KR20170051866A

KR20170051866A - 더덕 품종 구별을 위한 ssr 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170051866A
Application number: KR1020150153482A
Authority: KR
Inventors: 김호방; 김지현; 김재준; 김세림; 길진수; 엄유리; 이이
Original assignee: 주식회사 바이오메딕
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2015-11-03
Publication date: 2017-05-12
Also published as: KR101752658B1

Abstract

본 발명은 10개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종을 구별하기 위한 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종을 구별하기 위한 키트 및 상기 SSR 프라미어 세트를 이용하여 더덕 품종을 구별하기 위한 방법에 관한 것으로, 본 발명의 더덕 품종 구별용 특이 SSR 프라이머를 통하여 더덕 품종의 효율적인 식별이 가능할 뿐만 아니라, 더덕 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

Description

더덕 품종 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도{SSR molecular markers for discriminating of Codonopsis lanceolata cultivars and uses thereof}

본 발명은 더덕 품종 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 10개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종 구별용 SSR 프라이머 세트, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종 구별용 키트 및 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 더덕 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

더덕(Codonopsis lanceolata)은 도라지과(Companulaceae)에 속하는 다년생의 쌍자엽 식물이다. 더덕은 전통 약용 식물로서 매우 가치가 있으며 중국, 일본 및 한국 등의 동아시아에서 매우 인기있는 채소이다.

더덕 뿌리에는 사포닌, 페닐프로파노이드, 알카로이드, 트리테르펜 및 플라보노이드 등과 같은 물질들을 포함하고 있다는 많은 연구가 보고되었다. 게다가, 많은 연구들이 더덕의 성분들이 면역 시스템에 영향을 주거나 종양 성장 억제(Sathiyamoorthy et al., 2011, Mol. Biol. Rep. 38:3541-3549) 등의 의학적 효능이 있음을 보고하였다. 이치카와 등(Ichikawa et al., 2009, J. Nat. Med. 63:52-57)은 더덕에는 7가지 종류의 사포닌이 있음을 보고하였다. 그래서, 재배되는 더덕 내의 화학물질의 조성 및 구성요소에 두드러진 다양성이 있을 것으로 추측되어졌다.

몇몇의 DNA 마커들이 더덕 내 유전적 거리 또는 유전적 관계를 분석하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 두 등(2002, J. Medicinal. Crop. Sci. 10:194-199)은 백두산 및 여러 한국 지역으로부터 채취한 더덕의 유전적 관계를 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)를 사용하여 연구하였다. 이 등(2001, Korean J. Medicinal Crop Sci. 9:205-210) 또한 RAPD 방법을 사용하여 잔대(Adenophora triphylla)와 더덕의 식별 및 유전적 관계를 보고하였다. 구 등(2006, Plant Cell. Rep. 25:896-906)은 ISSR (inter-simple sequence repeat)과 RAPD 방법의 성공적인 개발 및 이를 더덕에 적용한 결과를 보고하였다. 그러나, RAPD 방법은 유전적 거리 연구에는 충분하지 못하여 추가적인 DNA 마커의 개발이 여전히 필요하다.

SSR (simple sequence repeat) 마커는 유전적 관계의 분석을 위한 매우 효과적인 수단이다. 게다가, 게놈(genome) 도처에 그것의 일정한 분포와 개체간 높은 다형성으로 인해 비표준(non-reference) 식물체 게놈 연구에 유용한 도구이다. 그래서, 비표준 식물체 게놈에서 계통학적 분석 또는 유전적 다양성을 위해 SSR 마커를 작물에 적용한 많은 연구들이 보고되었다. 이 등(2013, Conservation Genet. Resour. 5:393-395)은 당삼(Codonopsis tangshen) 및 만삼(Codonopsis pilosula)을 위한 SSR 마커를 확인하였고, 이러한 발견을 사삼 속(Codonopsis genera)의 이 두 구성원들의 유전적 다양성 및 집단 구조를 조사하는데 성공적으로 활용하였다. 그러나, 아직까지 한국의 가장 중요한 약용 식물인 더덕에서는 SSR 마커 개발에 관한 연구가 없었다.

