RU2786396C1 - Набор для определения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локус генома человека - Google Patents
Набор для определения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локус генома человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2786396C1 RU2786396C1 RU2021138311A RU2021138311A RU2786396C1 RU 2786396 C1 RU2786396 C1 RU 2786396C1 RU 2021138311 A RU2021138311 A RU 2021138311A RU 2021138311 A RU2021138311 A RU 2021138311A RU 2786396 C1 RU2786396 C1 RU 2786396C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- sequence
- seq
- interest
- construct
- fam
- Prior art date
Links
- 102100019197 PPP1R12C Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 101710002259 PPP1R12C Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 17
- VYXSBFYARXAAKO-BXMGYBSLSA-N CHEMBL3183331 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N\CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-BXMGYBSLSA-N 0.000 claims description 14
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-N-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 13
- 230000002068 genetic Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 12
- 229920000033 CRISPR Polymers 0.000 description 8
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 7
- 101700043583 CCR5 Proteins 0.000 description 6
- 102100012080 CCR5 Human genes 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003260 fluorescence intensity Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 101710008635 CYP74A2 Proteins 0.000 description 2
- 101700023344 GAF1 Proteins 0.000 description 2
- 229920002391 Guide RNA Polymers 0.000 description 2
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 2
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 2
- 101700057967 RPP30 Proteins 0.000 description 2
- 102100000665 RPP30 Human genes 0.000 description 2
- 102000031061 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108091000118 Tyrosine 3-monooxygenases Proteins 0.000 description 2
- 201000007146 X-linked severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 2
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 2
- 230000003291 dopaminomimetic Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 201000003793 myelodysplastic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 210000002569 neurons Anatomy 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 108010082319 CRISPR-Associated Protein 9 Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 102100014446 CYBB Human genes 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 229920002459 Intron Polymers 0.000 description 1
- 206010024324 Leukaemias Diseases 0.000 description 1
- 102100014727 MECOM Human genes 0.000 description 1
- 101700036258 MECOM Proteins 0.000 description 1
- 108010082739 NADPH Oxidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920000272 Oligonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 208000000389 T-Cell Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000006110 Wiskott-Aldrich Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000001392 Wiskott-Aldrich Syndrome Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010093528 Wiskott-Aldrich Syndrome Protein Proteins 0.000 description 1
- 208000010025 X-Linked Combined Immunodeficiency Disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001090 X-linked chronic granulomatous disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 201000009446 chronic granulomatous disease Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structures Anatomy 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 108091005938 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 231100000025 genetic toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010355 genome engineering Methods 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано для определения и подсчета количества копий вставки интересующей конструкции в исследуемой популяции генетически модифицированных клеток. Предложен набор для определения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локус генома человека при проведении цифровой капельной мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Технический результат, достигаемый при использовании предлагаемого набора, заключается в обеспечении высокоточного подсчета копийности вставки интересующей конструкции в генетическом материале. 2 ил., 1 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, молекулярной биологии, может быть использовано для определения и подсчета количества копий вставки интересующей конструкции в AAVS1 локус исследуемой популяции генетически модифицированных клеток. Актуальность изобретения связана с необходимостью анализа эффективности проведения вставки при проведении генетических модификаций клеток.
Настоящее изобретение не предназначено для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека, а также для определения и подсчета количества копий вставки интересующей конструкции в исследуемой популяции генетически модифицированных клеток зародышевой линии человека, не предполагает использование человеческих эмбрионов.
Несмотря на быстрое развитие новых методов доставки конструкций в геном человека, наиболее распространенным методом на данный момент остается использование в качестве вектора для доставки ретровирусных конструкций. Эта методика продолжает использоваться как наиболее эффективная, однако ее использование может быть связано со значительными рисками для пациента. Так, при лечении Х-сцепленного тяжелого комбинированного иммунодефицита у пяти детей возник Т клеточный лейкоз [Howe S. J. и др. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients // J. Clin. Invest. 2008. T. 118. №9. C. 3143-3150.]. В одном из случаев лейкоз проявил резистентность к химиотерапии, что привело к гибели пациента. В другом исследовании при лечении синдрома Вискотта-Олдрича семь пациентов развили острую форму лейкоза [Braun С.J. и др. Gene therapy for Wiskott-Aldrich syndrome-long-term efficacy and genotoxicity // Sci. Transl. Med. 2014. T. 6. №227.]. При лечении Х-сцепленной хронической гранулематозной болезни два пациента развили миелодиспластический синдром [Stein S. и др. Genomic instability and myelodysplasia with monosomy 7 consequent to EVI1 activation after gene therapy for chronic granulomatous disease // Nat. Med. 2010. T. 16. №2. C. 198-204.]. Все случаи заболеваний связаны с непредсказуемостью места встраивания конструкции в геном человека при использовании ретровирусов. Это может приводить как к нарушению работы здоровых генов, так и к усилению экспрессии протоонкогенов.
