CN101448847A - 影响磷酸二酯酶表达的寡核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多种针对编码磷酸二酯酶(PDE)的基因的治疗用反义寡核苷酸和这些反义寡核苷酸的组合的应用。这些反义寡核苷酸可以用作患者体内与细胞cAMP减少有关的疾病的治疗中的分析工具和/或治疗剂，所述疾病例如为呼吸道的炎症，包括例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫综合征、支气管炎、慢性支气管炎、硅肺病、肺纤维化、肺同种异体移植物排斥反应、变应性鼻炎和慢性鼻窦炎以及其中环AMP升高或PDE水平降低有利的其他症状。

Description

影响磷酸二酯酶表达的寡核苷酸
相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年5月19日提交的美国临时申请60/801,384号的优先权。
技术领域
本发明涉及用于基于反义寡核苷酸的疗法的方法、试剂和组合物。特别是，本发明涉及基于反义寡核苷酸的疗法在患者的与cAMP减少有关的疾病的治疗中的应用，所述疾病包括，例如，诸如炎症和癌症等PDE相关疾病。本发明还涉及其中涉及cAMP(环AMP)磷酸二酯酶的基因疗法和用于鉴别新型的基于反义的策略的方法。
背景技术
肺泡和气道上皮被认为是在调节肺部对氧化应激、脓毒症、内毒素血症和其他严重疾病的炎性反应和代谢反应中起重要作用的动态屏障。特别是，呼吸道上皮是在上皮-血液界面处的炎症/感染的首要目标，其本身能够通过募集炎性细胞和产生炎症介质而放大炎症信号。
慢性阻塞性肺病(COPD)是其中认为炎症的持续上调发挥作用的炎性气道和肺泡疾病的一个实例。COPD的炎症的特征在于：增进嗜中性粒细胞、CD8阳性淋巴细胞和巨噬细胞到气道中的浸润。嗜中性粒细胞和巨噬细胞在COPD的气道炎症的发病机制中起重要作用，因为它们能够释放包括促进组织发炎及破坏的弹性蛋白酶、金属蛋白酶和氧自由基在内的大量介质。已有人认为，炎性细胞积累在患有COPD的患者的气道中是由吸引炎性细胞进入气道、激活它们并保持它们存在的促炎细胞因子和趋化因子的释放增多所驱动。存在的细胞也释放对组织产生负面影响并维持疾病的酶(如金属蛋白酶)和氧自由基。已显示大量各种促炎细胞因子和趋化因子在患有COPD的患者的肺部增多。其中，在患有COPD的患者的气道内增多的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素8(IL-8)发挥了重要作用。
炎症似乎发挥作用的呼吸系统疾病的其他实例包括：哮喘、嗜酸性粒细胞性咳嗽、支气管炎、肺同种异体移植物的急性和慢性排斥反应、结节病、肺纤维化、鼻炎和鼻窦炎。哮喘被定义为气道炎症、可逆的阻塞和气道高反应性。在这种疾病中，涉及的炎性细胞主要是嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，虽然嗜中性粒细胞和巨噬细胞可能也很重要。已显示大量各种细胞因子和趋化因子在气道中增多并通过促进炎症、阻塞和高反应性而在此疾病的病理生理学中发挥作用。
嗜酸性粒细胞性咳嗽的特征是慢性咳嗽和在没有气道阻塞或高反应性的情况下在患者的气道内存在炎症细胞，主要是嗜酸性粒细胞。在此疾病中，数种细胞因子和趋化因子增多，不过它们大多是针对嗜酸性粒细胞的。嗜酸性粒细胞在气道内被募集和激活并潜在地释放在炎症和咳嗽的维持中起作用的酶和氧自由基。
急性支气管炎是在感染或刺激事件(例如污染、粉尘、气体或化学品)中发生的下气道的一种急性疾病。慢性支气管炎被定义为2年内每年至少3个月的大部分日子存在咳嗽和生痰。在气道内的急性或慢性支气管炎期间，还可以发现炎性细胞，主要是嗜中性粒细胞，以及广泛的各种趋化因子和细胞因子。这些介质被认为在这些疾病期间发生的炎症、症状和粘液产生中起作用。
肺移植是在患有终末期肺部疾病的患者中进行。当自身的炎性细胞、淋巴细胞未将供体器官识别为“自体”时，会发生急性的和更严重的慢性的同种异体移植物排斥反应。炎性细胞由趋化因子和细胞因子募集，并释放出大量的各种酶，这导致组织破坏，在慢性排斥反应的情况中，导致一种称为闭塞性细支气管炎的疾病。
结节病是一种在组织中发生慢性非干酪性肉芽肿的原因不明的疾病。肺部是最常见的受影响的器官。肺支气管肺泡灌洗显示大部分是淋巴细胞、巨噬细胞和有时是嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的增多。这些细胞也被细胞因子和趋化因子募集并激活，被认为与该疾病的发病机制有关。
肺纤维化是一种特征为会引起慢性呼吸功能不全的进行性和慢性的纤维化(瘢痕)的肺组织疾病。存在不同类型和起因的肺纤维化，但所有的特点都是肺组织中的炎性细胞流入和持续、成纤维细胞的激活和增殖并伴随胶原沉积。这些事件似乎与肺组织内的细胞因子和趋化因子的释放有关。
急性鼻炎是一种鼻子或上气道的在感染或刺激事件(例如，污染、粉尘、气体或化学品)过程中发生的急性疾病。慢性鼻炎被定义为存在持续的慢性流鼻水、鼻充血、打喷嚏和瘙痒。在急性或慢性鼻炎期间，上气道内还可以发现炎性细胞与广泛的各种趋化因子和细胞因子。这些介质被认为在这些疾病中发生的炎症、症状和粘液产生中发挥作用。
急性鼻窦炎是一种特征为鼻充血、流鼻涕、化脓性痰、头痛或鼻窦疼痛并伴有或不伴有发烧的急性的(通常为传染性)的鼻窦疾病。慢性鼻窦炎被定义为持续超过6个月的急性鼻窦炎症状。在急性或慢性鼻窦炎期间，上气道和鼻窦内还可以发现炎症细胞与广泛的各种趋化因子和细胞因子。这些介质被认为在这些疾病中发生的炎症、症状和粘液产生中发挥作用。
有越来越多的证据表明炎症与肿瘤疾病之间存在密切联系。肿瘤微环境由进入其中的细胞形成，它们的功能反映了局部的状况。在肿瘤发展中，肿瘤部位处发生的连续变化类似于慢性炎症。这种慢性炎症反应似乎主要由肿瘤调控，并且似乎促进肿瘤的存活。已经清楚的是，在发展中的肿瘤内部或者周围观察到的早期和持续的炎症反应通过提供各种与维持组织稳态有关的介质(例如，可溶性生长因子和存活因子、基质重塑酶、活性氧物种和其他生物活性分子)来调控肿瘤发展的许多方面(基质重塑、血管生成、恶性潜能)。
如上所述，这些炎性呼吸系统疾病或其中炎症起关键作用的疾病均具有如下特征：存在募集并激活不同的炎性细胞的介质，这些炎性细胞释放引起正常组织的症状、炎症持续和为慢性时的破坏或瓦解的酶或氧自由基。
一个合理的治疗方法是下调细胞因子和趋化因子的产生和炎性细胞的反应。这在所有上述疾病中一直利用局部或全身施用皮质类固醇进行并获得了不同程度的成功。皮质类固醇具有免疫抑制性，不仅影响炎性细胞而且还影响机体的其他细胞，长期施用时会导致毒性。
尽管可提供用于COPD、哮喘和其它炎性呼吸系统疾病的药物，但是这些疾病的流行率和发病率一直保持稳定或增加。显然，炎性呼吸系统疾病的治疗存在未满足的医疗需求，因此迫切需要创新性的治疗剂。基于反义寡核苷酸的治疗提供了一种选择性减少特定基因的表达而无传统治疗策略的毒性作用的新的替代途径。正在研究用于治疗数种疾病的反义疗法。之前已显示，如WO9966037所述，针对炎症介质的受体的反义寡核苷酸可以施用于肺部并下调它们的靶标。