본 발명에서는, 더덕의 게놈 서열을 기반으로 10개의 신규한 SSR 마커를 개발하였고, 이러한 마커들을 이용하여 한국 내 10개 지역으로부터 채집한 53개의 재배중인 더덕의 발생적 관계를 성공적으로 분석하였다.

한편, 한국공개특허 제2014-0106892호에는 'SSR 마커를 이용한 마 유전자원 식별 방법'이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제0842434호에는 '인삼에서 유래된 SSR 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 더덕 품종 구별을 위한 SSR 분자마커 및 이의 용도와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 더덕의 부분 게놈 서열로부터 10개의 SSR 마커를 발굴하고, 상기 SSR 마커를 이용하여 수집한 53개 더덕 자원간의 유전적 다양성을 분석하여, 더덕 품종을 효과적으로 구별할 수 있는 SSR 프라이머를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 10개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종을 구별하기 위한 SSR 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종을 구별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 SSR 프라이머 세트를 이용하여 더덕 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 더덕 품종 구별을 위한 SSR 프라이머를 통하여 더덕 품종의 효율적인 판별이 가능할 뿐만 아니라, 더덕 분자육종 연구 등에 유용한 정보를 제공할 수 있을 것이다.

도 1은 53개 더덕 유전자원에 대한 UPGMA (unweighted pair group method with arithmetic average) 계통수를 보여주는 그림이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 10개의 SSR (simple sequence repeat) 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종 구별용 SSR 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 SSR 프라이머 세트는 구체적으로 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 SSR 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 10개의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 가장 바람직하게는 10개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트를 모두 포함할 수 있다.

상기 10개의 SSR 프라이머 세트를 동시에 이용하면 더덕 품종을 더욱 효율적으로 판별할 수 있다.

상기 SSR 프라이머는 각 SSR 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 및 서열번호 19 및 20 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 SSR 프라이머(20개 올리고 뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 SSR 프라이머는 서열번호 1 및 2; 서열번호 3 및 4; 서열번호 5 및 6; 서열번호 7 및 8; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 12; 서열번호 13 및 14; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 18; 및 서열번호 19 및 20의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고 뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 더덕 품종 구별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

더덕 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 더덕 품종을 구별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 더덕 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega, 미국)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 SSR 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 6-FAM (6-Carboxyfluorescein), NED, VIC, PET 또는 ROX이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 6-FAM, NED, VIC, PET 또는 ROX를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한 상기 표지 물질에는 Cy-5 또는 Cy-3가 포함될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 SSR 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.

본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 아가로스 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Genetic Analyzer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 형광염료를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

더덕 자원의 수집 및 DNA 추출

53개 더덕 자원은 신선한 뿌리 또는 종자의 형태로 국내 종자회사 또는 농가에서 수집하였다. 수집된 더덕 자원은 하기 표 1에 정리하였다. 수집된 뿌리 또는 종자는 2015년 봄에 충북대학교 온실 포장에서 재배하였다. 게놈 DNA 추출을 위해 잎 조직을 액체질소로 마쇄한 후 DNA 추출 때까지 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다. 게놈 DNA는 Doyle과 Doyle (Phytochemistry Bulletin, 1987, 19:11-15)의 방법에 따라 추출하였다.