Одним из возможных путей решения этой проблемы является направленное встраивание конструкции в геном человека. Для этого может использоваться быстро развивающаяся CRISPR система, которая позволяет проводить направленное встраивание конструкции при использовании подходящей донорной последовательности [Hsu P. D., Lander Е. S., Zhang F. Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering // Cell. 2014. T. 157. №6. C. 1262-1278.]. Безопасное встраивание конструкции можно проводить в так называемые "тихие гавани" генома - участки, вставка в которые генетических последовательностей не нарушает нормальной работы клетки. Одним из хорошо охарактеризованных участков является интрон PPP1R12C гена на AAVS1 локусе 19 хромосомы [Sadelain М., Papapetrou Е. Р., Bushman F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome // Nat. Rev. Cancer 2011 121. 2011. T. 12. №1. C. 51-58.]. Слабая стабильная экспрессия этого гена позволяет использовать его для встраивания конструкций без собственного промотора, что может быть использовано для экспрессии интересующей конструкции или для дальнейшего отбора отредактированных клеток с помощью флуоресцентных меток или генов устойчивости к антибиотикам.
Встраивание конструкции с использованием CRISPR системы происходит за счет репарации двунитевого разрыва ДНК выбранного участка генома. Белок CRISPR системы вносит в геномную ДНК двунитевой разрыв, специфичность которого задается короткой последовательностью гидовой РНК. При успешном встраивании интересующей конструкции в геном репарация этого разрыва проходит по пути гомологичной рекомбинации, в котором в качестве матрицы для репарации используется внесенная в клетку донорная последовательность ДНК. Значительным недостатком CRISPR системы по сравнению с использованием ретровирусных векторов остается низкая эффективность встраивания конструкции. Это объясняется особенностями работы системы, а также сложностью подбора оптимальных условий для каждого индивидуального случая, связанную со сложностью считывания успешного встраивания конструкции в геном.
На момент подачи заявки из открытых источников было известно о следующих аналогах.
В патенте US 2019203274, А1 описывается метод детекции HDR редактирования с использованием ddPCR, однако метод используется для детекции коротких изменений в геноме и не подразумевает использования для детекции встраивания полноразмерных конструкций.
В качестве прототипа нами выбран метод проверки CRISPR встраивания EGFP последовательности белка в человеческие iPS клетки с помощью системы ddPCR. В этой системе используется вставка последовательности флуоресцентного белка EGFP в локус тирозингидроксилазы для последующей визуализации дифференцированных дофаминергических нейронов [Überbacher С.и др. Application of CRISPR/Cas9 editing and digital droplet PCR in human iPSCs to generate novel knock-in reporter lines to visualize dopaminergic neurons // Stem Cell Res. 2019. T. 41.]. Для проведения ПЦР в этом методе используется две пары праймеров - одна пара для проверки наличия вставки и одна для нормировочного гена RPP30. Для проверки наличия вставки используется прямой праймер, отжигающийся выше левого плеча гомологии, использующегося в донорной конструкции, и обратный праймер, отжигающийся на Т2А последовательности донорной конструкции. В качестве зондов используются последовательность с FAM флуорофором, написанная на участок плеча гомологии и последовательность с НЕК флуорофором, написанная на последовательность RPP30 гена. Из клеток, подверженных редактированию на четвертый день выделяется геном, затем проводится пробоподготовка и постановка ddPCR, анализ результатов которого позволяет определить обогащение популяции iPS клетками с целевой вставкой.
Способ-прототип подходит для определения эффективности встраивания конструкции в ген тирозингидроксилазы, что является частным применением CRISPR редактирования. За пределами этого исследования остается определение эффективности встраивания интересующих конструкций в AAVS1 локус, что может быть использовано для широкого спектра исследований.
