CN104131015B - 一种岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种岷江百合病程相关蛋白10基因<i>LrPR10-5</i>的应用，<i>LrPR10-5</i>的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所述，编码病程相关蛋白10蛋白，本发明通过功能基因组学相关技术研究证实<i>LrPR10-5</i>基因具有提高植物抗真菌的功能，将本发明抗真菌<i>LrPR10-5</i>基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达，结果转基因烟草植株具有很强的体外抗真菌活性，实验结果表明超表达<i>LrPR10-5</i>的转基因烟草对灰葡萄孢、立枯丝核菌以及核盘菌等多种真菌的生长具有明显的抑制作用。

Description

一种岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌活性的岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5的应用。

背景技术

植物病害是农业生产中一个非常棘手的问题，尤其是真菌病害，约占到植物总病害的80％，严重影响着农作物的产量和品质。依靠植物育种培育抗性品种、使用化学农药或采取轮作等耕作制度等传统病害防治方法取得了一定成效，然而这些方法均存在或多或少的弊端，如传统育种周期长、化学农药残留高且易对环境造成污染且费时费力等，所以传统控制植物病害的方法不能彻底植物真菌病害的问题。随着重组DNA技术的创立和发展，利用基因工程技术来培育植物新品种以应对真菌病害已取得初步成效，且有望从根本上解决真菌病害问题。

植物在生长发育过程中常遭受多种生物和非生物因子的胁迫，如干旱、寒冷、真菌侵染等，因此进化出一系列的防御机制来抵御逆境胁迫，其中病程相关蛋白(pathogenesis-relatedprotein，PR)的激活和积累是植物防御反应的重要组成部分。根据其结构、亲源关系和生物活性，PR蛋白一般分为17个家族(PR1-PR17)，广泛存在于单子叶植物和双子叶植物中。1988年，Somssich等用激发子处理欧芹细胞首次发现PR-10蛋白(SomssichIE,SchmelzerE,KawalleckP,etal.Genestructureandinsitutranscriptlocalizationofpathogenesis-relatedprotein1inparsley.MolGenGenet,1988,213:93-98)，随后在水稻、辣椒、刺茄、和花生等植物中相继发现PR-10家族成员，但至今仍未见到此种蛋白出现在非植物组织中的报道。大部分的PR蛋白为胞外蛋白，而PR-10则是典型的胞内蛋白，存在于细胞溶质中。另外，PR-10还具有分子量较低(16-19kDa)、等电点偏酸性以及三级结构高度保守等特性。PR-10与主要的树木花粉过敏原和食物过敏原十分相似，并且属于Betv1-like超家族。其二级结构中存在一个高度保守的氨基酸序列GXGGXG(X为任意氨基酸)，被称为“P-loop”基序。该基序广泛存在于核酸结合蛋白中，并且其磷酸化可能与PR-10的核糖核酸酶活性有关。

作为植物防御系统中的可诱导组分，PR-10受多种病原菌的诱导表达。刺茄SsPR-10受TMV诱导上调表达(LiuXJ,HuangBB,LinJ,etal.Anovelpathogenesis-relatedprotein(SsPR10)fromSolanumsurattensewithribonucleolyticandantimicrobialactivityisstressandpathogen-inducible.JPlantPhysiol,2006,163:546-555)。用欧文氏菌、假单胞菌、构巢曲霉和青霉菌分别侵染紫草叶片，24h后收集感染叶片和远离感染部位的叶片分别进行检测，结果显示病原菌能明显诱导受侵害叶片中LePR-1(紫草中的一种PR-10蛋白基因)的转录，而且在远离感染部位的叶片中病原菌也能系统性诱导LePR-1的转录。这些结果表明LePR-1基因能受多种病原体浸染而诱导表达(HwangHJ,KimH,WangCS.Geneencodingpathogenesis-related10proteinofproteinofLithospermumerythrorhizonisresponsivetoexogenousstimulirelatedtotheplantdefensesystem.PlantSci,2003,165:1297-1302)。将人参PgPR10-2基因转入烟草中使其超表达，发现转基因烟草对辣椒疫霉和炭疽病菌的抗性增强(PullaRK,LeeOR,InJG,etal.Expressionandfunctionalcharacterizationofpathogenesis-relatedproteinfamily10gene,PgPR10-2,fromPanaxginsengC.A.Meyer.Physiolmolplantpathol,2010,74:323-329)。超表达玉米ZmPR-10的转基因烟草可以抑制黄曲霉的生长(ChenZY,BrownRL,RajasekaranK,etal.Identificationofamaizekernelpathogenesis-relatedproteinandevidenceforitsinvolvementinresistancetoAspergillusflavusinfectionandaflatoxinproduction.Phytopathology,2006,96:87-95)

