CN106222290B

CN106222290B - 一种兰州百合pr4基因定量检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN106222290B
Application number: CN201610674946.5A
Authority: CN
Inventors: 张玉宝; 王乐; 谢忠奎; 王亚军; 杨果; 王若愚; 郭志鸿
Original assignee: Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Research Institute of CAS
Current assignee: Northwest Institute of Eco Environment and Resources of CAS
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2016-08-16
Publication date: 2020-02-18
Anticipated expiration: 2036-08-16
Also published as: CN106222290A

Abstract

一种兰州百合病程相关蛋白PR4基因定量检测的试剂盒及其检测方法，该试剂盒主要包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂、荧光定量PCR反应试剂以及阳性对照品和阴性对照品，特异性引物由兰州百合PR4基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成；阳性对照品为兰州百合PR4基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品；阴性对照品为DEPC水；本发明针对兰州百合PR4基因提供了一种快速、敏感、特异的定量检测试剂盒和检测方法，为兰州百合PR4基因的表达及检测诊断提供了技术支持。

Description

一种兰州百合PR4基因定量检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种兰州百合病程相关蛋白PR4基因定量检测的试剂盒及检测方法。

背景技术

百合是一种集观赏、食用和药用于一体的重要经济作物，长期无性繁殖使病毒不断积累，严重影响了产量和品质；其中百合斑驳病毒（LMoV）、黄瓜花叶病毒（CMV）和百合隐症病毒（LSV）是最常见的三种病毒，感染率高达70%。病毒病造成百合种源严重退化，已是制约百合产业发展的重要因素，如何对病毒实现有效防治是百合产业健康发展急需解决的关键问题；目前，百合病毒防治技术非常落后，病毒防治主要采用杀灭传播介体蚜虫的方法，尽管能一定程度阻止病毒传播，然而已侵染的病毒仍会在百合上复制增殖；百合作为世界著名的球根花卉，至今还未开发出有效的百合病毒抑制剂，关于病毒抑制剂抗百合病毒作用机制的研究鲜有报道，使得现阶段对百合病毒病的防治非常盲目。

通常病毒抑制剂抗植物病毒的作用方式有：抑制病毒侵染、抑制病毒增殖或诱导寄主产生抗性；诱导抗性作为一种有效的抗病手段，已在许多病害体系中得到应用，已有研究发现，某些病毒抑制剂可以诱导寄主产生抗病毒物质，提高寄主对病毒的抵抗力；江山等（1996）发现病毒抑制剂可以诱导寄主产生病程相关蛋白（pathogenesis-relatedproteins，PRs）；PRs是植物体内的一类蛋白质，受病原体或其他外界因子的胁迫而诱导表达，在植物抵御疾病、响应外界压力以及适应不良环境方面发挥着重要作用；根据病程相关蛋白家族成员的氨基酸组成、结构及生物学功能等特点，将其分为17类，即PR1~PR17，其中PR4是PRs家族中参与植物系统获得抗性的重要效应因子，PR4类蛋白在植物中普遍存在，主要是一类M_r13×10³-16×10³的小分子量蛋白，目前已经从烟草、马铃薯、大麦、番茄等作物中分离纯化出PR4蛋白，已发现的PR4蛋白都存在相同的Barwin保守结构，根据其分子N端几丁质结合位点的有无，PR4蛋白又可以分为PR4Ⅰ和PR4Ⅱ两类；已有证据表明PR4蛋白具有广泛的抗菌活性，并且PR4转基因的烟草和拟南芥对植物病原菌的抗性也有显著提高；通常，PRs蛋白在健康植株中表现微弱，当被不同的诱导因子诱导时迅速产生并积累，其与植物诱导抗性之间有密切的关联；因而研究病毒抑制剂对PR蛋白的诱导能力，是了解抗病毒制剂对植物是否具有诱导抗性作用的一个重要内容。

在我们对百合抗病毒技术的开发研究中，初步筛选了2种适用于大田的百合病毒抑制剂，其对兰州百合主要病毒CMV的复制均有较好的抑制作用；同时，从病毒感染的兰州百合植株中也检测到了PR4基因的表达；为了进一步明确病毒抑制剂对PR4基因表达的影响，本研究建立了一种兰州百合病程相关蛋白PR4基因定量检测的试剂盒及检测方法。