相对于目前的炎性呼吸系统疾病或任何其他全身性炎性疾病的疗法，一种可减少由大量各种细胞释放的促炎细胞因子和趋化因子并且同时对抗炎介质或酶的释放具有降低作用的治疗方法可能具有优势。
环核苷酸cAMP和cGMP是普遍存在的参与信号传导途径和机制的第二信使。哺乳动物细胞已进化出酶的复杂且高度保守的补体，该补体通过多重且复杂的前馈和反馈机制来调节环核苷酸的生成和失活。cAMP和cGMP均通过腺嘌呤基(腺苷酸根)或鸟嘌呤基(鸟苷酸根)环化酶的催化活性，由它们各自的三磷酸酯(ATP和GTP)形成，分别如Essayan D.M.Cyclic nucleotide phosphodiesterase(PDE)inhibitors and immunomodulation.Biochem.Pharmacol.，1999，57，965-973中所述。cAMP/cGMP的失活通过环核苷酸依赖型磷酸二酯酶(PDE)催化的3′-磷酸二酯键的水解断裂而导致形成相应的无活性5′-单磷酸酯来实现，如Essayan(1999)与Perry M.J.和Higgs G.A(Chemotherapeutic potential of phosphodiesterase inhibitors.1998，Curr Opin Chem Biol.4：472-481)所述。
已经表明，炎症反应和其进程对环核苷酸的稳态水平的调变极度敏感，其中受它们影响的靶细胞扩展到超过免疫细胞而包括辅助细胞，如气道平滑肌细胞、上皮细胞和内皮细胞以及神经元，如Perry和Higgs(1998)；Essayan(1999)所述。在这方面，胞内环核苷酸的调变对调控炎症环境起重要作用的新兴理念最近已演变成靶向和改善炎性反应/自身免疫反应。环核苷酸PDE是一个庞大的不断增多的多基因家族，包括至少11个家族的PDE酶。因此，选择性的和非选择性的PDE抑制剂在体外和体内的形态(profile)提示了潜在的作为抗抑郁药、抗增殖药、免疫调节剂、保胎药(tocolytics)、心肌力调节药/心率调节药和细胞保护剂的治疗应用。
胞内cAMP似乎不仅在平滑肌松弛、活化和增生中，而且在由炎性细胞导致的介质释放的调变中具有根本性的作用。cAMP水平下降可导致气道上皮细胞内的如TNF-α、GM-CSF和IL-8等炎性介质的产生增多。
对细胞因子在细胞稳态以及炎症/自身免疫性/传染性疾病中的调控作用的分子机制的研究已开始提供新的办法来设计药理干预的治疗策略。一种此类的新颖方法是PDE酶阻断的化疗潜力，这显示了有望治疗大范围的疾病状态的显著多样而复杂的方案。对PDE抑制的一种机制的理解集中在环核苷酸(cAMP和cGMP)的免疫调节性能，由此铺平了可以凭此清楚地说明抗炎、治疗性应用的渠道。
炎症反应和其发展对环核苷酸的稳态水平的调变极度敏感，其中受它们影响的靶细胞扩展到超过免疫细胞而包括结构细胞，如上皮细胞、平滑肌细胞和内皮细胞以及神经元(Perry和Higgs，1998；Essayan，1999)。胞内环核苷酸的调变对炎性反应的调控起主要作用。环核苷酸PDE是一个庞大的不断增大的多基因家族，包括至少11个家族的PDE酶。PDE在它们的组织和细胞分布以及在它们的分子和理化特征(包括核苷酸和蛋白序列、底物特异性、抑制剂敏感性和辅因子需求性)方面有差异。在不同的家族内，通过mRNA选择性剪接和差异性启动子的使用由相同基因产生组织特异性亚型。
cAMP特异性PDE4酶家族是研究最深入的PDE之一。此家族内的酶发现于大多数的促炎和免疫细胞，其中它们在cAMP代谢的调控中起关键作用。PDE4酶在巨噬细胞、嗜中性粒细胞、细胞毒素CD8+T细胞、支气管上皮细胞和气道平滑肌细胞中表达。此外，PDE4抑制剂调节呼吸系统疾病的动物模型中的炎症，这表明PDE4可能代表用小分子抑制剂进行干涉的治疗类策略中的合适标靶。抗PDE4药物抑制胞内cAMP的水解，这依次又提供了支气管扩张和对炎症反应的抑制。选择性PDE4抑制剂(如西洛司特(cilomilast)和罗氟司特(roflumilast))在嗜中性粒细胞炎症的动物模型中有效(Bundschuch DS等.J.Pharmacol.Exp.Ther.2001，297：280-290)。虽然将PDE4抑制剂用于治疗气道炎症仍在进行深入的临床研究，但是有数种抑制剂由于其毒性、剂量限制副作用(其中恶心和呕吐是最常见的生理表现)而已被放弃。因此，提高PDE4抑制剂的治疗率已变为主要问题，这仍然是研究的重要领域。
考虑到酶在靶组织中的分布以及PDE3和PDE4在气道平滑肌和炎性细胞中的高活性，可以在慢性气流阻塞的治疗中加入这些酶的选择性抑制剂。一般小分子抑制剂都集中在一个或多个PDE上而未对抑制PDE的所有同工酶的潜在不利影响进行评估。例如已有人提出，大多数归因于PDE4拮抗剂的毒性会通过抑制PDE4同种型D而发生。此外，如本文所示，抑制PDE的某些酶未能减少所有的促炎介质，但采用反义寡核苷酸的适当组合时，同种型特异性核苷酸的组合可能导致范围大得多的效果。
PDE3家族包含两种不同的基因，PDE3A和PDE3B，它们受cGMP抑制并对cAMP显示出高亲和性。每种PDE3基因编码至少两种剪接亚型。PDE3A已在平滑肌、血小板和心脏组织中得到鉴定。PDE3B在脂肪细胞和肝脏细胞中最为丰富。然而，来自使用选择性PDE3抑制剂或与PDE4抑制剂的组合的临床试验的初步数据已经有点令人失望，并且受到的期望明显降低，因为这些药品功效有限，并且由于副作用而使其在临床上的使用受限。
PDE7是首次从人类神经胶母细胞瘤中分离出。PDE7A编码一种对cGMP与PDE3和PDE4的抑制剂不敏感的cAMP特异性PDE，具有与其他cAMP PDE不同的氨基酸序列。在人类中，两种基因(PDE7A和PDE7B)已得到表征。PDE7A基因编码通过mRNA选择性剪接由同一基因得到的三种同工酶(PDE7A1、PDE7A2和PDE7A3)。在人类中，PDE7A2mRNA大量地表达在骨骼肌、心脏和肾脏中，而睾丸、肺和免疫系统(胸腺、脾、淋巴结、血液白细胞)是PDE7A1的丰富来源。此外，受激活的(而不是幼稚的)人类T淋巴细胞表达PDE7A3剪接变体。与此相反，PDE7B在人体中作为单一的同工酶存在，它与PDE7A具有约70％序列相似性，但具有明显不同的动力学特性。PDE7B主要表达在大脑和大量的其他组织(包括肝脏、心脏、甲状腺和骨骼肌)中。已显示，用抗CD3和抗CD28抗体刺激人类幼稚T细胞可促进IL-2的产生和克隆性扩增。这些作用归结于PDE7A，并且这种酶的下调阻碍了淋巴细胞增殖(Li L等，Science，1999，283，848-851)。
PDE4家族包含4种不同的基因(PDE4A-D)。由于基因的选择性剪接，据报道有多种剪接变体，这些剪接变体可分为两大类：长型和短型。PDE4A、B和D基因产物见于大多数免疫和炎性细胞。这些产物以组成型存在或者在激活后存在，如BurnoufC.和Pruniaux M.P.(Current Pharmaceutical Design 2002；8：1255-1296)所述。对所有的或某些的同种型PDE4的抑制与数种介质的下调有关；不过，已描述有某些促炎细胞因子(如IL-6)增多(Giembycz M.A.Expert Opin Invest Drugs2001，10：1361-1379)。