본 발명에 이용된 53개 더덕 자원 정보

번호	수납번호	형태	수집 장소	번호	수납번호	형태	수집장소
1	CL0001	뿌리	삼척시, 강원도	28	CL0028	뿌리	용인시, 경기도 (1)
2	CL0002	종자	원주시, 강원도	29	CL0029	종자	용인시, 경기도 (2)
3	CL0003	종자	철원군, 강원도	30	CL0030	종자	용인시, 경기도 (3)
4	CL0004	뿌리	춘천시, 강원도	31	CL0031	종자	용인시, 경기도 (4)
5	CL0005	뿌리	평창군, 강원도	32	CL0032	종자	용인시, 경기도 (5)
6	CL0006	뿌리	백두산, 평창군, 강원도	33	CL0033	뿌리	지리산, 산청군, 경상남도(1)
7	CL0007	뿌리	매봉산, 홍천군, 강원도	34	CL0034	종자	지리산, 산청군, 경상남도(2)
8	CL0008	뿌리	홍전군, 강원도	35	CL0035	종자	봉화군, 경상북도
9	CL0009	뿌리	홍전군, 강원도 (1)	36	CL0036	뿌리	울릉군, 경상북도
10	CL0010	뿌리	홍전군, 강원도 (2)	37	CL0037	뿌리	영주시, 경상북도
11	CL0011	뿌리	홍전군, 강원도 (3)	38	CL0038	종자	대전시 중구 (1)
12	CL0012	뿌리	홍전군, 강원도 (4)	39	CL0039	종자	대전시 중구 (2)
13	CL0013	뿌리	홍전군, 강원도 (5)	40	CL0040	종자	서울시 송파구
14	CL0014	뿌리	홍전군, 강원도 (6)	41	CL0041	종자	서울시 종로구
15	CL0015	종자	홍전군, 강원도 (7)	42	CL0042	뿌리	광양시, 전라남도
16	CL0016	종자	홍전군, 강원도 (8)	43	CL0043	뿌리	지리산, 구례군, 전라남도
17	CL0017	종자	홍전군, 강원도 (9)	44	CL0044	뿌리	신암군, 전라남도
18	CL0018	종자	홍전군, 강원도 (10)	45	CL0045	뿌리	화순군, 전라남도
19	CL0019	종자	홍전군, 강원도 (11)	46	CL0046	뿌리	무주군, 전라북도 (1)
20	CL0020	종자	홍전군, 강원도 (12)	47	CL0047	뿌리	무주군, 전라북도 (2)
21	CL0021	종자	홍전군, 강원도 (13)	48	CL0048	뿌리	서귀포시, 제주도
22	CL0022	종자	홍전군, 강원도 (14)	49	CL0049	뿌리	제주시, 제주도 (1)
23	CL0023	종자	홍전군, 강원도 (15)	50	CL0050	뿌리	제주시, 제주도 (2)
24	CL0024	종자	홍전군, 강원도 (16)	51	CL0051	종자	제주시, 제주도 (3)
25	CL0025	종자	남양주시, 경기도	52	CL0052	뿌리	단양군, 충청북도
26	CL0026	종자	부천시, 경기도	53	CL0053	뿌리	청주시, 충청북도
27	CL0027	뿌리	양평군, 경기도

더덕 SSR (simple sequence repeat) 마커의 발굴

미소부수체(microsatellite) 농축 라이브러리는 Glenn과 Schable의 방법(Methods in Enzymology, 2005, 395:202-222)에 따라 제작하였다. 간략히 서술하면, 더덕의 게놈 DNA를 제한효소 Rsa I으로 절단하여 대략 300~1,000개 염기쌍에 해당하는 DNA 절편들을 얻고, 이들 절편을 링커와 연결반응을 수행하였다. 연결반응 산물은 3′말단이 비오틴으로 표지된 미소부수체 탐침과의 혼성화를 통한 중복 농축 단계에 사용하였다. 미소부수체 서열이 풍부한 DNA 절편은 pGEM-T 벡터(Promega, 미국)와의 연결반응에 사용하였으며, 연결반응 산물을 대장균 DH5α 균주의 형질전환에 사용하였다. 형성된 콜로니로부터 재조합 클론을 확인하기 위하여 M13 정방향 및 역방향 프라이머 세트(M13F(-20), 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3': 서열번호 21, M13R, 5'-GAAACAGCTATGACCATG-3': 서열번호 22)를 이용하여 콜로니 PCR을 수행하였다. 증폭산물을 정제하여 ABI3730 DNA 서열 분석기(Applied Biosystems, 미국)를 이용한 염기서열 분석에 사용하였다. 벡터와 링커 서열을 제거한 후, Lasergene SeqMan 소프트웨어(버전 7.0.0; DNASTAR, 미국)를 이용하여 염기서열을 조립하고 중복이 제거된 콘티그를 확보하였다. 2개에서 6개 뉴클레오티드에 대해서는 최소 3회 반복, 복합 형태에 대해서는 100개 염기쌍 이내의 간격을 갖는 경우를 기준으로 MISA 소프트웨어(http://www.pgrc.ipk-gastersleben.de/misa)를 사용하여 잠정적인 SSR 마커들을 확보하였다. PCR 프라이머 디자인을 위해 증폭 크기는 85~350 염기쌍, 프라이머 결합 온도는 57-60℃를 기준으로 하였다. 본 실험에 사용된 프라이머는 (주)바이오메딕에서 합성하여 사용하였다. 프라이머의 특이성 여부는 게놈 DNA를 주형으로 사용한 통상적인 PCR 증폭 반응을 통해 검정하였다. 다형성 마커의 일차 선발은 10개의 더덕 자원에서 추출한 더덕 게놈 DNA를 동량 혼합하여 주형으로 사용한 PCR을 통해 수행하였다. PCR 증폭 산물은 2% 아가로스 겔에서 전기영동하였다.

