CN109136366A - 一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒 - Google Patents
一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒,属于生物医学领域中的临床分子诊断技术。本发明的检测体系,能在一个多重复合PCR扩增体系同时扩增检测22个SMN基因致病性突变位点以及3个对照位点。本发明所提供的检测体系,灵敏度高,分辨率高,在通常利用的100‑500bp检测范围内可清晰、有效地区分1bp差异;检测速度快、需要操作少、可自动化大批量检测,极大降低操作强度和检测成本,4小时内可得到结果。其检测样本可以使用血液、血卡等检材扩增,免除了DNA提取的步骤,操作更加简便,适合于批量操作。该检测对于作为对SMN1第7外显子检测的补充,对SMA研究和携带者筛查具有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒,属于生物医学领域中的临床分子诊断技术。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA),是一种较常见的遗传性神经肌肉疾病。典型的SMA呈常染色体隐性遗传,患者在婴幼儿阶段发病,特征为脊髓前角运动神经元的变性和缺失,具体临床表现为进行性、对称性肢体躯干及近端肌肉无力和萎缩。SMA按严重度以及发病年龄可分为三个类型:I型(婴儿型)属于最严重的类型,一般于出生后6个月前发病,一生无法独立坐稳、站立,大多数患儿2岁以前会因呼吸衰竭而死亡;II型(中间型)一般于出生后6~18个月发病,能坐,少数可以站或走,但随肌肉持续萎缩会丧失行走能力,大多能活到20-30岁;III型(慢性型)一般于出生18个月之后发病,病程进展较慢,能独立行走,长期存活率较好。
SMA相关致病基因携带者频率为1/40~1/60,发病率为1/6000~1/10000,在各人种之间无明显差异。在全世界范围,SMA是携带率和发病率第二高的儿童常染色体致死性遗传病,仅次于囊性纤维病。在我国,SMA是导致婴幼儿死亡的头号常染色体遗传病。
脊髓性肌萎缩症的致病基因定位于染色体5q11.2~13.3区域,起关键性作用的基因为运动神经元生存基因1(survival motor neuron,SMN1)。SMN1基因全长约20kb,转录产物长约1.7kb,编码294个氨基酸的SMN蛋白,参与构成与RNA加工有关的多蛋白复合体。SMN蛋白在人体组织中普遍表达,脊髓前角运动神经元对其需求较高,若SMN蛋白表达水平过低,会使神经元死亡,导致肌肉的萎缩。
SMN基因存在两个高度同源性的拷贝,分别为端粒拷贝(SMN1)和着丝粒拷贝(SMN2)。它们的差别仅有五个碱基,这也造成了对SMN1检测的困难。SMN1可以表达稳定、完整的功能蛋白SMN,而SMN2基因只能表达少量具有活性的SMN蛋白。SMN1是SMA的致病性基因;SMN2本身不会引起SMA,但其拷贝数量会影响SMA的严重程度。
典型的SMA呈常染色体隐性遗传。正常人基因组中至少存在一个正常的SMN1拷贝;而典型SMA患者基因组中没有正常的SMN1基因。其中95-98%的SMA患者为SMN1基因缺失(通常称为SMN1第7外显子纯合缺失),其余2-5%SMA患者仅有一个包含致病性突变的SMN1基因;如一条染色体上携带正常SMN1,另一条染色体无正常SMN1,此种情况称为SMA携带者。携带者个体不会表现SMA症状,但如果男女双方都是携带者,有25%的风险生育SMA患儿。
针对SMN1基因检测不仅是SMA诊断的重要依据,也可为携带者筛查和生育指导提供指导。目前针对SMN1第7外显子缺失检测的研究和应用相对较多,通常使用多重连接依赖探针扩增(MLPA)、荧光定量PCR(qPCR)等方法定量检测SMN1第7外显子拷贝数。而对于SMN1基因的致病性突变,目前研究相对较少,也没有适于应用的检测方法。
对于患者确诊或者先证者亲属诊断,SMN1基因的致病性突变的检测可以通过测序等方法进行。但是对于携带者筛查,测序等方法从成本和工作量上不具备可行性。如果只进行SMN1第7外显子检测,则会有相当比例的致病性突变携带者漏检。因此,急需开发一种适于批量检测的SMN1基因的致病性突变检测方法。这对于SMA研究和携带者筛查具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时检测22种常见SMN基因致病性突变的检测体系及试剂盒。
检索孟德尔遗传数据分析库(On-line Mendelian Inheritance in Man,OMIN)数据及相关研究文献,选择确定明确致病且相对高发的SMN基因致病性突变位点共22个。其中7个位点为文献报道的中国人群中的高发突变位点。
本发明所提供的检测体系,能同时扩增检测上述22个SMN基因致病性突变位点以及3个对照位点。该体系所包含的22个位点信息见表1:
表1检测位点列表
所述第一组荧光标记为FAM,第二组荧光标记为HEX,其中所述两组位点从上往下的顺序均为实际检测结果图中从小到大的片段排列顺序。
本发明还提供根据该检测体系设计的试剂盒。
本发明所述检测体系,采用的是等位基因特性PCR(allele-specific PCR,ASPCR)结合定量荧光PCR(Quantitive Fluorescent PCR,QF-PCR)的方法对目的位点进行扩增,通过毛细管电泳进行扩增产物的检测,完成对目的位点分型的检测。对于每个检测位点设置三条引物,对两种分型分别设置一条不同长度的特异引物,以及一条荧光标记的上游或下游引物。每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增。完成PCR扩增和毛细管电泳检测后,通过特定荧光标记、特定长度的扩增产物的有无即可判定样本特定位点是否存在特定基因型。