一些植物激素和抗病信号分子影响PR-10的表达模式。如脱落酸(abscicisacid,ABA)、茉莉酸(jasmonicacid,JA)、赤霉素(gibberellicacid,GA3)、茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MeJA)、水杨酸(salicylicacid,SA)、乙烯等均在植物防御应答中起作用。ABA主要在寒冷、高盐和干旱胁迫中起作用，而JA是植物受机械损伤及病原菌侵染后的主要防御物质。水稻中一个PR-10基因(RSOsPR10)受JA诱导，但不受SA和ABA的诱导(HashimotoM,KisselevaL,SawaS,etal.AnovelricePR10protein,RSOsPR10,specificallyinducedinrootsbybioticandabioticstresses,possiblyviathejasmonicacidsignalingpathway.PlantCellPhysiol,2004,45:550-559)。研究表明，SA、乙烯、MeJA可以显著诱导辣椒CaPR-10的表达(ParkCJ,KimKJ,ShinR,etal.Pathogenesis-relatedprotein10isolatedfromhotpepperfunctionsasaribonucleaseinanantiviralpathway.PlantJ,2004,37:186-198)。

PR-10在病原菌入侵中起重要作用，并且PR-10蛋白具有体外抑菌功能，但其抗病机理尚不清晰。大多数PR-10的抑菌机制都被认为与其核糖核酸酶活性有关。PR-10基因编码的氨基酸序列中都存在一个高度保守的“GXGGXG”序列，被称为“P-LOOP”基序。该基序是一类广泛存在于核酸酶结合蛋白以及磷酸化激酶中，该区域的磷酸化可能与其核糖核酸酶活性相关(Hoffmann-SommergruberK,VanekKrebitzM,RadauerC,etal．GenomiccharacterizationofmembersoftheBetv1family:genescodingforallergensandpathogenesis-relatedproteinsshareintronpositions.Gene,1997,197:91-100)。转人参PgPR10-2基因的烟草株系的核糖核酸酶活性与抗真菌活性均有所提高(PullaRK,LeeOR,InJG,etal.Expressionandfunctionalcharacterizationofpathogenesis-relatedproteinfamily10gene,PgPR10-2,fromPanaxginsengC.A.Meyer.Physiolmolplantpathol,2010,74:323-329)。烟草花叶病毒侵染辣椒后，CaPR-10诱导表达，同时增加了裂解病毒RNA的核糖核酸酶活性(ParkCJ,KimKJ,ShinR,etal.Pathogenesis-relatedprotein10isolatedfromhotpepperfunctionsasaribonucleaseinanantiviralpathway.PlantJ,2004,37:186-198)。因此，植物PR10的防御相关机制可能与其具有核糖核酸酶活性有关。

本发明的病程相关蛋白10基因LrPR10-5来自岷江百合(LiliumregaleWilson)。岷江百合又名王百合，多年生草本植物，我国的百合特有种。仅分布于川西岷江流域海拔800～2700m的河谷到山腰的岩石缝中，具有极强的抗病性。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗真菌活性的岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5的应用，即在提高烟草对灰葡萄孢、立枯丝核菌、核盘菌抗性中的应用，LrPR10-5的核苷酸序列如SEQIDNO：1所述，该基因cDNA全长序列为846bp，包含一个474bp的开放阅读框、55bp的5’非翻译区、317bp的3’非翻译区，编码如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白质。

本发明中基因LrPR10-5的编码区是序列表SEQIDNO：1中第56-529位所示的核苷酸序列。

本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为LrPR10-5。

PR10是植物受生物或非生物胁迫后诱导产生并积累的一类蛋白质，是植物防卫体系的重要组成部分。PR10蛋白广泛存在于高等植物中，当遭受病原体侵染时一些PR10基因的表达量显著增高。另外，植物激素和信号分子也可以使一些PR10基因上调表达，例如茉莉酸、水杨酸、过氧化氢、乙烯、赤霉素等。植物PR10的核糖核酸酶活性与其具有的抑菌活性密切相关。