Проблемой, на решение которой направлено данное изобретение является создание набора, позволяющего проводить точное определение копийности вставки в AAVS1 локус интересующей конструкции в генетическом материале по отношению к копийности генома.
Технический результат, достигаемый при использовании предлагаемого набора, заключается в обеспечении высокоточного подсчета копийности вставки интересующей конструкции в генетическом материале.
Предложены оригинальные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды, позволяющие точно подсчитать копии вставки интересующей конструкции с нормировкой на один геном, при проведении цифровой капельной ПЦР.
Сущность изобретения заключается в следующем:
Предложен набор для определения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локусе генома человека при проведении цифровой капельной мультиплексной ПЦР, включающий прямой праймер FW-INS, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1; обратный праймер RV-INS, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2; флуоресцентный зонд INS-FAM, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3, с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ1; прямой праймер FW-CCR5, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4; обратный праймер RV-CCR5, имеющий последовательность SEQ ID NO: 5; флуоресцентный зонд CCR5-R6G, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя Rhodamine 6G (R6G) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ2.
Таким образом, предложена система, которая позволяет быстро считывать эффективность встраивания конструкции в AAVS1 локус генома человека, что может быть использовано для эффективного подбора оптимальных условий встраивания интересующей конструкции.
Возможность точного подсчета копийности вставки интересующей конструкции в геном достигается за счет использования прямого праймера, написанного к AAVS1 участку выше левого плеча гомологии донорной конструкции и обратного праймера, написанного к Т2А последовательности:
FW-INS: 5'- CGGACCACTTTGAGCTCTAC - 3'
RV-INS: 5'- GTTAGAAGACTTCCTCTGCCC - 3'
и флуоресцентного зонда, комплементарного последовательности левого плеча гомологии донора:
INS-FAM: [6-FAM] 5' -TTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGT-3'[BHQ1]
а также двух праймеров, фланкирующих локус участка гена CCR5:
FW-CCR5: 5'- TTGGTTTTGTGGGCAACATG - 3'
RV-CCR5: 5'- ACTTGAGTCCGTGTCACAAG - 3'
и флуоресцентного зонда, комплементарного последовательности гена CCR5:
CCR5-R6G: [R6G]5'-TGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGT -3'[BHQ2]
При этом прямой праймер FW-INS для амплификации фрагмента вставки интересующей конструкции имеет последовательность SEQ ID NO: 1.
Обратный праймер RV-INS для амплификации фрагмента вставки интересующей конструкции имеет последовательность SEQ ID NO: 2.
Флуоресцентный зонд INS-FAM с флуоресцентным красителем 6-FAM и гасителем BHQ1 для детекции участка плеча гомологии интересующей конструкции имеет последовательность SEQ ID NO: 3.
Прямой праймер FW-CCR5 для амплификации фрагмента гена CCR5, имеет последовательность SEQ ID NO: 4.
Обратный праймер RV-CCR5 для амплификации фрагмента гена CCR5, имеет последовательность SEQ ID NO: 5.
Флуоресцентный зонд CCR5-R6G с флуоресцентным красителем R6G и гасителем BHQ2 детектирует участок гена CCR5 для нормировки и имеет последовательность SEQ ID NO: 6.
Для дизайна праймеров и зондов был проведен биоинформатический анализ, где в качестве исходной информации использовали последовательность генов AAVS1 и CCR5 из базы данных National Center for Biotechnology Information U.S. National Library of Medicine (Gene ID: 54776, updated on 23-Nov-2021, Gene ID: 1234, updated on 5-Dec-2021).
