KR20220037462A - 살충성 결정 단백질을 부호화하는 합성 뉴클레오티드 서열과 그 사용방법 - Google Patents

살충성 결정 단백질을 부호화하는 합성 뉴클레오티드 서열과 그 사용방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 해충에 대한 살충 작용을 갖는 바실러스 튜링겐시스 (Bt) 살충성 결정 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 또한 본 개시는 식물 내 이러한 서열의 발현과도 관련이 있다. 본 개시는 DNA 구조체, 벡터 및 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 및 숙주 세포를 추가로 제공한다. 또한, 이는 곤충 저항성 형질전환 식물 생산을 위한 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열, 상기 서열을 포함하는 곤충 저항성 형질전환 식물 및 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스를 포함하는 조성물의 사용방법을 제공한다.

Description

살충성 결정 단백질을 부호화하는 합성 뉴클레오티드 서열과 그 사용방법
전자 제출된 염기 서열 참조
2019년 7월 30일 생성되어 명세서와 함께 동시에 11kb크기로 전자 보관된 파일명 " PD034766IN-SC sequence listing.txt"의 염기 서열(Sequence Listing) 공식 사본은 명세서의 일부이다.
본 개시는 해충에 대한 살충 작용을 갖는 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis)(Bt) 살충성 결정 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열(codon optimized synthetic nucleotide sequences)과 관련이 있다. 또한 본 개시는 식물 내 이러한 서열의 발현과도 관련이 있다.
해충은 전세계 농작물 손해의 주요 요인이며 매년 전세계 총 작물 생산량의 1/5를 파괴하는 원인이라고 한다. 식용으로 적합한 작물을 인공적으로 선택하는 과정에서, 궁극적으로 경제적 가치를 감소시키고 생산 비용을 증가시키는 해충 침입에 매우 취약한 식물 또한 선택된다.
전통적으로, 해충은 화학적 및/또는 생물학적 살충제 도포를 통해 방제한다. 화학적 살충제의 생산 및 이용과 연관된 환경 위험으로 인해 화학적 살충제 사용에 대한 특정 우려가 있다. 이러한 우려 때문에, 규제기관은 더 위험한 일부 살충제의 사용을 금지하거나 제한해왔다.
나아가, 해충이 새로운 환경에 적응할 수 있는, 예를 들어, 독성 물질의 영향을 극복하거나 자연적이거나 인공적인 식물 저항성을 피하는 자연 선택 과정으로 시간이 지남에 따라 진화할 수 있다는 것은 잘 알려진 사실인데, 이로 인해 문제가 가중된다.
생물학적 살충제는 화학적 살충제에 대해 환경적으로 그리고 상업적으로 허용되는 대안이다. 이는 오염 및 환경 위험을 감소시키고, 전통적인 광범위한 화학 살충제보다 더 큰 표적 특정성을 제공한다.
바실러스(Bacillus) 속 미생물의 특정 종은, 예를 들어, 바실러스 튜링겐시스(B.t.)는 광범위한 해충에 대한 살충 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 살충성 단백질이 바실러스 튜링겐시스의 영양 생장기에서 분리되었다 하더라도, 살충 작용은 부아포 결정성 단백질 봉입체(parasporal crystalline protein inclusions bodies)에 집중된 듯 보인다.
식물 내 천연 Bt 유전자 발현이 극도로 어렵다고 밝혀졌다 해도 식물 내 바실러스 튜링겐시스 (Bt) 살충성 결정 (cry) 단백질 유전자 발현은 당업계에 알려져 있다. 식물에서 기능하는 다양한 프로모터(promoter)와 결합하여 식물에서 Bt cry 단백질 유전자를 발현하기 위한 시도를 해왔다. 그러나, 낮은 수준의 단백질만이 형질전환 식물에서 획득되었다.
식물에서 Bt cry 유전자가 낮은 수준으로 발현되는 이유 중 하나는 G/C비율이 A/T보다 높은 식물 유전자보다 Bt DNA서열 내 A/T 함량이 높기 때문이다. 박테리아 유전자에 대한 A/T의 전체 값은 60-70%이고 식물 유전자의 경우 40-50%이다. 결과적으로, cry 유전자 코돈 사용빈도(codon usage) 내 GC 비율은 최적의 수준에서 발현되기에 매우 불충분하다. 더군다나, A/T 부유 영역은 전사 종결 부위(AATAAA 폴리아데닐화), mRNA 불안정 모티프 (ATTTA) 및 잠재 mRNA 스플라이싱 부위 또한 포함할 수 있다. 천연 Bt cry 유전자의 코돈 사용빈도는 식물 유전자와 크게 다른 것으로 관찰되었다. 결과적으로, 본 유전자의 mRNA는 효율적으로 활용될 수 없다. 코돈 사용빈도는 번역(translation) 또는 전사(transcription) 또는 mRNA 처리 수준에서의 유전자 발현에 영향을 줄 수 있다. 식물에서의 발현을 위한 살충성 유전자를 최적화하기 위해, 형질 전환될 숙주 식물 내에 자연 발생적으로 포함된 유전자를 되도록 많이 닮도록 유전자를 변형하기 위한 시도를 해왔다.
그러나, 특정 해충에 대한 저항성을 부여하는 높은/최적의 수준의 Bt cry 단백질을 발현하는 농작물 품종 개발은 여전히 농업 분야에서 중요한 문제이다. 곤충 방제 단백질 유전자의 발현 증가는 농경학적으로 허용 가능한 수준의 곤충 저항성을 갖는 유전학적으로 개량된 식물의 개발에 매우 중요했다. 농작물의 곤충 침입 방제 또는 방지를 위한 다양한 시도가 이루어져 왔지만, 특정 해충은 농업에서 심각한 문제로 남아있다. 그러므로, 형질전환 식물 내 살충성 단백질의 원하는 발현 수준을 지닌 곤충 저항성 형질전환 농작물(insect resistant transgenic crop plants)이 여전히 필요하다.
본 개시는 해충에 대한 살충 작용을 갖는 Bt Cry2Ai 단백질을 부호화하는 식물 코돈 최적화 합성 DNA 서열을 제공하여 기존의 해충 침입 문제에 대한 해결책을 제공한다.
본 명세서에 해충에 대한 살충 작용을 갖는 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 개시한다. 본 개시는 식물 세포 내 이종 유전자의 발현 향상을 위한 방법에 대한 것이다. cry2Ai 유전자의 유전자 또는 코딩 영역은 식물 특정 선호 코돈 서열(plant specific preferred codon sequence)를 제공하도록 구성된다. 이와 같이, Cry2Ai 단백질에 대한 코돈 사용빈도가 식물 내 발현을 위해 변경된다. 이러한 식물 최적화 코딩 서열은 식물 세포 내 코딩 서열의 발현을 지시할 수 있는 프로모터와 작동 가능하도록 연결될 수 있다. 코돈 최적화 바실러스 튜링겐시스(B. thuringiensis) 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물 및 형질변환된 숙주 세포 또한 본 개시의 양상이다.
본 개시의 목적 중 하나는 살충 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것으로, 여기서 뉴클레오티드 서열은 식물 내 발현에 대하여 최적화되었다.
본 개시의 또 다른 목적은 식물, 특히 가지, 목화, 쌀, 토마토, 밀, 옥수수, 수수, 귀리, 기장, 콩과 식물, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 배추속 식물, 콩, 완두콩, 나무콩, 감자, 후추, 조롱박, 상추, 고구마 카놀라, 대두, 알팔파, 땅콩 및 해바라기로 구성된 그룹에서 선택된 식물에서 Bt 단백질 발현을 극대화하도록 살충성 Bt 단백질을 부호화하는 코돈 취적화 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이다.
본 개시에 따르면, 발명자들은 식물 내 발현을 증가시키기 위하여 코돈 사용빈도를 변경한 Bt 살충성 Cry2Ai 결정 단백질 유전자를 합성하였다. 그러나, 전반적인 코돈 분포 면에서, 식물 유전자와 유사하도록 코돈 사용빈도를 변경하는 대신, 발명자들은 본 개시의 뉴클레오티드 서열 합성 시 식물에서 가장 선호되는 코돈을 이용해 코돈 사용빈도를 최적화하였다. 최적화된 식물 선호 코돈 사용빈도는 목화, 가지 및 토마토 같은 쌍떡잎 식물, 쌀과 같은 외떡잎 식물 그리고 병아리콩 및 나무콩 같은 콩과 식물에서 높은 수준의 Bt 살충 단백질 발현에 효과적이다.
본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1 (NCBI GenBank: ACV97158.1)에 명시된 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 바실러스 튜링겐시스 Cry2Ai 단백질로부터 유래되었다. 서열 ID 번호 1 (SEQ ID NO: 1)에 명시된 아미노산 서열을 갖는 단백질은 헬리코버파 아르미게라(Helicoverpa armigera) -목화 벌레 및 옥수수 벌레, 크나파로크로시스 메디날리스(Cnaphalocrocis medinalis)-혹명나방, 스컬포파가 인세르튤라스(Scirpophaga incertulas)-볏노란 줄기벌레 및 페크티노포라 가십피엘라(Pectinophora gossypiella)를 포함해 다양한 나비목 곤충에 대하여 활성적이다.
본 개시는 식물 내 발현을 위한 코돈 최적화 Bt cry2Ai 뉴클레오티드 합성을 통해 예시되었지만, 코돈 최적화 Bt cry2Ai 뉴클레오티드는 목화, 가지, 토마토, 쌀 및 옥수수와 같은 식물에서 단백질 발현을 최적화시키기 위해 활용될 수 있음을 알아냈다.
이에 따라, 본 개시의 한 양상은 서열 ID 번호 1(SEQ ID NO: 1)에 명시된 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이고, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은 (a) 서열 ID 번호 2 (SEQ ID NO: 2)에 명시된 뉴클레오티드 서열; (b) 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631에서 서열 ID 번호 2 (SEQ ID NO: 2)에 명시된 바와 같이 뉴클레오티드 서열의 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) (a)와 (b)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹에서 선택된다.
본 개시의 또 다른 양상은 (a) 서열 ID 번호 2 (SEQ ID NO: 2)에 명시된 뉴클레오티드 서열; (b) 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631에서 서열 ID 번호 2 (SEQ ID NO: 2)에 명시된 바와 같이 뉴클레오티드 서열의 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) (a)와 (b)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹에서 선택된 식물 내 발현을 위한 코돈 최적화 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 개시의 또 따른 양상은 서열 ID 번호 1(SEQ ID NO: 1)에 명시된 바와 같이 아미노산 서열을 갖는 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 제공하는 것이고, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은:
a. 서열 ID 번호 2 (SEQ ID NO: 2)에 명시된 바와 같거나, 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열이거나, 또는
b. 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631에서 서열 ID 번호 2 (SEQ ID NO: 2)에 명시된 바와 같이 뉴클레오티드 서열의 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 서열이다.
본 개시의 또 다른 양상은 본 명세서에 개시된 바와 같이 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA(recombinant DNA)를 제공하는 것이며, 여기서 뉴클레오티드 서열은 이종 조절 인자(heterologous regulatory element)와 작동 가능하도록 연결된다.
본 개시의 또 다른 양상은 서열 ID 번호 1의 아미노산서열을 포함하는 살충성 Cry2Ai 단백질 또는 그 살충 부분을 암호화하는 코딩 서열인 5' 비-번역 서열 및 3' 비-번역 영역을 포함하는 관심 살충성 단백질의 발현을 위한 DNA 구조체를 제공하는 것이고, 여기서 상기 5' 비-번역 서열은 식물 세포에서 기능하는 프로모터를 포함하고, 상기 코딩 서열은 본 명세서에 개시한 대로 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열이며, 상기 3' 비-번역 서열은 전사종결서열 및 아데닐산중합반응(polyadenylation) 신호를 포함한다.
본 개시의 또 다른 양상은 본 명세서에 개시된 재조합 DNA 또는 본 명세서에 개시된 DNA 구조체를 포함하는 플라스미드 벡터(plasmid vector)를 제공하는 것이다.
본 개시의 또 다른 양상은 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 개시의 또 다른 양상은 식물에 곤충 저항성을 부여하는 방법을 제공하는 것으로, 다음을 포함한다:
(a) 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 식물 세포에 삽입하고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 (i) 식물 세포에서 기능하는 프로모터 및 (ii) 터미네이터(terminator)에 작동 가능하도록 연결된다;
(b) (a) 단계의 식물 세포에서 형질 전환된 식물 세포를 획득하고, 여기서 상기 형질 전환된 식물 세포는 본 명세서에 개시된 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 그리고
(c) (b) 단계의 상기 형질 전환된 식물 세포에서 형질 전환 식물을 생성하고, 여기서 상기 형질 전환 식물은 본 명세서에 개시된 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시의 또 다른 양상은 본 명세서에서 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환식물을 제공하는 것이다.
본 개시의 또 다른 양상은 서열 ID 번호 1에 명시된 바와 같이 아미노산 배열을 갖는 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis)를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 개시의 또 다른 양상은 농작물 내 곤충 침입을 방제하고 곤충 저항성 관리를 제공하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 방법은 상기 농작물을 본 명세서에 개시된 살충 유효량의 조성물에 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 개시의 추가적인 다른 양상은 곤충 저항성 형질전환 식물 생산을 위한 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열, DNA 구조체 또는 플라스미드의 용도이다.
본 개시의 추가적인 다른 양상은 살충 조성물 생산을 위한 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열의 용도이며, 여기서 조성물은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스 세포를 포함한다.
본 개시는 나비목에 속하는 해충을 포함하나 이에 국한되지 않는 해충에 대한 살충 작용을 갖는 Bt Cry2Ai 단백질을 부호화하는 식물 코돈 최적화 합성 DNA 서열을 제공하여 기존의 해충 침입 문제에 대한 해결책을 제공한다.
도1 은 pGreen0029-CaMV35S-201D1의 T-DNA 구조체 지도를 도시한다.
도2은 형질전환 목화의 유전적 형질변환 및 재생을 도시한다.
간단한 서열 설명
서열 ID 번호 1 (SEQ ID NO: 1)는 Cry2Ai 단백질 아미노산 서열(NCBI GenBank: ACV97158.1)이다.
서열 ID 번호 2 (SEQ ID NO: 2)는 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 을 부호화하는 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열 (201D1) 이다.
서열 ID 번호 3 (SEQ ID NO: 3)는 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 을 부호화하는 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열 (201D2) 이다.
서열 ID 번호 4 (SEQ ID NO: 4)는 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 을 부호화하는 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열 (201D3) 이다.
서열 ID 번호 5 (SEQ ID NO: 5)는 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 을 부호화하는 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열 (201D4) 이다.
서열 ID 번호 6 (SEQ ID NO: 6)는 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 을 부호화하는 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열 (201D5) 이다.
서열 ID 번호 7 (SEQ ID NO: 7)는 201D1 DNA 서열 (서열 ID 번호 2) 증폭을 위한 순방향 프라이머 서열(forward primer sequence)이다.
서열 ID 번호 8 (SEQ ID NO: 8)는 201D1 DNA 서열 (서열 ID 번호 2) 증폭을 위한 역방향 프라이머 서열(reverse primer sequence)이다.
서열 ID 번호 9 (SEQ ID NO: 9)는 nptII DNA 유전자 증폭을 위한 순방향 프라이머 서열이다.
서열 ID 번호 10 (SEQ ID NO: 10)는 nptII DNA 유전자 증폭을 위한 역방향 프라이머 서열이다.
본 명세서에서 제공하는 자세한 설명은 본 개시를 실시하는 과정에서 당업계에서 통상의 지식을 가진 자를 돕기 위한 것이며 본 명세서에서 논의된 실시예의 변경 및 수정이 본 개시의 범위 또는 사상에서 벗어나지 않고 당업계의 통상의 지식을 가진 자들에 의해 수행될 수 있으므로 본 개시의 범위를 과도하게 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 본 개시는 첨부된 도면 및/또는 염기 서열을 참조하여 이후 보다 완전하게 설명되나, 일부의 경우, 본 개시의 모든 실시예가 도시 및/또는 설명되지 않는다. 본 개시는 다양한 형식으로 구현될 수 있고 본 명세서에 명시된 실시예를 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다.
본 명세서에서 특정 용어가 사용된다 할지라도, 이들은 제한을 목적으로 하지 않고 일반적이고 설명적인 의미에서만 사용된다. 다음 정의는 실시예의 이해를 용이하게 하기 위하여 제공된다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용하는 바와 같이, 단수형 "하나(a)," "한(an)" 및 "그(the)"는 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 관사의 문법적 대상의 하나 이상(즉, 최소 하나)을 지칭하는데 사용된다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 프로브(a probe)"에 대한 언급은 이러한 프로브가 한 번 이상 조성물에서 존재할 수 있음을 의미한다. 유사하게, "하나의 요소(an element)"에 대한 언급은 하나 이상의 요소를 의미한다.　
본 명세서 전반에 걸쳐, "포함하다(comprises)" 또는 "포함하는(comprising)"라는 단어는 명시된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계 그룹의 포함을 뜻하나 기타 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계 그룹의 제외를 뜻하지는 않는다고 이해한다.
단위, 접두사 및 기호는 SI 허용 형태로 표시될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성하고 아미노산 서열은 각각 아미노(amino)에서 카르복시(carboxy) 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 작성한다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 아미노산은 본 명세서에서 흔히 알려진 세 글자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 권장하는 한 글자 기호로 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드는, 유사하게, 흔히 허용되는 단일 글자 코드로 지칭될 수 있다. 상기 정의된 용어는 전체적으로 본 명세서를 참조해 보다 완전하게 정의된다.
"핵산(nucleic acid)"이라는 용어는 일반적으로 거대 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "핵산" 및 "뉴클레오티드 서열"라는 용어는 본 명세서에서 서로 바꿔서 사용된다. 이는 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체에 대한 언급을 포함하고, 달리 제한하지 않는 한, 자연적으로 발생하는 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 단일 가닥 핵산에 잡종화 한다는 점에서 천연 뉴클레오티드의 본질을 갖는 알려진 유사체(예를 들어, 펩티드 핵산)를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산(DNA 및 RNA)을 만들고자 중합 (긴 사슬로 연결) 되는 서브유닛이다. 뉴클레오티드는 더 작은 3가지 성분, 리보오스 당, 질소염기 및 인산 기(들)로 구성된다.
"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 핵산의 단일 가닥 또는 평행 및 역평행 가닥을 의미한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 중 하나일 수 있다.
"올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"라는 용어는 일반적으로 짧은 폴리뉴클레오티드, 대체로 약 50개 이하의 뉴클레오티드를 의미한다. 뉴클레오티드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)를 통해 표현될 경우 "U"가 "T"를 대체하는 RNA 서열(즉, A, U, G, C)를 포함하기도 한다고 이해될 것이다.
"코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열(codon optimized synthetic nucleotide sequences)"이라는 용어는 비게놈 뉴클레오티드 서열이며 천연 또는 게놈 뉴클레오타이드 서열에 비해 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 변화가 생기는 합성 뉴클레오티드 서열 또는 핵산 분자를 가리키기 위해 본 명세서에서 서로 바꿔 사용된다. 일부 실시예에서, 천연 또는 게놈 핵산 분자에 대한 변화는 특정 유기체, 예를 들어, 식물 내 발현을 위한 핵산 서열의 코돈 최적화로 인한 핵산 서열 변화, 유전자 코드의 퇴화, 천연 또는 게놈 서열과 비교해 최소 하나의 아미노산 치환, 삽입, 결실 및/또는 추가 도입을 위한 핵산 서열 변화, 제한 효소 부위 도입을 위한 핵산 서열 변화, 게놈 핵산 서열과 연관된 하나 이상의 인트론 제거, 하나 이상의 이종 인트론 삽입, 게놈 핵산 서열과 연관된 하나 이상의 업스트림(upstream) 또는 다운스트림(downstream) 조절 영역 결실, 하나 이상의 이종 업스트림 또는 다운스트림 조절 영역 삽입, 게놈 핵산 서열과 연관된 5' 및/또는 3' 비-번역 영역 결실, 이종 5' 및/또는 3' 비-번역 영역 삽입 및 폴리아데닐화 부위 변형을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 개시의 문맥에 따라, 흔히 발생하는 핵산 염기에 대해 다음 약어가 사용된다. "A"는 아데노신, "C"는 시티딘, "G"는 구아노신, "T"는 티미딘 그리고 "U"는 우리딘을 의미한다.
일부 실시예에서, 비게놈 핵산 분자는 cDNA이다. 일부 실시예에서, 비게놈 핵산 분자는 합성 뉴클레오티드 서열이다.　코돈 최적화 뉴클레오티드 서열은 당업계에 알려진 방법, 예를 들어, Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498을 이용해 모든 관심 유기체에 대하여 준비할 수 있다. 최적화 뉴클레오티드 서열은 식물, 예를 들어 쌀, 토마토 및 목화 식물 등의 외떡잎 및 쌍떡잎 식물에서 살균성 단백질 발현을 증가시키는데 사용된다.
본 명세서에 개시된 새롭게 설계된 cry2Ai DNA 서열은 "코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열"로 지칭된다.
"DNA 구조체(DNA construct)", "뉴클레오티드 구조체(nucleotide constructs)", 및 "DNA 발현 카세트(DNA expression cassette)"라는 용어는 본 명세서에서 서로 바꿔 사용되며 실시예를 DNA를 포함하는 뉴클레오티드 구조체로 제한하고자 하지 않는다. 당업계의 통상의 지식을 가진 자들은 뉴클레오티드 구조체, 특히 리보뉴클레오티드와 리보뉴클레오티드 및 디옥시리보뉴클레오티드 조합으로 구성된 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 또한 본 명세서에 개시된 방법에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
"재조합(recombinant)" 핵산 분자 또는 DNA 또는 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에서 인간의 손에 의해 변경 또는 생산되었고 재조합 박테리아 또는 식물 숙주 세포에 있는 핵산 분자 또는 DNA 폴리뉴클레오티드를 지칭하는데 사용된다. 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 화학 합성 또는 유전 공학 기술을 이용한 폴리뉴클레오티드의 분리 세그먼트(isolated segments) 조작을 통해, 게놈, RNA 역전사로 인해 생성된 cDNA, 합성 핵산 분자 또는 서열의 다른 방법으로 분리된 세그먼트 2개의 인공 조합물에서 분리된 폴리뉴클레오티드일 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상동(Homologous)"은 동일한 핵산 가닥의 두 영역 혹은 서로 다른 2개의 핵산 가닥의 영역들 간의 뉴클레오티드 서열 유사성을 의미한다. 2개의 영역 내 뉴클레오티드 잔기 위치를 동일 뉴클레오티드 잔기가 차지할 경우, 영역은 해당 위치에서 상동한다. 각 영역의 최소 하나의 뉴클레오티드 잔기 위치를 동일 잔기가 차지할 경우, 제1영역은 제2영역과 상동한다. 두 영역 간 상동성은 동일 뉴클레오티드 잔기가 차지한 두 개의 영역의 뉴클레오티드 잔기 위치의 비율 면에서 표현된다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 5'-ATTGCC-3'를 갖는 영역과 뉴클레오티드 서열 5'-TATGGC-3'를 갖는 영역은 50%의 상동성을 공유한다. 가급적, 제1영역은 제1포션을 포함하고 제2영역은 제2포션을 포함하며, 여기서 각 포션의 뉴클레오티드 잔기 위치의 최소 약 50%, 가급적 최소 약 75%, 최소 약 90% 또는 최소 약 95%를 동일 뉴클레오티드 잔기가 차지한다. 더 선호되는 바로, 포션 각각의 모든 뉴클레오티드 잔기 위치는 동일 뉴클레오티드 잔기가 차지한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬은 당업계에 알려진 알고리즘의 전산화된 구현 (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 검사를 통해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "서열 동일성 비율(Percentage of sequence identity)"은 비교 윈도우(comparison window)에서 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 단편은 서열 2개의 최적 정렬에 대한 (추가 또는 결실을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교해 볼 때 추가 또는 결실(예를 들어, 갭 또는 오버행(overhang))을 포함할 수 있다. 비율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔류가 양 서열에서 일어나 일치하는 위치의 수를 산출하는 수를 결정함으로써 계산되어, 일치하는 위치의 수를 비교 윈도우 내 위치의 총 수로 나누고 결과에 100을 곱해 서열 동일성 비율을 산출한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 당업계에 알려진 알고리즘의 전산화된 구현 (GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA, 및 TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 검사를 통해 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 뉴클레오티드 서열 간 "실질적인 서열 동일성(substantial sequence identity)"이라는 용어는 참조 서열에 비해 최소 65%의 서열 동일성, 더 나아가, 최소 67% 내지 77%의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 뜻한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "프로모터/조절 서열(regulatory sequence)"이라는 용어는 프로모터/조절 서열과 작동 가능하도록 연결된 유전자 산물 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 예에서, 이 서열은 핵심 프로모터 서열일 수도 있고 다른 예에서, 이 서열은 유전자 산물 발현에 필요한 증폭자(enhancer) 서열 및 다른 조절 요소를 포함할 수도 있다. 프로모터/조절 서열은, 예를 들어, 조직 특정 방식으로 유전자 산물을 발현시키는 것일 수도 있다.
