

TCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAA 

ACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGG 

TGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATT 

ACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTA 

CTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTA 

CTGCTGGAAAGATTAAGCTT 

用30mL质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P1引物为上游引物、P12引物为下游引物，取1μL100ng/μL的模板、1μL浓度为10μmol/μL的P1引物、1μL浓度为10μmol/μL的P12引物，1μL PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、7μL双蒸水加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得全长为512bp的核苷酸片段，用质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，得到抗蚜虫基因ASGNA。 

CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTG 

GTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTA 

CAGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGG 

TCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCT 

GCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCGAACAAACCGA 

TTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTACAGAAGGATA 

GGAATGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTG 

GAATTCCCGCATCGCCACCCTCAGAGAAATATCCTACTGCTGGAAAGATAAAGCTTGTGA 

CGGCAAAGTAATGACCGGTGATCTTTTAACTTGCATGTATGTGGGAAGAGTAATAAAATA 

AGTGCATTTGAGATAATCGACCTCGTCGCG 

（2）-T Easy Vector与抗蚜虫ASGNA基因的连接 

用30mL质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳分离条带，用DNA纯化试剂盒回收518bp条带，取7.5μL浓度为50ng/μL回收产物、1μL10×PCR缓冲液，0.5μL浓度为10μmol/μL dATP、1μL活力单位为1U/UL TaqDNA聚合酶加入PCR管中，72℃延伸30分钟，在5’端和3’端分别加脱氧腺苷酸—dA，用30mL质量浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA纯化试剂盒回收，用T4连接酶连接片段与-T Easy Vector，按-T Easy载体试剂盒的操作步骤进行，连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，经测序鉴定正确后命名为T Easy-ASGNA；大肠杆菌DH5α和-T Easy载体试剂盒购置于Promega公司。 

2、pBI121-ASGNA双元表达载体的构建 

（1）带酶切位点XbaⅠ、ScaⅠ的抗蚜虫基因ASGNA的获得 

设计PCR扩增引物，引物序列为： 

F:ATTTCTAGACAACTACAAGTTACAAAATGG 

R:ATTGAGCTCAAGTTAAAAGATCACCGGT 

采用常规PCR方法扩增获得5’端带XbaⅠ酶切位点和3’端带ScaⅠ酶切位点的抗蚜虫基因ASGNA，与-T Easy Vector连接，按-T EasyVector试剂盒的操作步骤进行，获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，测序鉴定后命名为TEasy-XbaⅠ-ASGNA-ScaⅠ质粒。 

（2）表达载体pBI121与ASGNA的连接 

对pBI121载体及TEasy-XhoⅠ-ASGNA-XbaⅠ质粒分别用XbaⅠ和ScaⅠ进行双酶切，各自的双酶切体系如下： 

上述体系各自混匀，37℃水浴2小时，30ml质量浓度为1.0%的琼脂糖凝胶分离条带并回收，pBI121双酶切后回收12858bp的片段，命名为pBI121-1，TEasy-XhoⅠ-ASGNA-XbaⅠ质粒双酶切后回收518bp条带，命名为ASGNA-1，具体回收步骤按DNA纯化试剂盒说明书进行。 

T4DNA连接酶连接pBI121-1与ASGNA-1，反应体系如下： 

上述连接体系混匀，16℃连接16小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，在含50mg/L的卡那霉素的LB筛选培养基上筛选阳性菌落，摇菌提取质粒，测序鉴定后命名为pBI121-ASGNA双元表达载体，其T-DNA区的结构示意图见图1。在图1中，RB为T-DNA的右边界；LB为T-DNA的左边界；Nos Pro.为306bp的章鱼碱合酶基因启动子；NPT II为794bp的筛选标记基因-新霉素磷酸转移酶II基因；Nos为255bp 的章鱼碱合酶基因终止子；CaMV35S为834bp花椰菜花叶病毒的35S启动子；ASGNA是512bp的抗蚜基因ASGNA的DNA序列；Nos3’是ASGNA基因后的章鱼碱合酶基因终止子。 

上述载体构建过程中所用pBI121植物表达载体购于北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：MP-091，T4DNA连接酶，10×T4DNA连接酶缓冲液、DNA胶回收试剂盒购于Promega公司，XbaI、SacI、10×M缓冲液缓冲液购于大连宝生物工程有限公司。 