Далее, для реализации изобретения необходимо осуществить серию ПЦР-реакций с помощью системы (установки) для цифровой капельной ПЦР, например, Bio-Rad QX200 Droplet Digital PCR System, с использованием реагентов, предназначенных для конкретной системы (мастермикс, содержащий необходимые компоненты ПЦР, такие как Taq-полимераза, dNTP, растворы солей и т.д.). Приготовление смеси для цифровой ПЦР идет по следующему протоколу:
Состав смеси на одну лунку:
| • 2х ddPCR supermix for probes (Bio-Rad) | 11 мкл |
| • Праймер FW-INS 10 мкМ | 1 мкл |
| • Праймер RV-INS 10 мкМ | 1 мкл |
| • Праймер FW-CCR5 10 мкМ | 1 мкл |
| • Праймер RV-CCR5 10 мкМ | 1 мкл |
| • Флуоресцентный зонд FAM-INS 10 мкМ | 0,6 мкл |
| • Флуоресцентный зонд R6G-CCR5 10 мкМ | 0,6 мкл |
| • Вода | 10,8 мкл |
| • Раствор ДНК (анализируемый генетический материал) | 4 мкл |
Общий объем должен быть 22 мкл, конечная концентрация праймеров 450 нМ, конечная концентрация зондов 250 нМ, раствор ДНК рекомендуется готовить так, чтобы в 4 мкл содержалось от 50 нг до 350 нг ДНК. Далее, с использованием прибора для генерации капель необходимо приготовить эмульсию капель. После завершения генерации капель планшет с каплями запаивается фольгой в течение 5 секунд при 180 градусах С. Запаянное плато помещается в любой амплификатор, поддерживающий формат 96-луночных планшетов «с юбкой» (например, С1000 Thermal Cycler, Bio-Rad). Протокол термоциклирования представлен в таблице.
После амплификации плато переносится в прибор, детектирующий флуоресценцию в каплях, по каналам FAM и R6G(HEX). Анализ результатов проводится с помощью программы, поставляемой с прибором - QuantaSoft Software Bio-Rad. В качестве типового результата программа выдает два графика флуоресценции (FAM и R6G) в формате 1D и совмещенный мультиплексный плот в формате 2D.
В качестве примера использовали метод для оценки эффективности встраивания последовательности EGFP белка в AAVS1 локус на клеточной линии Hela Kyoto. Для приготовления проб клеточная линия Hela Kyoto была трансфецирована с помощью FuGENE®HD реагента (Promega) бицистронной lentiCRISPR v2-Blast плазмидой (Addgene #83480) с гидовой РНК, направленной к AAVS1 локусу с последовательностью 5'-GTGTCCCTAGTGGCCCCACTG-3' и донорной плазмидой AAV-CAGGS-EGFP (Addgene #22212). Через пять дней после трансфекции из клеток был выделен геномный материал набором для выделения и очистки геномной ДНК ExtractDNA Blood (Евроген). Согласно представленной выше методике, была проведена оценка эффективности встраивания интересующей конструкции в геном.
На фиг. 1 представлен пример анализа результата цифровой капельной ПЦР в виде графиков в формате 1D; верхний график - измерение флуоресценции в канале FAM; нижний график - измерение флуоресценции в канале R6G; каждая точка на графиках - проанализированная капля; по шкале ординат - интенсивность флуоресценции, по шкале абсцисс - порядковый номер проанализированной капли; нижний кластер капель (бесцветный) -капли без матрицы; верхние кластеры - положительные капли, где прошла ПЦР.
На фиг. 2 представлен пример анализа результата цифрового капельного ПЦР в виде 2D плота: по шкале ординат - интенсивность флуоресценции в канале FAM, по шкале абсцисс - интенсивность флуоресценции в канале R6G; негативный кластер капель (бесцветный) - слева внизу; кластер позитивных по FAM капель (синий) - слева вверху; кластер позитивных по R6G капель (зеленый) - справа внизу.
Таким образом, при анализе графиков в формате 1D (фиг. 1) видно два кластера капель, нижний - негативный, состоит из капель, в которые не попала матрица (ДНК) для амплификации, и верхний - позитивный, куда матрица (ДНК) попала, где успешно прошла ПЦР и появился сигнал флуоресценции. Программа автоматически разделяет оба кластера и подсчитывает количество положительных капель в каждом канале.
При анализе графиков в формате 2D (фиг. 2) кластеры капель, положительных по FAM и R6G, отчетливо различимы, и также автоматически разделяются. В случае успешного встраивания кассеты в AAVS1 локус количество капель, положительных по FAM составляет 8,8% от количества капель, положительных по R6G, что согласуется с литературными данными.
Основу способа с предлагаемым набором для измерения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локусе генома человека составляют синтезированные короткие ДНК олигонуклеотиды и приборная база для проведения цифрового капельного ПЦР. Предложенный метод считывания эффективности редактирования упрощает его оценку и может быть использован для оптимизации условий встраивания интересующей конструкции в геном.