本发明方法的特点:
1)使用遗传分析仪通过毛细管电泳检测扩增产物:
遗传分析仪检测平台是广泛使用的主流检测平台之一。通过毛细管电泳对荧光标记的扩增产物进行检测,检测的主要技术优势在于:
①,检测灵敏度高。
毛细管电泳结合使用荧光染料大幅提高了检测灵敏度,比琼脂糖电泳检测灵敏度高100倍以上。能更灵敏地检测到扩增产物,并且明确区分扩增野生型和突变型。另一方面,由于检测灵敏度高,为复合PCR扩增反应提供了更大调整空间。更重要的是,由于检测灵敏度高,降低了对PCR扩增产物量的要求,可以可以降低PCR扩增循环数、降低样本量需求。
②,检测分辨率高。
在通常利用的100-500bp检测范围内可清晰、有效地区分1bp差异。如此高的分辨率使得不会由于产物大小接近而产生误判,也避免了非特异扩增引起的结果误判。另一方面,高分辨率还使得同时检测更多位点成为可能。
③,可以同时对多种荧光信号检测。
更进一步拓展了检测范围,使得同时检测更多位点成为可能。
④,检测速度快(40分钟)、需要操作少、可自动化大批量检测。
⑤,检测结果可利用软件自动分析判型。
2)通过一个多重复合PCR扩增体系同时扩增多个位点:
本专利利用一个多重复合PCR扩增体系,实现了对22个SMN基因致病性突变位点的检测。其优势在于:
①,极大降低操作强度和检测成本。只一个PCR扩增和一个遗传分析仪检测反应即可完成全部检测。
②,单管扩增检测,最大程度上避免了污染和样品混淆等错误。
③,可以直接使用血液、血卡等检材扩增,免除了DNA提取的步骤,操作更加简便,适合于批量操作。
3)位点全面:
本体系涵盖了所有已报道的高频SMN基因致病性突变位点,以及中国人群中高发SMN基因致病性突变位点,共22个。该检测对于作为对SMN1第7外显子检测的补充,对SMA研究和携带者筛查具有重要应用价值。
综上,本专利提供一个同时检测22个SMN基因致病性突变位点的检测体系。其主要优点包括:每个样品只需一个扩增检测反应,一管反应可以得到22个位点的检测结果,极大降低操作强度;4小时内可得到结果。
附图说明
图1,样本A的扩增检测结果图,
图2,样本B的扩增检测结果图,
图3,样本C的扩增检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例一、检测体系
PCR扩增体系主要组分包含热启动DNA聚合酶、UDG酶、dNTP、扩增缓冲液及各位点引物等。
根据等位基因特性PCR原理,每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增。为此目的,对各引物进行了一系列特定的改动或修饰。为了协调扩增效率、改进产物峰型、便于毛细管电泳检测,也对引物进行了一系列特定的改动或修饰。本实施例所采用的经过改进优化的引物序列如下:
Exon3 283G/C位点:
正向共用引物:5’-FAM-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’
反向野生型引物:5’-ATGGCAGAACATTTGTACCC-3’
反向突变型引物:
Exon3 305G/A位点:
正向共用引物:5’-FAM-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’
反向野生型引物:5’-GTAAATGCAACCGTCTTCTGCCC-3’
反向突变型引物:
Exon3 346A/T位点:
正向共用引物:5’-FAM-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’
反向野生型引物:5’-AACACAGGTTTCTCTCTTAAAATCACT-3’
反向突变型引物:
Exon3 389A/G位点:
正向共用引物:5’-FAM-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’
反向野生型引物:5’-AGATTTTGCTCCTCTCTATTTACCT-3’
反向突变型引物:
Exon3 400G/A位点:
正向共用引物:5’-FAM-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’
反向野生型引物:5’-AAAGTAGATCGGACAGATTTTGCTCCAC-3’
反向突变型引物:
Exon3 406C/G位点:
正向共用引物:5’-FAM-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’
反向野生型引物:5’-AACACAGATTGGGGAAAGTAGATCGGACAGATCTGG-3’
反向突变型引物:
Exon 3 332C/G位点:
正向野生型引物:5’-GACGGTTGCATTTACCCCGC-3’
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-HEX-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’
Exon 3 388T/C位点:
正向野生型引物:5’-CCTGTGTTGTGGTTTACACTGTAT-3’
正向突变型引物:
反向共用引物:55’-HEX-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’
Exon6 815A/G位点:
向野生型引物:5’-ATGTTAATTTCATGGTACATGAGTGTCTA-3’