"구성(constitutive)" 프로모터는 세포에서 일정한 방식으로 작동 가능하도록 연결된 유전자의 발현을 유도하는 프로모터이다. 예를 들어, 세포 하우스키핑 유전자(cellular housekeeping gene) 발현을 유도하는 프로모터는 구성 프로모터로 간주된다.
"유도성(inducible)" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하도록 연결되는 경우 프로모터에 해당하는 유도물질(inducer)이 세포에 존재할 때에만 유전자 산물이 실질적으로 살아있는 세포내에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직 특정(tissue-specific)" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 특정하는 폴리뉴클레오티드와 작동 가능하도록 연결되는 경우 세포가 프로모터에 해당하는 조직 타입의 세포일때에만 유전자 산물이 실질적으로 살아있는 세포내에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "작동 가능하도록 연결된(Operably linked)"은 방향이나 거리에 관계없이 조절 서열과 코딩 서열 사이의 연결을 의미하고, 여기서 연결을 통해 조절 서열은 코딩 서열의 발현을 제어할 수 있다. 또한 "작동 가능하도록 연결된"이라는 용어는 연결된 핵산 서열이 인접해 있고, 2개의 단백질 코딩 영역을 연결하는데 필요한 경우, 동일한 해독 프레임(reading frame)에서 인접해 있음을 의미한다. "작동 가능하도록 연결된"이라는 용어는 프로모터와 제2서열 간 기능적 연결을 의미하기도 하고, 여기서 프로모터 서열은 제2서열에 해당하는 DNA서열의 전사를 개시 및 조정한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "이종 DNA 코딩 서열(heterologous DNA coding sequence)" 또는 "이종 핵산(heterologous nucleic acid)" 또는 "이종 폴리뉴클레오티드(heterologous polynucleotide)"는 자연적으로 Cry2Ai 단백질 또는 Cry2Ai 단백질의 동족체를 부호화하는 것 외의 코딩 서열을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "코딩 영역(coding region)"은 단백질 아미노산 서열을 결정하는 유전자, DNA, 또는 뉴클레오티드 서열의 일부를 의미한다. "비코딩 영역(non-coding region)"이라는 용어는 코딩 영역이 아닌 유전자, DNA, 또는 뉴클레오티드 서열의 일부를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 특정 핵산의 문맥상 사용될 경우, "부호화(encoding)" 또는 "부호화된(encoded)"이라는 용어는 핵산이 특정 단백질로의 뉴클레오티드 서열 번역을 지시하는데 필요한 정보를 포함함을 의미한다. 단백질이 부호화 된다는 정보는 코돈을 사용해 명시한다. 단백질을 부호화하는 핵산은 핵산의 번역된 영역 내에서 비-번역 서열(예를 들어, 인트론(intron))을 포함하거나 해당 개재 비-번역 서열(intervening non-translated sequence)(예를 들어, cDNA에서와 같이)이 결여된 상태일 수도 있다.
"폴리펩티드(polypeptide)," "펩티드(peptide)," 및 "단백질"이라는 용어들은 자연 발생 구조 변이체(naturally occurring structural variants) 및 펩티드 결합을 통해 연결된 그것의 합성 비-자연 발생 유사체(synthetic non-naturally occurring analogs)와 관련된 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 서로 바꾸어 사용할 수 있다. 합성 폴리펩티드는, 예를 들어, 자동화된 폴리펩티드 합성기(automated polypeptide synthesizer)를 이용해 합성할 수 있다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연 발생 아미노산에 해당되는 인공적인 화학 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. "잔기(residue)" 또는 "아미노산 잔기(amino acid residue)" 또는 "아미노산"이라는 용어는 단백질, 폴리펩티드, 또는 펩티드(총칭하여, "단백질")에 포함되는 아미노산을 지칭하기 위해 본 명세서에서 서로 바꾸어 사용할 수 있다. 아미노산은 자연 발생 아미노산일 수 있고, 달리 제한되지 않는 한, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능할 수 있는 천연 아미노산의 알려진 유사체를 포함할 수 있다. 　
"단백질"이라는 용어는 일반적으로 대형 폴리펩티드(large polypeptide)를 의미한다. "펩티드"라는 용어는 일반적으로 짧은 폴리펩티드(short polypeptide)를 의미한다. 그러나, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드 결합을 통해 연결된 둘 이상의 아미노산 잔기로 구성된 아미노산 중합체를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발현 카세트(expression cassette)"는 유전자 및 그 발현에 필요한 조절 영역을 포함하는 유전자 모듈을 의미하고, 이는 벡터에 포함될 수 있다.
"벡터(vector)"는 핵산 분자를 포함하고 분리된 핵산을 세포 내부에 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연관된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나 이에 국한되지 않는 수많은 벡터가 당업계에 알려져 있다. 따라서, "벡터"라는 용어에는 자기복제 플라스미드 또는 바이러스가 포함된다. 또한 이 용어는 예를 들어, 폴리리신 화합물, 리포솜 등과 같이 세포로의 핵산 이동을 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물을 포함하는 것으로 이해해야 한다. 바이러스 벡터의 예에는 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector), 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터(retroviral vector) 등이 포함되나 이에 국한되지 않는다.
"발현 벡터(Expression vector)"라는 용어는 발현될 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 핵산을 포함하는 벡터를 의미한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스작용(cis-acting) 요소를 포함하고; 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포에 의해 또는 체외 발현시스템(in vitro expression system)에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 코스미드, 플라스미드(예를 들어, 리포솜에 노출(naked)되거나 포함) 및 재조합 핵산을 포함하는 바이러스 등 당업계에 알려진 모든 것들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "숙주 세포(host cell)"라는 용어는 벡터를 포함하고 발현 벡터의 복제 및/또는 발현을 지원하는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 대장균(E. coli)과 같은 원핵 세포(prokaryotic cell) 또는 효모, 곤충, 양서류 또는 포유류 세포와 같은 진핵 세포(eukaryotic cell) 또는 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물 세포일 수 있다. 외떡잎 숙주 세포의 예는 쌀 숙주 세포이고 쌍떡잎 숙주 세포의 예는 가지 또는 토마토 숙주 세포이다. 가능하다면, 서열은 예측 헤어핀 이차 mRNA 구조(predicted hairpin secondary mRNA structure)를 피하기 위해 변형한다.
본 명세서에서 사용되는 "독소(toxin)"라는 용어는 살균 작용 또는 살충 작용을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다. "Bt" 또는 "바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis)" 독소는 해당 독소를 포함하는 Bt의 다양한 균주에서 발견되는 보다 넓은 부류의 Cry 독소를 포함하고자 한다.
"프로브(probe)" 또는 "샘플 프로브(sample probe)"이라는 용어는 보체 또는 특정 미세배열(microarray) 요소에 의해 인식되는 분자를 의미한다. 본 개시를 통해 조사될 수 있는 프로브의 예는 DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 올리고당, 다당류, 당, 단백질, 펩티드, 단클론 항체(monoclonal antibodies), 독소, 바이러스 항원결정기(viral epitopes), 호르몬, 호르몬 수용체, 효소, 효소 기질(enzyme substrate), 보조인자(cofactor) 및 세포 표면 수용체(cell surface receptor)에 대한 작용제(agonists) 및 길항제(antagonists)를 포함하는 약물을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "상보적(complementary)" 또는 "보체(complement)"라는 단어는 이중 가닥 핵산에서 수소 결합을 통해 연관되는 염기, 푸린 및 피리미딘 쌍을 의미한다. 다음 염기 쌍: 구아닌과 사이토신; 아데닌과 티미딘; 그리고 아데인과 우라실은 상보적이다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 완전하고 부분적인 상보성을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "잡종화(hybridization)"라는 단어는 핵산 가닥이 염기 쌍을 통해 상보 가닥과 결합하는 과정을 의미한다. 동일하지 않지만, 매우 유사한 2개의 상보적 핵산의 잡종화에서 이용되는 조건은 가닥 2개의 상보성 정도 및 가닥의 길이에 따라 다양하다. 따라서, 상기 용어는 완전한 잡종화뿐만 아니라 부분적인 잡종화를 고려한다. 해당 기법 및 조건은 본 업계의 전문가에게 잘 알려져 있다.
"살충 작용(insecticidal activity)" 및 "살균 작용(pesticidal activity)"이라는 단어는 적절한 시간 동안의 먹이 공급(feeding) 및 노출 후 해충 폐사율, 해충 무게 감소, 해충 퇴치(repellency), 및 기타 해충의 행동학적이고 물리적 변화에 의해 측정될 수 있으나, 이에 국한되지 않는, 유기체 또는 물질(예를 들어, 단백질 등)의 활동을 지칭하기 위해 본 명세서에서 서로 바꾸어 사용할 수 있다. 따라서, 살균 작용을 하는 유기체 또는 물질은 최소 하나의 측정 가능한 해충 적합성(fitness) 매개변수에 부정적인 영향을 미친다. 예를 들어, "살충성 단백질"은 스스로 또는 다른 단백질과 결합하여 살충 작용을 나타내는 단백질이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "해충을 살충하는(affecting insect pests)"이라는 용어는 살충, 생장 억제, 번식 능력 방해, 섭식 저해 활동 등을 포함하나 이에 국한되지 않는, 모든 발달 단계에서의 곤충 섭식, 생장 및/또는 행동 변화 제어를 의미한다.　
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "살균 유효량(pesticidally effective amount)"은 해충 환경에 존재할 때 살균 작용을 하는 유기체 또는 물질의 양을 함축한다. 각 물질 또는 유기체의 경우, 특정 환경에서 영향을 받은 각 해충에 대한 살균 유효량은 실증적으로 결정된다. 유사하게, "살충 유효량(insecticidally effective amount)"은 해충이 곤충 해충일 경우 "살균 유효량"을 지칭할 때 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "형질변환 식물(transformed plant)" 및 "형질전환 식물(transgenic plant)"은 게놈 내에서 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물을 의미한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 연속 세대로 전달되도록 형질전환 또는 형질변환 식물의 게놈 내에서 안정적으로 통합된다. 이종 폴리뉴클레오티드는 단독으로 또는 재조합 DNA 분자의 일부로 게놈에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "형질전환(transgenic)"이라는 용어는 식물 세포, 식물 세포계, 캘러스(callus), 조직, 식물 부분 또는 유전자형이 하나 이상의 이종 핵산의 존재로 변경된 식물을 포함한다고 이해한다. 이 용어는 초기 형질전환체를 통한 유성 교배(sexual crosses) 또는 무성 번식(asexual propagation)에 의해 생성된 형질전환체 뿐만 아니라 당업계에 알려진 유전적 형질변환 방법을 이용해 초기에 획득한 형질전환체를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "초기 형질전환체(initial transgenic)"라는 용어는 전통적인 식물 육종 방법 또는 무작위 타화수정(random cross-fertilization), 비-재조합 바이러스 감염(non-recombinant viral infection), 비-재조합 세균성 질환(non-recombinant bacterial transformation), 비-재조합 전위(non-recombinant transposition), 또는 자연 돌연변이(spontaneous mutation)와 같은 자연 발생 사건을 통한 (염색체 또는 염색체 외) 게놈의 교체를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "식물"이라는 용어는 전체 식물, 식물 세포, 식물 프로토폴라스트(plant protoplast), 식물이 재생될 수 있는 식물 세포 조직 배양균, 식물 캘러스(plant calli), 식물 클럼프(plant clump), 및 배, 화분, 밑씨, 종자, 잎, 꽃, 가지, 열매, 알맹이, 이삭, 속대, 겉껍질, 줄기, 뿌리, 뿌리 끝, 꽃밥 등과 같은 식물과 그 후대 또는 그 일부에서 온전한 식물 세포를 포함한다. 형질전환 식물의 일부는 실시예의 범위 내에 있으며 예를 들어, 형질전환 세포에서 발생되는 꽃, 줄기, 열매, 잎과 뿌리 뿐만 아니라 식물 세포, 프로토폴라스트, 조직, 캘러스 및 배 또는 실시예의 DNA 분자를 통해 이전에 형질 변환되어 최소 형질전환 세포의 일부를 구성하는 그들의 후대를 포함한다.
바실러스 튜링겐시스(Bacillus thuringiensis) cry 유전자 및 코돈 최적화
델타-엔도톡신(δ-endotoxins)을 부호화하는 약 400개의 cry 유전자가 이제 시퀀싱되었다(Crickmore, N. 2005. Using worms to better understand how Bacillus thuringiensis kills insects. Trends in Microbiology, 13(8): 347-350). 다양한 델타-엔도톡신은 아미노산 서열 유사성을 근거로 여러 개의 강(class)(Cry 1, 2, 3, 4, 등)으로 분류되었다. 이러한 강들은 여러 개의 아강(subclass)(Cry1A, Cry1B, Cry1C, 등)으로 구성되고, 이는 아과 또는 이형(Cry1A, Cry1B, Cry1C, 등)으로 세분된다. 각 강의 유전자는 서로 45% 이상 동일하다. 각 개별 cry 유전자 산물은 일반적으로 소수의 종의 유충기로 제한되는, 한정적 활동 스펙트럼을 갖는다. 그러나, Cry 단백질의 동일성 정도와 활동 스펙트럼 간 상관관계를 확립하는 것을 불가능했다. Cry1Aa 및 Cry1Ac 단백질은 84% 동일하나, Cry1Aa만 누에나방(Bombyx mori) (L.)에 유독하다. 반대로, 33%만 동일한 Cry3Aa 및 Cry7Aa은 모두 콜로라도 감자잎벌레(렙티노타르사 디셈리네아타(Leptinotarsa decemlineata))에 대하여 활성적이다. 다른Cry 독소의 경우 곤충에 전혀 활성적이지 않으나, 다른 무척추동물에는 활성적이다. 예를 들어, Cry5 및 Cry6 단백질 강은 선충류에 활성적이다. 보다 최근의 경우, Cry34Ab1/Cry35Ab1로 명명되고, 입벌레과(Chrysomelidae family)의 다양한 딱정벌레목 해충에 대해 활성적인 Bt의 이원 독소에 대한 특징이 규정되었다. Cry 독소군의 다른 종과는 상동하는 부분이 거의 없을지라도, Cry라는 명칭이 할당되었다.
형질전환 식물 내 이종 단백질의 희망 발현 수준을 얻기 위해, 코딩 서열의 G+C 함량이 숙주 식물 종의 G+C 함량과 보다 가깝게 일치하는 바와 유사하게, 코돈 사용빈도가 숙주 식물 종의 코돈 사용빈도와 보다 가깝게 일치하도록, 다양한 방식을 통해 천연의, 가끔 야생형 또는 원형 게놈 DNA 코딩 서열을 변경하는 것이 유익한 것으로 밝혀졌다.
식물 분자 생물학 분야의 지식을 지닌 사람은 다수의 DNA 서열이 단일 아미노산 서열을 부호화하도록 설계될 수 있다는 점을 이해한다. 관심 단백질에 대한 코딩 영역의 발현을 증가시키는 일반적인 수단은 코돈 조성이 유전자가 발현되도록 표적화된 숙주의 전체 코돈 조성과 유사한 방식으로 코딩 영역을 변형시키는 것이다.
게놈/천연 핵산은 숙주 유기체에서의 발현 증가를 위해 최적화될 수 있다. 따라서, 숙주 유기체가 식물일 경우, 합성 핵산은 발현 향상을 위해 식물 선호 코돈(plant-preferred codons)을 이용해 합성될 수 있다. 예를 들어, 실시예의 핵산 서열이 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 종 모두에서 발현될 수 있다 해도, 이러한 선호도가 다른 것으로 밝혀졌기 때문에 서열을 수정해 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물의 특정 코돈 선호도 및 GC 함량 선호도를 설명할 수 있다 (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). 따라서, 특정 아미노산에 대한 쌀 선호 코돈은 쌀의 알려진 유전자 서열에서 유도될 수 있고 특정 아미노산에 대한 가지 선호 코돈은 가지의 알려진 유전자 서열에서 유도될 수 있다.
추가 서열 수정은 세포 숙주 내 유전자 발현을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 여기에는 유전자 발현에 유해할 수 있는 가짜 폴리아데닐화 신호(spurious polyadenylation signals), 엑손 인트론 스플라이스 사이트 신호(exon-intron splice site signals), 트랜스포존 유사 반복(transposon-like repeats) 및 기타 특성화된 서열을 부호화하는 서열의 제거가 포함된다. 숙주 세포에서 발현된 알려진 유전자를 참조해 산출된 바와 같이, 서열의 GC 함량은 특정 세포 숙주에 대한 평균 수준으로 조정될 수 있다.
Vaeck et al., (Vaeck M, Reynaerts A, Hφfte H, Jansens S, De Beukeleer M, Dean C, Zabeau M, Van Montagu M, Leemans J (1987) Transgenic plants protected from insect attack. Nature 327:33-37)은 미국 및 유럽에서 옥수수를 공격하는 주요 해충 중 하나인 유럽 옥수수 좀(European corn borer)으로부터의 보호를 위해 Bt cry1Ab 유전자를 발현시키는 곤충 저항성 형질전환 담배(tobacco plant)생산을 보고했다. 그러나, 강력한 프로모터의 사용에도 불구하고, 식물 내 독소 생산은 초기에 효과적인 농업용으로 사용하기에는 너무 약했다 (Koziel G M, Beland G L, Bowman C, Carozzi N B, Crenshaw R, Crossland L, Dawson J, Desai N, Hill M, Kadwell S, Launis K, Maddox D, McPherson K, Heghji M, Merlin E, Rhodes R, Warren G, Wright M, Evola S (1993) Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis. Biotechnology 11:194-200). 식물 유전자와 달리, Bt 유전자는 A+T 함량이 높은데 (66%), 이는 식물에 대한 부최적 코돈 사용빈도이고 이로 인해 전사의 미스 스플라이싱(missplicing) 또는 조기 종결이 발생할 수 있다 (De la Riva and Adang, 1996).
Perlak et al., (Perlak F J, Fuchs R L, Dean D A, McPherson S L, Fishhoff D A (1991) Modification of the coding sequences enhances plant expression of insect control protein genes, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88:3324-3328.) 는 천연 유전자에 비해 식물 내에서의 독소 생산을 2배 허용하는 식물에 대한 최적의 코돈 사용빈도를 보장하기 위해 부호화된 펩티드 서열을 수정하지 않고 cry 유전자의 코딩 서열을 수정했다. 이 전략은 변형된 cry1 유전자를 통해 형질 변환된 목화, 쌀 및 옥수수 그리고 변형된 cry3A 유전자를 통해 형질 변환된 감자와 같은 많은 식물에서 성공적으로 사용되었다. Bt 옥수수 및 Bt 목화는 전세계에서 대규모로 재배된다.
따라서, 유기체 중에서 자연적으로 존재하는 코돈 편향(naturally existing codon bias)은 이종 유기체에서 유전자의 부최적 발현을 야기한다. 본 개시에서, 바실러스 튜링겐시스의 천연 cry2Ai 유전자는 외떡잎 및 쌍떡잎 식물을 포함한 식물 내 재조합 단백질의 최적 발현을 위해 인실리코(in-silico) 방식으로 재구성되었다. 다변량 분석을 통한 설계를 하는 동안, 희귀 및 초희귀 코돈은 쌍떡잎/외떡잎 식물의 선호도가 높은 코돈으로 대체되었다. 유전자 설계자 툴(gene designer tool)로 설계한 재구성된 합성 유전자는 절단된 단백질(truncated protein)의 발현을 피하기 위해 희귀 코돈 사용량, mRNA의 2차구조 안정성, 유전자 2차 전사 시작에 대해 수동으로 확인되었다. 최적화 mRNA의 구조 및 안정성은 mRNA 옵티마이저(optimizer)에 의해 확인 및 입증되었다.
본 개시의 특정 양상은 Cry2Ai 살충성 단백질, 살충 조성물, 폴리뉴클레오티드 구조체, 재조합 뉴클레오티드 서열, 재조합 벡터, 본 개시의 핵산 분자를 포함하는 형질 변환 미생물 및 식물을 부호화하는 코돈 최적화 합성 핵산을 제공한다. 이러한 조성물은 해충, 특히 작물 해충 방제 방법에서 사용된다.
본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 구성, 유도, 일시적 조절, 발생적 조절, 조직 선호 및 조직 특정 프로모터를 포함한 다양한 프로모터와 함께 결합되어 재조합 DNA 분자를 준비할 수 있다. 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열(코딩 서열)은 천연 cry2Ai 유전자와 비교할 때 형질 변환 식물에서 실질적으로 더 높은 수준의 발현을 제공한다. 따라서, 헬리코버파 아르미게라(Helicoverpa armigera)-목화 벌레 및 옥수수 벌레, 크나파로크로시스 메디날리스(Cnaphalocrocis medinalis)-혹명나방 및 스컬포파가 인세르튤라스 (Scirpophaga incertulas)-볏노란줄기벌레 및 페크티노포라 가십피엘라(Pectinophora gossypiella)와 같은 나비목 해충(Lepidopteran pests)에 저항성을 갖는 식물을 생산할 수 있다.
본 개시의 하나의 실시예는 식물 선호 코돈을 갖는 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 개시의 또 다른 실시예는 목화, 가지, 쌀, 토마토 및 옥수수와 같은 식물에서의 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공한다. 본 개시의 또 다른 실시예는 본 개시의 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열을 포함하는 식물 형질 변환 벡터 및 DNA 발현 카세트를 제공한다. 본 개시의 또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열을 포함하는 조성물 또는 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열에 의해 부호화되는 살충성 폴리펩티드를 제공한다. 본 명세서에 개시된 조성물은 본 개시의 살균성 및/또는 살충성 단백질/폴리펩티드를 포함하는 살균성 및/또는 살충성 조성물일 수 있다. 또 다른 실시예는 Cry2Ai 독소 단백질을 발현시키는 본 개시의 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물을 제공한다.
특히, 본 개시는 서열 ID 번호 2, 서열 ID 번호 3, 서열 ID 번호 4, 서열 ID 번호 5, 및 서열 ID 번호 6에 명시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 제공하고, 여기서 상기 뉴클레오티드는 서열 ID 번호 1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 살충성 Cry2Ai 단백질을 부호화한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 나아가 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 cry2Ai 뉴클레오티드 서열을 통해 형질 변환된 미생물 및 식물, 그리고 해충 살충 과정에서 해당 뉴클레오티드 서열, 살균성 조성물, 형질 변환 유기체, 및 그의 생성물 사용을 포함하는 방법을 제공한다.
실시예의 폴리뉴클레오티드 서열은, 부호화된 살충성 및/또는 살균성 단백질 생성을 위해 임의의 유기체, 예를 들어, 바실러스 튜링겐시스와 같은 미생물 및 식물을 형질 변환 시키는데 사용될 수 있다. 식물 해충 살충 또는 방제를 위한 해당 형질 변환 유기체의 사용을 포함한 방법을 제공한다. 실시예의 핵산 및 뉴클레오티드 서열은 엽록체 등 세포 소기관(organelle)을 형질 변환 시키는데 사용될 수도 있다. 당업계의 기술자가 본 개시에 개시된 뉴클레오티드 서열을 이용해 형질변환을 수행할 수 있도록 하는 희망 유기체의 형질 변환 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
실시예의 뉴클레오티드 서열은 특정 유기체 세포에 의한 발현에 최적화된 핵산 또는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 살균작용을 하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 식물 선호 코돈을 이용해 역번역(back-translated)(즉, reverse translated)된 핵산 서열을 포함한다.
본 개시는 살충성 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 핵산/뉴클레오티드 서열을 제공한다. 합성 코딩 서열은 쌀, 토마토, 가지, 옥수수, 목화 및 콩과 식물과 같은 외떡잎 및 쌍떡잎 식물에서 단백질을 발현시키는데 사용하기에 특히 적합하다.
본 개시는 특히 식물에서 잘 발현되도록 적응된 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 합성 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 평균적으로 식물 종에서 자연 발생하는 유전자에서 활용되는 거의 동일한 빈도로 식물 최적화 코돈을 활용한다. 또한 본 개시는 식물이 곤충 저항성을 갖도록 하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
식물 형질 변환을 위해, 선택가능한 표지 유전자(selectable marker gene)를 본 개시에서 사용한다. 본 명세서에 개시된 합성 서열을 포함하는 DNA 구조체 및 형질전환 식물은 농업적으로 중요한 식물을 이용하기 위한 방법 및 조성물로 교시한다.
코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열 각각이 부호화하는 단백질은 나비목 종의 억제성 생물학적 활동(inhibitory biological activity)을 나타낸다. 외떡잎 및/또는 쌍떡잎 식물은 바실러스 튜링겐시스 균주에서 유래된 알려진 나비목 살충성 단백질을 이용하는 것만으로는 이전에 실현 불가능했던 분야에서 곤충 저항성 관리의 수단을 획득하기 위해 단백질, 결정 단백질, 독소, 및/또는 하나 이상의 표적 해충(target pest) 내에서 유전자를 억제하고자 하는 해충 특정 이중 가닥 RNA 등의 살충제를 부호화하는 다른 뉴클레오티드 서열과 결합하여 또는 단독으로 본 명세서에 개시된 뉴클레오티드 서열 각각을 통해 형질 변환될 수 있다.