发明内容

本发明提供一种兰州百合PR4基因定量检测的试剂盒及检测方法。

技术方案如下：

一种兰州百合PR4基因定量检测的试剂盒，主要包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂以及荧光定量PCR反应试剂，特异性引物由兰州百合PR4基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成，特异性引物的序列如下：

兰州百合PR4基因上游引物P1：5’-CGGGCAACCTACAACTACTACTAC-3’

兰州百合PR4基因下游引物P2：5’-GCGGTCCAGCCATACTTCTT-3’

内参18S rRNA基因上游引物P3：5’-GGGGAAACTTACCAGGTCCA-3’

内参18S rRNA基因下游引物P4：5’-CAGACAAATCGCTCCACCAA-3’

其中，扩增兰州百合PR4基因的片段长度为125bp，扩增内参18S rRNA基因片段长度为111bp。

本发明的关键在于扩增引物的设计。

为达到定量检测的要求，试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为兰州百合PR4基因标准品质粒以及内参18S rRNA基因标准品质粒，阴性对照品为DEPC水；兰州百合PR4基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品序列如下：

兰州百合PR4基因标准品：

cgggcaacctacaactactactacccggcacagaacaactgggacctcaacgccgtcagcgcctactgcgcaacatgggacgccagcaagcccttgtggtggcgcaagaagtatggctggaccgc;

内参18S rRNA基因标准品：

ggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagactgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg。

可将上述兰州百合PR4基因标准品以及内参18S rRNA基因标准品序列构建到质粒载体中，测定质粒浓度后换算为拷贝数，然后用双蒸水将阳性质粒进行10倍梯度稀释，以10倍系列稀释的质粒溶液作为模板进行荧光定量PCR扩增，根据拷贝数的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到标准曲线，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照标准曲线即可获得待测样品起始cDNAs的精确拷贝数，再经过内参校正后最终获得待测样品PR4基因的标准拷贝数。

本发明还涉及以上所述的检测兰州百合PR4基因表达的试剂盒的检测方法，其包括的步骤如下：

步骤①以兰州百合叶片、茎杆或种球为待测样品，提取总RNA，进行反转录RT反应合成cDNAs；

步骤②荧光定量PCR：以待测样品cDNAs作为模板，用检测PR4基因表达的上下游引物、检测内参基因18S rRNA表达的上下游引物分别进行荧光定量PCR扩增；以DEPC水为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增；

步骤③数据采集与分析：上述步骤②反应结束后，利用计算机分析软件自动获得扩增曲线和溶解曲线，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线，若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，且溶解曲线形成单一的溶解峰，则判断为阳性。

定量检测时，所述检测方法同时以10倍系列稀释的兰州百合PR4基因和18S rRNA基因标准品的质粒溶液进行荧光定量PCR检测，分别根据拷贝数的对数值与各标准品Ct值的关系绘制得到标准曲线，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照相应标准曲线获得待测样品起始cDNAs中PR4基因和18S rRNA基因的精确拷贝数，按照以下公式得到经过内参归一化校正后的待测样品PR4基因的标准拷贝数：

其中，所述标准品序列如下：

兰州百合PR4基因标准品：

内参18S rRNA基因标准品：

优选的，所述步骤①中反转录RT程序为：待测样品总RNA与PR4基因下游引物P2和18S rRNA基因下游引物P4混合后，70℃变性10min，迅速置冰上急冷2min; 再加入反转录RT缓冲液、dNTP混合物和反转录酶等，于42℃水浴1h，70℃保温15min，制成待测样品cDNAs，置冰上待用。

优选的，所述步骤②中荧光定量PCR反应程序为：95℃ 30sec，95℃ 5sec， 60℃30sec， 35个循环；95℃ 15sec，60℃ 1min，95℃ 15sec；上述反应结束后，利用计算机分析软件自动获得标准曲线、扩增曲线和溶解曲线。