PCR 증폭 및 유전자형 결정

PCR 반응은 20 ng 게놈 DNA, 1 x HS^TM Taq DNA 중합효소 완충액, 1.5 mM MgCl₂, 각각 0.2 mM dNTP, 각각 0.2 μM의 프라이머, 1.25 unit HS^TM Taq DNA 중합효소를 포함하는 20 ㎕의 반응부피에 Biometra Thermalcycler (Goettingen, 독일)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭을 위한 조건은 다음과 같다: 초기 열변성(1회)-95℃ 5분, DNA 증폭(총 34회 반복)-94℃ 30초, 57-60℃ 30초, 72℃ 30초, 최종 신장 반응(1회)-72℃ 30분. PCR 증폭산물은 증폭여부를 확인하기 위하여 2% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 본 실험에 사용한 더덕 SSR 증폭용 PCR 프라이머 세트는 표 2에 정리하였다. 정방향 프라이머의 5′말단은 형광염료인 6-FAM, NED, VIC 또는 PET (Applied Biosystems, 미국)으로 표지하였다. PCR 증폭 후, 0.2 ㎕의 PCR 증폭산물을 9.8 ㎕의 Hi-Di formamide 및 0.2 ㎕의 GeneScan^TM 500 LIZ^® 사이즈 스탠다드(Applied Biosystems, 미국)와 혼합하였다. 혼합물은 95℃에서 5분간 변성시킨 후 얼음에 방치하였다. 증폭된 DNA 절편은 50 cm 모세관이 장착된 ABI3730 DNA 서열 분석기 상에서 모세관 전기영동을 통해 DNA 절편들을 분리하였다.