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-HEX-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’
Exon 6 784A/G位点:
正向野生型引物:5’-GGGCTTCCTCTTGAACATG-3’
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-HEX-GGGAGGATGGAAAACAGAGACTTAC-3’
Exon6 785G/T位点:
正向共用引物:5’-HEX-AATCTCCAGACTTTACTTTTTTGTTTACT-3’
正向野生型引物:5’-CCACTCATGTACCATGAAATTAACCTAC-3’
反向突变型引物:
Exon6 830A/G位点:
正向共用引物:5’-HEX-AATCTCCAGACTTTACTTTTTTGTTTACT-3’
正向野生型引物:5’-GTCAGGAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCATCT-3’
反向突变型引物:
Exon6 821C/T位点:
正向共用引物:5’-HEX-AATCTCCAGACTTTACTTTTTTGTTTACT-3’
正向野生型引物:5’-CTGAGTGATTACTTACCATATAATAGCCCG-3’
反向突变型引物:
Exon1 5C/G位点:
正向野生型引物:5’-CGCGGGTTTGCTATGTC-3’
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-FAM-GCCCAAACTGCTCGAGGAA-3’
Exon1 22insA位点:
正向野生型引物:5’-GAGCAGCGGCGTCCG-3’
正向突变型引物:5’-ATTAGAGCAGCGGCTTCAA-3’
反向共用引物:5’-FAM-GCCCAAACTGCTCGAGGAA-3’
Intron6 835-1G/A位点:
正向野生型引物:5’-ATTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACCG-3’
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-FAM-GTTCAAAAACATTTGTTTTCCACAA-3’
Exon7 863G/T位点:
正向野生型引物:5’-CAGACAAAATCAAAAAGAAGGACG-3’
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-FAM-GTTCAAAAACATTTGTTTTCCACAA-3’
Exon7 836G/T位点:
正向共用引物:5’-HEX-GTAGGCATGAGCCACTGCAAG-3’
反向野生型引物:5’-CCTTCTTTTTGATTTTGTCTGAACC-3’
反向突变型引物:
Exon2 88G/A位点:
正向共用引物:5’-FAM-AACAAATCTACTCATGGTATGTGGATAG-3’
反向野生型引物:5’-CTGTATCATCCCAAATGTCAGACTC-3’
反向突变型引物:
Exon2 131A/T位点:
正向共用引物:5’-FAM-AACAAATCTACTCATGGTATGTGGATAG-3’
反向野生型引物:5’-ATACCTTAAATGAAGCCACAGCTCTAT-3’
反向突变型引物:
Exon5 683 T/A位点:
正向共用引物:5’-FAM-AATCTTTTTGATATGTATAAAACAAATATTCT-3’
反向野生型引物:5’-GGAGGCAGCCAGCATGATATTA-3’
反向突变型引物:
Exon5 689C/T位点:
正向野生型引物:5’-CACCACCACCCCACTTAGTCTC-3’
正向突变型引物:
反向共用引物:5’-FAM-CTAACAGGAACTACCTCCTTATGGC-3’
Amel位点:
正向引物:5’-HEX-GATCACTGTTTGCATTAGCAGTCC-3’
反向引物:5’-ATGGTAGGAACTGTAAAATTGGGAC-3’
Penta D位点:
正向引物:5’-FAM-AAGGTCGAAGCTGAAGTGAGC-3’
反向引物:5’-ACTTTCTCTTAGCCTGTGGCGTG-3’
Penta E位点:
正向引物:5’-HEX-ACTGGTCTACTTTGGGCTTAAAAAT-3’
反向引物:5’-AAGTGTTGAACTTCAAGAACAAGGA-3’
注:1.“-”单下划线代表各引物在引物3’端-2至-15位改动1至3个碱基。
2.“=”双下划线代表各引物可以在引物3’端-15位之后的序列进行改动,包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。
3.所有共用引物均在5’端进行FAM或HEX荧光标记。
二、以本发明所提供检测体系对一SMA患者家系进行检测。
样本信息:检测样本为一家系三例样本:
样本A,SMA患者,通过MLPA方法确定SMN1 exon7拷贝数为1;
样本B,样本A母亲,通过MLPA方法确定SMN1 exon7拷贝数为1;
样本C,样本A父亲,通过MLPA方法确定SMN1 exon7拷贝数为2。
三、检测方法
步骤1:PCR扩增反应
1)PCR预混溶液分装(在试剂准备区完成)
振荡混匀PCR预混溶液(PCR Master Mix),预计进行5个检测数,每个PCR反应管分装19μL。
2)加入模板(在标本制备区完成)
检测模板为DNA样本A、DNA样本B和DNA样本C,向对应PCR反应管中加入模板,A、B和C各1μL DNA样品、1μL阳性对照和1μL阴性对照。
