CN110628881A - 检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法 - Google Patents

检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法 Download PDF

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卜令斌
张瑞
刘秀财
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Abstract

本发明公开了一种检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法，根据叶酸多态性位点相关基因进行设计的PCR扩增引物从而得到引物组合物，以及质谱延伸引物；通过现有DNA提取试剂盒，提取待测样本DNA；使用引物组合物通过PCR扩增反应体系，获得靶序列扩增引物；通过SAP酶反应体系处理，除去靶序列扩增引物中含有的未反应的dNTP；使用质谱延伸引物通过延伸反应体系，在延伸引物的3’端连接一个碱基，纯化后，从而得到延伸产物；将纯化后的延伸产物在质谱仪上进行质谱检测；所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。

Description

检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试 剂盒使用方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及多重PCR扩增技术和基质辅助激光解析电离时间飞行质谱技术(MALDI-TOF-MS)；且更具体而言，本发明涉及一种检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法。
背景技术
叶酸属B族维生素，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。大量研究证实，叶酸缺乏是导致出生缺陷的主要原因。正常的叶酸除可预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产、胎儿宫内发育迟缓、早产、新生儿低出生体重等疾病的发病率。
研究发现，叶酸利用能力受遗传基因影响。如果与叶酸代谢相关的基因发生变异，它们所产生的酶活性就会下降。这些人即使按照常规剂量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平仍然会不足。遗传体质的差异决定了机体对叶酸的吸收和利用能力。因此，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。
有一种情况是，许多孕妇是在无意中怀孕的，增补叶酸的时间往往滞后至少2－3个月，错过了补充叶酸的关键时期。在发达国家，新婚期即开始了叶酸的增补。因此，想在近期生育的女性，应该尽早进行叶酸代谢的基因检测，然后确定叶酸的补充方法。
男性增补叶酸对优生有着同等重要的意义。叶酸摄入不足，男性机体叶酸水平偏低，主要会导致两方面的不良后果：一是精子密度低、活性下降、勃起功能减弱；二是精液中携带的染色体数量异常(过多或过少，即精子中出现“非整倍体”)，引起唐氏综合症或流产。
综上所述，通过最先进的科学手段检测每对新婚夫妇对叶酸的利用能力，不仅可以实现个性化增补叶酸，还可以增强新婚夫妇增补叶酸的意识和依从性，从而更有效地降低新生儿出生缺陷风险。
叶酸代谢密切相关的基因是有2个，即MTHFR和MTRR。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因变异引起相应的酶活性降低可使同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸减少，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症。
1.MTHFR基因
MTHFR基因位于一号染色体lp36.3，全长19.3kb，mRNA全长7105bp，有12个外显子，编码含657个氨基酸的蛋白。
亚甲基四氢叶酸还原酶催化5,10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基甲硫氨酸。该酶是人体叶酸代谢中的一个十分重要的酶。
rs1801131是MTHFR基因第八个外显子上第1298(1337)核苷酸的一个A/C多态，引起MTHFR基因编码的蛋白质第429个氨基酸由Glu变为Ala。在世界人群中的该多态的频率分布，A占77％，C占23％。中国人群中的分布A占81％，C为19％。
rs1801131位点的多态性是影响该酶的活性的一个重要因素。携带MTHFR 1298C等基因的酶活性为野生型的68％左右，因而阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加。
rs1801133是位于MTHFR基因第五个外显子677位上的一个C/T多态，引起MTHFR基因编码的蛋白质第222个氨基酸由Ala(A)变为Val(V)。在世界人群中的该多态的频率分布，A占78％，T占22％。中国人群中的分布A占67％，C为34％。MTHFR 677位点的多态性是影响该酶活性的一个重要因素，导致酶活性和热稳定性下降。若以个体携带677CC基因型时其MTHFR活性为100％，携带CT基因型的活性则为CC的71％，基因型为TT型的只有34％。
2.MTRR基因
MTRR基因位于5p15.3-p15.2，全长32021kb，mRNA全长3274bp，共有15个外显子，编码具有726个氨基酸的蛋白质。
甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必须氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR编码)催化的，而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素B12被氧化而最终失活。MTRR编码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。
MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因。主要突变型有122M(A66G)、S175L、其它一些片段插入缺失和点突变。其中A66G是最主要和研究最多的突变。
MTRR突变是造成叶酸/甲基维生素缺乏症的主要病因，也是同型半胱氨酸、叶酸代谢异常的主要原因之一。而同型半胱氨酸、叶酸代谢与许多疾病(Down综合症-先天愚型、神经管疾病、心血管疾病等)相关，因此MTRR突变被认为是这些疾病的高风险因素。
rs1801394是位于5p15.3-p15.2之间的MTRR基因第2个外显子处的一个A/G多态，引起MTRR基因编码的蛋白第22个氨基酸由Ile变为Met(Ile22Met)。在dbSNP数据库中，世界人群中的该多态的频率分布为，A占57.4％，G占42.6％左右。在中国人群中该多态的频率分布为：A占76％，G占24％左右。