본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 나비목 해충, 딱정벌레목 해충, 자흡형(piercing and sucking) 해충 등으로 구성된 그룹에서 선택된 일반 식물 해충 각각 중 하나 이상을 방제하기 위한 최소 하나의 수단을 포함하도록 형질 변환된 식물을 획득하기 위해 살충성 독소를 부호화하는 다른 타입의 뉴클레오티드 서열과 결합하여 식물에서 사용될 수도 있다.
조절 서열(Regulatory sequences)
전사 및 번역 조절 신호(Transcriptional and translational regulatory signal)는 프로모터, 전사 개시 시작 부위, 작동 유전자(operator), 활성제(activator), 증폭자, 기타 조절 요소, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈(initiation codon), 종결 신호 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드/DNA 구조체는 5'에서 3'로의 전사 방향에서 숙주 역할을 하는 유기체에서 기능적인 전사 및 번역 개시 영역 (즉, 프로모터), 실시예의 DNA 서열, 및 전사 및 번역 종결 영역 (즉, 종결 영역)을 포함한다. 전사 개시 영역(즉, 프로모터)은 숙주 유기체 및/또는 실시예의 서열에 대하여 천연, 유사, 외래, 또는 이종적일 수 있다. 추가적으로, 프로모터는 자연 서열 혹은 대체 합성 서열일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "외래(foreign)"라는 용어는 프로모터가 삽입된 천연 유기체에서 프로모터가 발견되지 않음을 나타낸다. 프로모터가 실시예의 서열에 "외래적" 이거나 "이종적"일 경우, 프로모터는 실시예의 작동 가능하도록 연결된 서열에 대한 천연 또는 자연 발생 프로모터가 아닌 것으로 의도된다.
많은 프로모터가 실시예를 수행하는데 사용될 수 있다. 프로모터는 원하는 결과를 기반으로 선택할 수 있다. 본 개시의 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열은 숙주 유기체에서의 발현을 위해 구성, 조직 선호, 유도성, 또는 기타 프로모터와 결합할 수 있다. 식물 숙주 세포에서 사용하기에 적합한 구성 프로모터는, 예를 들어, 코어 CaMV 35S 프로모터(core CaMV 35S promoter); 쌀 액틴(rice actin); 유비퀴틴(ubiquitin); ALS 프로모터 등을 포함한다.
원하는 결과에 따라, 유도성 프로모터에서 유전자를 발현하는 것이 이로울 수 있다. 식물에서 실시예의 뉴클레오티드 서열 발현 조절을 위한 손상 유도성 프로모터(wound-inducible promoter)는 특히 관심 대상이다. 이러한 손상 유도성 프로모터는 해충 섭식으로 인한 피해에 반응할 수 있고, 감자 단백질 가수분해효소 억제제(potato proteinase inhibitor)(pin II) 유전자; wun1 및 wun2, win1 및 win2; WIP1; MPI 유전자 등을 포함한다.
추가적으로, 병원체 유도성 프로모터(pathogen-inducible promoter)는 실시예의 방법 및 뉴클레오티드 구조체에서 이용될 수 있다. 이러한 병원체 유도성 프로모터는 병원체에 의한 감염 후 유도되는 병원성관련단백질(pathogenesis-related protein)(PR 단백질); 예를 들어, PR 단백질, SAR 단백질, β-1,3-글루카나아제, 키티나아제 등의 프로모터를 포함한다.
화학 조절 프로모터(Chemical-regulated promoter)는 외인성 화학 조절제(exogenous chemical regulator)를 사용해 식물 내 유전자 발현을 조절할 수 있다. 목적에 따라, 프로모터는 화학물질 사용이 유전자 발현을 유도할 경우 화학 유도성 프로모터(chemical-inducible promoter)이거나 화학물질 사용이 유전자 발현을 억제할 경우 화학 억제성 프로모터(chemical-repressible promoter)일 수도 있다. 화학 유도성 프로모터는 당업계에 잘 알려져 있고, 벤젠술폰아미드 제초제 약해 경감제(benzenesulfonamide herbicide safener)에 의해 활성화되는 옥수수 In2-2 프로모터(maize In2-2 promoter), 발아전 제초제(pre-emergent herbicide)로 사용되는 소수 친전자성 화합물(hydrophobic electrophilic compound)에 의해 활성화되는 옥수수 GST 프로모터(maize GST promoter) 및 살리실산에 의해 활성화되는 타바코 PR-1a 프로모터(tobacco PR-1a promoter)를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 기타 관심 화학 조절 프로모터는 스테로이드 반응성 프로모터(steroid-responsive promoter)를 포함한다.
특정 조직에서 "선호되는" 발현을 갖는 프로모터는 최소 하나의 다른 식물 조직에서 보다 해당 조직에서 더 많이 발현된다. 일부 조직 선호 프로모터는 거의 특정 조직에서만 발현을 나타낸다. 조직 선호 프로모터는 특정 식물 조직 내에서 강화된 살균성 단백질 발현을 표적화 하는데 활용될 수 있다. 해당 프로모터는, 필요한 경우, 약한 발현을 위해 변형될 수 있다.
일부 조직 특정 프로모터의 예는 잎 선호 프로모터(leaf-preferred promoter), 뿌리 특정 또는 뿌리 선호 프로모터(root specific or root preferred promoter), 종자 특정 또는 종자 선호 프로모터(seed specific or seed preferred promoter), 화분 특정 프로모터(pollen specific promoter) 및 중과피 특정 프로모터(pith specific promoter)를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
뿌리 선호 또는 뿌리 특정 프로모터는 알려져 있고 문헌에서 이용가능한 것에서 선택되거나 다양한 호환(compatible) 종들로부터 새로 (de novo) 분리될 수 있다.
"종자 선호" 프로모터는 "종자 발아(seed-germinating)" 프로모터(종자 발아 중 활성인 프로모터) 뿐만 아니라 "종자 특정(seed-specific)" 프로모터(종자 저장 단백질 프로모터 등 종자 발달 중 활성인 프로모터) 모두를 포함한다. 감마 제인(Gamma-zein) 및 Glob-1는 배유 특정 프로모터(endosperm-specific promoter)이다. 쌍떡잎 식물의 경우, 종자 특정 프로모터는 β.-파세올린, β.-콘글리시닌, 대두렉틴, 크루시페린 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 외떡잎 식물의 경우, 종자 특정 프로모터는 옥수수 15 kDa 제인, 22 kDa 제인, 27 kDa 제인, g-제인, 왁시(waxy), 슈렁큰(shrunken) 1, 슈렁큰 2, 글로불린 1 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
낮은 수준의 발현을 원할 경우, 약한 프로모터를 사용한다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 "약한 프로모터(weak promoter)"라는 용어는 낮은 수준에서의 코딩 서열 발현을 유도하는 프로모터를 뜻한다. 이러한 약한 구성 프로모터는, 예를 들어, Rsyn7 프로모터, 코어 35S CaMV 프로모터 등의 코어 프로모터를 포함한다.
종결 영역은 옥토핀 합성효소(octopine synthase)(OCS) 및 노팔린 합성효소(nopaline synthase)(NOS) 종결 영역과 같은 A. 튜메파시엔스 (A. tumefaciens)의 티아이 플라스미드(Ti-plasmid)에서 이용 가능하다.
DNA 발현 카세트는 추가적으로 5' 선도 서열(leader sequence)을 포함할 수 있다. 이러한 선도 서열은 작용하여 번역을 향상시킬 수 있다. 번역 리더는 당업계에 알려져 있고, 피코르나바이러스(picornavirus) 리더, 예를 들어, EMCV 리더 (뇌심근염 (Encephalomyocarditis) 5' 비코딩 영역); 포티바이러스(potyvirus) 리더, 예를 들어, TEV 리더(담배 에치 (Tobacco Etch) 바이러스), MDMV 리더 (옥수수 드워프 모자이크 (Maize Dwarf Mosaic) 바이러스), 알팔파 모자이크(alfalfa mosaic) 바이러스(AMV RNA 4)의 외피 단백질 mRNA의 비-번역 리더; 담배 모자이크(tobacco mosaic) 바이러스 리더(TMV); 및 옥수수 황화 모틀 바이러스(maize chlorotic mottle virus) 리더(MCMV)를 포함한다.
본 명세서에서 개시되고 청구된 개시의 하나의 특정 실시예에서, 조직 선호 또는 조직 특정 프로모터는 살충성 단백질을 부호화하는 본 개시의 합성 DNA 서열, 및 최소 하나의 그런 재조합 분자로 안정적으로 형질 변환된 형질전환 식물과 작동 가능하도록 연결된다. 그에 따라 생성된 식물은 DNA(들)가 발현된 식물의 해당 부분을 먹고 사는 특정 곤충에 저항성을 갖게 된다.
선택가능한 표지 유전자 (Selectable marker gene)
일반적으로, 발현 카세트는 형질 변환된 세포의 선택을 위한 선택가능한 표지 유전자를 포함한다. 선택가능한 표지 유전자는 형질 변환된 세포 또는 조직의 선택을 위해 활용된다. 표지 유전자는 글루포시네이트 암모늄(glufosinate ammonium), 브로목시닐(bromoxynil), 이미다졸리논(imidazolinone), 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트(dichlorophenoxyacetate) (2,4-D) 와 같은 제초제 화합물에 대한 저항성을 부여하는 유전자 뿐만 아니라 네오마이신 인산전이효소(neomycin phosphotransferase) II (nptII) 및 히그로마이신 인산전이효소(hygromycin phosphotransferase) (hptII) 를 부호화하는 것과 같은 항생물질 내성(antibiotic resistance)을 부호화하는 유전자를 포함한다. 적합한 선택가능한 표지 유전자의 추가 예는 클로람페니콜(chloramphenicol), 메토트렉세이트(methotrexate), 스트렙토마이신(streptomycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 블레오마이신(bleomycin), 설폰아마이드(sulphonamide), 브로목시닐(bromoxynil), 글리포세이트(glyphosate), 포스피노트리신(phosphinothricin)에 대한 저항성을 부호화하는 유전자를 포함하나 이에 국한되지 않는다.
상기 선택가능한 표지 유전자 목록은 제한하기 위함이 아니다. 모든 선택가능한 표지 유전자는 실시예에서 사용될 수 있다.
DNA 구조체 및 벡터
본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 관심 유기체에서의 발현을 위해 DNA 구조체에서 제공된다. 구조체는 본 개시의 서열과 작동 가능하도록 연결된 5' 및 3' 조절 서열을 포함한다.
이러한 폴리뉴클레오티드 구조체는 조절 영역의 전사 조절을 받도록 Cry2Ai 독소 단백질 서열을 부호화하는 DNA 서열 삽입을 위한 복수의 제한부위와 함께 제공된다. 폴리뉴클레오티드 구조체는 선택가능한 표지 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다. 구조체는 원하는 유기체로 동시에 형질 변환되도록 최소 하나의 추가 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다. 또는, 추가 유전자(들)이 다수의 폴리뉴클레오티드 구조체에 제공될 수 있다.　
DNA 구조체/발현 카세트를 준비하는데 있어, 다양한 DNA 단편이 적절한 방향에서 그리고 적절할 경우, 적절한 해독틀에서 DNA 서열에 제공되도록 조작될 수 있다. 이를 위해, 어댑터(adapter)나 링커(linker)가 DNA 단편 결합을 위해 이용될 수 있고 또는 다른 조작이 편리한 제한 부위, 불필요한 DNA 제거, 제한부위 제거 등을 위해 제공되도록 포함될 수 있다. 이를 위해, 체외 돌연변이유발(in vitro mutagenesis), 프라이머 복구, 제한, 어닐링(annealing), 재치환(resubstitution), 예를 들어, 전이 및 전환이 포함될 수 있다.
본 개시에 따라, 본 명세서에 개시된DNA 구조체/발현 카세트는 재조합 발현 벡터에 삽입될 수 있다. "재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)"라는 표현은 박테리아 플라스미드, 파지(phage), 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유류 세포 바이러스 또는 기타 벡터를 의미한다. 일반적으로, 숙주에서 복제되고 안정될 수 있는 한, 어떤 플라스미드 또는 벡터라도 사용할 수 있다. 발현 벡터의 중요한 특징은 복제기점(replication origin), 프로모터, 표지 유전자, 및 번역조절요소를 가지고 있다는 것이다.
형질 변환된 세포의 선택을 허용하는 표지 및 대장균(E. coli) 내 복제 시스템을 포함하는 많은 클로닝 벡터(cloning vector)는 외래 유전자를 고등식물로 삽입하기 위한 준비에 사용할 수 있다. 벡터는, 예를 들어, pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, 특히 pACYC184를 포함한다. 따라서, Bt 독소 단백질을 부호화하는 서열을 갖는 DNA 단편은 적합한 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있다. 생성된 플라스미드는 대장균으로의 형질변환에 사용된다. 대장균 세포는 적합한 배지에서 배양되어, 수확되고, 용해된다. 플라스미드는 복구된다. 서열 분석, 제한 분석, 전기 영동, 및 기타 생화학분자 생물학적 방법이 일반적으로 분석 방법으로 수행된다. 각 조작 후, 사용된 DNA 서열은 절단되어 다음 DNA 서열에 연결될 수 있다. 각 플라스미드 서열은 동일하거나 다른 플라스미드에서 복제될 수 있다. 원하는 유전자를 식물에 삽입하는 방법에 따라, 다른 DNA 서열이 필요할 수 있다. 만약, 예를 들어, Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포의 형질변환을 위해 사용될 경우, Ti 또는 Ri 플라스미드 T-DNA의 최소 우측 경계는, 그러나 가끔 우측 및 좌측 경계는, 삽입될 유전자의 측면 영역으로 연결되어야 한다.
본 개시의 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열 및 전사/번역 조절에 적합한 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업계 기술자에게 잘 알려진 방법으로 구축할 수 있다. 그런 방법의 예는 체외(in vitro) 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술, 및 체내(in vivo) 재조합 기술을 포함한다. DNA 서열은 mRNA 합성을 유도하기 위해 발현 벡터에서 적합한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한, 발현 벡터는, 번역 개시 부위로서, 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 개시의 재조합 벡터의 선호 예는 벡터가 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적절한 숙주에 존재할 경우 자신의 일부, 즉 이른바 T-영역을 식물 세포에 전달할 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 타입의 Ti-플라스미드 벡터는 식물 세포 또는 잡종 DNA(hybrid DNA)를 식물 게놈에 적절하게 삽입함으로써 새로운 식물을 생산할 수 있는 원형질체에 잡종 DNA를 전달하는데 현재 사용된다.
발현 벡터는 최소 하나의 선택가능한 표지 유전자를 포함할 수 있다. 선택가능한 표지 유전자는 일반적인 화학적 방법에 의해 선택될 수 있음을 기반으로 특성을 갖는 뉴클레오티드 서열이다. 비형질변환 세포로부터의 형질변환 세포의 분화에 사용될 수 있는 모든 유전자는 선택 마커일 수 있다. 글리포세이트 및 포스피노트리신과 같은 제초제에 내성이 있는 유전자와 카나마이신, 히그로마이신, G418, 블레오마이신 및 클로람페니콜과 같은 항생제에 내성이 있는 유전자가 예에 포함되나 이에 국한되지 않는다.
본 개시의 재조합 벡터의 경우, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴 또는 유비퀴틴 프로모터 중 어느 하나일 수 있지만, 이에 국한되지 않는다. 형질변환체가 다양한 단계에서 다양한 메커니즘을 통해 선택될 수 있기 때문에, 구성 프로모터가 본 개시에 선호될 수 있다. 그러므로, 구성 프로모터 선택 가능성을 본 명세서에서 제한하지 않는다.
본 개시의 재조합 벡터의 경우, 임의의 전통적인 터미네이터를 사용할 수 있다. 그것의 예는 노팔린 합성효소 (NOS), 쌀 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터 및 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefacien)의 옵토핀(optopine) 유전자에 대한 터미네이터 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 터미네이터의 필요성과 관련하여, 일반적으로 이러한 영역이 식물 세포 내 전사의 신뢰도 및 효율성을 증가시킬 수 있다고 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 개시의 맥락에 비춰 볼 때 선호도가 매우 높다.
당업계 기술자는 본 명세서에 개시된 DNA 구조체 및 벡터가 곤충 저항성 형질전환 식물 생산 및/또는 살충성 조성물 생산에 사용될 수 있음을 알고 있고, 여기서 조성물은 Cry2Ai 살충성 단백질을 생산하기 위해 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스 세포 또는 본 명세서에 개시된 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있는 다른 미생물을 포함할 수 있다.
재조합 세포
또한 실시예는 본 개시의 최소 하나의 코돈 최적화 핵산, 핵산을 포함하는 발현 카세트, 또는 발현 카세트를 포함하는 벡터를 통해 형질 변환된 미생물도 포함한다. 일부 실시예에서, 미생물은 식물에서 증식하는 것이다. 본 개시의 실시예는 본 개시의 Cry2Ai 단백질을 발현시킬 수 있는 형질 변환 미생물을 포함하는 캡슐화된(encapsulated) 살균성 단백질과 관련이 있다.
추가 실시예는 식물 및 곤충 세포, 박테리아, 효모, 바큘로바이러스, 원생동물, 선충 및 조류로 구성된 그룹에서 선택된 유기체 등의 형질 변환 유기체와 관련이 있다. 형질 변환 유기체는 본 개시의 코돈 최적화 합성 DNA 분자, 상기 DNA 분자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함하는데, 이는 형질 변환 유기체 게놈에 안정적으로 포함될 수 있다.
Cry2Ai 단백질을 부호화하는 유전자는 곤충 병원체(insect pathogenic organism)를 형질변환 시키는데 이용될 수 있다고 인식된다. 해당 유기체에는 바큘로바이러스, 진균, 원생동물, 박테리아 및 선충이 포함된다.
실시예의 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 적합한 벡터를 통해 미생물 숙주에 도입될 수 있고 상기 숙주는 환경 또는 식물이나 동물에 적용될 수 있다. 핵산을 세포에 삽입한다는 맥락에서 "도입된(introduced)"이라는 용어는 "형질주입(transfection)", "형질변환(transformation)" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하고, 핵산이 세포의 게놈으로 결합되거나 (염색체, 플라스미드, 색소체, 미토콘드리아 DNA), 자율 리플리콘(autonomous replicon)으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현(예를 들어, 세포감염된 mRNA)될 수 있는 진핵 또는 전핵 세포로의 핵산 결합에 대한 언급을 포함한다.　
DNA의 안정적 유지 및 발현을 고려하는 조건에서 살균성 단백질을 발현시키는 외래 DNA를 미생물 숙주로 도입하기 위해 여러가지 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 구조체의 발현을 위한 전사 및 번역 조절 신호와 작동 가능하도록 연결된 관심 뉴클레오티드 구조체, 및 통합이 일어나게 될 숙주 유기체 및/또는 통합이나 안정적인 유지가 일어나게 될 숙주에서 기능하는 복제 시스템 내 서열에 상동하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트가 구축될 수 있다.
식물 형질변환 방법 및 형질전환 식물 생산
Bt Cry2Ai 독소 단백질을 부호화하는 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열(DNA 서열)은 당업계에 잘 알려진 다양한 기법을 이용해 식물 세포에 삽입될 수 있다. 일단 삽입된 DNA가 식물 게놈에 통합되면, 이는 상대적으로 안정적이다. 형질변환 벡터는 카나마이신, 비알라포스, G418, 블레오마이신, 또는 히그로마이신과 같은 살생물제 또는 항생물질에 대한 저항성을 형질변환 식물 세포에 부여하는 선택℃* 표지를 일반적으로 포함한다. 따라서 개별적으로 사용되는 표지는 삽입된 DNA를 포함하지 않는 세포보다 형질변환 세포의 선택을 허용해야 한다.
DNA를 식물 숙주 세포에 삽입하기 위해 많은 기법을 이용할 수 있다. 이러한 기술에는 기타 가능한 방법 뿐만 아니라 형질변환체로 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조진스(Agrobacterium rhizogenes)를 이용하는 T-DNA를 이용한 형질전환, 융합, 주입, 유전자총(biolistics)(미세입자 충격(microparticle bombardment)) 또는 전기천공법이 포함된다. 아그로박테리아가 형질변환에 사용될 경우, 삽입될 DNA는 특별 플라스미드, 즉 중간 벡터(intermediate vector) 또는 바이너리 벡터(binary vector)로 복제되어야 한다. 중간 벡터는 T-DNA 내 서열과 상동한 서열로 인해 상동 재조합을 통해 Ti 또는 Ri 플라스미드로 통합될 수 있다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 T-DNA 전달에 필요한 vir 영역을 포함하기도 한다.
중간 벡터는 아그로박테리아에서 자기 복제를 할 수 없다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드(helper plasmid)를 이용해 아그로박테리아 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 전달될 수 있다(접합(conjugation)). 바이너리 벡터는 대장균 및 아그로박테리아 모두에서 자기 복제를 할 수 있다. 그들은 선택℃* 표지 유전자 및 링커 또는 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역에 둘러싸인 폴리링커(polylinker)을 포함한다. 그들은 아그로박테리아로 바로 형질 변환될 수 있다. 숙주 세포로 이용되는 아그로박테리아는 독성(vir) 영역을 나르는 플라스미드를 포함한다. vir 영역은 식물 세포로의 T-DNA 전달에 필요하다. 추가 T-DNA가 포함될 수 있다. 그렇게 형질 변환된 박테리아는 식물 세포의 형질변환에 이용된다. 식물 외식편(Plant explant)은 식물 세포로의 DNA 전달을 위해 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조진스(Agrobacterium rhizogenes)와 함께 이롭게 배양할 수 있다. 그 후 전체 식물이 적합한 배양기에서 감염된 식물 재료(예를 들어, 잎 조각, 줄기 부분, 뿌리, 원형질체 또는 현탁-배양(suspension- cultivated) 세포)로부터 재생될 수 있고, 여기에 선택용 항생물질 또는 살생물제가 포함될 수 있다. 그 후 그렇게 획득된 식물을 삽입된 DNA의 존재를 위해 테스트할 수 있다. 주입 및 전기천공법의 경우, 플라스미드에 대한 특별한 요구사항이 없다. 보통의 플라스미드, 예를 들어, pUC 유도체(derivative)를 이용할 수 있다.
형질변환된 세포는 전통적인 방법을 따라 식물로 재배될 수 있다. 이러한 식물은 재배 후 동일한 형질 변환 균주나 다른 균주를 통해 수분되고, 희망 표현형 특징(phenotypic characteristic)이 구성 또는 유도 발현이 식별된 잡종이 발생된다. 2세대 이상을 재배해 원하는 표현형 특징의 발현이 안정적으로 유지되어 유전됨을 보장하고 종자를 수확해 원하는 표현형 특징의 발현이 달성되었음을 보장할 수 있다. 그들은 생식 세포를 형성하고 형질 변환된 형질을 자손 식물(progeny plant)에 전달할 수 있다. 이러한 식물은 통상적인 방법으로 재배하고 동일한 형질 변환된 유전 인자 또는 다른 유전 인자를 갖는 식물과 이화수정 시킬 수 있다. 생성된 잡종 개체는 해당되는 표현형 특징을 갖는다.
본 개시의 식물 형질 변환 방법은 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 식물에 도입하는 것을 포함하고 폴리뉴클레오티드를 식물에 도입하는 특정 방법에 의존하지 않는다. 안정적 형질변환 방법, 일시적 형질변환 방법 및 바이러스 매개(virus-mediated) 방법을 포함하나 이에 국한되지 않는, 식물로의 폴리뉴클레오티드 도입 방법은 당업계에 알려져 있다.　
본 개시의 일 실시예에서, 식물은 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 통해 형질 변환되었다. 형질 변환된 식물의 일부 비제한적 예는 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 번식가능(fertile) 형질전환 쌀 및 토마토 식물이다. 쌀과 토마토의 형질변환 방법은 당업계예 알려져 있다. 다양한 다른 식물 역시 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 이용해 형질 변환될 수 있다.
"안정적 형질변환(Stable transformation)"은 식물에 도입된 뉴클레오티드 구조체는 식물의 게놈으로 통합되고 그것의 자손을 통해 유전될 수 있음을 의미하고자 한다. "일시적 형질변환(Transient transformation)"은 폴리뉴클레오티드는 식물에 도입되고 식물의 게놈으로 통합되지 않거나 또는 폴리펩티드는 식물에 도입됨을 의미하고자 한다.
뉴클레오티드 서열을 식물에 도입하기 위한 프로토콜 뿐만 아니라, 형질변환 프로토콜 또한 식물 타입 또는 식물 세포, 즉, 형질변환 대상인 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물에 따라 달라질 수 있다. 식물 세포로의 뉴클레오티드 서열 도입 및 식물 게놈으로의 후속 삽입에 대한 적합한 방법에는 미량주사법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 아그로박테리움-매개 형질전환(Agrobacterium-mediated transformation) 및 충격 입자 가속(ballistic particle acceleration)이 포함된다.