3)PCR扩增(在扩增区完成)
将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内,设置反应体系为20μL。
按以下反应程序进行PCR扩增:
步骤2:扩增产物进行毛细血管电泳检测
配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液:(0.5μL分子量内标+8.5μL甲酰胺)×检测样品数,涡旋振荡混匀10-15秒;用移液器给每个检测孔分装9μL的甲酰胺和内标混合物;取1μL扩增产物加入甲酰胺和内标混合物里,盖上封板胶盖。如果需要可以使用离心机短暂离心将样品中的气泡除掉;把样品放置95℃变性3分钟,迅速放置冰浴上3分钟。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。检测建议设置进样时间为10秒、进样电压为3kV、运行时间为1800秒。
步骤3:数据分析
向GeneMapper软件中导入相关文件,包括Panel、Bin、对应的Analysis Method、ROX500内标。输入样品源数据(.fsa文件),在相关参数选择栏中选定之前导入的文件,分析数据。
步骤4:检测结果的判定
检测结果如图所示,图1为样本A的扩增检测结果图,图2为样本B的扩增结果图,图3为样本C的扩增结果图。位点排列顺序及各分型产物大小见表一。所检测三例样本检测结果如表二。
表二各样本位点检测结果统计
根据以上检测结果,样本A(患者)与样本C(父亲)在683G/T位点检出致病性突变T分型,样本B(母亲)在所检测各位点中未检出致病性突变分型。
对于该家系样本,前期经过MLPA方法确认了SMN1拷贝数,样本A/B/C分别携带1/1/2个SMN1拷贝。样本A为SMA患者,仅基于SMN1拷贝数无法解释样本A患病。
结合本发明的检测结果,可对该家系患病原因充分合理的解释:样本A的SMN1基因上带有来源于其父的683T致病性突变,该突变属于无义突变,导致SMN1蛋白提前终止。样本A仅有的一个SMN1拷贝上携带有致病性突变导致该拷贝无法产生正常功能的SMN1蛋白,最终导致患病。
需要特别说明的是,由于所检测SMN1基因与SMN2基因高度同源,所有检测位点的野生型产物都包括来源于SMN2的扩增产物。因此,虽然样本A只有一个683位点突变分型的SMN1拷贝,仍然会检测到683位点野生型产物,这与样本A只有一个SMN1拷贝并不矛盾。
本实施例中,我们的检测结果有效地确定了患者病因及突变位点,也可为该患者家庭再次生育指导提供明确信息。本检测作为SMN1拷贝数检测的补充,具有不可替代的应用价值。
序列表
<110> 中国人民解放军海军总医院
<120> 一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acctccccac tgatcaaaac g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcagaac atttgtacac 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attaatggca gaacatttgt acag 24
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acctccccac tgatcaaaac g 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtaaatgcaa ccgtcttctg acc 23
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
attagtaaat gcaaccgtct tctgact 27
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acctccccac tgatcaaaac g 21
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacacaggtt tctctcttaa aatcaat 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attaaacaca ggtttctctc ttaaaatcaa a 31
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<212> DNA
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acctccccac tgatcaaaac g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agattttgct cctctctatt tacat 25
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attaagattt tgctcctctc tatttacac 29
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acctccccac tgatcaaaac g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaagtagatc ggacagattt tgctacac 28
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
attaaaagta gatcggacag attttgctac at 32