더덕 SSR 마커 증폭을 위한 프라이머 세트 정보

프라이머명	신장 온도(℃)	대립인자 크기 범위 (bp)	서열정보 (5'→3') (서열번호)
CLSSR-1-F	58	136-166	FAM-GACACAGCATTATCCACGAA (1)
CLSSR-1-R			GTTTAATTATGCGTTTTGGCTGTC (2)
CLSSR-2-F	59	186-215	PET-CACCACTCAATCATGCAAGC (3)
CLSSR-2-R			GTTTGACGCAGRRGCAGAAAAGAA (4)
CLSSR-4-F	61	231-261	FAM-AGGTGGAAACGGTGTCTTTG (5)
CLSSR-4-R			GTTTGTCCACAGATGCCATTCGTA (6)
CLSSR-5-F	59	146-194	FAM-GAGAACAATTATTTAAGAACGGATG (7)
CLSSR-5-R			GTTTGTCAGGCCCGRAAAAATGAA (8)
CLSSR-6-F	59	143-161	PET-TGGACTGTAGATGCCCTGCT (9)
CLSSR-6-R			GTTTTTAAGCCCAAGGTGTTCGTT (10)
CLSSR-7-F	59	128-131	VIC-TAGTTTGGTGGGTAGGTGGA (11)
CLSSR-7-R			GTTTTGCACTTCCCAAGAAGAAAC (12)
CLSSR-9-F	58	161-165	VIC-GCAGAAGTGAGTATGCAAGTAG (13)
CLSSR-9-R			GTTTGATCATATCTATTGGCATGCA (14)
CLSSR-10-F	58	108-126	FAM-CATCCCTCCCTGAAAAATGT (15)
CLSSR-10-R			GTTTTGAAACTTTATGGGCATCTTG (16)
CLSSR-11-F	58	104-112	NED-GTCCTTGCTCACAATTAGCC (17)
CLSSR-11-R			GTTTTGACAAAATGGTGATGCCTA (18)
CLSSR-12-F	58	122-130	PET-GGGACGCATTTTCGTAATC (19)
CLSSR-12-R			GTTTAGAAATGTTTGTTTATGGGGTG (20)

유전적 다양성에 대한 데이터 분석

존재/비존재(1/0)를 토대로 DNA 피크를 기록하여 분석을 위한 자료 생성에 사용하였다. 각 SSR 마커의 좌위와 변이체를 분석하였다. 유전좌위에 대한 다양성 수치는 유전 다양성 지수를 사용하여 계산하였다. 수치는 다음과 같이 계산하였다: h=1-∑p _i ², p _i 는 i번째 대립유전자의 빈도를 뜻함. 각 유전좌위에 대한 관찰된 이형접합도는 각 SSR 마커에 대해 산정하였다. 밀접하게 연관된 다양성의 척도인 다형성 정보 함유량(PIC, polymorphism information content)은 PowerMarker 소프트웨어(버전 3.25; http://statgen.ncsu.edu/powermarker)를 사용하여 산정하였다. 수집된 자원의 유전적 다양성을 분석하기 위한 통계적 계산은 NTSYS 소프트웨어(버전 2.1; http://www.exetersoftware.com)를 사용하여 수행하였다. UPGMA 계통수는 Jaccard 유전적 유사도를 이용하여 작성하였다. WINBOOT 소프트웨어를 사용하여 부트스트랩 분석을 수행하였다.

실시예 1. SSR 마커 발굴

더덕의 미소부수체 함유 게놈 콘티그 서열(226개)로부터 10개의 다형성 SSR 마커가 발굴되었고, 각각은 CLSSR (Codonopsis lanceolata Simple Sequence Repeat) 시리즈로 표기하였다(표 3). 2개 뉴클레오티드가 반복되는 CLSSR-2 마커를 제외한 대부분의 SSR 마커는 4개 뉴클레오티드가 반복되는 마커였다. 증폭된 밴드 크기는 104~261 염기쌍이었으며, 전기영동 결과, 단일 혹은 두 개의 밴드를 보여주었다. 이 결과로부터 우리는 더덕 유전자원 분석을 위한 게놈 DNA 기반의 신규한 SSR 마커를 확보하였다.

CLSSR 마커의 정보

마커명	SSR 모티프 정보
CLSSR-1	(CATC)3(CATA)7
CLSSR-2	(CT)8(ATCT)5
CLSSR-4	(CTGT)4
CLSSR-5	(TATG)5
CLSSR-6	(AGAA)7
CLSSR-7	(TATG)5
CLSSR-9	(CATA)7
CLSSR-10	(TTGT)6
CLSSR-11	(AAGA)7
CLSSR-12	(AAGA)7

실시예 2. SSR 마커의 다형성 및 유전적 다양성 분석

우리는 53개의 더덕 수집 자원으로부터 10개 SSR 마커를 사용하여 깨끗하게 증폭되는 밴드를 얻었다. 모든 시료의 다형성은 GeneScan^TM 500 LIZ^® 사이즈 스탠다드를 사용하여 분석하였고, 각 밴드 크기를 데이터화 하였다(표 4).