SEQ ID NO 1: FW-INS: 5'- CGGACCACTTTGAGCTCTAC - 3'
SEQ ID NO 2: RV-INS: 5'- GTTAGAAGACTTCCTCTGCCC - 3'
SEQ ID NO 3: INS-FAM: [6-FAM] 5' -TTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGT-3'[BHQ1]
SEQ ID NO 4: FW-CCR5: 5'- TTGGTTTTGTGGGCAACATG - 3'
SEQ ID NO 5: RV-CCR5: 5'- ACTTGAGTCCGTGTCACAAG - 3'
SEQ ID NO 6: CCR5-R6G: [R6G]5'-TGGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGGT -3'[BHQ2]
Claims (1)
- Набор для определения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локус генома человека, исключая клетки зародышевой линии человека, при проведении цифровой капельной мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, включающий прямой праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1; обратный праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2; флуоресцентный зонд INS-FAM, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3, с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя 6-карбоксифлуоресцеина (6-FAM) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ1; прямой праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4; обратный праймер, имеющий последовательность SEQ ID NO: 5; флуоресцентный зонд CCR5-R6G, имеющий последовательность SEQ ID NO: 6, с ковалентно пришитой к 5'-концу последовательности молекулой флуоресцентного красителя Rhodamine 6G (R6G) и ковалентно пришитой к 3'-концу последовательности молекулой гасителя флуоресценции BHQ2.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2786396C1 true RU2786396C1 (ru) | 2022-12-20 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2749741C1 (ru) * | 2020-12-11 | 2021-06-16 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2749741C1 (ru) * | 2020-12-11 | 2021-06-16 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Рибонуклеопротеиновый комплекс для редактирования генома человека |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Oceguera-Yanez F. et al. Engineering the AAVS1 locus for consistent and scalable transgene expression in human iPSCs and their differentiated derivatives // Methods. - 2016. - Т. 101. - С. 43-55. Hamilton H. et al. Adeno-associated virus site-specific integration and AAVS1 disruption //Journal of virology. - 2004. - Т. 78. - No. 15. - С. 7874-7882. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108473975A (zh) | 检测肿瘤发展的系统和方法 | |
| Reeve | Encyclopedia of genetics | |
| CN109136366B (zh) | 一种脊髓性肌萎缩症相关基因的检测体系及检测试剂盒 | |
| Walker et al. | Comparison of the 5.8 S rRNA gene and internal transcribed spacer regions of trichomonadid protozoa recovered from the bovine preputial cavity | |
| CN105925672B (zh) | 一种检测hbb/gjb2/atp7b/pah遗传病基因的阳性质控品及其制备方法 | |
| CN111073961A (zh) | 一种基因稀有突变的高通量检测方法 | |
| CN107488728A (zh) | 3d数字pcr检测egfr特定基因突变的引物探针组合物、试剂盒及方法 | |
| CN112626213A (zh) | 基于二代测序技术的肝癌检测panel、试剂盒及其应用 | |
| CN111500690A (zh) | 一种检测car-t细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法 | |
| CN106319040A (zh) | 一种检测人cyp2c19基因分型的试剂盒及检测方法 | |
| CN107460254A (zh) | 一种基于猪line1转座子插入多态性研发新型分子标记的方法 | |
| CN111424087A (zh) | 基于二代测序的用于泛癌种检测或靶向用药的检测Panel、试剂盒及应用 | |
| CN114774530B (zh) | 检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物、试剂盒和方法 | |
| CN107988385B (zh) | 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒 | |
| CN106957902A (zh) | 一种用于检测药物性耳聋相关位点的非标记探针 | |
| RU2786396C1 (ru) | Набор для определения копийности вставки интересующей конструкции в AAVS1 локус генома человека | |
| CN110438206B (zh) | 一组检测egfr基因19外显子缺失突变的引物、探针和试剂盒 | |
| CN111349691B (zh) | Egfr基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN106755551A (zh) | 一种egfr/l858r突变液体活检试剂盒及其应用 | |
| CN108949911B (zh) | 鉴定和定量低频体细胞突变的方法 | |
| CN114540524A (zh) | 一种用于结核分枝杆菌及其耐药性的数字pcr检测试剂盒 | |
| CN102382896A (zh) | Npm1基因突变检测方法及其试剂盒 | |
| CN111593115A (zh) | 用于β-地中海贫血基因突变多重实时荧光PCR检测的引物和探针组合及试剂盒 | |
| CN110938680A (zh) | Dna及rna同时检测的基因变异位点检测方法 | |
| CN108018285B (zh) | 一种超敏感引物及其设计方法和应用 |