因此，人们希望抑制所有这三种PDE酶；不过这种方法可能会被已记载的施用这些酶的每一种的抑制剂的毒性所困扰。局部施用反义寡核苷酸可以避免酶抑制的全身毒性，但这些PDE有太多的同工酶，以致于此方法似乎不实用。对一种或多种的同种型的PDE酶的抑制可能不如完全PDE抑制有效，因为会存在其他同种型而具有它们的促炎作用。
因此，看起来所希望的是设法在更少地影响用于炎性呼吸系统疾病的抗炎介质或抑制酶的同时下调促炎介质和它们的细胞。因而在此提出针对选定的同种型的PDE酶的反义寡核苷酸的组合的治疗应用作为用于炎性呼吸系统疾病或环AMP增多起作用的任何疾病的治疗。
发明内容
本发明提供了多种反义寡核苷酸化合物，这些反义寡核苷酸化合物可以有效下调它们所针对的PDE同种型基因，本发明还提供了选定的反义寡核苷酸化合物，这些选定的反义寡核苷酸化合物不仅可以有效下调它们所针对的PDE同种型基因，而且还可以有效下调包括其他PDE同种型基因、炎症基因和促有丝分裂基因在内的其他相关基因。
在另一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含至少2种反义寡核苷酸化合物，每种反义寡核苷酸化合物能够下调不同的基因。在此方案的一些实施方式中，所述至少2种反义寡核苷酸化合物的组合导致了每种所述基因的显著下调，这种下调比每种反义寡核苷酸单独下调每种基因的能力的加合更大。在进一步的一些实施方式中，本发明还提供了一种组合物，该组合物包含至少2种反义寡核苷酸化合物，每种反义寡核苷酸化合物能够下调不同的基因，每种反义寡核苷酸化合物以该反义寡核苷酸化合物本身对下调其所针对的基因实际上无效的浓度存在，所述至少2种反义寡核苷酸化合物的组合导致了这些反义寡核苷酸化合物所针对的每种基因以及可任选的其他相关基因的显著下调。在本发明的这一方面的更进一步的实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包含至少两种反义寡核苷酸化合物的组合，所述至少两种反义寡核苷酸化合物各自针对不同的PDE靶基因，并且各自对下调或抑制一个PDE靶基因是有效的，每种寡核苷酸化合物在该组合中存在的浓度是它显示出少于20％的对其靶基因的抑制，这些寡核苷酸化合物的组合显示出超过20％的抑制，并使对于至少一种所述靶基因的抑制至少加倍。
本发明还提供了在本发明的组合物和方法中有效的反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有选自SEQ ID NO.1～92和113～126所组成的组中的序列。
本发明还提供一些药物组合物，所述药物组合物包含药学可接受的载体和如上所述的本发明的寡核苷酸或者至少两种反义寡核苷酸的组合。本发明还提供了这样的组合物在炎性呼吸系统疾病和其他炎症相关疾病的治疗和/或预防中的应用。
本发明的组合似乎通过被称为多基因敲除的方法发挥抑制作用。多基因敲除包括以下情况：
1)反义寡核苷酸不仅下调所针对的基因，而且还下调其他相关基因；和/或
2)至少2种反义寡核苷酸的组合，该反义寡核苷酸各自以其本身对下调所针对的基因的下调实际上无效的浓度存在，该组合导致了所述反义寡核苷酸所针对的基因以及可任选的其他相关基因的显著下调。
本发明利用上述办法来提供了用于治疗和/或预防患者的与cAMP减少有关的疾病的方法、组合物和试剂盒，所述疾病包括PDE相关疾病、炎性疾病(包括呼吸系统疾病，特别是COPD(慢性阻塞性肺病)和哮喘)以及炎症起重要作用的其他疾病(包括癌症)。
本发明还提供了减少细胞cAMP磷酸二酯酶的表达并由此降低其活性，从而维持胞内cAMP和细胞因子/趋化因子产生的正确平衡的方法、试剂和组合物。
本发明还提供了用于体外、体内和离体(ex vivo)鉴定/筛查能够干扰PDE表达和提高胞内cAMP水平的新型反义寡核苷酸化合物的组合、药物和疫苗的方法和工具。
本发明还提供了基于基因的治疗和转染方法，其中一种或多种反义寡核苷酸化合物用于细胞转染或递送到人类和动物以干扰PDE同种型基因表达。
本发明还提供了有效抗PDE3同种型(如PDE3A和PDE3B)、PDE4同种型(如PDE4A、PDE4B和PDE4D)和PDE7同种型(如PDE7A)以及其他PDE的反义寡核苷酸。
根据本发明的另一大方案，提供了用于提高反义寡核苷酸的核酸酶稳定性和/或靶基因抑制活性的方法，该方法包括用阿拉伯糖修饰的核苷酸、优选为2′-脱氧-2′-氟代阿糖核苷酸(FANA)置换所述寡核苷酸中的至少一个核苷酸。
在参照附图阅读对以下若干优选实施方式的非限制性描述之后，将明了本发明的其他目的和优点。
附图说明
现将根据附图对本发明进行更详细的说明，其中：
图1显示了不同的AON抑制其特异性靶敲除的功效。(A)使用LipofectamineTM 2000(Invitrogen，比率为1μg寡核苷酸：1μL LipofectamineTM2000)和200ng～400ng的AON(AS)或者相应的错配序列(错配/正义)，以靶向PDE3A、PDE3B、PDE7A、PDE4A、PDE4B或PDE4D的特定AON转染A549细胞24小时。PDE3B、PDE4A和PDE4B的mRNA表达水平使用Quantigene
Figure A200780018289D0016111124QIETU
测定(Panomics)来量化。使用实时PCR来量化PDE3A、PDE7A和PDE4D表达。PDE表达根据对照基因(β2M、Ppib或HPRT)的表达归一化。数据以相对于未处理细胞中的表达水平的平均抑制％表示(**p<0.01，***p<0.001，n＝3)。(B)用靶向超过一种PDE4亚型的AON转染293细胞过夜。PDE4亚型的mRNA表达水平使用实时PCR来量化并根据对照基因β2M的表达来归一化。数据以相对于转染有相应正义或错配AON的细胞的表达水平的平均抑制％表示。
图2显示了AON对肺上皮细胞的生物效应。将如上所述用AON转染过夜的A549细胞用IL-1β(10ng/mL)刺激4小时，以诱导趋化因子(IL-8，MCP-1)和细胞因子(GM-SCF)的分泌。收集细胞上清液并使用ELISA(酶联免疫吸附测定)确定趋化因子/细胞因子的水平。数据以特异性分泌的平均抑制％表示，其中对PDE-AON靶向细胞与错配/正义的AON靶向细胞之间的分泌水平进行比较。
图3显示了AON对免疫细胞的生物效应。将使用脂质试剂Escort IV(1μgAON:0.5μL脂质)以AON转染20小时的人外周血单核细胞(PBMC)，然后用PHA(10μg/mL)刺激6小时。收集细胞上清液并使用ELISA(BD Biosciences)评价PBMC响应PHA所分泌的细胞因子TNF-α和IL-2的水平。细胞因子的减少与无AON递送时的PHA刺激的细胞中的水平进行比较。数据以相对于用错配或正义对照序列AON(左轴)观察到的特异性细胞因子抑制的水平的AON抑制％表示。收集细胞裂解液以进行使用cAMP EIA(酶免疫测定)(Cayman Chemical)的cAMP测定作为PDE活性量度。cAMP的增多与无AON递送时的PHA刺激细胞中的水平进行比较。数据以相对于用错配或正义对照序列AON(右轴)获得的水平的cAMP的特异性增多％表示。数据表示为9-15供体之间的平均变化％±SE。