本发明涉及分离包含LrPR10-5的DNA片段并鉴定其功能，具有该基因片段的植物在一定程度上具有抵抗特定真菌侵染的表型，其中所述DNA片段如序列表SEQIDNO：1所示，对该基因进行序列分析，发现LrPR10-5全长cDNA为846bp，包含一个474bp的开放阅读框(ORF)、55bp的5’非翻译区(untranslatedregion，UTR)及317bp的3’UTR，其中ORF编码一个具有157个氨基酸的蛋白质。LrPR10-5编码蛋白具有PR10蛋白的保守结构域，BLASTp检索结果表明LrPR10-5编码的蛋白质与麝香百合PR10(AAD17336.1)的相似性为99%，与风信子、小麦、山羊草、芦笋、大麦以及其他物种的PR10蛋白高度相似，表明其属于岷江百合中的病程相关蛋白10。超表达序列表SEQIDNO：2所示的蛋白质可以增强烟草对灰葡萄孢、立枯丝核菌以及核盘菌的抗性。

本发明另一目的是将岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5应用在提高烟草对灰葡萄孢菌、立枯丝核菌以及核盘菌抗性中，具体操作如下：

(1)采用扩增LrPR10-5的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)扩增出LrPR10-5的全长编码区，然后将其连接到pMD-18T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；

(2)用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切pMD-18T-LrPR10-5载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pCAMBIA2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得LrPR10-5基因片段与pCAMBIA2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；

(3)以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。

本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自岷江百合的LrPR10-5基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性。它不仅可以为大规模生产作物、花卉等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。

附图说明

图1是本发明LrPR10-5转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果，图中：Marker为DL2000DNAMarker(大连宝生物)；正对照为质粒pMD-18T-LrPR10-5为模板的PCR产物；WT为非转基因烟草(野生型)总DNA为模板的PCR产物；

图2是本发明阳性LrPR10-5转基因烟草中LrPR10-5转录水平的表达分析结果图；图中：Marker是DL2000DNAMarker(大连宝生物)；WT是非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；正对照是质粒pMD-18T-LrPR10-5为模板的PCR产物；

图3是本发明LrPR10-5转基因烟草体外抗真菌活性的抑菌效果示意图；图中a、b、c、中的真菌分别是核盘菌、立枯丝核菌、灰葡萄孢；WT为野生型烟草的总蛋白；CK为空白对照，即无蛋白对照(用于提取蛋白的缓冲液)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例1：LrPR10-5全长基因克隆以及序列分析

用尖孢镰刀菌接种岷江百合，用接种24h后的根提取总RNA，用液氮将处理过的岷江百合的根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV(promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5μgTotalRNA，依次加入50ngoligo(dT)，2μLdNTP(2.5mMeach)、DEPC水至反应体积为14.5μL；混匀后，70℃加热变性5min后迅速在冰上冷却5min，然后依次加入4μL5×First-standbuffer、0.5μLRNasin(200U)、1μLM-MLV(200U)，混匀并短时离心，42℃温浴1.5h，取出后70℃加热10min，终止反应。cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。

以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因LrPR10-5，所用上下游引物序列分别及采用Advantage^TM2PCREnzyme(Clontech)扩增出目的基因；PCR反应条件：95℃2min；94℃30s，59℃30s，72℃50s，30个循环；72℃5min；反应体系(10μL)为1μLcDNA、1μL10×Advantage2PCRBuffer、0.5μL50×dNTPMix(10mMeach)、0.2μL正向引物(10μM)、0.2μL反向引物(10μM)、0.2μLAdvantage2PCRPolymeraseMix、6.9μLPCR-Gradewater；PCR结束后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳，用以检测扩增产物的特异性以及大小。

所得到PCR产物只有一条DNA带，故直接对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pMD18-Tvectorkit(大连宝生物)，反应体系和操作过程为：取1.5μLPCR产物，依次加入1μLpMD18-Tvector(50ng/μL)和2.5μL2×LigationsolutionI，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中。使用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrPR10-5的特异引物鉴定出多克隆位点插入LrPR10-5的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的LrPR10-5全长cDNA为846bp，通过NCBIORFfinder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个474bp的开放读码框(见序列表)，LrPR10-5编码一个含157个氨基酸的蛋白质LrPR10-5，其分子量约为16.7KDa，等电点约为5.31，含有2个半胱氨酸残基(C)，位于第79位和110位，因此单体蛋白可能形成一个二硫键，借助生物信息学软件SignalP4.1分析LrPR10-5编码的蛋白序列，检测其是否具有N端信号肽。结果显示在LrPR10-5中没有检测到信号肽的存在。