本发明针对兰州百合PR4基因提供了一种快速、敏感、特异的定量检测试剂盒和检测方法，为兰州百合PR4基因的表达及检测诊断提供了重要的技术支持。

附图说明

图1：兰州百合PR4基因标准品质粒荧光定量PCR扩增曲线图； 1-6分别对应：9.42×10⁸copies/μL、9.42×10⁷copies/μL、9.42×10⁶copies/μL、9.42×10⁵copies/μL、9.42×10⁴copies/μL、9.42×10³copies/μL标准品；

图2：兰州百合18S rRNA基因标准品质粒荧光定量PCR扩增曲线图；1-6分别对应：3.29×10⁹copies/μL、3.29×10⁸copies/μL、3.29×10⁷copies/μL、3.29×10⁶copies/μL、3.29×10⁵copies/μL、3.29×10⁴copies/μL标准品；

图3：兰州百合PR4基因标准品质粒荧光定量PCR标准曲线图；

图4：兰州百合18S rRNA基因标准品质粒荧光定量PCR标准曲线图；

图5：兰州百合PR4基因标准品质粒荧光定量PCR溶解曲线图；

图6：兰州百合18S rRNA基因标准品荧光定量PCR溶解曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

标准品质粒的获得

1、总RNA的提取

将50mg感染CMV和LSV的兰州百合叶片在液氮中研磨，用植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）进行感病组织总RNA 的提取。

2、引物设计与合成

根据中国科学院寒区旱区环境与工程研究所皋兰生态与农业综合试验站微生物实验室首次从兰州百合上克隆的PR4基因序列，以及GenBank上登录的百合18S rRNA 基因序列（GenBank登录号： D29775）设计了2对特异性引物P1、P2 及P3、P4，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3、阳性标准品质粒的制备

1）RT反应

利用兰州百合PR4下游引物P2、内参18S rRNA下游引物P4以及M-MLV反转录酶进行RT反应，合成cDNAs第一链。

10μL RT反应体系如下: 2μL总RNA，PR4下游引物P2、18S rRNA下游引物P4（各10μmol/L）各1μL，2μL DEPC-H₂O，70℃变性10 min，迅速置冰上急冷2 min；再加入2μL M-MLVbuffer （5×），1μL dNTP混合物（各10mmol/L ），0.34μL RNase抑制剂（30U/μL），0.35μLM-MLV反转录酶（200U /μL）和0.31μL DEPC-H₂O；混合后42℃水浴1h，70℃保温15 min，置冰上待用。

2）PCR反应

利用上述cDNAs为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别进行PR4和18S rRNA 基因的PCR扩增。

PCR反应体系为25μL，包括：1μL cDNAs（约50ng），0. 2μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），2.5μL 10×PCR buffer， 2μL dNTP混合物（各2.5mmol/L），0.5μL上游引物P1或P3（10μmol/L)，0.5μL下游引物P2或P4（10μmol/L），18.3μL ddH₂O。

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸1min，循环扩增30次，最后72℃延伸7min。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，按照克隆载体试剂盒（大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司）的说明将目的片段连接在pMD18-T载体上，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑平板筛选；随机挑取3个白斑菌落分别接种在氨苄LB培养基上，37℃摇菌12～16h；使用（大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司）的质粒微量抽提试剂盒提取质粒；分别取2µL质粒，在与上述PCR反应体系相同的条件下进行PCR扩增；将PCR检测得到的阳性重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序；测序证实序列完全正确的阳性质粒，即为标准品，兰州百合PR4和18S rRNA基因对应的片段长度分别为125bp和111bp；用NanoDrop ND-1000 核酸/蛋白分析仪测定标准品的OD₂₆₀nm和OD₂₈₀nm值，根据OD₂₆₀nm和OD₂₈₀nm值计算质粒浓度，换算为拷贝数/体积，然后用双蒸水将标准品进行10倍梯度稀释。

4、结果：

经测序，上述设计的标准品与预期完全相符，10倍系列稀释的PR4基因标准品质粒的浓度范围为：9.42×10³~9.42×10⁸copies/μL；18S rRNA基因标准品质粒的浓度范围为：3.29×10⁴ ~3.29×10⁹copies/μL；回收的标准品片段序列如下：