본 개시의 일 실시예에서, Cry2Ai 독소를 부호화하는 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 고등 유기체, 예를 들어, 본 개시의 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열을 이용하는 식물에서 발현된다. 이 경우, 독소의 유효량을 발현시키는 형질전환 식물은 해충으로부터 스스로를 보호한다. 곤충이 이러한 형질전환 식물을 먹기 시작하면, 발현된 독소 역시 섭취한다. 이로 인해 곤충이 식물 조직을 물어 뜯는 것을 막고, 또는 심지어 곤충에 해를 입히거나 죽일 수도 있다. 본 개시의 뉴클레오티드 서열은 발현 카세트에 삽입되어, 안정적으로 식물 게놈에 통합된다.
또한 실시예는 실시예의 최소 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질 변환되거나 형질 전환된 식물을 포함한다. 일부 실시예에서, 식물은 식물 세포 내 발현을 유도하는 프로모터와 작동 가능하도록 연결된 실시예의 최소 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 구조체를 통해 안정적으로 형질 변환된다.
실시예는 식물 병해충에 대한 식물의 저항성을 증가시키는 특정 생물학적 메커니즘에 의존하지 않지만, 식물 내 실시예의 뉴클레오티드 서열 발현을 통해 실시예의 살균성 단백질이 생산되고 식물 병해충에 대한 식물의 저항성이 증가할 수 있다. 실시예의 식물은 해충을 살충하는 농업 방법에 이용된다. 특정 실시예는 예를 들어, 쌀 및 토마토 식물과 같은 형질 변환된 농작물을 제공하는데, 이는 예를 들어, 크나파로크로시스 메디날리스(Cnaphalocrocis medinalis) -혹명나방 및 스컬포파가 인세르튤라스(Scirpophaga incertulas) -볏노란 줄기벌레를 포함한 다양한 나비목 곤충과 같은 식물의 해충을 살충하는 방법에 사용된다.
"대상 식물(subject plant) 또는 식물 세포"는 형질 변환과 같은 유전적 개변(genetic alteration)이 관심 유전자에 관해 영향을 받은 것이거나, 또는 그렇게 개변된 식물이나 세포에서 전해지고 개변을 포함하는 식물 또는 식물 세포이다. "대조(control)" 또는 "대조 식물(control plant)" 또는 "대조 식물 세포(control plant cell)"는 대상 식물 또는 식물 세포의 표현형 변화 측정을 위한 기준점을 제공한다. 대조 식물 또는 식물 세포는, 예를 들어, (a) 즉, 결과적으로 대상 식물 또는 세포를 발생시키는 유전적 개변에 대한 시작 물질(starting material)과 동일한 유전자형의 야생형(wild-type) 식물 또는 세포; (b) 시작 물질과 유전자형이 동일하지만 무표지(null) 구조체를 통해 (즉, 표지 유전자를 포함하는 구조체와 같이, 관심 형질에 미치는 영향이 알려지지 않은 구조체를 통해) 형질 변환된 식물 또는 식물 세포; (c) 대상 식물 또는 식물 세포의 자손 중 비 형질 변환 분리개체(segregant)인 식물 또는 식물 세포; (d) 대상 식물 또는 식물 세포와 유전적으로 동일하지만 관심 유전자 발현을 유도하는 조건이나 자극에 노출되지 않은 식물 또는 식물 세포; 또는 (e) 관심 유전자가 발현되지 않는 조건에 있는 대상 식물 또는 식물 세포 그 자체를 포함할 수 있다.
목화, 쌀, 가지(brinjal), 토마토 및 콩과 식물 계통과 같은 동종 번식된 식물로의 본 명세서에 개시된 cry2Ai 뉴클레오티드 결정 형질의 전달(또는 유전자 이입)은 반복성 선발 육종(recurrent selection breeding), 예를 들어, 역교배(backcrossing)를 통해 수행될 수 있다. 이 경우, 희망하는 반복친(recurrent parent)은 cry2Ai 결정 형질에 대해 본 명세서에서 개시된 뉴클레오티드 서열을 나르는 공여(donor) 동종번식(비반복)친과 먼저 교배된다. 그 후 이 교배의 자손은 비반복친에서 전달될 희망 형질(들)에 대하여 발생된 자손에서의 선택 이전의 반복친과 역교배된다. 희망 형질(들)에 대한 선택을 통한 반복친과의 3세대, 좋게는 4세대, 더 좋게는 5세대 이상의 역교배 후, 자손은 전달되는 형질을 제어하는 유전자좌(loci)에 대하여 이형접합 되겠지만, 대부분 또는 거의 모든 다른 유전자에 대해서는 반복친과 같을 것이다.
또한 실시예는 종자, 괴경, 알줄기, 알뿌리, 잎 및 뿌리 및 어린싹의 절단부분을 포함하나 이에 국한되지 않는, 실시예의 형질 변환된 식물의 식물 번식(plant-propagating) 물질과 관련이 있다.
실시예의 방법에서 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로 외떡잎 및 쌍떡잎 식물을 포함하나 이에 국한되지 않는, 형질변환 기법을 적용할 수 있는 고등 식물 부류만큼 광범위하다. 관심 식물의 예에는 곡물, 곡류, 야채, 기름, 과일, 관상식물, 잔디 등이 포함되나 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 벼 (오리자 사비타(Oryza sativa), 오리자 spp.(Oryza spp.)), 옥수수 (지 메이스(Zea mays)), 호밀 (세케일 시리얼(Secale cereale)), 수수 (소르굼 비칼라(Sorghum bicolor), 소르굼 불게어(Sorghum vulgare)), 기장 (예를 들어, 펄 기장(페니세툼 글라우쿰(Pennisetum glaucum)), 보통기장 (파니쿰 밀리아세움(Panicum miliaceum)), 조 (세타리아 이탈리카(Setaria italica)), 손가락 조 (엘레우신 코라카나(Eleusine coracana)), 밀 (트리티쿰 애스티붐(Triticum aestivum), 트리티쿰 sp.(Triticum sp.)), 귀리(아베나 사티바(Avena sativa)), 보리 (호르디움 불게어 L (Hordeum vulgare L)), 사탕수수 (사챠룸 spp. (Saccharum spp.)), 목화 (가시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum), 가시피움 발바덴스(Gossypium barbadense), 가시피움 sp. (Gossypium sp.)), 토마토 (리코페르시콘 에스쿨렌툼(Lycopersicon esculentum)), 가지 (솔라눔 멜론게나(Solanum　melongena)), 감자 (솔라눔 튜버로숨(Solanum tuberosum)), 사탕무 (베타 불가리스(Beta vulgaris)), 고구마 (이포모에아 바타투스(Ipomoea batatus)), 카사바 (마니핫 에스쿨렌타(Manihot esculenta)), 양상추 (라크투카 사티바(Lactuca sativa)), 양배추 (브라시카 오엘라시아 var. 카피타타(Brassica oleracea var. capitata)), 콜리플라워 (브라시카 오엘라시아 var. 보트리티스(Brassica oleracea var. botrytis)), 브로콜리 (브라시카 오엘라시아 var. 인디카(Brassica oleracea var. indica)), 브라시카 종 (예를 들어, B. 나푸스(B. napus), B. 라파(B. rapa), B. 준시아(B. juncea)), 특히 종자유 원료로 유용한 브라시카 종, 콩 (글리시네 맥스(Glycine max)), 해바라기 (헬리안투스 아누스(Helianthus annuus)), 잇꽃 (카르타무스 틴토리우스(Carthamus tinctorius)), 땅콩 (아라치스 히포가이아(Arachis hypogaea)), 비둘기 콩 (카자누스 카잔(Cajanus cajan)), 이집트콩 (시세르 아리에티눔(Cicer arietinum)), 줄 콩 (파세오루스 불가리스(Phaseolus vulgaris)), 리마 콩 (파세오루스 리멘시스(Phaseolus limensis)), 완두 (피숨 사티붐(Pisum sativum)), 완두류 (라티루스 spp. (Lathyrus spp.)), 오이 (세쿠미스 사티버스(Cucumis sativus)), 캔털루프 (세쿠미스 칸타루펜시스(Cucumis　cantalupensis)), 및 머스크 멜론 (세쿠미스 멜로(Cucumis melo)), 알팔파 (메디카고 사티바(Medicago sativa)), 담배 (니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)) 및 애기장대 (아라비돕시스 타리아나(Arabidopsis thaliana)).
관심 식물에는 관심 종자를 제공하는 곡물 식물, 지방종자(Oil-seed) 식물, 및 콩과식물이 포함된다. 관심 종자에는 옥수수, 밀, 보리, 쌀, 수수, 호밀, 기장 등과 같은 곡물 종자가 포함된다. 지방종자 식물에는 목화, 콩, 잇꽃, 해바라기, 브라시카, 옥수수, 알팔라, 야자나무과, 코코넛, 아마, 아주까리, 올리브 등이 포함된다. 콩과식물에는 콩류 및 완두류가 포함된다. 콩류에는 구아, 로커스트콩, 호로파, 콩, 강낭콩, 동부, 녹두, 리마 콩, 파바 콩, 렌즈콩, 이집트콩 등이 포함된다.
특정 실시예에서, 본 개시의 최소 하나의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열(들)은 원하는 표현형을 갖는 식물을 만들기 위해 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 임의의 조합으로 적층(stack)될 수 있다. 예를 들어, 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 다른 Bt 독소 단백질 등과 같은 살균성 및/또는 살충성 작용을 갖는 폴리펩티드를 부호화하는 임의의 다른 폴리뉴클레오티드와 함께 적층될 수 있다. 생성된 조합은 관심 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나의 다수의 복제품을 포함할 수도 있다. 또한 실시예의 뉴클레오티드 서열은 고급 오일 유전자, 균형 잡힌 아미노산, 비생물적 스트레스 저항성(abiotic stress resistance) 등과 같이 동물성 사료에 바람직한 형질을 포함하나 이에 국한되지 않는 다양한 희망 형질 조합을 갖는 식물을 생산하기 위해 임의의 다른 유전자 또는 유전자 조합과 함께 적층될 수 있다.
또한 본 개시의 뉴클레오티드 서열은 병 또는 제초제 저항성, 비병원성 및 병 저항성 유전자, 아세토락테이트 산티아제 (ALS), 포스피노트리신 또는 바스타(예를 들어, 바(bar) 유전자)와 같은 글루타민 산티아제 억제제, 글리포세이트 저항성에 대하여 바람직한 형질 및 고급 오일, 변성 오일, 변성 녹말(예를 들어, ADPG 피로포스포릴라아제 (AGPase), 녹말 신타아제 (SS), 녹말 분지 효소(starch branching enzymes)(SBE) 및 녹말 탈분지 효소(starch debranching enzymes)(SDBE))과 같은 생성물을 처리하는데 바람직한 형질과 함께 적층될 수 있다. 또한 실시예의 폴리뉴클레오티드를 웅성 불임성(male sterility), 줄기 강도, 개화 시기, 또는 세포 주기 조절이나 유전자 표적화와 같은 형질 변환 기술 특성 등의 작물 특성을 제공하는 폴리뉴클레오티드와 결합시킬 수 있다.
이러한 적층된 조합은 임의의 전통적이고, 유전적인 형질변환을 통한 식물 이중 교배를 포함하나 이에 국한되지 않는 임의의 방법, 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 방법을 통해 생성될 수 있다. 식물을 유전적으로 형질 변환하여 형질을 적층할 경우, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 언제라도 그리고 어떤 순서로도 결합할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 희망 형질을 포함하는 형질전환 식물은 후속 형질변환을 통한 추가 형질 도입을 위한 표적으로 사용될 수 있다. 형질은 형질변환 카세트의 임의의 조합을 통해 제공되는 관심 폴리뉴클레오티드와 함께 동시에 동시형질변환 프로토콜에 도입될 수 있다. 예를 들어, 2개의 서열이 도입될 경우, 2개의 서열은 별개의 형질변환 카세트(trans)에 포함되거나 동일한 형질전환 카세트(cis)에 포함될 수 있다. 서열의 발현은 동일한 프로모터 또는 서로 다른 프로모터를 통해 유도될 수 있다. 특정 경우에는, 관심 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하는 형질변환 카세트를 도입하는 것이 바람직할 수도 있다. 이는 식물 내 원하는 형질 조합을 생성하기 위하여 다른 억제 카세트 또는 과잉 발현(over-expression) 카세트의 임의의 조합과 결합될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 서열은 부위 특정 재조합 시스템을 이용하여 원하는 게놈 위치에서 적층될 수 있다고 인식된다.
형질전환 식물 분석
중합효소 연쇄 반응 (Polymerase Chain Reaction) (PCR)
본 개시는 서열 ID 번호 7-8에 명시된 프라이머가 존재하는 상태에서 PCR을 통한 DNA 증폭을 포함해, 서열 ID 번호 1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 본 개시에 개시된 서열 ID 번호 2에 명시된 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열 단편의 PCR 증폭 방법을 제공한다. 유사하게, 본 개시에 개시된 서열 ID 번호 3 내지 6에 명시된 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열의 단편은 상기 뉴클레오티드 서열에 특정인 프라이머를 이용해 증폭할 수 있다. 당업자는 상기 뉴클레오티드 증폭을 위해 설정된 프라이머를 설계할 수 있다. 탬플릿(template) DNA에서 얻은 DNA 단편의 PCR 증폭을 위한 프로토콜 및 조건은 본 본명세서에 기술되거나 당업계에 알려져 있다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머는 본 개시의 코돈 최적화 DNA 서열에서 해당하는 DNA 서열을 증폭시키기 위하여 PCR 반응 시 사용되도록 설계될 수 있다. PCR 프라이머 설계 및 PCR 클로닝(cloning) 방법은 당업계에 일반적으로 알려져 있고 Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)에 개시되어 있다, 이하 "삼브룩(Sambrook)". 알려진 PCR 방법은 쌍을 이루는 프라이머(paired primer), 이중 프라이머(nested primer), 단일 특정 프라이머(single specific primer), 퇴화된 프라이머(degenerate primer), 유전자 특정 프라이머(gene-specific primer), 벡터 특정 프라이머(gene-specific primer), 부분 불일치 프라이머(partially-mismatched primer) 등을 이용한 방법을 포함하나 이에 국한되지 않는다.　
일 실시예에서, 본 개시는 살균성 폴리펩티드를 부호화하는 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열 단편의 PCR 증폭에 적합한 프라이머 세트 및 DNA의 PCR 증폭에 설정된 프라이머 세트 사용 방법을 제공한다. 프라이머 세트는 본 개시의 뉴클레오티드 서열에 어닐링되도록 설계된 순방향 및 역방향 프라이머를 포함한다.
본 개시의 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열 증폭을 위한 프라이머 세트는 서열 ID 번호 7 및 서열 ID 번호 8에 명시된 순방향 및 역방향 프라이머를 포함한다.
서던 잡종화 ( Southern Hybridization )
잡종화 기술에서, 알려진 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부는 복제된 게놈 DNA 단편 집단(population)에 또는 선택된 유기체에 존재하는 다른 해당하는 뉴클레오티드 서열을 선택적으로 잡종화시키는 프로브(probe)로서 사용된다. 잡종화 프로브는 본 개시의 코돈 최적화 DNA 서열의 PCR 증폭 DNA 단편이거나, 또는 본 명세서에 개시된 합성 뉴클레오티드의 해당하는 서열에 잡종화할 수 있는 뉴클레오티드 서열(들) 또는 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 선형화된(linerarized) 플라스미드일 수 있고, 32P 이나 다른 검출가능 표지 등의 검출가능 그룹으로 라벨링할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 잡종화 프로브는 실시예의 서열에 기반하여 합성 올리고뉴클레오티드를 라벨링함으로써 만들 수 있다. 잡종화 프로브 준비 방법은 일반적으로 당업계에 알려져 있고 삼브룩에 개시된다.
예를 들어, 본 명세서에 개시된 전체 서열, 또는 그것의 하나 이상의 부분은 해당 서열에 특정으로 잡종화 할 수 있는 프로브로서 사용될 수 있다. 다양한 조건 하에서 특정 잡종화를 달성하기 위해, 이러한 프로브는 실시예의 서열에 고유하고 일반적으로 길이가 최소 약 10 또는 20 뉴클레오티드인 서열을 포함한다. 이러한 프로브는 PCR을 이용한 뉴클레오티드 서열의 해당 cry2Ai 뉴클레오티드 서열을 증폭하는데 사용될 수 있다.
이러한 서열의 잡종화는 엄격한 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "엄격한 조건(stringent conditions)" 또는 "엄격한 잡종화 조건(stringent hybridization conditions)"이라는 용어는 프로브가 다른 서열보다 검출 가능할 정도로 더 큰 정도로 (예를 들어, 최소 2배, 5배, 또는 10배 이상) 표적 서열에 잡종화되는 조건을 뜻한다. 엄격한 조건은 서열에 따라 다르며 다양한 상황에서 달라질 것이다. 잡종화 및/또는 세척조건의 엄격성을 제어함으로써, 프로브와 100% 상보적인 표적 서열을 식별할 수 있다 (상동 프로빙(homologous probing)). 또는, 엄격성 조건은 더 낮은 정도의 유사성을 검출하기 위해 서열 내 일부 불일치를 허용하도록 조정될 수 있다 (이종 프로빙(heterologous probing).
일반적으로, 엄격한 조건이란 염 농도가 약 1.5 M Na 이온 미만, 일반적으로 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 짧은 프로브(예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오티드)의 경우 온도가 최소 약 30°C이고 긴 프로브(예를 들어, 50 뉴클레오티드 이상)의 경우 온도가 최소 약 60°C인 조건이다. 엄격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제(destabilizing agent)를 추가해 달성할 수도 있다. 예시적인 낮은 엄격성 (low stringency) 조건에는 30% 내지 35%의 포름아미드 완충 용액(buffer solution), 1 M NaCl, 37°C에서의 1% SDS (황산 도데실 나트륨(sodium dodecyl sulfate)) 및 50°C 내지 55°C에서 1x 내지 2x SSC (20x SSC=3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨(trisodium citrate))로 세척(wash)을 통한 잡종화가 포함된다. 예시적인 적당한 엄격함 (moderate stringency) 조건에는 포름아미드 40% 내지 45%, 1.0 M NaCl, 37°C에서의 1% SDS, 및 55 내지 60°C에서0.5x 내지 1x SSC로 세척을 통한 잡종화가 포함된다. 예시적인 높은 엄격함 (high stringency) 조건에는 포름아미드 50%, 1 M NaCl, 1% SDS at 37°C, 및 최소 약 20분 동안 60°C 내지 65°C에서 0.1x SSC로 최종 세척을 통한 잡종화가 포함된다. 선택적으로 세척 완충액(wash buffer)은 약 0.1% 내지 약 1% SDS를 포함할 수 있다. 잡종화 기간은 일반적으로 약 24시간 미만, 보통 약 4시간 내지 약 12시간이다.
특정성(specificity)은 일반적으로 잡종화 후(post-hybridization) 세척 기능으로, 최종 세척 용액의 이온 강도 및 온도가 결정적인 요인이다. DNA-DNA 잡종의 경우, 열융점(Tm)(thermal melting point)은 Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284의 수학식: Tm =81.5°C +16.6 (log M)+0.41 (% GC)-0.61 (% form)-500/L를 이용해 근사화할 수 있고; 여기서 M은 1가 양이온(monovalent cation)의 몰농도이고, % GC는 DNA내 구아노신 및 사이토신 뉴클레오티드 비율이며, "% form"은 잡종화 용액 내 포름아미드 비율이고, L은 염기 쌍 내 잡종의 길이이다. Tm 은 상보적 표정 서열의 50%가 완벽하게 일치하는 프로브에 잡종화되는 (정의된 이온 강도 및 pH에 따른) 온도이다. 세척은 2시간, 1시간, 또는 30분 등, 적어도 평형에 도달하고 낮은 잡종화 백그라운드 레벨(background level)에 도달할 때까지, 일반적으로 수행된다. Tm 은 불일치의 각 1%마다 약 1°C씩 감소하고; 따라서, Tm 잡종화 및/또는 세척 조건은 원하는 동일성 서열에 잡종화할 수 있도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 동일성이 90%인 서열을 발견할 경우, Tm 은 10°C 감소될 수 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 그 보체에 대하여 Tm보다 낮은 약 5°C로 선택된다. 그러나, 매우 엄격한 조건은 Tm보다 낮은 1, 2, 3, 또는 4°C에서 잡종화 및/또는 세척을 활용할 수 있고; 적당히 엄격한 조건은 Tm보다 낮은 6°C, 7°C, 8°C, 9°C, 또는 10°C에서 잡종화 및/또는 세척을 활용할 수 있고; 낮은 엄격성 조건은 Tm보다 낮은 11°C, 12°C, 13°C, 14°C, 15°C, 또는 20°C에서 잡종화 및/또는 세척을 활용할 수 있다.
수학식, 잡종화 및 세척 조성물 및 원하는 Tm을 이용해, 통상의 기술자는 세척 용액 및/또는 잡종화 엄격성 변화는 본질적으로 설명된다고 이해한다. 만약 원하는 불일치 정도로 인해 Tm이 45°C (수용액) 또는 32°C (포름아미드 용액) 미만일 경우, SSC 농도는 더 높은 온도를 사용할 수 있도록 높일 수 있다. 핵산의 잡종화에 대한 광범위한 안내서는 Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); 및 Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)에서 찾아볼 수 있다. 삼브룩 외 참고.
본 개시는 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631이나 이에 상보적인 서열로부터 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열의 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정적으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 당업계 기술자는 핵산 잡종화를 위해 본 명세서에 개시된 뉴클레오티드 서열에 기반한 프로브 준비에 대해 알고 있다.
단백질 발현 분석 (Protein Expression Assays)
관심 단백질의 발현 수준을 정량적으로 결정하기 위해, 다양한 분석을 수행할 수 있다. 관심 단백질의 발현 수준은 직접적으로, 예를 들어, 식물 내 부호화된 단백질 수준에 대한 분석을 통해 측정될 수 있다. 이러한 분석 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 노던 블로팅(Northern blotting) 혹은 정량적 역전사효소-PCR(quantitative reverse transcriptase-PCR)(qRT-PCR)를 이용해 전사 수준을 평가할 수 있는 반면, 웨스턴 블로팅(western blotting), ELISA 검정 (효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay)) 혹은 효소 검정(enzyme assay)을 이용해 단백질 수준을 평가할 수 있다.
본 개시에서, 본 개시에 개시된 코돈 최적화 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물의 Cry2Ai 단백질 발현 수준은 ELISA를 이용해 결정되었고 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 DNA 서열이 형질전환 식물 내 Cry2Ai 단백질 발현의 엄청난 향상을 보여준다는 것이 놀랍게도 그리고 뜻밖에 발견되었다. 이렇게 획득한 형질전환 식물 내 향상된 Cry2Ai 단백질 발현은 표적 곤충에 대한 최고 수준의 보호를 효율적으로 유발하는데 최적일 수 있다. 따라서 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 DNA 서열은 해충에 대한 저항성 향상을 위한 효과적인 곤충 방제를 통한 작물 수확량 증가를 위해 사용될 수 있다.
생물검정 (Bioassay)
광범위하게 다양한 생물검정 기법은 당업자에게 알려져 있다. 일반적인 절차에는 밀폐된 용기에서의 식이 공급원으로의 실험 화합물 또는 유기체 추가가 포함된다. 살균 작용은 적절한 시간 동안의 먹이 공급 및 노출 후 폐사율, 무게 감소, 유인(attraction), 퇴치, 및 기타 행동학적이고 물리적인 변화에 의해 측정될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 본 명세서에 개시된 생물검정은 유충 또는 성충 단계의 모든 섭식 해충과 함께 사용될 수 있다.
살충성 조성물 (Insecticidal composition)
생물학적 살충제는 기존의 화학 살충제에 대하여 가장 전망이 좋은 대안 중 하나이며, 이는 환경 및 생물군에 거의 또는 전혀 해를 끼치지 않는다. 바실러스 튜링겐시스 (일반적으로 Bt로 알려짐)는 성장의 정지기 또는 노화가 진행되는 동안 델타내독소(δ-endotoxin)로 불리는 결정성 단백질을 생산하는 살충성 그램 양성 아포균(insecticidal Gram-positive spore-forming bacterium)이다. Bt는 1902년 쉬게테인 이쉬와타리(Shigetane Ishiwatari)에 의해 병에 걸린 누에(밤빅스 모리(Bombyx mori))에서 처음 발견되었다. 그러나 이는 1915년 병에 걸린 밀가루 나방 애벌레(에페스티아 쿠니엘라(Ephestia kuhniella))에서 에른스트 베르라이너(Ernst Berliner)에 의해 공식적으로 특징화되었다. 곤충 방제에 이를 이용했다는 최초의 기록은 1920년 말 헝가리에 있고, 1930년대 초 유고슬라비에서, 이는 유럽 옥수수좀 방제를 위해 이용되었다. 선두적인 생물학적 합리 살충제(biorational pesticide)인 Bt는 초기에 곤충 병원체로 묘사되었고, 그 살충 작용은 대부분 또는 완전히 부아포 결정체(parasporal crystal)에서 기인한 것으로 여겨졌다. 이는 150종이 넘는 해충에 활성적이다. Bt 배양균의 독소는 결정성 단백질을 생산하는 능력에 있는데, 이에 대한 관찰을 통해 나비목, 파리목 및 딱정벌레목 중 특정 곤충 종의 방제를 위해 Bt를 기반으로 한 생물살충제(bioinsecticide)가 개발되었다.