图4显示了含有2’-F-ANA的AON对抑制靶基因表达的效力。(A)以所示剂量使用LipofectamineTM 2000(Invitrogen，1μg AON：1μL LipofectamineTM 2000)，以由PS-DNA构成的或者由PS-FANA修饰物或相应错配序列构成的PDE4D特异性AON转染A549细胞24小时。靶基因的PDE4D mRNA表达水平使用测定(Panomics)来量化，并根据β2M基因表达归一化。数据以相对于用正义对照序列处理的细胞中的表达水平的特异性抑制％表示。(B)于不同时间点(8、24或48小时)使用单剂量的LipofectamineTM 2000(Invitrogen，1μg AON：1μL LipofectamineTM 2000)以由PS-DNA构成的或者由PS-FANA修饰物或相应错配序列构成的PDE4D特异性AON转染A549细胞24小时。靶基因的PDE4DmRNA表达水平使用Quantigene
Figure A200780018289D0016111124QIETU
测定(Panomics)来量化，并根据β2M基因表达归一化。数据以相对于用正义对照序列处理的细胞中的表达水平的特异性抑制％表示。图下方的说明描述TOP 1497(PDE4特异性)AON中的FANA修饰物。
图5显示了含有2′-F-ANA的AON对肺上皮细胞的生物效应的影响。用由PS-DNA(TOP 1545)构成的或者修饰有FANA(PS-FANA，TOP 1545-F3)的PDE4B/4D双特异性AON转染A549细胞过夜，然后用IL-1β(10ng/mL)刺激4小时。通过ELISA(BD Biosciences)分析上清液的IL-8和MCP-1分泌，并根据alamarBlueTM测定来确定的细胞活力来对水平进行归一化。数据以相对于用相应的正义对照序列处理的细胞中的表达水平的平均抑制％表示(**p<0.01，n＝3)。
图6显示了含有2’-F-ANA的AON对免疫细胞的影响。(A)用FANA修饰的双特异性PDE4B/4D AON(TOP 1545)或者FANA修饰的PDE7A特异性AON(TOP 1731)或者两者一起转染人PBMC，然后用PHA(10μg/mL)刺激6小时。靶基因的mRNA表达使用测定(Panomics)来量化，并将所有PDE基因表达水平根据β2M基因表达归一化。数据以相对于用正义AON转染的细胞中的水平的PDE4B(n＝8)、PDE4D(n＝6)和PDE7A(n＝8)的mRNA表达的特异性抑制％表示。用比较所示列的非配对t检验测定P值。(B)收集细胞上清液并使用ELISA(Medicorp)评价PBMC响应PHA所分泌的细胞因子TNF-α和IL-2的水平。细胞因子的减少与无AON递送时的PHA刺激细胞中的水平进行比较。数据以相对于用相同剂量的错配或正义对照寡核苷酸观察到的抑制水平的AON抑制％表示。数据表示为8供体之间的平均变化％±SE。
图7显示了在使用LipofectamineTM 2000(Invitrogen，比率为1μg寡核苷酸：1μLLipofectamineTM 2000)和200ng、400ng和800ng的TOP-1545-F3或者TOP-1549AON以PDE4B/4D特异性AON(TOP-1545-F3)或TYMS(胸苷酸合成酶)特异性AON(TOP-1549)转染的293细胞中的TYMS基因表达的抑制。使用实时PCR来量化TYMS表达，将其根据对照基因(Ppib)的表达归一化。数据以相对于用相应正义或错配AON转染的细胞中的表达水平的平均抑制％表示。
图8显示了在CYNOM-K1猴细胞系中的(A)TOP1572-F2对减少PDE4D和PDE4B mRNA表达的功效和(B)TOP1731-F3对减少PDE7A mRNA表达的功效。用250nM的AON或相应的在无抗生素培养基中以比率为1μg寡核苷酸：2μL脂质复合(complex)到LipofectamineTM 2000中的对照将细胞转染24小时。PDE4D、PDE4B和PDE7A mRNA表达水平由RT-PCR测量，并根据PPIB对照基因的表达将其相对量化。PDE mRNA抑制的百分比相对于未转染的细胞中的基因水平进行测定。先使用单因素Anova然后使用Dunnett比较进行统计分析，**p<0.01。
图9显示了TOP1572-F2和TOP1545对减少正常人支气管上皮细胞(NHBE)中的(A)PDE4D mRNA表达和(B)MCP-1蛋白分泌物的功效。用250nM的AON或相应的在无抗生素培养基中以比率为1μg寡核苷酸：1μL脂质复合到LipofectamineTM 2000中的对照将细胞转染24小时。在转染期的终点用细胞因子混合物(cytomix)(500U/mL TNF-α+10ng/mL IL1-β+10ng/mL IFNγ)刺激细胞4小时。通过ELISA测定上清液中的MCP-1蛋白分泌，并根据由AlamarBlue检测测定的细胞活力归一化。PDE4D、mRNA表达水平由RT-PCR测量，并根据B2M对照基因的表达进行相对量化。抑制的百分比相对于用相应的对照处理过的细胞来确定。统计分析使用t检验进行，*p<0.05，***p<0.001。
图10显示了反义寡核苷酸(AON)TOP 1572抑制PHA刺激人PBMC的细胞因子分泌的功效。用TOP 1572(6.2nM)或相应的对照AON(TOP 1572，6.3nM)转染PBMC过夜，然后第二天用有丝分裂原PHA(10μg/ml)刺激6小时。使用ELISA将细胞上清液中的细胞因子IL-2(A)和TNF-α(B)的水平量化。数据表示1L-2(pg/ml)或TNF-α(ng/ml)的三个重复孔的平均值±SE。统计分析先使用单因素ANOVA进行，然后使用Bonferroni多重比较检验进行(比较AON转染后的细胞因子水平与PHA刺激细胞或者与相应的对照AON处理细胞)，**p<0.01且***p<0.001。细胞因子分泌的抑制％相对于响应PHA而获得的水平。
图11显示了AON TOP 1731抑制有丝分裂原刺激的人PBMC的细胞因子分泌的功效。用TOP 1731(3.1nM)或复合有Escort IV的相应对照AON(TOP 1731，3.1nM)转染PBMC过夜，然后第二天用有丝分裂原PHA(10μg/ml)刺激6小时。使用ELISA将细胞上清液中的细胞因子IL-2(A)和TNF-α(B)的水平量化。数据表示IL-2(pg/ml)或TNF-α(ng/ml)的三个重复孔的平均值±SE。统计分析使用单因素ANOVA进行，然后使用Bonferroni多重比较检验进行(比较AON处理后的细胞因子水平与PHA刺激细胞或者与相应对照AON处理细胞)，***p<0.001。细胞因子分泌的抑制％相对于响应PHA而获得的水平。