rs1801394位点是MTRR上的主要突变，引起甲基维生素缺乏症，并经常用来研究与脊柱裂、Down综合症、神经管缺陷、白血病等疾病的关系。
当前市场分子检测方法主要以限制性片段长度多态性分析、PCR测序、基因芯片为主，其中PCR测序是检测金标准，但是其需要检测时间长，其他方法也普遍存在低通量、低分辨率、高背景信号、高成本等缺陷。
MassArray分子量阵列技术是世界上领先的基因突变分析技术。MassArray结合了简单、可靠的引物延伸反应和先进的MALDI-TOF质谱技术，可以快速经济地进行基因型分析，达到目前市场上最高的准确率和性价比，实验设计灵活，价格低廉。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法。
本发明是通过如下技术方案实现的，一种检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物，
叶酸多态性位点相关基因包括MTHFR-RS1801133，MTRR-RS1801394，MTHFR-RS1801131；
引物组合物为扩增引物混合物，扩增引物混合物是根据上述每个待检测的叶酸多态性位点相关基因设计的PCR扩增引物的混合物，所述扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物，包括正向引物和反向引物，在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的17-25个碱基，在5'端具有标签序列，优选在5'端具有相同的标签序列，更优选所述标签序列为ACGTTGGATG，以区分扩增引物与延伸引物。
其扩增引物基因序列如下表所示：
一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒，包括权利要求1所述引物组合物。
作为本发明所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的优选方案：还包括质谱延伸引物，所述质谱延伸引物为用于质谱检测的延伸引物，所述质谱延伸引物的长度为15-28个碱基，并且其3'端位于叶酸多态性位点相关基因突变位点，在延伸方向上的上一个碱基，质谱延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为叶酸多态性位点相关基因突变位点。
其质谱延伸引物基因序列如下表所示：
其中，延伸产物和延伸引物之间的分子量差异不小于9Da；按照引物间，引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。
特别地，用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量在4500—8500Da之间。
一种所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法，
1)检测模板的制备：通过现有DNA提取试剂盒，提取待测样本DNA；
2)以提取的待测样本DNA为模板，使用引物组合物通过PCR扩增反应体系，获得靶序列扩增引物；
3)通过SAP酶反应体系处理，除去步骤2)获得的靶序列扩增引物中含有的未反应的dNTP；
4)将除去未反应dNTP的靶序列扩增引物，使用质谱延伸引物通过延伸反应体系，在延伸引物的3’端连接一个碱基，纯化后，从而得到延伸产物；
5)将纯化后的延伸产物在质谱仪上进行质谱检测；所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。
作为本发明所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法的优选方案：所述PCR扩增反应体系，各试剂及其用量见下表：
其中，PCR扩增反应条件为94℃，2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸5分钟。
作为本发明所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法的优选方案：所述SAP酶反应体系，各试剂及其用量见下表：
试剂 体积/反应
水(HPLE级) 1.53μl
SAP酶缓冲液 0.17μl
SAP酶 0.30μl
步骤(1)中获得PCR扩增产物 5.0μl
总体积 7.0μl
其中，SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除靶序列扩增引物中含有的未反应的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
作为本发明所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法的优选方案：所述延伸反应体系，各试剂及其用量见下表：
试剂 体积
水(HPLE级) 0.619μl
iPLEX缓冲液 0.200μl
iPLEXddNTP混合物 0.200μl
表3中的延伸引物混合物 *0.940μl
iPLEX酶 0.041μl
靶序列扩增引物 7.00μl
总体积 9.00μl
其中，延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1)使用的试剂耗材相对简单且稳定，不需要荧光染料、特殊的酶等价格昂贵的试剂；
2)反应可以在微量体系中进行，减少了样品和各种消耗品的使用；
3)由于质谱技术直接检测DNA的分子量(质荷比)且直接确定碱基的类型(即，不需要经过任何形式的信号转换)，因此，理论上只要有一个拷贝的扩增DNA片段被扩增即可识别，从而具有高的灵敏度；
4)质谱技术还有自动化、高通量检测等特点，因此，质谱技术与多引物延伸技术相结合，可以在一个反应体系中同时检测多个用药相关位点，从而大大减少了工作量，提高了检测通量。
特别地，本发明的技术方案采用飞行时间质谱基因分型系统，通过设计一套全新的质谱延伸引物，实现了对上述药物的个体化用药相关基因的检测和分型。其与其它现有方法相比，能够同时准确检测出叶酸相关多态性位点相关性，具有高通量、自动化、低成本的特点，有显著的优点。
附图说明
图1为样本提取的DNA为模板，对MTRR-rs1801394进行检测的质谱峰图分析结果的图，其结果为纯合A，显示对叶酸代谢正常，正常服用剂量。
图2为样本提取的DNA为模板，对MTRR-rs1801394进行检测的质谱峰图分析结果的图，其结果为纯合GA，显示对叶酸代谢较慢，服用叶酸风险较高，需减少服用剂量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
引物组合物序列由上海生工生物合成，PCR扩增试剂、SAP酶、Extension反应液、MassARRAY芯片均购自AgenaBioscience公司，PCR扩增仪为AB公司9700型号，质谱分析仪为Agena Bioscience公司MassARRAY CompactAnalyzer。