53개 더덕 유전자원에 대한 SSR 마커의 대립유전자 크기 데이터

	CLSSR-1	CLSSR-2	CLSSR-4	CLSSR-5	CLSSR-6	CLSSR-7	CLSSR-9	CLSSR-10	CLSSR-11	CLSSR-12
CL0001	150	196	231	201/376	148	128	161	114/127	104	124/132
CL0002	150	196/233	235/256	201/390	144/148	128/132	165/169	127	93/104	132/136
CL0003	150	211/219	235	201/376	148/152	128/132	165	118/122	104	128/136
CL0004	150	178	231	201/376	148/156	128/132	161/165	127	104/108	124
CL0005	150	196	231	201/376	148/160	128/132	161/165	124	104/112	132
CL0006	140/154	178	235	201/376	148	128	161	114/120	93/104	124
CL0007	140/154	190/211	235/256	201	128/132	161	127	100/104	124	124
CL0008	150	196	231	183/382	148	128/132	165/173	120	104/112	124/132
CL0009	150/154	178	235/261	201	148	128	161	127	93/108	124
CL0010	150	200/211	256	201/382	148	128/132	161/165	120/124	104	124/128
CL0011	130/154	178/211	235/256	201	140/152	132	161/165	-	93/104	124
CL0012	130	187/207	235	201/382	148/160	128	161/165	-	104	124
CL0013	-	187/239	247	201/376	146/156	128/132	165	-	104	124/136
CL0014	-	178	238/256	201/376	148	128	161/165	131	93/104	132
CL0015	130/154	215/227	238	201/376	148	128/132	165	124	104	124
CL0016	150	178	235	201/376	148	128/159	165	120/124	104	124/132
CL0017	150/154	187	238	201/376	148/156	130/132	161/165	127/131	108/112	124/128
CL0018	130	187	249	201/376	146/148	128/132	161	120	104	132
CL0019	130/150	207	235	201	146/148	130/132	161/165	124/127	104	124/132
CL0020	140/150	178/187	235	190	148/156	128/132	161/169	118	104	124
CL0021	150	178/200	238	201	148	132	165	124/127	104	124
CL0022	140/150	178	235	201/376	148	128	165	124	104	124
CL0023	150	219	247	201/382	148/152	128	161/165	127	104/108	124
CL0024	150/154	200/211	235	201/376	148/160	128/159	161/165	118	104	124
CL0025	130/154	183	235	201/382	148/160	128/130	161	118	93/104	124/128
CL0026	138/140	211/233	235	201	148	128	161	-	104	124
CL0027	150	250	261	201/376	148	132	165	127	104/112	124
CL0028	130/150	205/233	256	201/382	148/156	128/132	165	124	104/108	124/128
CL0029	150	178/196	256	201	148	128/132	161	120	104/108	124/132
CL0030	154/158	215	235	201	148	128/132	161/165	124/127	104/108	124/128
CL0031	150	211/223	235	183/376	146	128/132	161/165	127	100/112	124/128
CL0032	150	178	235/261	201/376	148	128/132	165	127	104/112	124
CL0033	-	190/239	261	201/376	148/160	128/130	173	127	104/108	128/132
CL0034	150	178	256/261	201/376	148/156	128	165	118	108	124/132
CL0035	148/154	190	235	201	146/156	128	165/173	124	104	124
CL0036	150	196	231	201	148/164	128/132	165	120/124	104	124
CL0037	150	196/211	256	201/376	148	128	165	120/122	104	124/128
CL0038	150	178	261	201/376	140/148	128	161	120/124	104	124
CL0039	140/150	205/211	235	201/382	148/160	128/132	161/165	-	104/112	132
CL0040	150/154	178/211	231/256	201	148/156	128	165	120	104/112	132/136
CL0041	130/054	178	256	201/376	148/160	128	165	-	104/112	124/132
CL0042	-	193/223	231	201/376	144/148	128/132	165	124/131	104	124/132
CL0043	-	190/211	235	201/382	148	128	165	124	108/120	124
CL0044	-	178/215	238/256	201/382	136/148	128/132	161/165	-	104/112	124
CL0045	-	178/187	256	201	146/148	128	165	120	104	124
CL0046	130/154	178/207	238/249	201	148/156	128/132	161/169	120/124	104/112	124/128
CL0047	130/140	211	247	201/376	148	128/132	165	124	104/108	124
CL0048	150	196	231	201	148	128	161/165	120/124	104	128/132
CL0049	144	178/233	235	201/382	144/148	128/132	161	-	104/108	124
CL0050	140/150	178/187	235	201/376	148/156	132	165/169	131	104	128/132
CL0051	150/154	211/215	235/261	201/382	148	128/132	161/165	120/124	104/108	124/132
CL0052	-	178	256	201/386	148/156	132	161/169	124	104	124/132
CL0053	130/154	200	235	201/382	148/160	128	161/165	127	104	124/128