百合PR4基因标准品序列：

百合18S rRNA基因标准品序列：

荧光定量PCR检测兰州百合PR4基因表达方法的建立

1、待测样品总RNA提取及cDNAs合成

采用天根生化科技（北京）有限公司的植物总RNA提取试剂盒，按照说明书提取待测兰州百合叶片的总RNA，根据标准品的获得中RT第一链cDNAs合成体系，将RNA反转录为cDNAs。

2、荧光定量PCR反应

以上述cDNAs为模板，用兰州百合PR4上下游引物P1、P2及内参18S rRNA上下游引物P3、P4分别在Stratagene公司的Mx3000p 荧光定量PCR 仪上进行PCR扩增。

PCR反应液组成如下：

上述cDNAs模板 2µL

SYBR Premix Ex Taq ^II（2×） 10µL

上游引物（P1或P3） 0.4µL

下游引物（ P2或P4） 0.4µL

Rox Reference Dye II (50×) 0.4µL

PCR-grade water 6.8µL

PCR反应条件为：95℃ 30sec，95℃ 5sec， 60℃ 30sec，72℃ 15sec ，35个循环；95℃ 1min， 55℃ 30sec，90℃ 30sec。上述反应结束后，利用计算机分析软件自动获得待测样品PR4基因和18S rRNA基因的扩增曲线和溶解曲线。

以DEPC水为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增，若待测样品cDNAs板模荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，且溶解曲线形成单一的溶解峰，则判断为阳性。

同时在相同条件下以10倍系列稀释的PR4标准品质粒和18S rRNA标准品质粒进行扩增，并分别绘制标准曲线。

测得待测样品cDNAs的Ct值后，分别对照相应的标准曲线获得待测样品起始cDNAs中PR4基因以及18S rRNA基因的精确拷贝数，按照以下公式得到经过内参归一化校正后的待测样品PR4基因的标准拷贝数：

。

检测结果

兰州百合PR4基因和18S rRNA基因标准品质粒的荧光定量PCR扩增曲线结果参见图1和图2，PR4基因标准品质粒浓度分别为1：9.42×10⁸copies/μL、2：9.42×10⁷copies/μL、3：9.42×10⁶copies/μL、4：9.42×10⁵copies/μL、5：9.42×10⁴copies/μL、6：9.42×10³copies/μL；18S rRNA基因标准品质粒浓度分别为1：3.29×10⁹copies/μL、2：3.29×10⁸copies/μL、3：3.29×10⁷copies/μL、4：3.29×10⁶copies/μL、5：3.29×10⁵copies/μL、6：3.29×10⁴copies/μL。

图3和图4分别为兰州百合PR4基因和18S rRNA基因对应的标准曲线，其中PR4基因回归方程：Y =－3.123*LOG（X）+43.41，RSq：0.998，PCR的扩增效率为109.0%； 18S rRNA基因回归方程：Y =－3.113*LOG（X）+ 40.61，RSq：0.999，PCR的扩增效率为109.5%。其中Y：对应的Ct值；X：基因的起始模板拷贝数。

图5和图6分别为兰州百合PR4基因和18S rRNA基因的溶解曲线，其中PR4基因和18S rRNA基因的目的产物溶解温度分别在87℃和83℃左右，扩增产物单一，形成特异的溶解峰，没有杂峰出现，且峰值较为一致，说明本发明定量结果准确、可靠。

根据荧光检测的Ct值以及扩增曲线和溶解曲线，判断待测样品PR4基因是否有表达；若荧光检测结果呈典型的扩增曲线和溶解曲线，如图1和图5所示，判断为阳性，所测样品中PR4基因有表达；若没有典型的扩增曲线和溶解曲线，判断为阴性，所测样品中PR4基因无表达；若判断阳性待测样品之间PR4基因表达量的差异，可根据PR4基因的标准拷贝数公式得到相应结果。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所

<120> 一种兰州百合PR4基因定量检测试剂盒及其检测方法

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgggcaacct acaactacta ctac 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcggtccagc catacttctt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggaaactt accaggtcca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagacaaatc gctccaccaa 20