实施例2 

实施例1合成的抗蚜虫基因ASGNA在双子叶植物抗蚜虫中的用途，其使用方法如下： 

将表达载体pBI121-ASGNA转入农杆菌GV3101中，在含有50mg/L卡那霉素的培养基上挑取含有目的基因的农杆菌单克隆，接种于15mL LB液体筛选培养基（含有50mg/L利福平,50mg/L庆大霉素,50mg/L卡那霉素）中，28℃200转/分钟培养24小时。取15mL活化的菌液接种于1L LB液体培养基（含有50mg/L利福平,50mg/L庆大霉素,50mg/L卡那霉素）中，28℃200转/分钟培养至600nm的吸光值为0.8-1.0。离心收集菌体，重悬于1.5L转化液中，转化液配比为：1/2×MS，5%蔗糖，1×B5有机，0.044μmol/L6-BA，50μl/L Silwet L-77（购于中科瑞泰生物科技有限公司，货号：Silwet），蒸馏水定容至1L，用0.4mol/L NaOH调节pH5.8。 

将野生拟南芥播种于蛭石上，用1/3MS培养液浇灌，置于温室，20～22℃、相对湿度为60%～70%、光照16小时，黑暗8小时，光照强度5000～7000Lux培养至盛花期时，将拟南芥倒浸于含农杆菌转化液的烧杯中，抽真空，维持0.05Mpa压力5分钟。取出拟南芥植株避光侧放24小时后扶正，继续培养待种子成熟。 

成熟的拟南芥种子经质量浓度为75%的乙醇，质量浓度为0.1%的氯化汞消毒后，用双蒸水冲洗5次以上均匀铺在含有50mg/L卡那霉素的MS固体培养基上，22℃，光照16小时，黑暗8小时，光照强度5000～7000Lux培养，培养1.5～2周后筛选阳性植株，移栽至蛭石上，用1/3MS培养液浇灌，置于温室，20～22℃、相对湿度为60%～70%、光照16小时，黑暗8小时，光照强度5000～7000Lux培养，生长30～40天，进行分子鉴定，鉴定为阳性的植株，即为获得的转ASGNA拟南芥，转基因拟南芥植株具有抑制蚜虫生长，减少蚜虫在拟南芥植株上分布数量的作用。 

实施例3 

在实施例2中，将表达载体pBI121-ASGNA转入农杆菌GV3101中，在含有50mg/L卡那霉素的培养基上挑取含有目的基因的农杆菌单克隆，接种于10mL LB液体筛选培养基中，28℃200转/分钟培养24小时。取15mL活化的菌液接种于1L LB液体培养基中，28℃200转/分钟培养至600nm的吸光值为0.8～1.0。离心收集菌体，重悬于1L转化液中，蒸馏水定容至1L，用0.4mol/L NaOH调节pH5.8。其它步骤与实施例2相同。 

实施例4 

在实施例2中，将表达载体pBI121-ASGNA转入农杆菌GV3101中，在含有50mg/L卡那霉素的培养基上挑取含有目的基因的农杆菌单克隆，接种于20mL LB液体筛选培养基中，28℃200转/分钟培养24小时。取15mL活化的菌液接种于1L LB液体培养基中，28℃200转/分钟培养至600nm的吸光值为0.8～1.0。离心收集菌体，重悬于1L转化液中，蒸馏水定容至2L，用0.4mol/L NaOH调节pH5.8。其它步骤与实施例2相同。 

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1合成的抗蚜虫基因ASGNA，连接CaMV35S启动子后转入拟南芥，获得转基因植株，该转基因植株对蚜虫的生长抑制及趋避性进行了实验，实验结果如下： 

1、拟南芥转基因植株对蚜虫生长的影响 

选取7个转抗虫基因ASGNA拟南芥株系，每株系各取30片叶子，置于养虫盒中，用软毛笔接入1日龄的蚜虫幼虫30头，蚜虫幼虫可在叶片上自由活动，每日定时更换叶片。同时以同期生长的野生拟南芥叶片作为对照，饲喂方法与转基因植株相同。连续观察一周，每天上午9:00统计一次蚜虫虫的存活数目及死亡数目，幷计算抑蚜率。在型号RXZ-500D的人工气候培养箱中培养蚜虫，培养条件为温度24±1℃，相对湿度85%–90%，光照16小时，黑暗8小时，光照强度5000～6000Lux，抗蚜效果的评价按如下公式计算: 

蚜口密度抑制率%=（对照植株存活虫数-转基因植株存活虫数）/对照植株存活虫数×100%。 

经过一周的蚜虫喂养试验，结果显示7个转ASGNA基因的拟南芥株系均有不同程度的抑蚜效果，蚜口密度抑制率从12%-75%不等，对蚜虫的平均抑制率为44%，这一结果表明人工合成的ASGNA基因有较高的抗蚜活性，实验和计算结果见图2。由附图2可见，转ASGNA基因的拟南芥抑制蚜虫的效果比野生拟南芥好。 

2、拟南芥转基因植株对蚜虫逃逸的影响 

对野生拟南芥和转ASGNA基因的拟南芥接种生长3～5天的蚜虫，每组8株，各接种15只蚜虫，分别在接种后1、3、6、9、12、15、18、21、24小时计数检测各组植株上蚜虫的逃逸数量，试验重复3次，经过统计，实验结果见图3。由图3可见，每个时间段，蚜虫对转ASGNA基因的拟南芥的趋避效应都要高于野生的拟南芥，说明转ASGNA基因的拟南芥对蚜虫有抗性。 