실시예의 조성물은 다양한 방법으로 식물, 종자, 및 식물 생성물을 보호하는데 사용된다. 예를 들어, 조성물은 분무, 살분법(dusting), 살포(broadcasting) 또는 종자코팅(seed coating)으로 구성된 그룹에서 선택된 절차를 통해 해충 환경에 유효량의 살균성 조성물을 배치하는 것을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다.
식물 번식 물질(열매, 덩이줄기, 알뿌리, 알줄기, 곡물, 종자), 특히 종자가 상업상품으로 판매되기 전, 원할 경우 박테리아, 진균 또는 유해 동물에 의한 피해를 예방하기 위하여 배합(formulation) 분야에서 통상적으로 사용하는 추가 보인자(carrier), 계면활성제(surfactant), 또는 이용촉진 보조제(application-promoting adjuvant)와 함께, 제초제, 살충제, 살균제, 살세균제, 살선충제, 연체동물 살충제, 또는 이러한 몇몇 제제(preparation)의 혼합물을 포함하는 보호 코팅(protectant coating)을 이용해 통상적으로 처리한다. 종자를 처리하기 위해, 덩이줄기 또는 곡물에 약제(liquid formulation)를 함침시키거나 또는 복합 습식(wet) 또는 건식(dry) 배합으로 이를 코팅하여 보호 코팅을 종자에 적용할 수 있다. 또한, 특별한 경우, 예를 들어, 싹이나 열매에 대한 처리 등 식물에 적용하는 다른 방법이 가능하다. 　
실시예의 살균성 단백질을 부호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 실시예의 식물 종자는 예를 들어, 캡탄, 카복신, 티람, 메탈락실, 피리미포스-메틸, 및 종자 처리에 일반적으로 사용되는 다른 것과 같은 종자 처리 화합물을 포함하는 종자 보호 코팅으로 처리될 수 있다. 일 실시예에서, 실시예의 살균성 조성물을 포함하는 종자 보호 코팅은 종자 처리에서 통상적으로 사용되는 종자 보호 코팅 중 하나와 결합하여 또는 단독으로 사용된다. 실시예의 조성물은 직접 적용을 목적에, 또는 적용 전 적절한 양의 물 또는 기타 희석제로 희석해야 하는 1차 조성물의 농축물로서 적합한 형태일 수 있다. 살균 농도는 특정 배합의 특징, 특히, 농축물인지 또는 직접 사용되는지 여부에 따라 다양하다. 조성물은 1 내지 98%의 고체 또는 액체 불활성 캐리어(inert carrier), 및 0 내지 50% 또는 0.1 내지 50%의 계면활성제를 포함한다. 이러한 조성물은 예를 들어, 건조한 형태일 경우 에이커 당 약 0.01 lb-5.0 lb. 그리고 액체 상태일 경우 에이커 당 약 0.01 pts.-10 pts.만큼 상업 상품에 대하여 라벨링된 비율로 주입된다.
또한 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 Cry2Ai 단백질을 생산할 수 있는 형질 변환된 바실러스 튜링겐시스 생산을 위해 사용될 수 있다. 그 후 형질 변환된 바실러스 튜링겐시스는 해충 관리와 같은 농업 활동에 유용한 살충성 및/또는 살균성 조성물 생산에 사용될 수 있다.
실시예에서, 형질 변환된 미생물 (전체 유기체, 세포, 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열로 형질 변환된 바실러스 튜링겐시스와 같은 포자(들), 살균성 단백질(들), 살균 성분(들), 해충을 살충하는 (pest-affecting) 성분(들), 돌연변이체(들), 생세포(living cell), 사세포(dead cell), 및 세포 성분의 혼합물을 포함하고 손상된 세포와 세포 성분을 포함하는 생세포 또는 사세포 및 세포 성분을 포함함) 또는 분리된 살균성 단백질은 살균 조성물(들)로의 허용가능한 캐리어, 즉, 예를 들어, 현탁액, 용액, 에멀션, 살포제, 분산성 과립 또는 펠렛, 수화제, 유제(emulsifiable concentrate), 에어로졸 또는 스프레이, 함침성 과립(impregnated granule), 보조제, 코팅형 페이스트(coatable paste), 콜로이드(colloid), 및 예를 들어, 폴리머 물질 내 캡슐화 물질(encapsulations)과 함께 배합할 수 있다. 이렇게 배합된 조성물은 건조, 동결 건조, 균질화, 추출, 여과, 원심분리, 침강 또는 폴리펩티드를 포함하는 세포의 배양균 농축과 같은 종래의 방법을 통해 조합될 수 있다. 　
상기 개시된 이러한 조성물은 계면활성제, 불활성 캐리어, 방부제, 습윤제, 섭식 자극제(feeding stimulant), 유인제, 캡슐화제(encapsulating agent), 결합제, 유화제, 염료, UV 보호제, 완충제, 유도제 또는 비료, 미량양분 공여자(micronutrient donor), 또는 식물 성장에 영향을 주는 다른 제제를 첨가해 수득할 수 있다. 제초제, 살충제, 살균제, 살세균제, 살선충제, 연체동물 살충제, 살비제, 식물생장 조절제, 수확 보조제 및 비료를 포함하나 이에 국한되지 않는 하나 이상의 농약은 특정 표적 해충에 대한 제품 취급 및 적용을 용이하게 하기 위해 배합 분야에서 통상적으로 사용하는 캐리어, 계면활성제 또는 보조제 또는 기타 성분과 결합할 수 있다. 적합한 캐리어 및 보조제는 고체나 액체일 수 있고 배합 기술에서 통상적으로 이용되는 물질, 예를 들어, 천연 또는 재생 광물질, 용매, 분산제, 습윤제, 점착제, 결합제, 또는 비료에 해당할 수 있다. 실시예의 유효 성분은 일반적으로 조성물 형태로 적용되고 처리될 작물 영역, 식물, 또는 종자에 적용될 수 있다. 예를 들어, 실시예의 조성물은 곡물저장빈 또는 사일로 등에서 저장하는 동안 또는 저장에 대한 대비로 곡물에 적용될 수 있다. 실시예의 조성물은 다른 화합물과 동시에 또는 연속적으로 적용될 수 있다. 실시예의 박테리아 균주에 의해 생산되는 살균성 단백질 중 최소 하나를 포함하는 실시예의 농약 조성물 또는 실시예의 유효성분 적용 방법은 엽면시비(foliar application), 종자 코팅, 및 토양시용(soil application)을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 적용 횟수 및 적용 비율은 해당되는 해충에 의한 침입 강도에 따라 다르다.
추가 실시예에서, 실시예의 형질 변환 미생물 및 살균성 단백질 뿐만 아니라 조성물은 전처리가 살균작용에 해롭지 않는 한 표적 해충 환경에 적용될 때 살균작용을 연장하기 위해 배합 이전에 처리될 수 있다. 이러한 처리는 처리가 조성물(들)의 특성에 해로운 영향을 끼치지 않는 한 화학적 및/또는 물리적 수단에 의해 수행될 수 있다. 화약 시약(reagent)의 예에는 할로겐화제(halogenating agents); 포름알데히드 및 글루타르알데하이드와 같은 알데히드; 제피란 염화물(zephiran chloride)과 같은 항감염약(anti-infectives); 아이소프로판올 및 에탄올과 같은 알코올이 포함되나 이에 국한되지 않는다.
다른 실시예의 경우, 실시예의 살균성 단백질 조성물을 표적 해충 환경에 적용하기 전에 단백질을 활성화시키기 위해 Cry 독소 폴리텝티드를 단백질분해효소(protease), 예를 들어, 트립신을 이용해 처리하는 게 이로울 수 있다. 세린단백질가수분해효소(serine protease)를 이용해 독소전구물질(protoxin)을 활성화시키는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
조성물(실시예의 형질 변환 미생물 및 살균성 단백질 포함)은 보호 조치로서 해충이 나타나기 시작할 때나 해충이 나타나기 전에 예를 들어, 분무, 약제미립화(atomizing), 살분법(dusting), 살포(scattering), 코팅 또는 주입(pouring), 토양으로의 도입, 관개용수로의 도입, 종자 처리나 일반 적용 또는 살분법을 통해 해충 환경에 적용될 수 있다. 예를 들어, 실시예의 살균성 단백질 및/또는 형질 변환 미생물은 저장 동안 곡물을 보호하기 위해 곡물과 혼합될 수 있다. 일반적으로 식물 생육 초기 단계에 해충을 잘 방제하는 것이 중요한데, 이는 이 때가 식물이 가장 심각하게 피해를 입을 수 있는 시기이기 때문이다. 실시예의 조성물은 필요하다고 생각될 경우 편리하게도 또 다른 살충제를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 조성물은 실시예의 바실러스 균주 또는 형질 변환 미생물의 캐리어 및 사세포의 조성물의 과립 형식으로 재식(planting) 시 토양에 직접 적용된다. 또 다른 실시예는 농약, 예를 들어, 제초제, 살충제, 비료, 불활성 캐리어 및 실시예의 바실러스 균주 또는 형질 변환 미생물의 사세포를 포함하는 조성물의 과립 형태이다. 　
당업계의 기술자는 모든 화합물이 동일하게 모든 해충에 유효하지 않음을 인식할 것이다. 실시예의 화합물은 해충에 대한 활성을 나타내고, 여기에는 경제적으로 중요한 작물, 산림, 온실, 묘목장, 관상식물, 식품 및 섬유, 공중 및 동물 보건, 가정 및 상업 구조, 가정 및 저곡 해충이 포함된다.
해충에는 나비목, 파리목(diptera), 딱정벌레목(coleopteran), 반시목(hemiptera) 및 동시아목(homoptera) 곤충이 포함된다.
나비목 해충에는 밤나방과(Noctuidae) 조밤나방, 거세미, 자벌레(loopers), 및 헬리오티네스(heliothines), 스포도프테라 프루지페르다 (J E 스미스)(Spodoptera frugiperda J E Smith)(폴아미웜, fall armyworm); S. 이그지구아(휴브너)(S. exigua Hubner)(파밤나방, beet armyworm); S. 리투라(파브리시우스)(S. litura Fabricius)(담배거세미나방, tobacco cutworm, 군집 애벌레(cluster caterpillar)); 마메스트라 컨피구라타(워커)(Mamestra configurata Walker)(버사밤나방 애벌레, bertha armyworm); M. 브라시카에(린나에우스)(M. brassicae Linnaeus)(배추좀나방, cabbage moth); 아그로티스 입실론(휴나겔)(Agrotis ipsilon Hufnagel) (검거세미, black cutworm); A. 오르토고니아(모리슨)(A. orthogonia Morrison)(배추밤나방, western cutworm); A. 서브테라니아(파브리시우스)(A. subterranea Fabricius)(그래뉼레이트 거세미, granulate cutworm); 알라바마 아르길라시아(휴브너)(Alabama argillacea Hubner)(목화잎벌레, cotton leaf worm); 트리초프루시아 니(휴브너)(Trichoplusia ni Hubner)(남방은무늬밤나방의 애벌레, cabbage looper); 슈도플루시아 인클루덴스(워커)(Pseudoplusia includens Walker)(콩 자벌레, soybean looper); 안티카르시아 젬마탈리스(휴브너)(Anticarsia gemmatalis Hubner)(벨벳콩 애벌레, velvetbean caterpillar); 하이페나 스카브라(파브리시우스)(Hypena scabra Fabricius)(녹색 클로버웜, green cloverworm); 헬리오디스 비레센스(파브리시우스)(Heliothis virescens Fabricius)(회색담배나방, tobacco budworm); 슈달레티아 유니펑타(하워스)(Pseudaletia unipuncta Haworth)(거염벌레, armyworm); 아테티스 민다라(바르네스&맥더노우)(Athetis mindara Barnes and Mcdunnough)(거친 피부 거세미, rough skinned cutworm); 우소아 메소리아(해리스)(Euxoa messoria Harris)(검은면 거세미, darksided cutworm); 이어리어스 인슐라나(보이스듀발)(Earias insulana Boisduval)(가시 목화다래벌레, spiny bollworm); E. 비텔라(파브리시우스)(E. vittella Fabricius)(점박이 목화다래벌레, spotted bollworm); 헬리코베르파 아르미게라(휴브너)(Helicoverpa armigera Hubner)(미국 목화다래벌레, American bollworm); H. 제아(바디)(H. zea Boddie)(옥수수벌레, corn earworm 또는 목화벌레, cotton bollworm); 멜란크라 픽타(해리스)(Melanchra picta Harris)(얼룩말 애벌레, zebra caterpillar); 에기라(Egira) (실로미지스, Xylomyges) 큐리아리스(그로트)(curialis Grote)(감귤류 거세미, citrus cutworm); 명나방과(Pyralidae) 천공충(borers), 보호고치 애벌레(casebearers), 벌집 나방(webworms), 콘웜(coneworms), 및 잎을 갉아 먹는 애벌레(skeletonizers), 오스트리니아 누빌라리스(휴브너)(Ostrinia nubilalis Hubner)(옥수수들명나방, European corn borer); 아미에로이스 트랜시텔라(워커)(Amyelois transitella Walker)(나발 오렌지벌레, naval orangeworm); 아나가스타 쿠에니엘라(젤러)(Anagasta kuehniella Zeller)(쌀겨얼룩명나방, Mediterranean flour moth); 카드라 카우텔라(워커)(Cadra cautella Walker)(줄알락명나방, almond moth); 칠로 슈프레살리스(워커)(Chilo suppressalis Walker)(이화명나방, rice stem borer); C. 파르텔루스(C. partellus)(수수 천공충, sorghum borer); 코르시라 세파로니카(스테인튼)(Corcyra cephalonica Stainton)(쌀 나방, rice moth); 클램버스 칼리기노셀러스(클레멘스)(Crambus caliginosellus Clemens)(옥수수리뿌리 밤나방, corn root webworm); C. 테테레루스 (징켄)(C. teterrellus Zincken)(블루그래스 밤나방, bluegrass webworm); 크나파로크로시스 메디날리스(구에니)(Cnaphalocrocis medinalis Guenee)(혹명나방, rice leaf roller); 데스미아 퓨네라리스(휴브너)(Desmia funeralis Hubner)(포도 나방, grape leaffolder); 디아파니아 히아리나타(린네)(Diaphania hyalinata Linnaeus)(멜론 벌레, melon worm); D. 니티알리스 (스톨)(D. nitidalis Stoll)(피클나방, pickleworm); 디아트라에아 그랜디오셀라(디아르)(Diatraea grandiosella Dyar)(옥수수대에 구멍을 뚫는 날개벼명나방, southwestern corn borer), D. 사칼라리스(파브리시우스)(D. saccharalis Fabricius)(사탕수수 천공벌레, surgarcane borer); 어레우마 로프티니(디아르)(Eoreuma loftini Dyar)(멕시코 벼명밤나비, Mexican rice borer); 에페스티아 엘루텔라(휴브너)(Ephestia elutella Hubner)(담배 나방, tobacco (cacao) moth); 갤러리아 멜로넬라(린네)(Galleria mellonella Linnaeus)(꿀벌 부채명 나방, greater wax moth); 헤르페토그래마 리카르시살리스(워커)(Herpetogramma licarsisalis Walker)(소드 밤나방, sod webworm); 호모어소마 일렉텔룸(허스트)(Homoeosoma electellum Hulst)(해바라기 나방, sunflower moth); 엘라스모팔퍼스 리그노셀루스(젤러)(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(명충나방 유충, lesser cornstalk borer); 아키로이아 그리셀라(파브리시우스)(Achroia grisella Fabricius)(애벌집나방, lesser wax moth); 로소스테제 스틱티칼리스(린네)(Loxostege sticticalis Linnaeus)(비트 밤나방, beet webworm); 오르타가 티리살리스(워커)(Orthaga thyrisalis Walker)(차나무 거미줄나방, tea tree web moth); 마루카 테스툴라시스(가이어)(Maruca testulalis Geyer)(콩명나방, bean pod borer); 플로디아 인터펑텔라(휴브너)(Plodia interpunctella Hubner)(화랑곡나방, Indian meal moth); 스컬포파가 인세르튤라스(워커)(Scirpophaga incertulas Walker)(볏노란줄기벌레, yellow stem borer); 우디아 루비갈리스(구에니)Udea rubigalis Guenee (셀러리 나방, celery leaftier); 잎말이나방과(Tortricidae) 잎말이나방(leafrollers), 눈 벌레(budworms), 종자벌레(seed worms) 및 열매 벌레(fruit worms), 에클레리스 글로베라나(월싱검)(Acleris gloverana Walsingham)(서부 검은머리 눈벌레, Western blackheaded budworm); A. 바리아나(페르난드)(A. variana Fernald)(동부 검은머리 눈벌레, Eastern blackheaded budworm); 아르킵스 아르기로스필라(워커)(Archips argyrospila Walker)(과수 잎말이나방, fruit tree leaf roller); A. 로사나(린네)(A. rosana Linnaeus)(유럽 잎말이나방, European leaf roller); 및 다른 잎말이나방(Archips) 종, 아도소피 오라나 (피셔 폰 로슬러스탐)(Adoxophyes orana Fischer von Rosslerstamm)(애모무늬잎말이나방, summer fruit tortrix moth); 코칠리스 호스페스(월싱엄)(Cochylis hospes Walsingham)(줄무늬해바라기나방, banded sunflower moth); 시디아 라티페레아나(월싱엄)(Cydia latiferreana Walsingham)(개암벌레, filbertworm); C. 포모넬라(린네)(C. pomonella Linnaeus)(코들링 나방, codling moth); 플라티노타 플라베다나(클레멘스)(Platynota flavedana Clemens)(알록잎말이나방, variegated leafroller); P. 스툴타나(월싱엄)(P. stultana Walsingham)(잡식성잎말이나방, omnivorous leafroller); 로베시아 보트라나(데니스&쉬퍼뮬러)(Lobesia botrana Denis & Schiffermuller)(유럽포도넝쿨나방, European grape vine moth); 스필로노타 오셀라나(데니스&쉬퍼뮬러)(Spilonota ocellana Denis & Schiffermuller)(눈꽃봉오리 나방, eyespotted bud moth); 엔도피자 비테아나(클레멘스)(Endopiza viteana Clemens)(그레이프베리나방, grape berry moth); 유포에실리아 앰비규엘라(허브너)(Eupoecilia ambiguella Hubner)(넝쿨 나방, vine moth); 보나고타 살루브리콜라(메이릭)(Bonagota salubricola Meyrick)(브라질사과잎말이나방, Brazilian apple leafroller); 그래폴리타 몰레스타(버스크)(Grapholita molesta Busck)(복숭아순나방, oriental fruit moth); 술래이마 헬리안타나(라일리)(Suleima helianthana Riley)(해바라기버드나방, sunflower bud moth); 아르지로태니아 종(Argyrotaenia spp.); 코리스토네우라 종(Choristoneura spp.)이 포함되나 이에 국한되지 않는다.
나비목에서 선택된 다른 작물학적 해충에는 알소필리아 포메타리아(해리스)(Alsophila pometaria Harris)(가을자벌레, fall cankerworm); 아나르시아 리네아텔라(젤러)(Anarsia lineatella Zeller)(복숭아나무가지유충, peach twig borer); 아니소타 세나토리아 (J. E. 스미스)(Anisota senatoria J. E. Smith)(주황색줄무늬참나무벌레, orange striped oakworm); 안테레아 페른니(구에린-메네빌레)(Antheraea pernyi Guerin-Meneville)(중국참나무누에나방, Chinese Oak Silkmoth); 밤빅스 모리(린네)(Bombyx mori Linnaeus)(누에, Silkworm); 부쿨라트릭스 투르베리엘라(버스크)(Bucculatrix thurberiella Busck)(코튼리프퍼포레이터, cotton leaf perforator); 콜라스 에우리팀(보이스두발)(Collas eurytheme Boisduval)(알팔파 애벌레, alfalfa caterpillar); 다타나 인테게리마(그로테&로빈슨)(Datana integerrima Grote & Robinson)(호두 애벌레, walnut caterpillar); 덴드로리머스 시비리커스(체트베리코프)(Dendrolimus sibiricus Tschetwerikov)(시베리아누에나방, Siberian silk moth), 엔노모스 서브시그나리아(허브너)(Ennomos subsignaria Hubner)(느릅나무자벌레, elm spanworm); 에라니스 틸리아리아(해리스)(Erannis tiliaria Harris)(린덴자벌레, linden looper); 유프로티스 치소르호아(린네)(Euproctis chtysorrhoea Linnaeus)(흰날개독나방, browntail moth); 해리시나 아메리카나(구에린-메네빌레)(Harrisina americana Guerin-Meneville)(그레이프리프 스켈레토나이저, grapeleaf skeletonizer); 헤밀레우카 올리비애(코크렐)(Hemileuca oliviae Cockrell)(레인지 애벌레, range caterpillar); 하이판트리아 쿠니아(드루어리)(Hyphantria cunea Drury)(흰불나방, fall webworm); 케이페리아 리코페르시엘라(월싱엄)(Keiferia lycopersicella Walsingham)(토마토요충, tomato pinworm); 람브이나 피셀라리아(허스트)(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(동부독미나리자벌레, Eastern hemlock looper); L. 피셀라리아 루구브로사(허스트)(L. fiscellaria lugubrosa Hulst)(사브독미나리자벌레, Western hemlock looper); 루코마 살리시스(린네)(Leucoma salicis Linnaeus)(새틴나방, satin moth); 리만트리아 디스퍼(린네)(Lymantria dispar Linnaeus)(매미나방, gypsy moth); 만두카 퀸퀴마쿨라타(하워스)(Manduca quinquemaculata Haworth)(오점박각시, five spotted hawk moth및 토마토박각시나방, tomato hornworm); M. 세스타(하워스)(M. sexta Haworth)(토마토박각시나방, tomato hornworm, 담배박각시나방, tobacco hornworm); 오페로프테라 브루마타(린네)(Operophtera brumata Linnaeus)(겨울나방, winter moth); 팔레아크리타 베마타(펙)(Paleacrita vemata Peck)(봄자벌레, spring cankerworm); 파필리오 크레스폰테스(크래머)(Papilio cresphontes Cramer)(자이언트 스왈로우테일, giant swallowtail, 오렌지 도그, orange dog); 프리가니디아 캘리포니아(패커드)(Phryganidia californica Packard)(캘리포니아 참나무벌레, California oakworm); 필로크니스티스 시트렐라(스테인튼)(Phyllocnistis citrella Stainton)(시트러스잎나방벌레, citrus leafminer); 필로노티크터 블랑카르델라(파브리시우스)(Phyllonotycter blancardella Fabricius)(점박이잎굴나방, spotted tentiform leafminer); 피에리스 브라시캐(린네)(Pieris brassicae Linnaeus)(큰흰나비, large white butterfly); P. 라파에(린네)(P. rapae Linnaeus)(작은흰나비, small white butterfly); P. 나피 (린네)(P. napi Linnaeus)(녹색줄무늬흰나비, green veined white butterfly); 플라티프틸리아 카르두이아크틸라(라일리)(Platyptilia carduidactyla Riley)(아티초크 털날개나방, artichoke plume moth); 플루텔라 자일로스텔라 (린네)(Plutella xylostella Linnaeus)(배추좀나방, diamondback moth); 페크티노포라 가십피엘라(선더스)(Pectinophora gossypiella Saunders)(분홍목화다래벌레, pink bollworm); 폰티아 프로토디케(보이스두발&르콩트)(Pontia protodice Boisduval & Leconte)(남부배추벌레, Southern cabbageworm); 사불로데스애그로타타(구에니)(Sabulodes aegrotata Guenee)(잡식성 자벌레, omnivorous looper); 슈이주라 콘킨나(J. E. 스미스)(Schizura concinna J. E. Smith)(붉은혹애벌레, red humped caterpillar); 시토트로가 시리얼엘라(올리비어)(Sitotroga cerealella Olivier)(곡식나방, Angoumois grain moth); 타우메토포에아 피티오캄파(쉬퍼뮬러)(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)(소나무행렬애벌레, pine processionary caterpillar); 티네올라 비셀리엘라(험멜)(Tineola bisselliella Hummel)(웨빙옷좀나방, webbing clothesmoth); 투타 앱솔루트(메이릭)(Tuta absolute Meyrick)(토마토립마이너, tomato leafminer); 이포노메우타 파델라(린네)(Yponomeuta padella Linnaeus)(집나방, ermine moth); 헬리오디스 서브플렉사 구에니(Heliothis subflexa Guenee); 말라코소마 종(Malacosoma spp.) 및 오르기아 종(Orgyia spp.)이 포함되나 이에 국한되지 않는다.