实施例
实施例1引物的设计
(1)引物组合物：
根据所选择的待检测的药物代谢酶和作用靶点药物的叶酸多态性位点相关基因，设计出特异性针对每种叶酸多态性位点相关基因的PCR扩增引物，PCR扩增引物可扩增包括突变位点在内的一段DNA序列。所述扩增引物在3'端具有与其所针对的基因序列完全匹配的至少15个碱基，在5'端具有10个碱基(acgttggatg)的标签序列，以区分扩增引物与延伸引物。
(2)质谱延伸引物：
质谱延伸引物为用于质谱检测的延伸引物，所述延伸引物的长度为15-28个碱基，并且其3'端位于用药相关突变位点的在延伸方向上的上一个碱基，延伸引物在发生延伸反应时，只延伸一个碱基，延伸的碱基即为用药相关突变位点。其中，延伸引物的野生型延伸产物与突变型延伸产物之间的分子量差异不小于9Da(Da＝道尔顿)，且各个用药相关突变位点的延伸产物间的分子量差异不小于30Da。按照引物之间、引物与扩增产物/延伸产物间不形成二聚体、引物自身不形成发夹结构以及引物与模板间不发生错配的原则设计引物。特别地，用于质谱检测的延伸引物按照下列原则设计：各延伸产物的分子量相互间的差别不小于30Da，各延伸引物与各延伸产物之间的分子量差异不小于9Da，延伸引物与延伸产物的分子量在4300—8500Da之间。
本发明设计的针对所述的叶酸多态性位点相关基因突变位点信息如表1所示，扩增引物参见表2，延伸引物参见表3。
表1：叶酸多态性位点相关基因突变位点信息
表2：扩增引物基因序列
表3：质谱延伸引物基因序列
实施例2检测模板的制备
突变样本为医院受检2名肿瘤患者的肿瘤组织(编号为2-A和2-B)和正常人组织样本4份(编号为3-A、4-A、5-A、6-A)提取DNA(采用Tiangen DNA试剂盒提取，操作方法按照试剂盒说明书提取)。
实施例3检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法
步骤(1)以实施例2中提取的DNA为模板，使用实施例1中的PCR扩增引物通过PCR扩增，获得靶序列扩增引物。PCR扩增反应体系参见表4。其中，所有试剂购买自AgenaBioscience公司。
表4：PCR扩增反应体系
PCR反应条件为94℃，2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸5分钟。在本实施例中，使用实施例2中提取的DNA作为PCR扩增的DNA模板。同时，将无菌双蒸水作为阴性对照。将对照样本与待测样本按照相同的反应过程进行反应和测试，以验证检测的有效性。
步骤(2)通过SAP酶处理，除去步骤(1)获得的靶序列扩增引物中含有的未反应的dNTP。SAP酶反应体系见表5。所有试剂购买自AgenaBioscience公司。
表5：SAP酶反应体系
SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除PCR扩增反应中剩余的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
步骤(3)以(2)中获得的扩增产物为模板，使用实施例1中的质谱延伸引物通过延伸反应，在延伸引物的3’端连接一个碱基，从而得到延伸产物。延伸反应体系见表6。所有试剂购买自Agena Bioscience公司。
表6：延伸反应体系
*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大小进行线性关系调整(即，根据每种延伸引物的分子量计算每种引物的使用量)。其中，配制延伸引物混合物，y＝-300.77Ln(x)+2730.7；R2＝0.8536；
延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
(4)采用树脂(购买自AgenaBioscience公司)纯化步骤(3)中获得的延伸产物。在延伸产物中加入6mg树脂，16.00μl水，垂直摇匀一小时。经过本步反应后，树脂将与反应体系中的阳离子充分结合，从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物可在4℃保存数天，也可在-20℃保存数周。所得的纯化产物在4000rpm离心5分钟后，取上清直接用于质谱检测。
(5)将纯化后的产物在Agena Bioscience MALDI-TOF质谱仪上进行质谱检测。所得到的质谱峰图通过Typer4.0分析软件(由Agena Bioscience公司提供)进行分析，得到分型结果。
检测结果：
图1为样本提取的DNA为模板，对MTRR-rs1801394进行检测的质谱峰图分析结果的图，其结果为纯合A，显示对叶酸代谢正常，正常服用剂量。
图2为样本提取的DNA为模板，对MTRR-rs1801394进行检测的质谱峰图分析结果的图，其结果为纯合GA，显示对叶酸代谢较慢，服用叶酸风险较高，需减少服用剂量。
质谱峰图分析结果如图1-图2所示。
序列表
<110> 阔然医学检验实验室(徐州)有限公司
<120> 检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物、试剂盒以及试剂盒使用方法
<130> 2019
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 1
acgttggatg cttgaaggag aaggtgtctg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 2
acgttggatg cttcacaaag cggaagaatg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 3
acgttggatg gcagaaaatc catgtaccac 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 4
acgttggatg ctatatgcta cacagcaggg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 5
acgttggatg ccgagaggta aagaacgaag 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 6
acgttggatg tgaagagcaa gtcccccaag 30
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 7
tgcgtgatga tgaaatcg 18
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 8
caaaggccat cgcagaagaa at 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类基因组(human genomic)
<400> 9
ggggaggagc tgaccagtga ag 22