<210> 5

<211> 125

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgggcaacct acaactacta ctacccggca cagaacaact gggacctcaa cgccgtcagc 60

gcctactgcg caacatggga cgccagcaag cccttgtggt ggcgcaagaa gtatggctgg 120

accgc 125

<210> 6

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggggaaactt accaggtcca gacatagtaa ggattgacag actgagagct ctttcttgat 60

tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag cgatttgtct g 111

Claims

1.一种兰州百合PR4基因定量检测试剂盒，包括特异性引物、第一链cDNAs合成试剂以及荧光定量PCR反应试剂，所述特异性引物由兰州百合PR4基因和内参18S rRNA基因的特异性引物组成，所述特异性引物的序列如下：

兰州百合PR4基因上游引物P1：5’-CGGGCAACCTACAACTACTACTAC-3’

兰州百合PR4基因下游引物P2：5’-GCGGTCCAGCCATACTTCTT-3’

内参18S rRNA基因上游引物P3：5’- GGGGAAACTTACCAGGTCCA -3’

内参18S rRNA基因下游引物P4：5’ -CAGACAAATCGCTCCACCAA -3’；

其特征在于所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为兰州百合PR4基因标准品质粒以及内参18S rRNA基因标准品质粒，所述阴性对照品为DEPC水；所述兰州百合PR4基因标准品和内参18S rRNA基因标准品序列如下：

兰州百合PR4基因标准品：

内参18S rRNA基因标准品：

ggggaaacttaccaggtccagacatagtaaggattgacagactgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagcgatttgtctg;

其特征在于将上述兰州百合PR4基因标准品和内参18S rRNA基因标准品序列构建到质粒载体中，测定阳性质粒浓度后换算为拷贝数，然后用双蒸水将上述阳性质粒进行10倍梯度稀释，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4分别进行荧光定量PCR扩增，根据拷贝数的对数值与标准品Ct值的关系可绘制得到PR4基因和18S rRNA基因的标准曲线；同时将待测样品提取总RNA后进行反转录RT反应,以合成的cDNAs为模板，应用上述特异性引物P1、P2及P3、P4在相同条件下进行荧光定量PCR扩增，测得待测样品cDNAs的Ct值后，对照标准曲线即可获得待测样品起始cDNAs中PR4基因和18SrRNA基因的精确拷贝数，再经过内参校正后最终获得待测样品PR4基因的标准拷贝数。

2.根据权利要求1所述的兰州百合PR4基因定量检测试剂盒，其中兰州百合PR4基因标准品质粒浓度为9.42×10⁸copies/μL；内参18S rRNA基因标准品质粒浓度为3.29×10⁹copies/μL。

3.一种采用如权利要求1所述的兰州百合PR4基因定量检测试剂盒定量检测兰州百合PR4基因的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤① 以兰州百合叶片、茎杆或种球为待测样品，提取总RNA，进行反转录RT反应合成cDNAs；

步骤② 荧光定量PCR：以待测样品cDNAs作为模板，用兰州百合PR4基因和内参18SrRNA基因的特异性引物P1、P2以及P3、P4分别进行荧光定量PCR扩增；以DEPC水为阴性对照于相同条件下进行荧光定量PCR扩增；所述检测方法同时以10倍系列稀释的兰州百合PR4基因标准品质粒和内参18S rRNA基因标准品质粒进行荧光定量PCR扩增；

步骤③ 数据采集与分析：上述步骤② 反应结束后，分别根据拷贝数的对数值与各标准品Ct值的关系绘制得到PR4基因和18S rRNA基因的标准曲线；利用计算机分析软件自动获得待测样品PR4基因和18S rRNA基因的扩增曲线以及溶解曲线，若待测样品PR4基因荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，且溶解曲线形成单一的溶解峰，则判断为阳性，所测样品中PR4基因有表达；

若没有典型的扩增曲线和溶解曲线，则判断为阴性，所测样品中PR4基因无表达；

若判断阳性样品中PR4基因的表达量，可将测得的阳性样品cDNAs的Ct值分别对照相应的标准曲线获得cDNAs中PR4基因以及18S rRNA基因的精确拷贝数，按照以下公式得到经过内参归一化校正后的阳性样品PR4基因的标准拷贝数：

。