해충은 초기 발달 단계, 예를 들어, 유충이나 다른 미숙 형태로서 실시예의 조성물의 살균 작용에 대하여 시험될 수 있다. 곤충은 온도가 약 20°C 내지 약 30°C 이고 상대습도가 약 30% 내지 약 70%인 완전한 어둠 속에서 기를 수 있다.
본 개시에 따라 곤충, 특히 나비목을 방제하는 방법은 본 개시의 코돈 최적화 cry2Ai 뉴클레오티드 서열로 형질 변환된 숙주 세포를 포함해, 본 명세서에 개시된 살충성/살균성 조성물을 보호될 장소(구역)에 대해 보호될 구역 또는 식물에 적용(예를 들어, 분무)하는 것을 포함할 수 있다. 보호될 장소는, 예를 들어, 해충 또는 성장중인 초목의 서식지 또는 초목이 성장할 구역을 포함할 수 있다.
본 개시는 가지 해충 방제 방법에 관한 것으로, 이 방법은 본 개시의 cry2Ai 뉴클레오티드 서열로 형질 변환된 가지 식물을 심거나 또는 본 개시의 cry2Ai 단백질을 포함하는 조성물을 분무하여 보호 할 구역이나 식물에 본 명세서에 개시된 살충성/살균성 조성물을 적용하는 것을 포함한다. 또한 본 개시는 가지 식물에 미치는 피해를 최소화하기 위하여 가지 해충에 본 개시의 조성물을 사용하는 것에 관한 것이다.
또한 본 개시는 나비목 쌀 명밤나비, 혹명나방, 줄점팔랑나비, 거세벌레, 멸강나방, 또는 케이스 벌레, 더 나아가 칠로 수프레살리스(Chilo suppressalis), 칠로 팔텔러스(Chilo partellus), 스크리포파가 인설투라스(Scirpophaga incertulas), 세사미아 인페렌스(Sesamia inferens), 크나파로크로시스 메디날리스(Cnaphalocrocis medinalis), 마라스미아 파트날리스(Cnaphalocrocis medinalis), 마라스미아 이그지구아(Marasmia exigua), 마라스미아 루라리스(Marasmia exigua), 스키르포파가 이노타타(Scirpophaga innotata)로 구성된 그룹에서 선택된 곤충과 같은 쌀 해충을 방제하는 방법에 대한 것으로, 이 방법은 본 개시의 cry2Ai 뉴클레오티드 서열로 형질 변환된 벼를 심거나 또는 본 개시의 cry2Ai 단백질을 포함하는 조성물을 분무하여 보호 할 구역이나 식물에 본 명세서에 개시된 살충성/살균성 조성물을 적용하는 것을 포함한다. 또한 본 개시는 벼에 미치는 피해를 최소화하기 위하여 벼 해충에 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하는 것에 관한 것이다.
또한 본 개시는 나비목 헬리코버파 아르미게라(Helicoverpa armigera)와 같은 토마토 해충을 방제하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 본 개시의 cry2Ai 뉴클레오티드 서열로 형질 변환된 토마토 식물을 심거나 또는 본 개시의 cry2Ai 단백질을 포함하는 조성물을 분무하여 보호 할 구역이나 식물에 본 명세서에 개시된 살충성/살균성 조성물을 적용하는 것을 포함한다. 또한 본 개시는 토마토 식물에 미치는 피해를 최소화하기 위하여 토마토 해충에 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하는 것에 관한 것이다.
또한 본 개시는 목화 해충을 방제하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 본 개시의 cry2Ai 뉴클레오티드 서열로 형질 변환된 목화를 심거나 또는 본 개시의 cry2Ai 단백질을 포함하는 조성물을 분무하여 보호 할 구역이나 식물에 본 명세서에 개시된 살충성/살균성 조성물을 적용하는 것을 포함한다. 또한 본 개시는 목화에 미치는 피해를 최소화하기 위하여 목화 해충에 본 명세서에 개시된 조성물을 사용하는 것에 관한 것이다.
Cry2Ai 독소 단백질을 수득하기 위하여 (서열 ID 번호 1), Cry2Ai 단백질을 발현시키는 재조합 숙주 세포를 적합한 배지에서 통상적인 방법으로 재배해 효소 분해나 세제 등과 같은 전통적인 방법을 이용해 용해할 수 있다. 그 후 독소는 크로마토그래피, 추출이나 전기영동법 등과 같은 표준 기법을 이용해 분리 및 정제될 수 있다.
따라서, 본 개시는 해충, 특히 식물 병해충을 살충하는 조성물 및 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시는 헬리코버파 아르미게라(Helicoverpa armigera) -목화벌레 및 옥수수벌레, 크나파로크로시스 메디날리스(Cnaphalocrocis medinalis) -혹명나방, 및 스컬포파가 인세르튤라스(Scirpophaga incertulas) -볏노란줄기벌레, 및 스펙티노포라 가십피엘라(Spectinophora gossypiella)와 같으나 이에 국한되지 않는 해충에 대해 생물학적으로 활성적인 살충성 폴리펩티드를 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
본 개시에 따라, 실시예 중 하나에서, 서열 ID 번호 1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은 (a) 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열; (b) 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631에서 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정적으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) (a)와 (b)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹에서 선택된다.
또 다른 실시예에서, 본 개시는 (a) 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열; (b) 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631에서 서열 ID 번호 2 에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정적으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) (a)와 (b)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹에서 선택된 식물 내 발현을 위한 코돈 최적화 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
실시예 중 하나에서, 서열 ID 번호 1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 상기 뉴클레오티드 서열은:
a. 서열 ID 번호2에 명시된 바와 같거나, 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열이거나, 또는
b. 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631에서 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열 중 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정적으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열이다.
또 다른 실시예에서, 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열이 제공되고, 여기서 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열에 특정적으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 ID 번호 3, 서열 ID 번호 4, 서열 ID 번호 5 및 서열 ID 번호 6으로 구성된 그룹에서 선택된다.
또 다른 실시예에서, 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA가 제공되고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 이종 조절 요소에 작동 가능하도록 연결된다. 또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 재조합 DNA에 관한 것으로, 여기서 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 선택가능한 표지 유전자, 보고 유전자(reporter gene) 또는 그 조합을 선택적으로 포함한다. 그러나, 또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 재조합 DNA에 관한 것으로, 여기서 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은 액포, 미토콘드리아, 엽록체, 색소체 표적화 또는 분비를 위해 표적화 또는 전이 (transit) 펩티드를 부호화하는 DNA 서열을 선택적으로 포함한다.
또 다른 실시예에서, 5' 비-번역 서열을 포함하는 관심 살충성 단백질, 서열 ID 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 살충성 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 코딩 서열, 또는 그의 살충 부분 및 3' 비-번역 영역의 발현을 위한 DNA 구조체가 제공되며, 여기서 상기 5' 비-번역 서열은 식물 세포에서 기능하는 프로모터를 포함하고, 상기 코딩 서열은 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열이며, 여기서 상기 3' 비-번역 서열은 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
실시예 중 하나는 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터와 관련된다. 또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하는 플라스미드 벡터를 제공한다. 추가 실시예는 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구조체를 포함하는 플라스미드 벡터를 제공한다.
또 다른 실시예는 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 개시의 숙주 세포는 식물, 박테리아, 바이러스, 진균 및 효모 세포를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 개시된 숙주 세포는 식물 세포, 아그로박테륨 또는 대장균 이다.
본 개시의 또 다른 실시예는 다음 단계를 포함하는 식물에 곤충 저항성을 부여하는 방법을 제공한다:
(a) 식물 세포에 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 삽입하고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 (i) 식물 세포에서 기능하는 프로모터 및 (ii) 터미네이터에 작동 가능하도록 연결된다;
(b) (a)단계의 식물 세포에서 형질 변환된 식물 세포를 획득하고, 여기서 상기 형질 변환된 식물세포는 본 개시의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 그리고
(c) (b)단계의 상기 형질 변환된 식물 세포에서 형질전환 식물을 생성하고, 여기서 상기 형질전환 식물은 본 개시의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 곤충 저항성을 부여하기 위한 방법을 통해 획득한 형질전환 식물에 관한 것이다. 그러나 본 개시의 또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물에 관한 것이다. 그러나 본 개시의 또 다른 실시예는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 형질전환 식물에 관한 것으로, 여기서 뉴클레오티드 서열은 서열 ID 번호 2, 서열 ID 번호 3, 서열 ID 번호 4, 서열 ID 번호 5 및 서열 ID 번호 6로 구성된 그룹에서 선택된다. 그러나 본 개시의 또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 형질전환 식물에 관한 것으로, 여기서 상기 식물은 목화, 가지, 쌀, 밀, 옥수수, 수수, 귀리, 기장, 콩과 식물, 토마토, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 브라시카 종, 콩, 완두콩, 비둘기콩, 감자, 후추, 조롱박, 상추, 고구마 카놀라, 대두, 알팔파, 땅콩, 해바라기, 잇꽃, 담배, 사탕수수, 카사바, 커피, 파인애플, 시트러스, 코코아, 차, 바나나 및 멜론으로 구성된 그룹에서 선택된다.
본 개시의 추가 실시예는 본 개시의 형질전환 식물에서 획득한 조직, 종자 또는 자손에 관한 것으로, 여기서 상기 종자 또는 자손은 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그러나 본 개시의 또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 조직, 종자 또는 자손에서 유래된 생물학적 샘플에 관한 것으로, 여기서 상기 샘플은 본 개시의 검출 가능한 양의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 개시의 추가 실시예는 본 개시에 개시된 형질전환 식물에서 유래된 상품 생성물을 제공하고, 여기서 상기 생성물은 본 명세서에 개시된 검출 가능한 양의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 개시의 또 다른 실시예는 서열 ID 번호 1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 명세서에 개시된 조성물은 동일 해충에 대한 독성이 있으나 상기 살충성 단백질에서 다른 방식의 살충 작용을 나타내는 추가 살충제를 선택적으로 포함할 수 있다. 본 개시의 조성물의 살충제는 바실러스 독소, 제노라브두스(Xenorhabdus) 독소, 포토라브두스(Photorhabdus) 독소 및 상기 해충 내 하나 이상의 필수 유전자 억제에 특정적인dsRNA로 구성되는 그룹에서 선택된다.
그러나 본 개시의 또 다른 실시예는 농작물 내 곤충 침입을 방제하고 곤충 저항성 관리를 제공하는 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 상기에서 설명한 살충 유효량의 조성물을 상기 농작물과 접촉시키는 것을 포함한다.
본 개시의 추가 실시예는 곤충 저항성 형질전환 식물 생산을 위한 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열, DNA 구조체 또는 플라스미드 사용에 관한 것이다. 그러나 본 개시의 또 다른 실시예는 살충 조성물 생산을 위한 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열 사용에 관한 것으로, 여기서 조성물은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스 세포를 포함한다.
본 개시의 또 다른 실시예는 본 명세서에 개시된 최소 하나의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 형질전환 식물을 제공한다. 추가 실시예는 본 명세서에 개시된 방법을 통해 획득한 형질전환 식물을 제공한다. 본 명세서에 개시된 형질전환 식물은 쌀, 밀, 옥수수, 수수, 귀리, 기장, 콩과 식물, 목화, 토마토, 가지, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 브라시카 종, 콩, 완두콩, 비둘기콩, 감자, 후추, 조롱박, 상추, 고구마 카놀라, 대두, 알팔파, 땅콩, 해바라기, 잇꽃, 담배, 사탕수수, 카사바, 커피, 파인애플, 시트러스, 코코아, 차, 바나나 및 멜론으로 구성된 그룹에서 선택된다. 본 개시의 일부 실시예는 본 발명의 형질전환 식물(들)에서 획득한 조직, 종자 또는 자손에 관한 것으로, 여기서 상기 종자 또는 자손은 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 개시의 일부 실시예는 조직, 종자 또는 자손에서 유래된 생물학적 샘플을 제공하고, 여기서 샘플은 검출 가능한 양의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일 실시예는 본 개시의 형질전환 식물에서 유래된 상품 생성물을 포함하고, 여기서 생성물은 검출 가능한 양의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 본 개시의 최소 하나의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스를 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 서열 ID 번호1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 Cry2Ai 단백질을 부호화한다. 조성물은 동일 해충에 대한 독성이 있으나 상기 살충성 단백질에서 다른 방식의 살충 작용을 나타내는 추가 살충제를 선택적으로 포함한다. 살충제는 바실러스 독소, 제노라브두스(Xenorhabdus) 독소, 포토라브두스(Photorhabdus) 독소 및 상기 해충 내 하나 이상의 필수 유전자 억제에 특정적인dsRNA로 구성되는 그룹에서 선택된다.
또 다른 실시예에서, 농작물 내 곤충 침입을 방제하고 곤충 저항성 관리를 제공하는 방법이 제공되고, 여기서 상기 방법은 본 명세서에 개시된 살충 유효량의 조성물을 상기 농작물과 접촉시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시예는 곤충 저항성 형질전환 식물 생산을 위한 본 개시의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열, DNA 구조체 또는 플라스미드 사용에 관한 것이다. 그러나 또 다른 실시예는 살충 조성물 생산을 위한 본 명세서에 개시된 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열 사용에 관한 것으로, 여기서 조성물은 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스 세포를 포함한다.
본 개시의 이러한 및/또는 다른 실시예는 본 개시의 설명 일부를 구성하는 청구항 문구에 반영된다.
본 개시의 다양한 변형 및 다른 실시예는 설명 및 연관된 도면에 제시된 지시의 이점을 갖는, 이러한 발명이 속한 당업계의 기술자에 의해 제시될 수 있다. 그러므로, 본 개시가 본 명세서에 개시된 특정 실시예에 국한되지 않으며 변형 및 다른 실시예가 첨부된 청구항 범위 내에 포함되도록 의도된 것이라고 이해해야 한다.
다음 예시들은 본 개시를 예시적으로 설명하고, 원하는 개시 또는 보호를 제한하기 위해 제공되지 않는다.
예시
다음 예시들은 본 개시를 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명과 함께 당업계의 통상의 기술자들에게 제공하기 위해 제시되고, 발명자가 발명품으로 간주하는 것의 범위를 제한하거나 하기 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내기 위함은 아니다. 사용되는 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했으나, 일부 실험상 오류 및 편차는 고려해야 한다.
일반적인 방법
DNA 조작은 당업계에서 표준인 절차를 이용해 수행되었다. 이러한 절차는 결과를 실질적으로 바꾸지 않고 종종 변경 및/또는 대체될 수 있다. 다른 참조가 식별되는 경우를 제외하고, 이러한 절차의 대부분은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, second edition, 1989에 설명되어 있다.
예 1: CRY2Ai 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 서열 설계 (서열 ID 번호 1)
식물 코돈 편향(plant codon bias)을 갖는 DNA 서열은 형질전환 실물에서 서열 ID 번호1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 Cry2Ai 단백질 발현을 위해 설계 및 합성되었다. 식물에 대한 코돈 사용빈도 표는 서열 ID 번호 1 (NCBI GenBank ACV97158.1)의 Cry2Ai 단백질 서열에서 획득한 코딩 서열로부터 계산되었다. DNA 서열은 코돈 선택을 위한 기본 기준으로 몬테 카를로 알고리즘 (Monte Carlo algorithm) (Villalobos A, Ness J E, Gustafsson C, Minshull J　and Govindarajan S (2006) Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments; BMC Bioinformatics 67:285-293)을 사용하여 최적화하였다. DNA 서열을 최적화하면서 코돈 사용빈도 표에서 확률을 고려하였다. 희귀하고 사용빈도가 적은 코돈은 가장 많은 코돈으로 대체했다. 가중 평균 식물 코돈 세트는 해당 아미노산에 대한 총 코돈 사용량의 약 10% 미만으로 사용된 중복(redundant) 코돈을 생략한 후 계산되었다. 각 코돈에 대한 가중 평균 표현은 다음 공식을 이용해 계산되었다:
CI의 가중 평균 % = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100, 여기서 CI는 문제의 코돈이고 %C2, %C3 등은 잔여 동의 코돈(synonymous codon)의 평균 % 사용빈도 값을 나타낸다.
서열 ID 번호 1의 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 식물-코돈-최적화 DNA 서열을 유도하기 위해, 생성된 DNA 서열이 식물 최적화 코돈 편향 표의 전체 코돈 조성물을 갖도록 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 DNA 서열 내 코돈 치환이 수행되었다. 서열은 바람직하지 않는 제한 효소 인식 부위, 잠재적 식물 인트론 스플라이스 부위(potential plant intron splice sites), 장기적인 A/T 또는 C/G 잔기(long runs of A/T or C/G residues) 및 식물 세포에서 RNA 안정성, 전사 또는 코딩 영역 번역을 방해할 수 있는 다른 모티프(motif)를 제거하기 위해 추가적으로 정제되었다. 유전자는 mRNA의 안정적인 2차 구조 형성을 위해 6.0　kcal/mole 컷오프(cut-off) 값을 지닌 유전자 디자이너 소프트웨어를 이용해 인실리코(in-silico)에서 최적화되었다. 원하는 제한 효소 인식 부위를 통합하고 장기 내부 개방형 해독틀(Open Reading Frames) (+1외의 프레임)을 제거하기 위해 다른 변화가 이루어졌다. 제한 인식 부위 XbaI, NcoI 및 BamHI는 개시 코돈 ATG 전에 통합되었고 제한 인식 부위 SmaI는 정지 코돈 전에 삽입되어 C 단말 단백질 태그 융합을 위한 원핵(prokaryotic) 벡터에서 최적화된 코돈을 복제할 수 있다. 제한 인식 부위 EcoRI 및 HindIII는 정지 코돈 후 통합되었다. 정지 코돈 TGA 은 최적화된 유전자에서 사용되었다.
이러한 변화는 모두 식물 편향 코돈 조성물을 거의 유지하는 제약 내에서 이루어졌다. Cry2Ai 단백질(서열 ID 번호 1)을 부호화하는 완벽한 식물-코돈-최적화 서열은 서열 ID 번호 2-6에 명시된다. 식물-편향 코돈 최적화 DNA 서열의 인실리코 번역은 천연 Cry2Ai 단백질(서열 ID 번호 1)와의 100% 동일성을 보여주었다. 식물-코돈-최적화 DNA 서열(서열 ID 번호 2-6)은 201D1, 201D2, 201D3, 201D4 및 201D5으로 지정되었다. 201D1-D5 DNA 단편(서열 ID 번호 2-6)은 상업 벤더(vendor)(Genscript Inc,USA)에 의해 합성되었다. 201D1DNA 단편은 당업계에 알려져 있고 pUC57-201D1로 지정된 방법을 이용해 pUC57 벡터에서 복제되었다. 유사하게, 201D2 DNA, 201D3 DNA, 201D4 DNA 및 201D5 DNA 단편은 pUC57에서 복제되었고 각각 pUC57-201D2, pUC57-201D3, pUC57-201D4 및 pUC57-201D5으로 지정되었다.
예 2: 발현 벡터 구성
예1의 pUC57-201D1 벡터를 BamHI 및 HindIII로 분해시켜 201D1 DNA (서열 ID 번호 2) 단편 (반응 부피 (Reaction volume) - 20μl, 플라스미드 DNA - 8.0 μl, 10X 버퍼 - 2.0 μl, 제한 효소BamHI - 0.5 μl, 제한 효소HindIII - 0.5 μl, 증류수 - 9.0 μl)을 획득하였다. 모든 시약을 섞어 반응 혼합물(reaction mixture)을 얻고, 반응 혼합물을 2%의 아가로스 겔에서 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 통해 분석하고 201D1 DNA 단편을 UV 조명 아래에서 깨끗하고 날카로운 메스를 이용해 아가로스 겔에서 절제한 후 37°C에서 30분 동안 배양하였다. DNA 단편은 겔 용리 키트(gel elution kit)를 이용해 겔에서 용리하였다. DNA 단편을 포함하는 겔 조각(slice)을 2 ml의 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)로 옮기고 3X 샘플 부피의 완충제 DE-A를 첨가하였다. 겔은 볼텍싱(vortexing)을 통해 완충제 DE-A에서 재현탁되고 내용물은 겔이 완전히 용해될 때까지 75°C에서 가열한 후 혼합한 0.5X 완충제 DE-A 및 DE-B을 함께 첨가하였다. 칼럼(column)을 안으로 넣어 에펜도르프 튜브를 준비하고 결합 혼합물을 칼럼으로 옮겼다. 칼럼이 있는 에펜도르프 튜브를 간단히 원심 분리했다. 칼럼을 새로운 에펜도르프 튜브에 넣고 세척 완충액 - W I (Qiagen Kit) 500μl를 첨가한 후 원심 분리하였다. 상청액(supernatant)을 버리고 세척 완충액 - W 2 700 μl을 칼럼의 벽을 따라 첨가해 모든 잔여 완충액을 씻어내고 원심 분리하였다. 이 단계를 완충액 W 2의 부분 표본(aliquot) 700 μl을 이용해 반복하였다. 칼럼을 새로운 에펜도르프 튜브로 옮겨 1분간 6000 rpm에서 원심 분리해 잔여 완충액을 제거하였다. 칼럼을 새로운 에펜도르프 튜브에 다시 놓고 용리 완충액 40 μl을 막 중앙에 첨가하였다. 용리 완충액이 있는 칼럼을 실온에서 1분간 두고 튜브를 1분간 12000 rpm에서 원심 분리하였다. 용리된 201D1 DNA 단편은 추후 사용할 때까지 -20°C에서 보관되었다.
이렇게 획득한 분리 및 정제된 201D1 DNA 단편은 선형화된 pET32a 벡터에서 결찰되었다. 결찰(ligation)은 T4DNA 리가아제 효소(반응 부피 - 30 μl, 10X 결찰 완충액 - 3.0 μl, 벡터 DNA - 5.0 μl, Insert DNA - 15.0 μl, T4 DNA 리가아제 효소 - 1.0 μl, 증류수 -6.0 μl)를 이용해 수행되었다. 시약을 잘 섞고 생성된 반응 혼합물을 2시간 동안 16°C에서 배양하였다. 그 후, 대장균 BL21 (DE3) 균주의 수용성 세포(competent cell)를 결찰 혼합물 10μl를 BL21 DE3 수용성 세포 100 μl에 첨가하여 201D1 DNA를 나르는 pET32a 벡터를 포함하는 결찰 혼합물로 형질 전환시켰다. 이렇게 획득한 세포 혼합물을 30분간 얼음 위에 놓고 열 충격을 주기 위해 물중탕(water bath)에 60초동안 42°C에서 배양한 후 5-10분동안 얼음 위에 다시 올려 놓았다. 그 후, LB 브로스(broth) 1 ml를 혼합물에 첨가해 200 rpm로 항온진탕기(incubator shaker)에서 1시간 동안 37°C에서 추가 배양하였다. 세포 혼합물을 카르베니실린 50μg/ml와 함께 LB 세균 배양액(agar)에 도포하고 밤새 37°C에서 배양하였다. 양성 클론(positive clone)은 제한분해분석(restriction digestion analysis)을 통해 식별되었다. 이렇게 획득한 발현 벡터는 pET32a-201D1로 지정되었다.
유사하게, 서열 ID 번호 3-6에 명시된 다른 외떡잎 식물 코돈 최적화 DNA 서열을 나르는 발현 벡터는 생성되어 pET32a-201D2, pET32a-201D3, pET32a-201D4, 및 pET32a-201D5으로 지정되었다.
예 3: 대장균 ( E coli .) 내 CRY2Ai 발현
pET32a에서 복제되고 pET32a-201D1로 지정된 201D1 DNA (서열 ID 번호 2)는 대장균 BL 21 D3에서 발현되었다. 발현은 약 OD nm=0.5 내지 1.0의 세포 밀도에서 1mM IPTG로 유도되었다. 유도 후, 대장균 세포를 단백질 생성을 위해 16°C에서 24 내지 40시간 동안 진탕기에서 배양하였다. Cry2Ai 단백질(서열 ID 번호 1)은 세포에서 가용성 형태로 발현되었다. 그 후, 배양균을 원심분리관으로 옮겨 5분 동안 10000 rpm에서 원심 분리하였다. 상청액을 버리고 세포 10 ml를 라이소자임으로 소화시켜 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 샘플을 5분 동안 10000 rpm에서 원심 분리시키고 상청액을 버렸다. 펠렛(pellet)을 멸균 증류수에 현탁시키고 10분 동안 10000 rpm에서 원심 분리하였다. 이 단계를 2번 반복하고 펠렛을 -20°C에서 보관하였다. 유도된 재조합 균주에서 단백질을 포함하는 펠렛은 10% SDS-PAGE를 통해 분석하였다.
유사하게, 서열 ID 번호 3-6에 명시된 DNA 서열은 pET32a에서 복제되어 대장균 BL 21 D3에서 발현되었다.