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<211> 21
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<212> DNA
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<400> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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attagacggt tgcatttacc cagg 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctcatctagt ctctgcttcc agaaa 25
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cctgtgttgt ggtttacact ggat 24
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
attacctgtg ttgtggttta cactggac 28
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ctcatctagt ctctgcttcc agaaa 25
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
atgttaattt catggtacat gagtggcta 29
<210> 26
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
attaatgtta atttcatggt acatgagtgg ctg 33
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctcatctagt ctctgcttcc agaaa 25
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gggcttcctc ttgaacacg 19
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggctgggctt cctcttgaac aca 23
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gggaggatgg aaaacagaga cttac 25
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aatctccaga ctttactttt ttgtttact 29
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccactcatgt accatgaaat taacatac 28
<210> 33
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
attaccactc atgtaccatg aaattaacat aa 32
<210> 34
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aatctccaga ctttactttt ttgtttact 29
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtcaggaaaa gatgctgagt gattacttac catat 35
<210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
attagtcagg aaaagatgct gagtgattac ttaccatac 39
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aatctccaga ctttactttt ttgtttact 29
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctgagtgatt acttaccata taatagccag 30
<210> 39
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
attactgagt gattacttac catataatag ccaa 34
<210> 40
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgcgggtttg ctatggc 17
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
attacgcggg tttgctatgg g 21
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gcccaaactg ctcgaggaa 19
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gagcagcggc gtccg 15
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
attagagcag cggcgtcaa 19
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gcccaaactg ctcgaggaa 19