图12显示了将F’ANA修饰的TOP 1572和TOP 1731组合时对PHA刺激PBMC的细胞因子分泌减少的强化功效。用TOP 1572-F2(3.1和6.3nM)、TOP 1731-F3(3.1和6.3nM)或者这两种AON(各3.1nM，总计6.3nM)将人PBMC转染过夜。第二天用PHA(10μg/ml)刺激PBMC6小时，然后通过ELISA将细胞上清液中的细胞因子IL-2的水平量化。IL-2分泌的抑制％相较于PHA刺激后的未转染细胞产生的水平进行确定。数值表示平均值±S.E.。
图13比较了在293细胞系中对于减少(A)PDE4D和(B)PDE4B mRNA表达的TOP1572(PS-DNA)的功效与TOP1572-F1、TOP1572-F2和TOP1572-F3(PS-FANA版本)的功效。用250nM的AON或相应的在无抗生素培养基中以比率为1μg寡核苷酸:1μL脂质复合到LipofectamineTM 2000中的对照将细胞转染24小时、48小时或72小时。PDE4D和PDE4B mRNA表达水平由RT-PCR测量，并根据PPIB对照基因的表达进行相对量化。特异性PDE mRNA抑制的百分比相对于用相应对照转染的细胞中的基因水平进行确定。
图14比较了在A549细胞系中对于减少PDE7A mRNA表达的TOP1731(PS-DNA)的功效与TOP1731-F3(PS-FANA)的功效。用250nM、125nM或75nM的AON或相应的在无抗生素培养基中以比率为0.8μg寡核苷酸：1μL脂质复合到LipofectamineTM 2000中的对照寡核苷酸将细胞转染48小时。PDE7A mRNA表达水平由Quantigene
Figure A200780018289D0016111124QIETU
测定来测量，并根据B2M对照基因的表达将其相对量化。特异性PDE mRNA抑制的百分比相对于用相应对照转染的细胞中的基因水平确定。
表格的简要说明：
表1a鉴定了根据本发明的人PDE7A反义寡核苷酸。
表1b鉴定了根据本发明的人PDE3A反义寡核苷酸。
表1c鉴定了根据本发明的具有针对一种以上PDE4亚型(PDE4A/4D或PDE4B/4D)的双特异性的反义寡核苷酸。AON序列中的PDE4亚型间的碱基对错配以下划线示出。在AON中碱基对的肌苷置换用字母I表示。
表1d鉴定了具有针对PDE3B、PDE4D和PDE7A的特异性和针对PDE4A和4B的双特异性的反义寡核苷酸。
表2a鉴定了本发明的含有FANA碱基的人PDE7A反义寡核苷酸。FANA修饰碱基以粗体字表示。
表2b鉴定了本发明的含有FANA碱基的人PDE3A反义寡核苷酸。FANA修饰碱基以粗体字表示。
表2c鉴定了本发明的含有FANA碱基的人PDE3B反义寡核苷酸。FANA修饰碱基以粗体字表示。
表2d鉴定了本发明的含有FANA碱基的人PDE4A反义寡核苷酸。FANA修饰碱基以粗体字表示。
表2e鉴定了本发明的含有FANA碱基的人PDE4D反义寡核苷酸。FANA修饰碱基以粗体字表示。
表2f鉴定了本发明的含有FANA碱基的人PDE4B反义寡核苷酸。FANA修饰碱基以粗体字表示。
表2g鉴定了本发明的具有针对一种以上PDE4亚型的双特异性并含有FANA碱基的人反义寡核苷酸。FANA修饰碱基以粗体字表示。
表3显示了用于实时PCR的人寡核苷酸引物。
具体实施方式
此处的发明涉及用于治疗与细胞内cAMP减少有关的疾病和/或与至少一种PDE的水平升高有关的疾病的反义寡核苷酸类化合物、治疗组合物和方法。本发明旨在提高细胞内cAMP的水平，同时降低炎性细胞释放的促炎介质以及酶的水平。
为了取得这些效果，在一个方面，本发明利用了在此称为“多基因敲除”的方法。多基因敲除指的是，通过不仅下调所针对的同工酶基因而且下调一种或多种相关基因的一种本发明的反义寡核苷酸化合物，或者通过各自下调不同同工酶基因的至少两种反义寡核苷酸化合物的组合，来抑制或下调多个基因。
与细胞cAMP水平降低有关的疾病包括其中有至少一种cAMP特异性PDE水平升高的疾病(即PDE相关疾病)。
术语“下调”在此处用于指对基因表达至少部分地抑制。根据本发明，反义寡核苷酸化合物下调或抑制所针对的基因，即，该反义寡核苷酸化合物对其显示出足以引起抑制的序列互补性的基因。
术语“相关基因”指在与细胞cAMP减少有关的疾病和/或至少一种PDE水平升高有关的疾病的病理生理学中可能也起作用的其他基因，但是对这些基因，该反义寡核苷酸化合物不具有完全的或者部分的互补性。这样的基因包括但不局限于，编码PDE酶或同种型、介质(例如，细胞因子和趋化因子)的基因和编码酶的基因。介质的实例包括IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15和TNF-α。适当的酶的实例包括但不限于，基质金属蛋白酶(MMP)，如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-12。
根据本发明，反义寡核苷酸(AON)化合物在此定义为：对编码特殊靶蛋白的DNA或mRNA显示出互补性，使得能够干扰mRNA的转录和翻译和/或诱导RNase(核糖核酸酶)或RNase样活性，从而起减少靶蛋白的表达的作用的天然产生的或经修饰的(优选为耐核酸酶的)寡核苷酸。当该寡核苷酸化合物与靶DNA或mRNA杂交时，靶蛋白的表达减少，从而干扰/防止其转录/翻译。因此，本寡核苷酸化合物必须充分地与所针对的核酸互补以与该核酸杂交。所以，如本领域技术人员应当理解的，尽管在最优选实施方式中，这些寡核苷酸化合物与所针对的核酸有100％互补性，但是100％互补性对于在寡核苷酸化合物与所针对的核酸之间发生杂交而言不是必需的。于是，在一些实施方式中，这些寡核苷酸化合物可能与所针对的核酸具有约95％、90％、85％、80％、75％、70％、60％和50％的互补性。
术语“核酸”和“核酸分子”在本文中可以互换使用，指的是由核苷酸(即核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或者两者)组成的分子。该术语包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的单体和聚合物，在聚合物的情况中，核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸通过5′-3′连接(linkage)而连接在一起。不过，连接可以包括在核酸合成领域已知的任何连接，包括例如含5′-2′连接的核酸。核酸分子中使用的核苷酸可以是天然产生的，也可以是合成制造的能够与天然产生的碱基对形成碱基配对关系的类似物。能够形成碱基配对关系的非天然产生的碱基的实例包括但不限于：氮杂和脱氮嘧啶类似物、氮杂和脱氮嘌呤类似物和其中嘌呤和嘧啶环的一个或多个碳和氮原子已被杂原子(例如，氧、硫、硒和磷等)取代的其他杂环碱基类似物。
此处的发明还涉及到对一种或多种的反义寡核苷酸的修饰，这样的修饰不会对所述反义寡核苷酸减少或抑制靶蛋白的表达的活性有显著不利的影响，而是可以提高此活性。