예 4: CRY2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 을 부호화하는 201D1 DNA (서열 ID 번호 2) 를 포함하는 식물 형질 변환 벡터 생성
201D1 DNA (서열 ID 번호 2)를 나르는 pUC57-201D1 벡터를 제한 효소로 분해시켜 201D1 DNA 단편 (반응 부피 - 20μl, 플라스미드 DNA - 8.0 μl, 10X 완충액 - 2.0 μl, 제한 효소 EcoRV - 0.5 μl, 증류수 - 9.5 μl)을 방출시켰다. 모든 시약을 섞고 혼합물을 30분 동안 37°C에서 배양하였다. 제한 분해 후 획득한 생성물을 겔 전기영동으로 분석하고 그 후 추가적으로 정제하였다.
Ti 플라스미드 pGreen0029 벡터를 EcoRV 효소 (반응 부피 - 20μl, 플라스미드 DNA - 8.0 μl, 10X 완충액 - 2.0 μl, 제한 효소 EcoRV - 0.5μl, 증류수 - 9.5 μl)를 이용한 제한 분해를 통해 준비하였다. 모든 시약을 섞고 혼합물을 30분 동안 37°C에서 배양하였다. 제한 분해 후 획득한 생성물을 겔 전기영동으로 분석하였다.
정제된 201D1 DNA 단편(서열 ID 번호 2)은 선형화된 pGreen0029 벡터에서 결찰되었다. 결찰은 T4DNA 리가아제 효소(반응 부피 - 30 μl, 10X 결찰 완충액 - 3.0 μl, 벡터 DNA - 5.0 μl, 삽입 DNA - 15.0 μl, T4 DNA 리가아제 효소 - 1.0 μl, 증류수 -6.0 μl)를 이용해 수행되었다. 시약을 잘 섞고 생성된 반응 혼합물을 2시간 동안 16°C에서 배양하였다. 그 후, 대장균 BL21 (DE3) 균주의 수용성 세포를 결찰 혼합물 10μl를 BL21 DE3 수용성 세포 100 μl에 첨가하여 201D1 DNA(서열 ID 번호 2)를 나르는 pGreen0029 벡터를 포함하는 결찰 혼합물을 이용해 형질 변환시켰다. 이렇게 획득한 세포 혼합물을 30분간 얼음 위에 놓고 열 충격을 주기 위해 물중탕에 60초 동안 42°C에서 배양한 후 5-10분동안 얼음 위에 다시 올려 놓았다. 그 후, LB 브로스 1 ml를 혼합물에 첨가해 200 rpm로 항온진탕기에서 1시간 동안 37°C에서 추가 배양하였다. 세포 현탁액(100 μl)을 카르베니실린 50μg/ml를 포함하는 LB 한천 배지(agar medium)에 균일하게 도포하였다. 플레이트(plate)를 밤새 37°C에서 배양하였다. 양성 클론을 제한분해분석을 통해 확인하였다. 이렇게 획득한 재조합 벡터는 pGreen0029 CaMV35S-201D1로 지정되었다.
따라서, 재조합 플라스미드 pGreen0029-CaMV35S-201D1는 35SCaMV 프로모터의 전사 조절 하에 식물-최적화 201D1 DNA 서열(서열 ID 번호 2)을 포함한다. 또한, pGreen0029-CaMV35S-201D1은 NOS 프로모터의 전사 조절 하에 식물 선택℃* 표지 유전자인 nptII 유전자를 포함한다(도 1). pGreen0029-CaMV35S-201D1 T-영역의 구성요소의 물리적 배열은 다음과 같이 예시된다:
RB>35SCaMV: 201D1 CDS: CaMV polyA>NOS 프로모터: nptII CDS: NOS Poly A>LB
유사하게, 서열 ID 번호 3-6에 명시된 DNA 서열은 Ti 플라스미드 pGreen0029에서 복제되고 이렇게 획득한 재조합 벡터는 pGreen0029-CaMV35S-201D2, pGreen0029-CaMV35S-201D3, pGreen0029-CaMV35S-201D4 및 pGreen0029-CaMV35S-201D5으로 지정되었다. T-영역 내 상기 DNA 서열 (서열 ID 번호 3-6)을 나르는 pGreen0029-CaMV35S의 구성요소의 물리적 배열은 다음과 같이 예시된다:
RB>35SCaMV: 201D2 CDS: CaMV polyA>NOS promoter: nptII CDS: NOS Poly A>LB
RB>35SCaMV: 201D3 CDS: CaMV polyA>NOS promoter: nptII CDS: NOS Poly A>LB
RB>35SCaMV: 201D4 CDS: CaMV polyA>NOS promoter: nptII CDS: NOS Poly A>LB
RB>35SCaMV: 201D5 CDS: CaMV polyA>NOS promoter: nptII CDS: NOS Poly A>LB
재조합 벡터 pGreen0029- CaMV35S-201D1를 통한 아그로박테륨(Agrobacterium tumefaciens ) 형질변환
아그로박테륨(Agrobacterium tumefaciens) 균주 LBA440는 서열 ID 번호 2에 명시된 DNA서열을 나르는 재조합 pGreen0029- CaMV35S-201D1 플라스미드를 통해 형질 변환되었다. pGreen0029-CaMV35S-201D1 플라스미드 DNA 200ng을 아그로박테륨(A. tumefaciens) 균주 LBA440 수용성 세포 100 μl의 부분 표본에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 얼음 위에서 배양한 후 20분 동안 액체 질소로 이동시켜 실온에서 해동하였다. 그 후 아그로박테륨 세포를 1 ml 의 LB 브로스로 옮겨 200 rpm로 수조 진탕기(water bath shaker)에서 24시간 동안 28°C에서 배양하였다. 세포 현탁액을 리팜피신 50 μg/ml, 카나마이신 30μg/ml 및 테트라사이클린 5 μg/ml을 포함하는 LB 한천 배지에 균일하게 도포하였다. 플레이트를 밤새 28°C에서 배양하였다. 형질 변환된 아그로박테륨 세포를 플라스미드 추출 및 제한분해방법을 통해 분석하고 양성 아그로박테륨 집락(positive A. tumefaciens colonies)은 추후 사용을 위해 선별 및 저장하였다.
예 5 (A) pGreen0029-CaMV35S-201D1 구조체를 통한 아그로박테륨 -매개( AGROBACTERIUM -MEDIATED) 목화 형질변환
목화 형질변환의 실험상 세부내용을 하기에 설명한다. 목화 형질변환 업계 전문가는 다른 식물 발현가능 선택가능한 표지 유전자를 이용할 경우 다른 방법을 목화 형질변환 및 형질변환 식물 선별에 이용할 수 있다고 이해한다.
재료
아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 및 선택가능한 표지
튜메파시엔스(tumefaciens) LBA4404 및 선택가능한 표지로서의 네오마이신 인산전이효소(neomycin phosphotransferase) II (nptII) 유전자를 본 명세서에 개시된 목화 형질변환 및 재생 실험에 사용하였다.
배양 배지 (Culture media)및 기타
루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB) 배지 (Himedia); LB 한천 (Himedia); MS 매트로 염 (MS macro salts) (Himedia), MS 마이크로 염 (MS micro salts) (Himedia), FeEDTA, B5 비타민, 티아민-HCI (thiamine-HCl) (Duchefa), 피리독신-HCI (pyridoxine-HCl) (Duchefa), 니코틴산 (Duchefa)], 미오이노시톨 (Sigma), 수크로스 (Sigma), 한천 (Duchefa); 2, 4-디클로로페녹시아세트산 (2, 4-D) (Duchefa): 1 mg/mL 스톡 (stock); 키네틴 (Duchefa); 인돌-3-부티르산 /IBA (Duchefa); 아세토시린곤 (3',5'-디메톡시-4'-히드록시아세토페논) (Sigma); 아목시실린 (Duchefa); 카나마이신 단일황산염 (Kanamycin monosulphate) (Duchefa)
식물 재료
목화 (가시피움 히르수툼(Gossypium hirsutum) L. var Coker 310
체외 종자 발아 및 전-배양 (pre-culture)
목화 종자 var Coker 310를 20분동안 28°C ± 2°C, 200 rpm의 진탕기에서 0.1% Tween-20이 포함된 멸균수에 담그고 20분동안 진탕기에서 0.1% HgCl2 로 처리하였다. 종자를 멸균수로 5차례 세척했다. 멸균된 종자를 밤새 멸균수에 담가 두었다. 멸균된 종자를 25°C ± 2°C에서 16/8 명암 광주기에 따라 MS 배지에서 발아시켰다. 자엽형 외식편(cotyledonary explants)을 7일 된 묘목에서 준비하고 MS 염, B5 비타민, 30.0 g/l; 2,4-D (1.0 mg/l) 및 키네틴 (5.0 mg/l)을 포함하는 피타겔(Phytagel): 2.5 g/l pH: 5.8을 포함하는 MS 배지에서 전배양시켰으며 이 때 배축 면은 배지에 닿은 상태였다.
공동-배양, 선발 및 식물 재생
24시간 후, 전배양 배지의 외식편을 플라스미드 pGreen0029-CaMV35S-201D1를 포함하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 (A. tumefaciens) LBA4404의 현탁 배양(suspension culture)을 통해 20분간 감염시켰다. 현탁 배양 배지는 아세토시린곤(Acetosyringone) 100 uM로 구성되었다. 초과된 현택 배양균을 멸균 여과지로 블롯 건조(blot drying)시켜 제거하고 2,4-D (1.0 mg/l) 및 키네틴 (5.0 mg/l)을 함유하는 MS 배지 + 아세토시린곤(100 μM)을 포함하는 공동-배양 배지로 옮겼다. 25 C± 2°C의 암흑 속에서 공동-배양 48시간 후, 외식편을 멸균 증류수 및 아목시실린(Augmentin) 300 mg/l를 포함하는 수용액으로 세척하였다. 공동-배양된 외식편은 멸균 여과지에서 블롯 건조시키고 2,4-D (1.0 mg/l) 및 키네틴 (5.0 mg/l)을 함유하는 MS 배지 + 카나마이신 (50 mg/l) + 아목시실린 (300 mg/l)을 포함하는 선발배지에서 배양하였다. 캘리(calli)가 나타날 때까지 외식편을 동일 배지에서 2주마다 동일한 배지에서 계대배양(subculture)하였다. 캘리를 모아 MS 배지 + 카나마이신 (50 mg/l) + 아목시실린 (300 mg/l)에서 계대배양하였다. 증식한 캘리를 동일 배지에서 21일마다 계대배양하였다. 배발생 캘리(embryogenic calli)를 식별해 추가 KNO3 (1.9 g/l)를 함유하는 MS 배지 + 아목시실린 (300 mg/l)에서 계대 배양하여 체세포 배아(somatic embryos)를 획득하였다. 배발생 캘리의 체세포배를 MS 배지 + 아목시실린 (300 mg/l)에서 추가로 계대배양하였다. 부착 캘러스(adhering callus)와 함께 배아를 배양 배지에 놓인 여과지에 놓았다. 그 다음 성장한 체세포 배아를 반강도 MS 배지를 포함하는 유리병으로 옮겼다. 체세포 배아는 정상적으로 성장해 14-25일 내에 묘목이 되었다. 묘목을 세포 배양 병에서 조심스럽게 꺼내 토석질(soilrite)을 포함하는 작은 플라스틱 화분에서 경화시켜 7-8일 동안 28 ± 2°C에서 유지시켰다. 그 후, 묘목을 온실로 옮겼다 (도 2).
목화 형질변환 및 재생 분야에 대한 지식을 가진 자는 다른 방법이 목화 형질변환 및 재생에 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 형질변환 식물의 선택을 위해, 다른 식물 발현 가능하고 선택 가능한 선택 마커를 사용할 수 있다.
예 5 (B) 201D1 DNA 서열 (서열 ID 번호 2) 을 통해 형질변환된 추정 형질전환 목화의 분자 분석
게놈 DNA 분리
전체 게놈 DNA를 예 5 (A)에서 획득한 추정 형질전환 목화 및 Coker 310의 대조 비-형질전환 식물 (control non-transgenic plant) 잎 조직에서 추출했다. 잎을 추정 형질전환 목화 및 비-형질전환 목화에서 채취하고 QIAGEN TissueLyser II (Retsch)을 이용해 추출 완충액 (1M Tris-HCl, pH 7.5, 1M NaCl, 200 mM EDTA 및 10 % SDS) 300 μl으로 균질화시켜 10분 동안 12000 rpm에서 원심 분리하였다. 상청액을 멸균 마이크로 원심분리관(microfuge tube)으로 옮겼다. 상청액에, 클로로폼-이소펜틸 (chloroform-isoamyl) 알코올 (24:1) 을 첨가하고 10분 동안 12000 rpm에서 원심 분리하였다. 수성층을 마이크로 원심분리관으로 옮겼다. 거기에 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 이소프로판올을 첨가하고 20분 동안 -20°C에서 보관하였다. 그 후 상청액을 버리고 펠렛에 에탄올 300 μl을 첨가하였다. 5분 동안 10000 rpm에서 원심 분리 후, 상청액을 버리고 DNA 펠렛을 15분동안 공기 중에서 건조시킨 후 0.1X TE 완충액 (Tris -pH 8.0: 10.0 mM 및 EDTA -pH 8.0: 1.0 mM) 40 μl에서 용해시켰다. 260 nm에서 OD를 측정함으로써 게놈 DNA의 품질 및 양을 나노드롭 1000® 분광 광도계(Nanodrop 1000® spectrophotometer)를 이용해 평가하였다. 또한, DNA의 온전성을 0.8%의 아가로스 겔을 이용해 전기영동법을 수행하여 평가하였다.
PCR 분석
서열 ID 번호 7 및 서열 ID 번호 8에 명시된 프라이머를 이용한 합성 cry2Ai-201D1 DNA 그리고 서열 ID 번호 9 및 서열 ID 번호 10에 명시된 프라이머를 이용한 nptII 유전자 분석을 목적으로 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction)(PCR)을 추정 형질전환 목화 및 비-형질전환 대조 목화의 게놈 DNA (100 ng) 를 대상으로 수행하였다.
PCR 조건
5분 동안 94º C: 1사이클
45초 동안 94º C
45초 동안 58º-62º C 30 사이클
45초 동안 72º C
10분 동안 72º C: 1 사이클
모든 추정 형질전환 목화는 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 cry2Ai-201D1 DNA (1500 bp) 및 nptII 유전자(698 bp)에 대하여 양성인 것으로 밝혀졌다.
핵산잡종화반응 (Southern hybridization)
모든 PCR 양성 목화를 핵산잡종화반응을 위해 선발하였다. ELISA 양성 T0 형질전환 목화의 게놈 DNA(각 5 μg)는 NcoI 또는 XbaI 또는 BamHI 제한효소를 통해 분해되어 201D1 DNA 프로브로 라벨링된 [α-32P]- dCTP을 이용해 서던 블랏 잡종화(Southern blot hybridization)되었다.
PCR 및 ELISA 양성 형질전환 목화 및 비-형질전환 목화의 게놈 DNA를 16시간 동안 37°C에서 NcoI 제한 효소로 분해하였다. 플라스미드 DNA pGreen0029-CaMV35S-201D1는 양성 대조군으로 사용하였다. 분해된 게놈 DNA 샘플 및 플라스미드 DNA는 1X TAE 완충액에서 밤새도록 20 V로 0.8%의 아가로스 겔에서 분해하고, UV 투과조명장치(UV transilluminator)에서의 브롬화 에티듐 염색으로 시각화하고, 겔 문서화 시스템 (SYNGENE) 에서 문서화하였다.
제한 분해되고 전기영동법으로 분리된 게놈 DNA는 부드럽게 교반하여 30분 동안 겔을 2 볼륨(volumes)의 변성용액(denaturing solution)에 담궈 변성시켰다. 겔은 부드럽게 교반하여 30분 동안 2 볼륨의 중화 용액에 담궈 중화시켰다. 겔은 멸균 탈이온화수(de-ionized water)에 간단히 세척하고 DNA는 표준 프로토콜에 따라 16시간 동안 20X SSC 완충액에서 상향 모세혈관 이동(upward capillary transfer)을 통해 양전하를 띄는 나일론 막(positively charged nylon membrane)(시그마(Sigma))으로 옮겼다. 게놈 DNA를 완벽하게 이동한 후, 나일론 막을 2X SSC 완충액에서 간단하게 세척하고 5분 동안 공기 중에서 건조했다. DNA는 1분 동안 1100 μJ에서 UV-크로스 링커(UV-cross linker)(UV Stratalinker® 1800 Stratagene, CA, USA)에 막을 노출시켜 가교(cross-linked)시켰다. 가교된 막은 비닐 봉지에 밀봉하고 서던 블랏 잡종화에 사용될 때까지 4ºC에서 보관하였다.
- 변성 용액:
NaCl: 1M
NaOH: 0.5N
- 중화 용액:
NaCl: 1.5M
Tris: 0.5M
- 20X SSC:
NaCl: 3.0M
시트르산나트륨: 0.3M
pH: 7.0 with conc.HCl
20x SSC 용액은 다음과 같이 희석될 수 있다:
최종 SSC 농도 20x SSC 용액 증류수 또는 탈이온화수
3x SSC 30 ml 170 ml
2x SSC 20 ml 180 ml
1x SSC 10 ml 190 ml
0.5x SSC 5 ml 195 ml
프로브 준비
겔 추출 미니프렙(miniprep) 키트(Bio Basic Inc., Canada)를 이용해 정제되고 벡터에서 증폭된 201D1 DNA 단편의 1500 bp 약 100 ng은 라벨링 프로브로 이용된 [α- 32P] -dCTP를 통해 방사성 동위 원소를 써서 식별(radiolabelled)했다.
프로브 라벨링(Probe labelling): 증폭되고 정제된 PCR 4 μl을 라벨링을 위해 탬플릿 DNA(template DNA)로 이용하였다. 탬플릿 DNA는 마이크로 원심분리관에서 마구잡이 시발체(random primer)(DecaLabel DNA Labeling Kit, Thermo Fisher Scientific Inc. USA) 10 μl과 함께 혼합하였다. 멸균 증류수로 부피를 최대 40 μl까지 만들고 끓는 물 중탕에서 5분간 가열하여 변성시킨 후 얼음 위에서 냉각시켰다. 변성된 DNA에, dATP, dGTP, dTTP, [α- 32P]-dCTP (50μCi) 5 μl 및 DNA 중합효소 I의 클레노우 절편(Klenow fragment) 1 μl 을 포함하는 라벨링 혼합물 5 μl을 첨가하고 물 중탕에서 10분 동안 37°C으로 배양하였다. 0.5M EDTA 1 μl을 첨가해 반응을 중단시키고 4분 동안 끓는 물 중탕에서 배양시켜 4-5분 동안 얼음 위로 이동시켰다.
프로브를 이용한 선-잡종화 및 잡종화
상기 기술된 DNA 가교막을 잡종화 완충액 30 ml를 포함하는 잡종화 병에 조심스럽게 넣었다. 병을 꽉 닫고 선-잡종화 처리를 위해 45분 내지 1시간 동안 65°C의 오븐에 두었다.
잡종화 완충액을 병 밖으로 쏟고 DNA 프로브로 라벨링된 변성 [α- 32P]-dCTP을 포함하는 잡종화 용액 (65°C로 유지) 30 ml로 교체했다. 잡종화 용액으로 채운 병을 단단히 밀봉해 16시간 동안 65°C의 오븐에 두었다.
- 잡종화 용액:
Na2HPO4, pH 7.2: 0.5M
SDS: 7 % (W/V)
EDTA, pH 7.2: 1mM
잡종화 완충액을 병 밖으로 쏟았다. Wash I 용액을 첨가하고 병을 10분 동안 65ºC에서 천천히 돌아가는 플랫폼 위 오븐에 두었다. 10분 후, Wash I 용액을 Wash II 용액 30 ml로 교체하고 부드럽게 교반해 5-10분 동안 65°C에서 배양했다. 그 후 Wash II 용액을 쏟아내고 막 내 방사능 수치를 그레고르-뮬러 카운터(Gregor-Muller counter)를 이용해 확인했다. 수치에 따라, Wash III 30 ml를 병에 첨가하고 부드럽게 교반해 30초 내지 1분 동안 65°C에서 배양했다. 그 후, Wash III 용액은 제거하고 막은 실온에서 5-10분 동안 와트맨 제 1 여과지(Whatman No.1 filter paper)에 건조시키고 -80°C에서 2일 동안 신호 강화 스크린(signal intensifier screen) (Hyper cassette® from Amersham, USA) 암막에서 엑스레이 필름(Kodak XAR)에 노출시켰다.
2일 동안 노출한 후, 엑스레이 필름을 암실에서 꺼내 1분 동안 현상액에 담근 후 1분 동안 물에 담궜다. 마지막으로, 엑스레이 필름을 2분 동안 정착액에 담근 뒤 1-2분 동안 물에 세척한 후 공기 중에 건조시켰다.
- 세척액
Wash I: 3X SSC + 0.1% SDS
Wash II: 0.5X SSC + 0.1% SDS
Wash III: 0.1X SSC + 0.1% SDS
- 현상액:
팩(Pack) A 내용물 13.2 g을 증류수 800 ml에 용해시키고 완전히 용해된 후 팩 B 성분 89g을 추가하고 천천히 저으며 용해시켰다. 완전히 용해시킨 후 부피는 최대 1000ml였고 갈색병에 보관하였다.
- 정착액:
정착액 268g을 천천히 저으며 증류수 800 ml에 용해시켰고 완전히 용해된 후 부피는 최대 1000ml였고 컨트리(country) 여과지를 통해 여과시키고 갈색병에 보관하였다.
모든 PCR 양성 형질전환 목화는 목화 게놈 내 전이 유전자(transgene)의 통합을 나타내는 다양한 크기의 잡종화 신호를 보여주었다. 일부 형질전환 목화는 단일 좌(locus)(201D1 DNA의 단일 복제품(single copy))에서의 201D1 DNA 서열 통합을 보여준 반면, 소수의 형질전환 목화는 다중좌에서의 201D1 DNA 서열 통합을 보여주었다. 잡종화 신호는 양성 대조군에서 관찰되는 반면, 비-형질전환 목화에서는 그 어떤 잡종화 신호도 나타나지 않았다.
그 후 전이유전자(서열 ID 번호 2-201D1) DNA의 단일 복제품과 함께 형질전환 목화(T0)를 추가 실험을 위해 선택하였다. T0 식물의 종자를 성장시켜 T1 내지 T4 세대 자손을 획득하였다.
예 6 ELISA를 이용한 추정 형질변환 목화 (T0)의 생화학적 분석
EnviroLogix Quantiplate 키트 (EnviroLogix Inc., USA)를 이용한 샌드위치 ELISA (Sandwich ELISA)를 추정 형질전환 PCR 양성 (201D1 DNA 서열 - 서열 ID 번호 1) 목화 내 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호1) 의 정량 평가를 위한 제조업체 측 지시사항에 따라 수행하였다. 키트와 함께 제공된 양성 및 음성 대조군은 참조자료로써 사용하였다. 추정 형질전환 목화에서 획득한 두 번째 본엽(true leaf)을 본 실험에 사용하였다. 잎 조직의 약 30 mg을 추출 완충액 500 μl에서 균질화시키고 7분 동안 4ºC에서 6,000 rpm으로 원심 분리시키고 어세이(assay)를 위해 상청액을 사용하였다. 상청액(100 μl)을 항-Cry2Ai-단백질 항체 사전 코팅 플레이트(anti-Cry2Ai-protein antibody pre-coated plate)에 올려놓았다. 플레이트를 파라필름으로 덮고 15분 동안 상온에서 (24ºC ±2) 배양하였다. 효소 접합체(Enzyme conjugate)(100 μl)를 각각의 웰(well)에 첨가하였다. 1시간 후, 웰을 1X 세척 완충액으로 완전히 세척하였다. 기질(100 μl)을 각각의 웰에 첨가하고 30분 동안 배양하였다. 정지액(0.1N 염산)을 첨가해 반응을 중단시켰다. 음성 대조군을 블랭크(blank)로 이용해 플레이트의 광학밀도(Optical density)(O.D.)를 450 nm에서 판독하였다. 각 샘플을 두 번 복제하고 각각의 웰을 복제로 간주하였다.
(키트와 함께 이용 가능한) 교정기의 다양한 농도의 광학 밀도 간 그래프를 작성했다. Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 농도는 그래프에 있는 해당 농도 레벨에 대한 O.D. 값을 그래프로 계산해 결정하였다. 농도는 하기에 기술된 바와 같이 계산되었다,
Figure pct00001
샘플에 있는 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 양은 생 잎 조직 그램당 마이크로그램으로 표현하였다. Cry2Ai 정량 ELISA 키트로 검사한 15개의 PCR 양성 목화 결과 (T0) 중 모두가 어린 형질전환 목화 잎 조직에서 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 발현에 대해 양성인 것으로 밝혀졌다.