<210> 46
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
attttaactt cctttatttt ccttacag 28
<210> 47
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
attaatttta acttccttta ttttccttac aa 32
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gttcaaaaac atttgttttc cacaa 25
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cagacaaaat caaaaagaag gaag 24
<210> 50
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
attacagaca aaatcaaaaa gaaggaat 28
<210> 51
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gttcaaaaac atttgttttc cacaa 25
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtaggcatga gccactgcaa g 21
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ccttcttttt gattttgtct gaaac 25
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
attaccttct ttttgatttt gtctgaaaa 29
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aacaaatcta ctcatggtat gtggatag 28
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ctgtatcatc ccaaatgtca gaatc 25
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
attactgtat catcccaaat gtcagaatt 29
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aacaaatcta ctcatggtat gtggatag 28
<210> 59
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ataccttaaa tgaagccaca gctatat 27
<210> 60
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
attaatacct taaatgaagc cacagctata a 31
<210> 61
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
aatctttttg atatgtataa aacaaatatt ct 32
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ggaggcagcc agcatgatag ta 22
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
attaggaggc agccagcatg atagtt 26
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
caccaccacc ccacttagta tc 22
<210> 65
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
attacaccac caccccactt cgtatt 26
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ctaacaggaa ctacctcctt atggc 25
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gatcactgtt tgcattagca gtcc 24
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
atggtaggaa ctgtaaaatt gggac 25
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
aaggtcgaag ctgaagtgag c 21
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
actttctctt agcctgtggc gtg 23
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
actggtctac tttgggctta aaaat 25
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
aagtgttgaa cttcaagaac aagga 25
Claims (9)