本反义寡核苷酸化合物也可以在对其活性无显著不利影响的情况下通过插入或缺失1个或多个碱基来进行修饰。特别是，在对所针对的基因显示出100％互补性的寡核苷酸的末端处的碱基的增加或缺失通常可以在不显著损失抑制活性的情况下进行。可以进行这样的修饰以提高寡核苷酸的活性或者增强寡核苷酸的稳定性。此外，本反义寡核苷酸化合物中的1个或多个碱基的取代也可以在对活性无不利影响的情况下进行，例如，用一种嘌呤置换另一种嘌呤(腺嘌呤、鸟嘌呤)和用一种嘧啶置换另一种嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。
根据本发明的反义寡核苷酸化合物还包括siRNA(小干扰RNA)和由RNAi(RNA干扰)方法产生的含有siRNA的RISC(RNA诱导沉默复合物)。最近报道的RNA干扰(RNAi)方法被视为一种抑制靶基因表达的新工具。如若干年前已知的，RNAi是基于低级真核生物中的古老的抗病毒防御机制。这是由双链RNA及其剪切为21-23nt的小干扰RNA(siRNA)所诱导，这在RISC复合物的协助下与单链形式的靶mRNA杂交之后导致同源的内源性mRNA的降解。RNAi作用的方式仍有待充分阐述，但它已经成为在各种各样的真核细胞物种(如线虫、蝇类、植物、真菌和哺乳动物)中产生功能缺失表型的首选方法。
根据本发明的反义寡核苷酸化合物还包括可以引入上述化学修饰的、能够体外和/或体内抑制基因转录和/或翻译的核酶和短核苷酸序列、单链或双链的RNA或DNA。
在一个方面，本发明的组合物和方法，虽然不受具体作用模式的限制，似乎通过已命名为“多基因敲除”的机制发挥作用。在本发明的背景中的多基因敲除是指：
1)一种反义寡核苷酸化合物，它不仅下调其所针对的基因而且下调其他相关基因；和
2)至少2种反义寡核苷酸化合物的组合，所述至少两种反义寡核苷酸化合物各自能够下调基因，各自以该反义寡核苷酸化合物本身对下调所针对的基因实际上无效的浓度存在，该组合导致了对这些反义寡核苷酸化合物所针对的每种基因的显著下调，并且还可以下调其他相关基因。此效果首次公开在本申请人的PCT申请公报WO05/030787号中。
在一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含至少2种反义寡核苷酸化合物，每种反义寡核苷酸化合物能够下调不同的基因。在该方案的一些实施方式中，至少2种反义寡核苷酸化合物的组合导致了每种基因的显著下调，这种下调大于每种反义寡核苷酸化合物单独下调每种基因的能力的加合。
在一个方面，本发明提供了用于治疗和/或预防与细胞cAMP减少有关的疾病和/或至少一种PDE水平升高有关的疾病的药物组合物，所述组合物包含药学可接受的载体和至少两种反义寡核苷酸化合物，每种反义寡核苷酸化合物针对至少一部分的不同的靶PDE编码基因，每种寡核苷酸化合物能够下调其所针对的靶基因，每种寡核苷酸化合物以该寡核苷酸化合物显示少于20％的对靶PDE基因的抑制的浓度存在，该组合显示出超过20％的抑制，并使对至少一种靶基因和可任选的其他相关基因的抑制至少加倍。
本领域技术人员会意识到，本发明的寡核苷酸化合物的在非常低的浓度的组合，例如，显示出小于1％的对靶PDE基因的抑制的浓度，可能无法组合成显示出至少20％的抑制。能够用于形成本发明的组合的每种寡核苷酸化合物的最低浓度会变化，此浓度可以为达到0.5％抑制的浓度或者达到1％～5％抑制的浓度。本发明提供了用于治疗和/或预防与细胞cAMP减少有关的疾病和/或至少一种PDE水平升高有关的疾病的药物组合物，所述组合物包含药学可接受的载体和至少两种反义寡核苷酸，所述至少两种反义寡核苷酸各自能够下调不同的靶基因，这些寡核苷酸中的至少一种以其本身实际上无效的浓度(例如，显示出少于20％的对靶基因的抑制的浓度)存在，这些寡核苷酸的组合显示出超过20％的抑制，并使对至少一种靶基因和可任选的其他相关基因的抑制至少加倍。
本发明还提供了至少两种反义寡核苷酸化合物的组合在用于治疗和/或预防与细胞cAMP减少有关的疾病(如呼吸道炎性疾病)的应用，每种寡核苷酸化合物针对编码不同的PDE同种型的基因，每种寡核苷酸化合物能够下调其所针对的基因，这些寡核苷酸化合物以每种反义寡核苷酸化合物本身对下调其所针对的基因实际上无效的浓度存在，所述至少两种寡核苷酸化合物的组合可以有效地下调这些寡核苷酸化合物所针对的基因中的至少一种基因和可任选的其他相关基因。
本发明还提供了一种治疗和/或预防与细胞cAMP减少有关的疾病(如炎性呼吸系统疾病)的方法，该方法包括向受试者施用至少两种反义寡核苷酸化合物，所述至少两种反义寡核苷酸化合物各自能够下调不同的靶PDE基因，这些寡核苷酸化合物以每种反义寡核苷酸化合物本身对下调其靶基因实际上无效的浓度(例如，显示出少于20％的对靶基因的抑制的浓度)进行施用，这些寡核苷酸化合物的组合可以有效地下调这些寡核苷酸化合物所针对的基因中的至少一种基因和可任选的其他相关基因。
本发明还提供了上述药物组合物在制造用于治疗和/或预防与细胞cAMP减少有关的疾病或cAMP特异性PDE水平升高有关的疾病(PDE相关疾病，如炎性疾病和癌症)的药物中的应用。本发明的方法和组合物所针对的炎性疾病总体上定义为：其中存在炎性细胞和/或介质的疾病。炎性疾病的实例包括但不限于：多发性硬化症、接触性皮炎、变应性和非变应性眼病、类风湿性关节炎、感染性休克、骨质疏松症和认知障碍。本发明的方法和组合物所针对的炎性呼吸系统疾病总体上定义为：其中存在炎性细胞和介质的呼吸道和肺部的疾病。炎性呼吸系统疾病的实例包括但不限于：COPD、哮喘、嗜酸性粒细胞性咳嗽、支气管炎、肺同种异体移植物的急性和慢性排斥反应、结节病、肺纤维化、鼻炎和鼻窦炎。
本发明还提供了上述药物组合物在制造用于治疗和/或预防病理生理学中涉及环AMP减少的疾病的药物中的应用。
本发明还提供了修饰反义寡核苷酸的方法，使得反义寡核苷酸可以到达靶核苷酸和/或更有效地针对靶基因而用于治疗和/或预防炎性呼吸系统疾病。
本发明还提供了一种包含上述组合物的制剂，该制剂可全身和/或局部施用。
本发明还提供了将药物组合物递送到靶多核苷酸的体内方法，所述方法包括向受试者施用上述组合物与使该组合物能够到达一种或多种靶基因的表面活性剂的组合。
优选的是，可以使用本发明的反义寡核苷酸化合物进行治疗的受试者或患者包括但不限于：无脊椎动物、脊椎动物、鸟类、哺乳动物(如猪、山羊、绵羊、牛、狗、猫，尤其是人类)。本发明的寡核苷酸化合物被设计为适用于待治疗的具体动物。特别是，反义寡核苷酸化合物的序列将鉴于物种间基因组差异而随治疗受试者而改变。
本发明还提供了有效抗PDE家族酶(例如，能够抑制其表达)的反义寡核苷酸，所述PDE家族酶包括但不限于PDE3、PDE4和PDE7。本领域技术人员会意识到，每种PDE亚型(subtype)可以还包括同种型。例如，PDE3亚型包括PDE3A和PDE3B同种型；PDE4亚型包括同种型PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D；PDE7亚型包括同种型PDE7A1、PDE7A2、PDE7A3和PDE7B。