표 2에 요약된 ELISA 결과를 검토한 결과, 201D1 DNA를 포함하는 구조체를 포함하는 대부분의 형질전환 목화가 서로 다른 세대의 생장기동안 생 잎 조직 10 μg/g 내지 20 μg/g의 범위에서 Cry2Ai 단백질 (서열 ID 번호 1) 을 발현시켰다는 놀랍고 예상하지 못한 관찰 결과가 드러났으며, 놀랍게도 형질전환 식물의 추후 세대 내 단백질 발현에서 안정적이라 할지라도, 세대에 걸친 (T1-T4) 유의미한 변화는 나타나지 않았다. Cry1Ac 단백질 발현이 서로 다른 세대의 생장기 동안 생 잎 조직 5 μg/g 내지 10 μg/g로 밝혀진 반면, 발현은 세대를 걸친 (T1-T4) 유의미한 변화를 나타내지 않았다. 따라서, Cry2Ai 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 DNA 서열은 선행 기술에 대한 형질전환 식물 내 단백질 발현의 상당한 향상을 보여준다.
표 2: 형질전환 목화의 비교 ELISA 분석
201D1 DNA 서열 (서열 ID 번호 2) 을 포함하는 형질전환 목화 잎 내 Cry2Ai 단백질 발현 (ug/gm F.wt)
서열 ID 번호 2에 명시된 DNA 서열을 포함하는 형질전환 목화 T0 T1 T2 T3 T4 Average STD
201-1 13.70 14.42 17.44 17.49 15.43 15.70 1.54
201-2 19.99 13.57 17.36 15.49 17.08 16.70 2.13
201-3 17.68 23.14 19.21 18.21 18.01 19.25 2.01
201-4 10.66 16.34 16.57 15.47 16.36 15.08 2.24
201-5 8.48 7.69 7.06 9.30 9.21 8.35 0.87
201-6 13.05 16.65 15.78 17.54 18.65 16.33 1.89
201-7 17.14 7.51 7.91 13.50 7.13 10.64 4.00
201-8 12.55 11.27 14.90 13.53 13.31 13.11 1.19
201-9 13.94 12.20 12.73 12.80 12.97 12.93 0.57
201-10 12.56 12.02 12.23 12.45 12.53 12.36 0.21
201-11 12.95 19.16 18.07 19.16 19.42 17.75 2.45
201-12 12.13 11.03 12.38 12.81 14.23 12.52 1.04
201-13 11.63 17.95 16.45 18.59 17.45 16.41 2.49
201-14 14.04 12.55 15.37 14.19 13.31 13.89 0.94
201-15 16.91 14.80 13.15 13.15 15.62 14.72 1.45
cry1Ac 유전자를 포함하는 형질전환 목화 잎 내 살충성 Cry1Ac 단백질 발현 (ug/gm F.wt)
Cry1Ac단백질을 발현시키는 형질전환 목화 T0 T1 T2 T3 T4 Average STD
P1 9.09 5.45 5.63 5.63 5.63 6.28 1.40
P2 8.77 8.09 8.77 8.77 8.77 8.64 0.27
P3 10.45 7.73 7.15 7.15 7.15 7.92 1.28
P4 9.90 4.16 4.95 4.95 4.95 5.78 2.08
P5 9.19 8.38 9.19 9.19 9.19 9.03 0.32
전술한 개시가 이해의 명확성을 목적으로 실례 및 예시의 방법으로 일부 상세하게 설명되었다 해도, 특정 변화 및 변경이 본 개시 범위 내에서 실시될 수 있음은 명백하다.
SEQUENCE LISTING <110> DCM SHRIRAM LIMITED <120> SYNTHETIC NUCLEOTIDE SEQUENCES ENCODING INSECTICIDAL CRYSTAL PROTEIN AND USES THEREOF <130> PD034766IN-SC <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 633 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of Cry2Ai protein (NCBI GenBank: ACV97158.1) <400> 1 Met Asn Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Asn Ile Thr Cys His Ala His 1 5 10 15 Asn Val Val Ala His Asp Pro Phe Ser Phe Glu His Lys Ser Leu Asn 20 25 30 Thr Ile Glu Lys Glu Trp Lys Glu Trp Lys Arg Thr Asp His Ser Leu 35 40 45 Tyr Val Ala Pro Ile Val Gly Thr Val Gly Ser Phe Leu Leu Lys Lys 50 55 60 Val Gly Ser Leu Val Gly Lys Arg Ile Leu Ser Glu Leu Gln Asn Leu 65 70 75 80 Ile Phe Pro Ser Gly Ser Ile Asp Leu Met Gln Glu Ile Leu Arg Ala 85 90 95 Thr Glu Gln Phe Ile Asn Gln Arg Leu Asn Ala Asp Thr Leu Gly Arg 100 105 110 Val Asn Ala Glu Leu Ala Gly Leu Gln Ala Asn Val Ala Glu Phe Asn 115 120 125 Arg Gln Val Asp Asn Phe Leu Asn Pro Asn Gln Asn Pro Val Pro Leu 130 135 140 Ala Ile Ile Asp Ser Val Asn Thr Leu Gln Gln Leu Phe Leu Ser Arg 145 150 155 160 Leu Pro Gln Phe Gln Ile Gln Gly Tyr Gln Leu Leu Leu Leu Pro Leu 165 170 175 Phe Ala Gln Ala Ala Asn Leu His Leu Ser Phe Ile Arg Asp Val Ile 180 185 190 Leu Asn Ala Asp Glu Trp Gly Ile Ser Ala Ala Thr Val Arg Thr Tyr 195 200 205 Arg Asp His Leu Arg Asn Phe Thr Arg Asp Tyr Ser Asn Tyr Cys Ile 210 215 220 Asn Thr Tyr Gln Thr Ala Phe Arg Gly Leu Asn Thr Arg Leu His Asp 225 230 235 240 Met Leu Glu Phe Arg Thr Tyr Met Phe Leu Asn Val Phe Glu Tyr Val 245 250 255 Ser Ile Trp Ser Leu Phe Lys Tyr Gln Ser Leu Met Val Ser Ser Gly 260 265 270 Ala Asn Leu Tyr Ala Ser Gly Ser Gly Pro Gln Gln Thr Gln Ser Phe 275 280 285 Thr Ala Gln Asn Trp Pro Phe Leu Tyr Ser Leu Phe Gln Val Asn Ser 290 295 300 Asn Tyr Ile Leu Ser Gly Ile Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Thr Phe 305 310 315 320 Pro Asn Ile Gly Gly Leu Pro Gly Ser Thr Thr Thr His Ser Leu Asn 325 330 335 Ser Ala Arg Val Asn Tyr Ser Gly Gly Val Ser Ser Gly Leu Ile Gly 340 345 350 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Ile Asn Gly Arg Ala Tyr Thr Val Ser Asn Val Asn Thr Thr Thr Asn 565 570 575 Asn Asp Gly Val Asn Asp Asn Gly Ala Arg Phe Ser Asp Ile Asn Ile 580 585 590 Gly Asn Ile Val Ala Ser Asp Asn Thr Asn Val Thr Leu Asp Ile Asn 595 600 605 Val Thr Leu Asn Ser Gly Thr Pro Phe Asp Leu Met Asn Ile Met Phe 610 615 620 Val Pro Thr Asn Leu Pro Pro Leu Tyr 625 630 <210> 2 <211> 1944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 201D1 <400> 2 tctagaccat ggggatccat gaataatgtt cttaactctg gaaggaatat tacctgccat 60 gcacataatg ttgttgcaca tgacccattc agttttgaac ataagagtct aaacactata 120 gaaaaagagt ggaaggagtg gaaaaggaca gatcattctc tatacgtagc tccaatcgtg 180 gggactgtgg gttcttttct attaaagaag gtaggttcct tagtgggtaa gagaatactg 240 tctgaacttc aaaatctgat cttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300 cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360 gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta acaggcaagt ggataacttt 420 ttaaacccta accaaaatcc agtcccactt gctattattg attccgtcaa cacattacag 480 cagttattcc 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ttgaacagtg caagggttaa ctattctgga ggagtcagtt caggtcttat tggagcaaca 1080 aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaacc gtgttaccac cgttaagcac accattcgta 1140 aggagttggt tagactcagg gacagataga gaaggagtcg caacatcaac gaattggcag 1200 actgagtctt tccaaacaac tctttcactt aggtgtggag cttttagcgc tagggggaac 1260 agcaactatt ttcctgacta ctttataaga aacatatcag gtgtcccatt ggttattagg 1320 aacgaggatt taacaaggcc tctacattac aaccagataa gaaatattga gtcaccgtct 1380 ggtactccag gtggtgctag ggcttattta gtgagcgtgc ataataggaa gaataacatt 1440 tacgctgcaa acgaatatgg aactatgata catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500 accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560 aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620 acccttcgtg gaaatggaaa ttcttataat ttgtatttga gagcttcttc tattggaaat 1680 tctactatta gagttactat taatggaaga gcttatactg tttctaatgt taatactact 1740 actaataatg atggagttaa tgataatgga gctagatttt ctgatattaa tattggaaat 1800 attgttgctt ctgataatac taatgttact ttggatatta atgttacttt gaattctgga 1860 actccttttg atttgatgaa tattatgttt gttcctacta atttgcctcc tttgtatcct 1920 ggataagaat tcaagcttga gctc 1944 <210> 4 <211> 1944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 201D3 <400> 4 tctagaccat ggggatccat gaataatgtt ttaaactctg gtcgtaacat tacatgtcat 60 gcacataacg tagtagcaca tgatccattc tctttcgaac ataaatcttt aaacacaatt 120 gaaaaagaat ggaaagaatg gaaacgtaca gatcattctt tatacgtagc accaattgta 180 ggtacagtag gttctttctt attaaaaaaa gtaggttctt tagtaggtaa acgtatttta 240 tctgaattac aaaacttaat tttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300 cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360 gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta accgtcaagt agataacttt 420 ttaaacccta accaaaatcc agtaccactt gctattattg attctgtaaa cacattacaa 480 caattattcc tttcacgttt acctcaattc caaatccaag gttatcaatt actactatta 540 ccactattcg ctcaagcagc taacttacac ttaagtttta tccgtgatgt tattttaaat 600 gcagacgaat ggggtatttc agcagcaact gtacgtactt atcgtgatca tctacgtaac 660 tttacacgtg attactctaa ctactgtatt aacacatatc aaacagcttt tcgtggctta 720 aacactcgtc ttcacgatat gcttgagttt cgtacataca tgtttttaaa cgttttcgag 780 tatgttagta tttggtcact atttaagtat caatctctta tggtatcttc tggagcaaac 840 ctatacgcat ctggttcagg cccacaacaa acacaatctt ttacagcaca aaactggcca 900 tttttatatt cattatttca agtaaactct aattacattt tatcaggtat tagcggtaca 960 cgtctttcta ttacattccc aaatattgga ggattaccag gttcaacaac aactcattca 1020 ttaaacagtg cacgtgttaa ctattctggc ggagtaagtt caggtcttat tggcgcaaca 1080 aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaaca gtattaccac cattaagcac accattcgta 1140 cgtagttggt tagactcagg tacagatcgt gaaggagtag caacatcaac gaattggcaa 1200 actgagtctt tccaaacaac tctttcactt cgttgtggag catttagcgc tcgtggtaac 1260 agcaactatt ttcctgacta ctttattcgt aacatttcag gtgtaccatt agttattcgt 1320 aacgaggatt taacacgtcc actacattac aaccaaattc gtaatattga gtcaccatct 1380 ggtactccag gtggtgctcg tgcttattta gtaagcgtac ataatcgtaa gaataacatt 1440 tacgcagcaa acgaatatgg aactatgata catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500 accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560 aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620 acccttcgtg gtaacggtaa ctcttacaac ttatacttac gtgcatcttc tattggtaac 1680 tctacaattc gtgtaacaat taacggtcgt gcatacacag tatctaacgt aaacacaaca 1740 acaaacaacg atggtgtaaa cgataacggt gcacgtttct ctgatattaa cattggtaac 1800 attgtagcat ctgataacac aaacgtaaca ttagatatta acgtaacatt aaactctggt 1860 acaccattcg atttaatgaa cattatgttc gtaccaacaa acttaccacc attataccca 1920 ggttaagaat tcaagcttga gctc 1944 <210> 5 <211> 1944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 201D4 <400> 5 tctagaccat ggggatccat gaataatgtt ctgaacagcg gccgcaacat cacgtgccat 60 gcccataacg tcgtcgccca tgacccgttt agctttgaac ataaaagcct gaacacgatc 120 gaaaaagaat ggaaagaatg gaaacgcacg gaccatagcc tgtatgtcgc cccgatcgtc 180 ggcacggtcg gcagctttct gctgaaaaaa gtcggcagcc tggtcggcaa acgcatcctg 240 agcgaacttc aaaatctgat cttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300 cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360 gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta acaggcaagt ggataacttt 420 ttaaacccta accaaaatcc ggtcccgctt gctattattg attccgtcaa cacattacag 480 cagttattcc tttcacgcct gcctcaattc caaatccagg ggtatcaact cctgctgttg 540 ccgctgttcg ctcaagccgc taacttgcac ctgagcttta tcagagatgt tattttgaat 600 gcagacgaat gggggatttc agccgcaacg gtgagaacgt atagagatca tctgcgcaac 660 tttacaagag attactctaa ctactgtatt aacacatatc aaacagcttt tagaggcttg 720 aacacgaggc ttcacgatat gcttgagttt aggacataca tgtttttgaa cgttttcgag 780 tatgttagca tttggtcact gtttaagtat caatccctta tggtatcctc tggagcaaac 840 ctgtacgcct ccggttcagg cccgcaacaa acccaatcct ttacagcaca gaactggccg 900 tttttgtatt cattgtttca agtgaactct aattacattc tctcaggtat tagcggtaca 960 agactttcta ttacattccc gaatatcgga ggactcccgg gttcaacaac aacgcattca 1020 ttgaacagcg caagggttaa ctattctggc ggagtcagct caggtcttat tggcgcaaca 1080 aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaacc gtgttaccgc cgttaagcac accgttcgta 1140 aggagctggt tagactcagg gacagataga gaaggagtcg caacatcaac gaattggcag 1200 acggagtctt tccaaacaac gctttcactt aggtgtggag cctttagcgc tagggggaac 1260 agcaactatt ttcctgacta ctttatcaga aacatctcag gtgtcccgtt ggttattagg 1320 aacgaggatt taacaaggcc gctgcattac aaccagatca gaaatattga gtcaccgtcc 1380 ggtacgccgg gtggtgctag ggcttattta gtgagcgtgc ataataggaa gaataacatt 1440 tacgccgcaa acgaatatgg aactatgata catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500 accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560 aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620 acccttcgtg gcaacggcaa cagctataac ctgtatctgc gcgccagcag catcggcaac 1680 agcacgatcc gcgtcacgat caacggccgc gcctatacgg tcagcaacgt caacacgacg 1740 acgaacaacg acggcgtcaa cgacaacggc gcccgcttta gcgacatcaa catcggcaac 1800 atcgtcgcca gcgacaacac gaacgtcacg ctggacatca acgtcacgct gaacagcggc 1860 acgccgtttg acctgatgaa catcatgttt gtcccgacga acctgccgcc gctgtatccg 1920 ggctaagaat tcaagcttga gctc 1944 <210> 6 <211> 1944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 201D5 <400> 6 tctagaccat ggggatccat gaataatgtt ctgaactctg gtcgtaacat cacttgtcac 60 gctcacaacg tagtagctca cgatccgttc tctttcgaac acaaatctct gaacactatc 120 gaaaaagaat ggaaagaatg gaaacgtact gatcactctc tgtacgtagc tccgatcgta 180 ggtactgtag gttctttcct gctgaaaaaa gtaggttctc tggtaggtaa acgtatcctg 240 tctgaactgc aaaatctgat cttcccatct ggtagtattg acctgatgca ggaaatactt 300 cgtgctactg agcaattcat taaccaacgt ttgaatgctg atacacttgg tagggtaaat 360 gccgaactcg ctggattgca ggccaatgtt gctgagttta accgtcaagt ggataacttt 420 ttaaacccta accaaaatcc ggtaccgctt gctattattg attctgtaaa cacattacag 480 cagttattcc tttcacgtct gcctcaattc caaatccagg gttatcaact cctgctgttg 540 ccgctgttcg ctcaagccgc taacttgcac ctgagtttta tcagagatgt tattttgaat 600 gcagacgaat ggggtatttc agccgcaact gtgagaactt atagagatca tctgcgtaac 660 tttacaagag attactctaa ctactgtatt aacacatatc aaacagcttt tagaggcttg 720 aacactcgtc ttcacgatat gcttgagttt cgtacataca tgtttttgaa cgttttcgag 780 tatgttagta tttggtcact gtttaagtat caatctctta tggtatcttc tggagcaaac 840 ctgtacgcct ctggttcagg cccccaacaa acccaatctt ttacagcaca gaactggccg 900 tttttgtatt cattgtttca agtgaactct aattacattc tctcaggtat tagcggtaca 960 agactttcta ttacattccc caatatcgga ggactcccgg gttcaacaac aactcattca 1020 ttgaacagtg cacgtgttaa ctattctggc ggagtaagtt caggtcttat tggcgcaaca 1080 aatcttaatc acaatttcaa ctgttcaacc gtgttaccgc cgttaagcac accgttcgta 1140 cgtagttggt tagactcagg tacagataga gaaggagtag caacatcaac taattggcag 1200 actgagtctt tccaaacaac tctttcactt cgttgtggag cctttagcgc tcgtggtaac 1260 agcaactatt ttcctgacta ctttatcaga aacatctcag gtgtaccgtt ggttattcgt 1320 aacgaggatt taacacgtcc cctgcattac aaccagatca gaaatattga gtcaccgtct 1380 ggtactccgg gtggtgctcg tgcttattta gtgagcgtgc ataatcgtaa gaataacatt 1440 tacgccgcaa acgaatatgg aactatgatc catcttgctc cggaggatta taccgggttt 1500 accattagtc caatccacgc aacacaagtg aataatcaga caaggacttt tatatctgaa 1560 aaattcggca atcaaggaga ttctcttagg tttgagcaat ctaacacgac cgctcgttac 1620 acccttcgtg gtaacggtaa ctcttacaac ctgtacctgc gtgcttcttc tatcggtaac 1680 tctactatcc gtgtaactat caacggtcgt gcttacactg tatctaacgt aaacactact 1740 actaacaacg atggtgtaaa cgataacggt gctcgtttct ctgatatcaa catcggtaac 1800 atcgtagctt ctgataacac taacgtaact ctggatatca acgtaactct gaactctggt 1860 actccgttcg atctgatgaa catcatgttc gtaccgacta acctgccgcc gctgtacccg 1920 ggttaagaat tcaagcttga gctc 1944 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> is a forward primer sequence for amplification of 201D1 DNA sequence (SEQ ID NO: 2) <400> 7 ctccaatcgt ggggactgtg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> is a reverse primer sequence for amplification of 201D1 DNA sequence (SEQ ID NO: 2) <400> 8 cccgatagat gaagcacgga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> is a forward primer sequence for amplification for nptii dna gene <400> 9 acgaggaagc ggtcagccca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> is a reverse primer sequence for amplification for nptII DNA gene <400> 10 ttgcacgcag gttctccggc 20

Claims (24)

  1. 서열 ID 번호 1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 부호화하는 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 (a) 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열; (b) 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631에서 서열 ID 번호 2 에 명시된 바와 같이 뉴클레오티드 서열의 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) (a)와 (b)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹에서 선택되는, 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열.
  2. (a) 서열 ID 번호 2에 명시된 뉴클레오티드 서열; (b) 뉴클레오티드 위치 262 내지 402 및/또는 1471 내지 1631에서 서열 ID 번호 2에 명시된 바와 같이 뉴클레오티드 서열의 최소 10개의 뉴클레오티드에 특정으로 잡종화하는 뉴클레오티드 서열; 및 (c) (a)와 (b)의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹에서 선택된 식물 내 발현을 위한 코돈 최적화 서열을 포함하는 핵산 분자.
  3. 제1 또는 2항에 있어서, 서열 ID 번호 2에 명시된 상기 뉴클레오티드 서열에 특정으로 잡종화하는 상기 뉴클레오티드 서열은, 서열 ID 번호 3, 서열 ID 번호 4, 서열 ID 번호 5 및 서열 ID 번호 6로 구성된 그룹에서 선택되는, 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열.
  4. 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 DNA에 있어서, 상기 뉴클레오티드 서열은 이종 조절 인자와 작동 가능하도록 연결된, 재조합 DNA.
  5. 제4항에 있어서, 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은, 선택가능한 표지 유전자, 보고 유전자 또는 그 조합을 선택적으로 포함하는, 재조합 DNA.
  6. 제4항에 있어서, 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열은, 액포, 미토콘드리아, 엽록체, 색소체에 대한 표적화를 위한 또는 분비를 위한, 표적화 또는 전이 펩티드를 부호화하는 DNA 서열을 선택적으로 포함하는, 재조합 DNA.
  7. DNA 구조체에 있어서,
    상기 DNA 구조체는 5' 비-번역 서열을 포함하는 식물 내 살충성 단백질, 서열 ID 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 살충성 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 코딩 서열, 또는 그의 살충 부분, 및 3' 비-번역 영역의 발현을 위한 것이고,
    상기 5' 비-번역 서열은 식물 세포에서 기능하는 프로모터를 포함하고,
    상기 코딩 서열은 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열이며,
    상기 3' 비-번역 서열은 전사 종결 서열 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는, DNA 구조체.
  8. 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드 벡터.
  9. 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주 세포는 식물, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 효모 세포인, 숙주 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 아그로박테륨 또는 대장균인, 숙주 세포.
  12. 식물에 곤충 저항성을 부여하는 방법에 있어서,
    (a) 식물 세포에 제1항에 있어서의 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 단계로서, 상기 뉴클레오티드 서열은 (i) 상기 식물 세포에서 기능하는 프로모터 및 (ii) 터미네이터에 작동 가능하도록 연결되는, 삽입 단계;
    (b) (a)단계의 상기 식물 세포에서 형질 변환된 식물 세포를 획득하는 단계로서, 상기 형질 변환된 식물세포는 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 획득 단계; 그리고 및
    (c) (b)단계의 상기 형질 변환된 식물 세포에서 형질전환 식물을 생성하는 단계로서, 상기 형질전환 식물은 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 생성 단계
    를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서의 상기 방법을 통해 획득한 상기 형질전환 식물.
  14. 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 형질전환 식물.
  15. 제13 또는 14항에 있어서, 상기 식물이 쌀, 밀, 옥수수, 수수, 귀리, 기장, 콩과 식물, 목화, 토마토, 가지, 양배추, 콜리플라워, 브로콜리, 브라시카 종, 콩, 완두콩, 비둘기콩, 감자, 후추, 조롱박, 상추, 고구마 카놀라, 대두, 알팔파, 땅콩, 해바라기, 잇꽃, 담배, 사탕수수, 카사바, 커피, 파인애플, 시트러스, 코코아, 차, 바나나 및 멜론으로 구성된 그룹에서 선택되는, 형질전환 식물.
  16. 제13 또는 14항에 있어서의 상기 형질전환 식물에서 획득한 조직, 종자 또는 자손에 있어서,
    상기 종자 또는 자손이 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 조직, 종자 또는 자손.
  17. 제16항에 있어서의 상기 조직, 종자 또는 자손에서 유래된 생물학적 샘플에 있어서,
    상기 샘플은 검출 가능한 양의 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 생물학적 샘플.
  18. 제13 또는 14항에 있어서의 상기 형질전환 식물에서 유래된 상품 생성물에 있어서,
    상기 생성물은 검출 가능한 양의 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 상품 생성물.
  19. 서열 ID 번호 1에 명시된 아미노산 서열을 갖는 Cry2Ai 단백질을 부호화하는 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스를 포함하는 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 동일 해충에 대한 독성이 있으나 상기 살충성 단백질에서 다른 방식의 살충 작용을 나타내는 추가 살충제를 선택적으로 포함하는, 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 살충제는 바실러스 독소, 제노라브두스 독소, 포토라브두스 독소 및 상기 해충 내 하나 이상의 필수 유전자 억제에 특정 dsRNA로 구성되는 그룹에서 선택되는, 조성물.
  22. 농작물 내 곤충 침입을 방제하고 곤충 저항성 관리를 제공하는 방법에 있어서,
    상기 방법은 살충 유효량의 제19항에 있어서의 상기 조성물을 상기 농작물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 곤충 저항성 형질전환 식물 생산을 위한, 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열의 용도.
  24. 살충 조성물 생산을 위한, 제1항에 있어서의 상기 코돈 최적화 합성 뉴클레오티드 서열의 용도에 있어서, 상기 조성물이 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바실러스 튜링겐시스 세포를 포함하는, 용도.
KR1020227004985A 2019-07-30 2020-07-28 살충성 결정 단백질을 부호화하는 합성 뉴클레오티드 서열과 그 사용방법 KR20220037462A (ko)

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