Claims (3)

1.一种人工合成抗蚜虫基因ASGNA，其特征在于它包含有17个核苷酸的5’非翻译区、21个核苷酸的3’非翻译区和一个长度为474bp开放读码框，其序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1抗蚜虫基因ASGNA的合成方法，其特征在于它包括下述步骤：

(1)确定抗蚜虫基因ASGNA序列及设计引物

基因序列号为GenBank:M55556.1的雪花莲凝集素基因LEC GNA2，将雪花莲凝集素基因序列中的122位A改为T，290位G改为T，299位G改为A，350位A改为T，365位T改为C，434位G改为T，470位A改为T，482位G改为T，得到抗蚜虫基因ASGNA的核苷酸序列，根据此序列设计如下12条引物：

P1:CAACTACAAGTTACAAAATGGCTAAGGCAAGTCTCCTCATTTTGGCCGCCATCTT

P2:TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATT

P3:CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTA

P4:TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCT

P5:AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACA

P6:TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGAT

P7:AAATTGGTTTGTTAGATGGGTTGTACACCACGAGGTTCCCATCAGTCTGCATGCTGA

P8:ATGCACACGTAATTCCCATTTTGGCCTCCAGTGTTGCTTGCCCAAATTGGTTTGTTAGA

P9:AACGATCAGTTCCGTAGATCACAACGTTCCTATCCTTCTGAAGGATGCACACGTAAT

P10:AGATGCGGGAATTCCAACAAGTCCGGTGTGAGTTCCAGTAGCCCAACGATCAGTTCCGT

P11:AAGCTTAATCTTTCCAGCAGTAGGATATTTCTCTGAGGGTGGAGATGCGGGAATTCCA

P12:AAGTTAAAAGATCACCGGTCATTACTTTGCAGTCACAAGCTTAATCTTTCCAGCA

(2)全长的抗蚜虫基因ASGNA连接合成

将10μmol/μL的P6上游引物与10μmol/μL的P7下游引物、PrimerHS DNAPolymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:10:8加入PCR管中，72℃延伸40min，得到长度为97bp如下的核苷酸片段：

TGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGG

AACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTT

用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P5引物为上游引物、P8引物为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P5引物、10μmol/μL的P8引物、PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入到PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得183bp的核苷酸片段如下：

AGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGG

TGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAA

CCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTG

CAT

用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P4引物作为上游引物、P9引物作为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P4引物、10μmol/μL的P9引物、PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得269bp的核苷酸片段如下：

TGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGT

CTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTG

CTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAAT

TTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAG

GAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTT

用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P3引物为上游引物、P10引物为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P3引物、10μmol/μL的P10引物、PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得354bp的核苷酸片段如下：

CTGAGTGACAATATTTTGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTATCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAAACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGGTGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATTACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTACTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCT

用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P2引物为上游引物、P11引物为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P2引物、10μmol/μL的P11引物、PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得440bp的核苷酸片段如下：

TCATTTTGGCCGCCATCTTCCTTGGTGTCATCACACCATCTTGCCTGAGTGACAATATTT

TGTACTCCGGTGAGACTCTCTCTACTGGGGAATTTCTCAACTACGGAAGTTTCGTTTTTA

TCATGCAAGAGGACTGCAATCTGGTCTTGTACGACGTGGACAAGCCAATCTGGGCAACAA

ACACAGGTGGTCTCTCCCGTAGCTGCTTCCTCAGCATGCAGACTGATGGGAACCTCGTGG

TGTACAACCCATCTAACAAACCAATTTGGGCAAGCAACACTGGAGGCCAAAATGGGAATT

ACGTGTGCATCCTTCAGAAGGATAGGAACGTTGTGATCTACGGAACTGATCGTTGGGCTA

CTGGAACTCACACCGGACTTGTTGGAATTCCCGCATCTCCACCCTCAGAGAAATATCCTA

CTGCTGGAAGATTAAGCTT

用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，以该片段为模板，用P1引物为上游引物、P12引物为下游引物，取100ng/μL的模板、10μmol/μL的P1引物、10μmol/μL的P12引物、PrimerHS DNA Polymerase with GC Buffer、双蒸水按体积比为1:1:1:10:7加入PCR管中，95℃预变性3分钟，94℃变性30秒，50℃退火40秒，72℃延伸1分钟，25次循环后，72℃再延伸5分钟，获得全长为512bp的核苷酸片段，用质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳回收该片段，得到抗蚜虫基因ASGNA，其序列如SEQ ID NO：1所示。

3.人工合成抗蚜虫基因ASGNA在转化拟南芥获得抗蚜虫转基因植物中的用途。