확인된 10개 SSR 유전좌위는 다형성을 보였다. 73개의 고유한 대립 유전자가 53개 자원에서 감지되었는데, 대립유전자수는 각 유전좌위당 4 내지 17개였으며, 평균 대립유전자수는 7.3개였다. CLSSR-7, CLSSR-9, CLSSR-12는 4개 대립유전자를 구분하였으며, CLSSR-11은 6개 대립유전자를 구분하였다. CLSSR-2는 17개의 대립유전자를 보여주었다. 73개 대립 유전자 중에서 13개 대립유전자는 하나의 자원에서만 나타났다. 하나의 자원에서만 나타나는 13개 대립유전자 중에서 CLSSR-1과 CLSSR-2로는 각각 4개, CLSSR-5로는 3개, CLSSR-6, CLSSR-11로는 각각 1개의 대립유전자가 검출되었다. 전체 더덕 자원에 대해 조사된 유전좌위에 대한 유전적 다양성은 0.63(h)의 평균값을 보였으며, 최소값은 0.51(CLSSR-7), 최대값은 0.86(CLSSR-2)이었다. 평균 이형접합 빈도는 0.49 였으며, CLSSR-1, CLSSR-2, CLSSR-5, CLSSR-6, CLSSR-7, CLSSR-11 마커에 대해서는 0.5 이상의 값을 보였다(표 5).

평균 PIC 값은 0.59 였으며, CLSSR-2가 0.85의 가장 높은 PIC 값을 보였다. 4개의 마커는 0.5 이하의 PIC 값을 보였다. PIC 값은 다양성 정도를 반영하며, 0.5 이상의 수치를 보이면 충분한 정보를 제공하는 마커이다. 10개 SSR 마커 중에서 4개의 마커가 0.5 이하의 수치를 보였다 하더라도 확보된 마커는 수집된 더덕 자원의 유전 다양성을 분석하기에 충분하다고 판단된다.

개발된 더덕 SSR 마커의 대립인자 수, 유전적 다양성(h), 이형접합성(heterozygosity) 및 다형성 정보 함유량(PIC) 분석결과

마커명	대립인자 수	유전적 다양성	이형접합성	다형성 정보 함유량
CLSSR-1	8	0.65	0.51	0.61
CLSSR-2	17	0.86	0.51	0.85
CLSSR-4	7	0.76	0.21	0.73
CLSSR-5	7	0.57	0.70	0.52
CLSSR-6	9	0.55	0.60	0.53
CLSSR-7	4	0.52	0.57	0.43
CLSSR-9	4	0.56	0.45	0.48
CLSSR-10	7	0.77	0.36	0.74
CLSSR-11	6	0.51	0.53	0.48
CLSSR-12	4	0.55	0.49	0.50
평균	7.3	0.63	0.49	0.59

실시예 3. 수집 더덕 자원들간의 유전적 연관관계 분석

수집 자원의 유전적 거리가 분석되었으며, SSR 마커를 활용한 절편 분석 결과를 토대로 53개 더덕 유전자원에 대한 UPGMA 계통수가 작성되었다(도 1). 유전적 거리 값은 0.74-0.95 범위였으며, 현저한 집단화를 보이는 유전자원은 없었다.