实施例2：植物超表达载体构建

采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入LrPR10-5的大肠杆菌质粒pMD-18T-LrPR10-5以及植物表达载体pCAMBIA2300s的质粒，取1μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶EcoRI(TaKaRa)和BamHI(TaKaRa)分别对质粒pMD-18T-LrPR10-5和pCAMBIA2300s进行双酶切(100μL体系)，反应体系和操作过程为：取20μLpMD-18T-LrPR10-5和pCAMBIA2300s质粒、依次加入10μL10×Kbuffer、5μLEcoRI、5μLBamHI、60μLddH₂O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对LrPR10-5片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)；取1μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，其余回收物置于-20℃保存备用。

利用T4DNALigase(TaKaRa)，将回收的LrPR10-5DNA片段和pCAMBIA2300s载体片段连接起来，反应体系(20μL)和操作过程为：取10μLLrPR10-5DNA片段依次加入2μLpCAMBIA2300s载体DNA、2μL10×T4DNALigaseBuffer、1μLT4DNALigase、5μLddH₂O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增LrPR10-5的特异引物进行PCR，挑选出LrPR10-5与pCAMBIA2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。

采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒(上海生工)提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300s-LrPR10-5质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300s-LrPR10-5转入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpCAMBIA2300s-LrPR10-5质粒加入含有200μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1min，然后迅速置于37℃水浴5min，之后立即冰浴2min，加入800μLLB液体培养基于28℃振荡培养4h。将活化后的农杆菌涂于含有50mg/LKm的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LrPR10-5的特异性引物进行PCR，检测pCAMBIA2300s-LrPR10-5是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。

实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选

本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl₂浸泡8min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2MS培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱(25℃，16h/d光照)，以后每月用MS培养基继代一次。

从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-LrPR10-5质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5mL含有50mg/LKm和20mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1mL浑浊的菌液至含有50mg/LKm的LB固体培养基上，28℃培养48h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养2-3h以活化农杆菌。

取烟草无菌苗叶子切成1cm²左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02mg/L6-BA+2.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，22℃无光条件下共培养2天。

将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂+50mg/LKm+200mg/L头孢霉素(cefotaximesodiumsalt，Cef)；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养(25℃，16h/d光照，8h/d黑暗)，待烟草长出芽后用含有50mg/LKm和200mg/LCef的MS培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50mg/LKm的MS培养基上使其生根，最后选择生根较好的再生苗进行阳性株的筛选。

采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增LrPR10-5的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，LrPR10-5转基因烟草共筛选到29株阳性转基因植株。

实施例4：转基因烟草中LrPR10-5的表达分析以及转基因植株抗真菌活性分析

取阳性转基因单株以及非转基因烟草(野生型)的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增LrPR10-5的特异引物进行PCR，分析各转基因单株中LrPR10-5转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取5μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到18个转基因单株中LrPR10-5在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～18。

将实验室保存的几种真菌接种于PDA固体培养基(200g/L马铃薯，15g/L琼脂，20g/L葡萄糖)上，28℃暗培养，待菌落生长至直径约为2~3cm时添加蛋白，分析转基因植株体外抗真菌活性，供试真菌共有7种：葡萄座腔菌(Botrosphaeriadothidea)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、链格孢(Alternariaalternata)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、轮状镰刀菌(Fusariumverticillioides)。

为了防止其它杂菌污染所提取的蛋白，整个植物蛋白提取过程均是无菌操作，首先取1g转基因烟草单株(编号分别为：1、2、4)及野生型叶片放入研钵中，加入1mL蛋白提取液(1MNaCl，0.1M乙酸钠，1%PVP，pH6)，充分研磨；转入1.5mL离心管中，混匀后4℃静置过夜，4℃离心30min(12,000g/min)，取上清于新的1.5mL离心管中，并取适量用紫外分光光度仪测定总蛋白浓度。将转基因和野生型植株的总蛋白浓度调整至0.2μg/μL，然后分别取20μL滴于各真菌培养基的无菌滤纸上，在每个真菌的平板上除了添加不同转基因烟草植株的总蛋白，同时平行添加野生型烟草的总蛋白和空白对照(提取蛋白所用的溶液)，28℃培养几天后观察各处理真菌生长的情况，并据此来评价LrPR10-5转基因烟草的体外抗真菌活性，结果如图3所示，LrPR10-5转基因烟草蛋白对核盘菌、灰葡萄、立枯丝核菌的生长具有很强的抑制作用。