Claims (7)

1.一种检测叶酸多态性位点相关基因的引物组合物，其特征在于：
叶酸多态性位点相关基因包括MTHFR-RS1801133，MTRR-RS1801394，MTHFR-RS1801131；
引物组合物为扩增引物混合物，扩增引物混合物是根据上述每个待检测的叶酸多态性位点相关基因设计的PCR扩增引物的混合物，其中，PCR扩增引物基因序列如下表所示：
2.一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述引物组合物。
3.根据权利要求2所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒，其特征在于：还包括质谱延伸引物，
所述质谱延伸引物的长度为15-28个碱基，并且其3'端位于叶酸多态性位点相关基因突变位点，在延伸方向上的上一个碱基；其质谱延伸引物基因序列如下表所示：
4.一种如权利要求3所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：
1)检测模板的制备：通过现有DNA提取试剂盒，提取待测样本DNA；
2)以提取的待测样本DNA为模板，使用引物组合物通过PCR扩增反应体系，获得靶序列扩增引物；
3)通过SAP酶反应体系处理，除去步骤2)获得的靶序列扩增引物中含有的未反应的dNTP；
4)将除去未反应dNTP的靶序列扩增引物，使用质谱延伸引物通过延伸反应体系，在延伸引物的3’端连接一个碱基，纯化后，从而得到延伸产物；
5)将纯化后的延伸产物在质谱仪上进行质谱检测；所得到的质谱峰图通过分析软件进行分析，得到分型结果。
5.根据权利要求4所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述PCR扩增反应体系，各试剂及其用量见下表：
其中，PCR扩增反应条件为94℃，2分钟；94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共扩增45循环；最终72℃延伸5分钟。
6.根据权利要求4所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述SAP酶反应体系，各试剂及其用量见下表：
试剂 体积/反应 水(HPLE级) 1.53μl SAP酶缓冲液 0.17μl SAP酶 0.30μl 步骤(1)中获得PCR扩增产物 5.0μl 总体积 7.0μl
其中，SAP酶反应条件为37℃温育40分钟，以去除靶序列扩增引物中含有的未反应的dNTP；85℃温育5分钟，以使SAP酶失活。
7.根据权利要求4所述的一种检测叶酸多态性位点相关基因的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述延伸反应体系，各试剂及其用量见下表：
试剂 体积 水(HPLE级) 0.619μl iPLEX缓冲液 0.200μl iPLEXddNTP混合物 0.200μl 表3中的延伸引物混合物 *0.940μl iPLEX酶 0.041μl 靶序列扩增引物 7.00μl 总体积 9.00μl
其中，延伸反应条件为94℃，30秒；94℃变性5秒，52℃退火5秒，80℃延伸5秒，共扩增40个循环，且在每个循环中退火和延伸进行5个小循环；最终72℃延伸3分钟。
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