1.一种脊髓性肌萎缩症相关基因的PCR检测体系,其特征在于同时对以下22个位点进行检测:Exon3 283G/C位点、Exon7 863G/T位点、Exon3 305G/A位点、Intron6 835-1G/A位点、Exon3 346A/T位点、Exon5 683T/A位点、Exon3 389A/G位点、Exon3 400G/A位点、Exon3406C/G位点、Exon1 22insA位点、Exon1 5C/G位点、Exon2 88G/A位点、Exon5 689C/T位点、Exon2 131A/T位点、Exon3 332C/G位点、Exon6 785G/T位点、Exon3 388T/C位点、Exon6821C/T位点、Exon6 830A/G位点、Exon6 815A/G位点、Exon6 784A/G位点、Exon7 836G/T位点。
2.根据权利要求1中所述的检测体系,其特征在于,采用多重等位基因特异性PCR扩增和毛细管电泳检测。
3.根据权利要求1或2中所述的检测体系,所述体系中还能检测对照位点。
4.根据权利要求3中所述的检测体系,所述对照位点为性别Amel基因、人类身份识别位点Penta D和Penta E中的一种或多种。
5.根据权利要求4中所述的检测体系,所述检测体系加入有检测位点的引物:
Exon3 283G/C位点:
正向共用引物:5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’,
反向野生型引物:5’-ATGGCAGAACATTTGTACAC-3’,
反向突变型引物:5’-ATTAATGGCAGAACATTTGTACAG-3’;
Exon3 305G/A位点:
正向共用引物:5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’
反向野生型引物:5’-GTAAATGCAACCGTCTTCTGACC-3’
反向突变型引物:5’-ATTAGTAAATGCAACCGTCTTCTGACT-3’
Exon3 346A/T位点:
正向共用引物:5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’,
反向野生型引物:5’-AACACAGGTTTCTCTCTTAAAATCAAT-3’,
反向突变型引物:5’-ATTAAACACAGGTTTCTCTCTTAAAATCAAA-3’;
Exon3 389A/G位点:
正向共用引物:5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’,
反向野生型引物:5’-AGATTTTGCTCCTCTCTATTTACAT-3’,
反向突变型引物:5’-ATTAAGATTTTGCTCCTCTCTATTTACAC-3’;
Exon3 400G/A位点:
正向共用引物:5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’,
反向野生型引物:5’-AAAGTAGATCGGACAGATTTTGCTACAC-3’,
反向突变型引物:5’-ATTAAAAGTAGATCGGACAGATTTTGCTACAT-3’;
Exon3 406C/G位点:
正向共用引物:5’-ACCTCCCCACTGATCAAAACG-3’,
反向野生型引物:5’-AACACAGATTGGGGAAAGTAGATCGGACAGATATGG-3’,
反向突变型引物:5’-ATTAAACACAGATTGGGGAAAGTAGATCGGACAGATATGC-3’;
Exon 3 332C/G位点:
正向野生型引物:5’-GACGGTTGCATTTACCCAGC-3’,
正向突变型引物:5’-ATTAGACGGTTGCATTTACCCAGG-3’,
反向共用引物:5’-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’;
Exon 3 388T/C位点:
正向野生型引物:5’-CCTGTGTTGTGGTTTACACTGGAT-3’,
正向突变型引物:5’-ATTACCTGTGTTGTGGTTTACACTGGAC-3’,
反向共用引物:5’-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’;
Exon6 815A/G位点:
向野生型引物:5’-ATGTTAATTTCATGGTACATGAGTGGCTA-3’,
正向突变型引物:5’-ATTAATGTTAATTTCATGGTACATGAGTGGCTG-3’,
反向共用引物:5’-CTCATCTAGTCTCTGCTTCCAGAAA-3’;
Exon 6 784A/G位点:
正向野生型引物:5’-GGGCTTCCTCTTGAACACG-3’,
正向突变型引物:5’-GGCTGGGCTTCCTCTTGAACACA-3’,
反向共用引物:5’-GGGAGGATGGAAAACAGAGACTTAC-3’;
Exon6 785G/T位点:
正向共用引物:5’-AATCTCCAGACTTTACTTTTTTGTTTACT-3’,
正向野生型引物:5’-CCACTCATGTACCATGAAATTAACATAC-3’,
反向突变型引物:5’-ATTACCACTCATGTACCATGAAATTAACATAA-3’;
Exon6 830A/G位点:
正向共用引物:5’-AATCTCCAGACTTTACTTTTTTGTTTACT-3’,
正向野生型引物:5’-GTCAGGAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCATAT-3’,
反向突变型引物:5’-ATTAGTCAGGAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCATAC-3’;