在此使用的术语“该反义寡核苷酸化合物实际上无效的浓度”指每种寡核苷酸化合物以单独取用时被观察到实际上无法下调该寡核苷酸化合物所针对的基因的浓度(显示出少于20％的对靶基因的抑制的浓度)进行使用。这与本发明的至少两种寡核苷酸化合物的组合的效果相反，所述至少两种寡核苷酸化合物各自以单独对它们所针对的基因无效的浓度(显示出少于20％的抑制的浓度)存在，该组合显示出超过20％的抑制，并且可以有效地使对这些寡核苷酸所针对的基因中的至少一种基因的抑制至少加倍。
此处所用的术语“寡核苷酸”指包含约1到大约100个核苷酸、更优选为1到80个核苷酸、进而更优选为约4到大约35个核苷酸的核酸分子。术语“寡核苷酸”也包括上述的经修饰的寡核苷酸和寡核苷酸化合物。
此处使用的术语“修饰的寡核苷酸”和“修饰的核酸分子”指在所有或者任何的核酸碱基、糖部分、核苷酸间磷酸键以及增加了取代基(如二胺、胆固醇和其他脂溶性基团)的分子的天然分子结构的分子水平上具有一种或多种化学修饰或者具有这些位点处的修饰的组合的核酸(包括寡核苷酸)。核苷酸间磷酸连接可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、乙酰胺酯、氨基甲酸酯、硫醚、桥联氨基膦酸酯(phosphoranidate)、桥联亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥联硫代磷酸酯和/或砜核苷酸间连接或3′-3′、2′-5′或5′-5′连接，以及这样类似的连接的组合(产生混合的主链修饰寡核苷酸)。这些修饰可以在寡核苷酸分子内(单一或重复的)或者位于寡核苷酸分子的一个或多个末端，可以包括分子中核苷酸间磷酸连接(如胆固醇、在氨基之间具有数目变化的碳残基的二胺化合物)的加入以及切割或交联到相反链或者相关的酶或其他蛋白的末端核糖、脱氧核糖和磷酸酯修饰。如核糖-二醛等亲电基团可以与所述蛋白的赖氨酰残基的ε-氨基共价连接。连接到寡聚物上的如N-乙基马来酰亚胺等亲核基团可以共价连接到mRNA的5′端或者另一亲电位点。术语“修饰的寡核苷酸”还包括具有对糖部分的修饰的寡核苷酸，如2′-取代的核糖核苷酸或者脱氧核糖核苷酸单体，其中任意所述单体经5′-3′连接而连接在一起。修饰的寡核苷酸也可以由维持了序列的靶特异性的PNA或吗啉修饰主链组成。
可任选的是，目前描述的寡核苷酸可以与各种生理学载体分子一起配制。目前描述的寡核苷酸也可以与强化其进入靶细胞的能力的分子相复合。这样的分子的实例包括但不限于：碳水化合物、多胺、氨基酸、肽、脂质和对于细胞生长具有重要性的分子。例如，寡核苷酸可结合脂质，由此产生的寡核苷酸/脂质乳液或者脂质体悬浮液可特别有效地提高寡核苷酸的体内半衰期。
作为替代，针对PDE靶的寡核苷酸也可以质子化/酸化，从而起磷酸二酯酶抑制剂和抗菌剂的双重作用。因此，本发明的另一个实施方式是另外质子化/酸化的PDE调节(modulating)治疗用寡核苷酸用于提高细胞摄取、改善脂质体包封、因而还可以用作为抗生素的应用。此外，寡核苷酸可以与例如进一步增强寡核苷酸的体内稳定性或以其他方式加强其药理学性质(例如，延长体内半衰期、降低毒性等)的各种公知化合物或结构相复合。
此处所用的术语“核酸主链”指在分子中连接核苷酸的化学部分的结构。这可以包括由任何的和所有的以化学方式连接的核苷酸所形成的结构。此处所用的修饰的主链包括对核苷酸之间的化学连接的修饰，以及可以用于增强稳定性和亲和性的其他修饰，如对糖结构的修饰。例如可以使用脱氧核糖的[α]-端基差向异构体，其中碱基相对于天然的[β]-端基差向异构体是倒位的。在一个优选的实施方式中，糖基的2′-OH可以变为2′-O-烷基或2′-O-烷基-n(O-烷基)，这提供了对降解(不包括亲和性)的抵抗性。
此处可互换使用的术语“酸化”和“质子化/酸化”指将质子(或正电性的氢离子)加入到核酸上的质子受体位点的过程。质子受体位点包括核酸的碱基结构上的氨基和磷酸二酯键的磷酸酯。当pH降低时，被质子化的这些受体位点的数目增加，导致质子化/酸化程度更高的核酸。
术语“质子化/酸化的核酸”指当以约每毫升16 A260的浓度溶解在水中时具有低于生理pH的pH(即低于约pH 7)的核酸。修饰的核酸、抗核酸酶的核酸和反义核酸都可以被此定义所涵盖。一般而言，核酸是通过使质子加入到核酸的反应位点上来质子化/酸化的，尽管会降低核酸的pH的其他修饰也可以使用并且也被此术语所涵盖。
此处所用术语“封端的”指在分子水平具有防止选定核苷酸降解(例如通过核酸酶作用而降解)的化学修饰的核酸。这种化学修饰的定位使得它保护核酸的整体部分，例如反义寡核苷酸的编码区。封端可以是3′封端或5′封端。例如，3′封端可以在分子的3′最末端位置，或者如果它是核酸整体序列的3′，则可以在3′端的内部。
术语“基本上抗核酸酶的”指与天然存在的或未修饰的核酸相比较抗核酸酶降解的核酸。本发明的修饰的核酸至少有超过对应的未修饰的核酸1.25倍的核酸酶降解抗性，与对应的未修饰的核酸相比，更优选超过至少2倍的抗性，进而更优选超过至少5倍的抗性，最优选超过至少10倍的抗性。这种基本抗核酸酶的核酸包括但不限于具有修饰主链的核酸，所述修饰主链如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、乙基磷酸三酯、2′-O-甲基硫代磷酸酯、2′-O-甲基-对乙氧基核糖核苷酸、2′-O-烷基、2′-O-烷基-n(O-烷基)、3′-O-烷基、3′-O-烷基-n(O-烷基)、2′-氟、2′-脱氧-赤藓戊呋喃糖基、2′-O-甲基核糖核苷、氨基甲酸甲酯、碳酸甲酯、倒位的碱基(如倒位的T)或这些主链的嵌合形式。
此处所用术语“基本上抗酸的”指与未修饰核酸相比较抗酸降解的核酸。通常，通过比较抗性核酸的降解百分率与对应的未修饰的核酸(即具有“正常”主链、碱基和磷酸二酯键的相应的核酸)的降解百分率来测量核酸的相对抗酸性。与其对应的未修饰的核酸相比，抗酸性核酸优选至少有超过所述对应的未修饰的核酸1.5倍的酸降解抗性，更优选有超过至少2倍的抗性，进而更优选有超过至少5倍的抗性，最优选有超过至少10倍的抗性。
此处所用的术语“PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B寡核苷酸”各自指一种寡核苷酸，它对应地靶向影响PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B表达或活性的序列。这些包括但不限于：PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、DE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B DNA编码序列，PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B DNA启动子序列，PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B DNA增强子序列，以及编码PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B的mRNA等。