序列表(SEQID)

<110>昆明理工大学

<120>一种岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5的应用

<160>4

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>846

<212>DNA

<213>LiliumregaleWilson

<220>

<221>mRNA

<222>(1)..(846)

<220>

<221>5'UTR

<222>(1)..(55)

<220>

<221>CDS

<222>(56)..(529)

<220>

<221>3'UTR

<222>(530)..(846)

<400>1

acatggggacacctctctcttcttctcaatcacctcagtctattcttaaacaatcatgtc60

atggtctgttgtgatcgagtctccggtgtcagcacttaggctctacagggcggccatcct120

cgactggcacaccctcggccccaagcttgtaccggagatcatcagcagtggcaccggaga180

aagcggtgatggtggcgtcgggagcgtcaggcaactcaacttcacctcagtgatgccatt240

cagctacgtgaaggaacgcttggacttcgtcgatcacgagaagtttgaatgccagtcaac300

catcatcgaaggcggccacttggggacgaggctggagtctgcctccgcccacttcaaggt360

tgagccgacgagtgccggcgggtgcatcgtcacggtcactaccaacaccaagcccctccc420

gggtattgaggctgatgaaggaatcatagccgcttcaaagggggcaatagagaagcattt480

cagggctgctgaagcctacctcctcgccaaccccgacgcttatgtttagtgcagtgtgtt540

tggagtcttttcgtgtgttgttgtgaaacttgtgagaattgtatttcgcttgtattgcat600

tttcccttctcaagcctgtcaaattatttggcagcttgaatcaacagaaataatcagacg660

tgtgagttttttttccttatttttacaacttggggcttaaatggcattggaagtgcaaca720

tgagaaacgaaattggtaatgaagtctgattgttctgtaatacggatatggccgacactg780

atatgaaatcaaatctctagttgcactaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa840

aaaaaa846

<210>2

<211>157

<212>PRT

<213>LiliumregaleWilson

<400>2

MetSerTrpSerValValIleGluSerProValSerAlaProArgLeu

151015

TyrArgAlaAlaIleLeuAspTrpHisThrLeuGlyProLysLeuVal

202530

ProGluIleIleSerSerGlyThrGlyGluSerGlyAspGlyGlyAla

354045

GlySerValArgGlnLeuAsnPheThrSerValMetProPheSerTyr

505560

ValLysGluArgLeuAspPheValAspHisGluLysPheGluCysGln

65707580

SerThrIleIleGluGlyGlyHisLeuGlyThrArgLeuGluSerAla

859095

SerAlaHisPheLysValGluProThrSerAlaGlyGlySerIleVal

100105110

ThrValThrThrSerAsnLysProLeuProGlyIleGluAlaAspGlu

115120125

GlyValIleAlaAlaSerLysGlyAlaMetGluLysHisPheArgAla

130135140

AlaGluAlaTyrLeuLeuAlaAsnProAspAlaTyrVal

145150155

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atggggacacctctctcttcttct24

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cgaaatacaattctcacaagtttcaca27

Claims (2)

1.一种岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5在提高烟草对灰葡萄孢(Botrytiscinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)抗性中的应用，其中所述岷江百合LrPR10-5基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.根据权利要求1所述岷江百合病程相关蛋白10基因LrPR10-5的应用，其特征在于提高烟草的灰葡萄孢、立枯丝核菌、核盘菌抗性的具体操作如下：

(1)将上述基因LrPR10-5与植物表达载体pCAMBIA2300s连接，构建植物超表达载体；

(2)将上述构建的重组载体通过根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）介导转入烟草中；

(3)以重组载体T-DNA上具有的抗性标记来筛选转化子，并通过聚合酶链式反应获得阳性转基因植株，分析转基因烟草蛋白对真菌生长的抑制活性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因烟草植株。