Exon6 821C/T位点:
正向共用引物:5’-AATCTCCAGACTTTACTTTTTTGTTTACT-3’,
正向野生型引物:5’-CTGAGTGATTACTTACCATATAATAGCCAG-3’,
反向突变型引物:5’-ATTACTGAGTGATTACTTACCATATAATAGCCAA-3’;
Exon1 5C/G位点:
正向野生型引物:5’-CGCGGGTTTGCTATGGC-3’,
正向突变型引物:5’-ATTACGCGGGTTTGCTATGGG-3’,
反向共用引物:5’-GCCCAAACTGCTCGAGGAA-3’;
Exon1 22 insA位点:
正向野生型引物:5’-GAGCAGCGGCGTCCG-3’,
正向突变型引物:5’-ATTAGAGCAGCGGCGTCAA-3’,
反向共用引物:5’-GCCCAAACTGCTCGAGGAA-3’;
Intron6 835-1G/A位点:
正向野生型引物:5’-ATTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAG-3’,
正向突变型引物:5’-ATTAATTTTAACTTCCTTTATTTTCCTTACAA-3’,
反向共用引物:5’-GTTCAAAAACATTTGTTTTCCACAA-3’;
Exon7 863G/T位点:
正向野生型引物:5’-CAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAG-3’,
正向突变型引物:5’-ATTACAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAT-3’,
反向共用引物:5’-GTTCAAAAACATTTGTTTTCCACAA-3’;
Exon7 836G/T位点:
正向共用引物:5’-HEX-GTAGGCATGAGCCACTGCAAG-3’,
反向野生型引物:5’-CCTTCTTTTTGATTTTGTCTGAAAC-3’,
反向突变型引物:5’-ATTACCTTCTTTTTGATTTTGTCTGAAAA-3’;
Exon2 88G/A位点:
正向共用引物:5’-AACAAATCTACTCATGGTATGTGGATAG-3’,
反向野生型引物:5’-CTGTATCATCCCAAATGTCAGAATC-3’,
反向突变型引物:5’-ATTACTGTATCATCCCAAATGTCAGAATT-3’;
Exon2 131A/T位点:
正向共用引物:5’-AACAAATCTACTCATGGTATGTGGATAG-3’,
反向野生型引物:5’-ATACCTTAAATGAAGCCACAGCTATAT-3’,
反向突变型引物:5’-ATTAATACCTTAAATGAAGCCACAGCTATAA-3’;
Exon5 683T/A位点:
正向共用引物:5’-AATCTTTTTGATATGTATAAAACAAATATTCT-3’,
反向野生型引物:5’-GGAGGCAGCCAGCATGATAGTA-3’,
反向突变型引物:5’-ATTAGGAGGCAGCCAGCATGATAGTT-3’;
Exon5 689C/T位点:
正向野生型引物:5’-CACCACCACCCCACTTAGTATC-3’,
正向突变型引物:5’-ATTACACCACCACCCCACTTCGTATT-3’,
反向共用引物:5’-CTAACAGGAACTACCTCCTTATGGC-3’;
Amel位点:
正向引物:5’-GATCACTGTTTGCATTAGCAGTCC-3’,
反向引物:5’-ATGGTAGGAACTGTAAAATTGGGAC-3’;
Penta D位点:
正向引物:5’-AAGGTCGAAGCTGAAGTGAGC-3’,
反向引物:5’-ACTTTCTCTTAGCCTGTGGCGTG-3’;
Penta E位点:
正向引物:5’-ACTGGTCTACTTTGGGCTTAAAAAT-3’,
反向引物:5’-AAGTGTTGAACTTCAAGAACAAGGA-3’。
6.根据权利要求5所述的检测体系,其引物序列上添加有修饰碱基或以修饰碱基取代正常碱基,所述修饰为荧光基团修饰、磷酸化修饰、硫代磷酸化修饰、锁核酸修饰或肽核酸修饰。
7.根据权利要求6所述的检测体系,其引物序列3’端-2至-15位改动1至3个碱基或者/和在引物3’端-15位之后的序列进行改动;所述改动包括末端增加其他序列、删除部分末端序列、改变部分碱基序列。
8.根据权利要求6所述的检测体系,所述引物分为两组,第一组为Exon3 283G/C位点、Exon7 863G/T位点、Exon3 305G/A位点、Intron6 835-1G/A位点、Exon3 346A/T位点、Exon5683T/A位点、Exon3 389A/G位点、Exon3 400G/A位点、Exon3 406C/G位点、Exon1 22insA位点、Exon1 5C/G位点、Exon2 88G/A位点、Exon5 689C/T位点、Exon2 131A/T位点、Penta位点;第二组为Exon3 332C/G位点、Exon6 785G/T位点、Exon3 388T/C位点、Exon6 821C/T位点、Exon6 830A/G位点、Exon6 815A/G位点、Exon6 784A/G位点、Exon7 836G/T位点、Amel基因位点、Penta E位点;第一组荧光标记为FAM,第二组荧光标记为HEX。
9.包含有权利要求1-8任一所述检测体系的SMN基因致病性突变的检测试剂盒。
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