지리산에 수집된 CL033 자원의 경우, 다른 자원들과 비교했을 때 비교적 먼 유전적 거리를 보여주었다. 지리산에서 수집된 또 다른 자원인 CL043은 강원도에서 수집된 CL001 및 CL004와 더 가까운 유연관계를 보였다. 아울러 계통 분석 결과는 강원도에서 수집된 CL001와 CL004가 각각 강원도와 경기도에서 수집된 CL017, CL031과 비교적 먼 유연관계를 보여주었다. 이상의 결과는 수집 지역간에 밀접한 유전적 연관관계가 없음을 보여준다. 경기도에서 수집된 CL027과 CL032 자원간 및 강원도에서 수집된 CL016과 CL022 자원간에는 본 연구에서 분석된 유전좌위에 대해서는 동일한 유전적 배경을 보여주었다.

높은 사포닌 함량 또는 강한 향을 가진 야생 더덕이 재배화 과정에서 전국적으로 퍼져나갔다고 여겨지고 있다. 소비자들이 작물의 기원 지역을 요구한다고 하더라도 본 연구결과는 생산지를 확인하기가 쉽지 않다는 것을 제시한다. 병저항성 품종이나 기능성 물질 함량이 높은 품종을 얻을 수 있는 기회가 높기 때문에 유전적 유연관계가 먼 유전자원을 수집하고 보존하는 것이 중요하다.

최근, 유전체 서열 분석 기술의 발달은 서열 정보의 고속대용량 확보를 가능하게 하고 있다. 가오 등(Gao et al., 2015, Plos ONE. 10:e0117342)은 차세대 유전체 서열 분석 기법을 사용하여 만삼(Codonopsis pilosula)에 대한 전사체 분석 결과를 보고하였으며, 사삼 속의 다당류 생합성 경로를 제시하였다. 이러한 보고는 표준 유전체 서열정보가 없는 작물에서 게놈 SSR, EST-SSR 또는 단일염기 다형성(SNP, single nucleotide polymorphism) 마커의 대량 발굴이 가능함을 제시하고 있다. 향후 이들 분자마커는 야생형뿐만 아니라 더덕 품종들의 유전체 및 유전학을 연구하는데 도움이 될 것으로 전망된다.

<110> Biomedic Co.,LTD <120> SSR molecular markers for discriminating of Codonopsis lanceolata cultivars and uses thereof <130> PN15332 <160> 22 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gacacagcat tatccacgaa 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtttaattat gcgttttggc tgtc 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caccactcaa tcatgcaagc 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtttgacgca grrgcagaaa agaa 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aggtggaaac ggtgtctttg 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtttgtccac agatgccatt cgta 24 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gagaacaatt atttaagaac ggatg 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gtttgtcagg cccgraaaaa tgaa 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tggactgtag atgccctgct 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtttttaagc ccaaggtgtt cgtt 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tagtttggtg ggtaggtgga 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gttttgcact tcccaagaag aaac 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gcagaagtga gtatgcaagt ag 22 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gtttgatcat atctattggc atgca 25 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 catccctccc tgaaaaatgt 20 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gttttgaaac tttatgggca tcttg 25 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtccttgctc acaattagcc 20 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gttttgacaa aatggtgatg ccta 24 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gggacgcatt ttcgtaatc 19 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gtttagaaat gtttgtttat ggggtg 26 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gaaacagcta tgaccatg 18

Claims

서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종을 구별하기 위한 SSR 프라이머 세트.
제1항에 있어서,
서열번호 1 및 2의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 SSR 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 SSR 프라이머 세트; 및 서열번호 19 및 20의 SSR 프라이머 세트를 포함하는 더덕 품종을 구별하기 위한 SSR 프라이머 세트.
제1항 또는 제2항에 따른 SSR 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 더덕 품종을 구별하기 위한 키트.
제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
더덕에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 SSR 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 더덕 품종을 구별하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.