如以上讨论，本发明的一个实施方式提供靶向影响PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4D、PDE7A表达或活性的序列的反义寡核苷酸。在一个实施方式中，反义寡核苷酸可以具有表1a～1d或表2a～2g所鉴定的序列之一。在另一个实施方式中，如本领域技术人员所理解的，反义寡核苷酸可以包含这些序列的片段或变体，这可以改变寡核苷酸组成和/或长度，但维持或增加寡核苷酸下调基因表达的活性。在另一个实施方式中，本发明提供具有表1a～1d或表2a～2g所鉴定的序列的至少两种反义寡核苷酸的组合。
对单一寡核苷酸的有效性的比较示于(但不限于)图1A、图1b和图5。例如，在图1A中，TOP 1512(SEQ ID NO.91)针对人类PDE4A和PDE4B，同时体外抑制这两个靶。类似地，图1b显示了可识别PDE4B和PDE4D共有的序列的TOP1545(SEQ ID NO.14)和TOP1556(SEQ ID NO.24)，表明两个靶序列均有抑制作用。可识别PDE4A和PDE4D共有的序列的TOP 1507(SEQ ID NO.10)和TOP 1508(SEQ ID NO.11)起对两个靶基因均有抑制的作用。
对至少2种寡核苷酸化合物的组合其有效性的比较示于但不限于图6a和12。例如，在图6中，TOP1545-F3(SEQ ID NO.85)和TOP-1731-F2(SEQ ID NO.53)表现出比这些寡核苷酸的任何一种在单独使用时对各自靶所具有的效果更大的同时减少PDE4B、PDE4D和PDE7A表达的效果。在图6b中，TOP1545-F3(SEQ ID NO.85)和TOP-1731-F2(SEQ ID NO.53)表现出比这些寡核苷酸的任何一种以相同总剂量(6.3nM)单独使用时对IL-2具有的效果更大的减少人类PBMC中IL-2释放的效果。参照图12，TOP1572-F2(SEQ ID NO.122)和TOP
17314-F3(SEQ ID NO.54)表现出比单独使用时更大的抑制IL-2分泌的效果。
反义寡核苷酸化合物的许多组合可根据本发明进行使用，这些组合导致上述的多基因敲除。反义寡核苷酸的组合的实例可以包括但不限于：至少一种针对PDE3的寡核苷酸化合物与至少一种针对PDE7的寡核苷酸化合物。组合的替代实例可以包括至少一种针对PDE4的寡核苷酸与至少一种针对PDE7的寡核苷酸。组合的替代实例可以包括至少一种针对PDE3的寡核苷酸、至少一种针对PDE4的寡核苷酸与至少一种针对PDE7的寡核苷酸。这样的反义寡核苷酸化合物可以选自但不限于表1a-1d和表2a-2g中提供的寡核苷酸。
此处所用术语“处理”、“进行处理”和“疗法”等一般表示获得期望的药理学和/或生理学效果。这种效果可以是预防性的，即完全或部分预防疾病或其症状，和/或可以是治疗性的，即部分或完全治愈疾病和/或减轻疾病引起的不利影响。此处所用“处理”涵盖对前文定义的受试者(尤其是人类)中的疾病的任何处理，并包括：
(a)预防受试者患上疾病，所述受试者容易患上该疾病但仍未诊断为患有该疾病；
(b)抑制疾病，即阻止疾病的发展；或
(c)缓解疾病，即引起疾病的消退。
此处针对载体、表面活性剂和组合物所用的术语“药学可接受的”指可接受用于治疗受试患者的物质，所述物质并非有毒的或对于通过此处所述任何途径给药另外是不可接受的。
本发明总体上涉及通过施用治疗有效量的本发明的反义寡核苷酸化合物对受试者进行的治疗，所述化合物包括siRNA、核酶、单链或双链的短核苷酸序列(包括可以与靶核酸互补或者可以任选地进行上述修饰的RNA和/或DNA)、具有所述RNA寡核苷酸的至少一部分的RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸能与RNA杂交形成寡核苷酸-RNA双链体，或嵌合寡核苷酸，它们将下调或抑制内源基因的体内表达。
“治疗有效的”量指无毒性但足以提供希望治疗效果的反义寡核苷酸化合物的量。在此情况下，反义寡核苷酸的这种剂量有效缓解、改善或预防正在治疗的状况或疾病的症状，如与细胞cAMP减少有关的疾病、PDE相关疾病、如炎症呼吸系统疾病等炎性疾病。
此处提供的药物组合物包含上述反义寡核苷酸化合物和一种或多种的药学可接受的表面活性剂。用于增强本发明的反义寡核苷酸吸收的合适的表面活性剂或表面活性剂成分之前已经在美国申请公开号2003/0087845中进行了描述，其中的关于表面活性剂的内容并入本文。该申请提出合适的表面活性剂“...包括合成和天然、以及全长和截短形式的表面活性剂蛋白A、表面活性剂蛋白B、表面活性剂蛋白C、表面活性剂蛋白D、表面活性剂蛋白E、二饱和磷脂酰胆碱(除了二棕榈酰以外)、二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、泛醌、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、棕桐酰-溶血磷脂酰胆碱、脱氢表雄酮、多萜醇、硫脂酸(sulfatidic acid)、甘油-3-磷酸酯、磷酸二羟基丙酮、甘油、甘油-3-磷酸胆碱、二羟基丙酮、棕榈酸酯、胞嘧啶二磷酸(CDP)二酰基甘油、CDP胆碱、胆碱、磷酸胆碱；以及天然和人工片状体，它们是以下表面活性剂成分的天然载体媒介：Ω-3脂肪酸、多烯酸(polyenic acid)、多烯酸(polyenoic acid)、卵磷脂、棕榈酸、环氧乙烷或环氧丙烷的非离子性嵌段共聚物、单体和聚合物形式的聚氧丙烯、单体和聚合物形式的聚氧乙烯、具有葡聚糖和/或烷酰基侧链的聚(乙烯胺)、Brij 35、Triton X-100和合成表面活性剂ALEC、Exosurf、Survan和Atovaquone等。这些表面活性剂可以在制剂中单独使用或作为多组分表面活性剂的一部分使用，或共价键合到反义寡核苷酸(oligo)的5′和/或3′端。
本发明组合物的反义组分包括至少两种反义寡核普酸化合物的组合，可以在脂质颗粒或囊泡(如脂质体或微晶)中而包含于药物制剂中。如美国专利号6,025,339中所述，脂质颗粒可以具有任何合适的结构，如单层或多层结构，只要该反义寡核苷酸包含于其中即可。带正电的脂质如乙基硫酸N-[1-(2，3-(二油酰氧)丙基)]-N，N，N-三甲基铵或“DOTAP”，对于这样的颗粒和囊泡是特别优选的。这种脂质颗粒的制备是公知的。参见例如美国专利：授予Janoff等的4,880,635；授予Kurono等的4,906,477；授予Wallach的4,911,928；授予Wallach的4,917,951；授予Allen等的4,920,016；授予Wheatley等的4,921,757，等等。
本发明的组合物可以用将反义寡核苷酸化合物输送到如肺等希望部位的任何方式施用。此处公开的反义化合物可以用任何合适的方式施用于患者的肺，但优选通过由包含所述反义化合物的可吸入颗粒组成的气溶胶的吸入方式施用。
本发明的组合物可以作为包含具有可吸入尺寸的颗粒(例如尺寸小到足以在吸入时穿过鼻、口和喉并穿过支气管和肺部肺泡的颗粒)的制剂施用于呼吸系统。一般来说，可吸入颗粒的尺寸为约0.5～10微米。包含在气溶胶中的具有不可吸入尺寸的颗粒容易沉积在咽喉并被吞咽，因此气溶胶中不可吸入颗粒的量优选最小化。对于经鼻施用，优选10μm(微米)～500μm的颗粒尺寸以确保保留在鼻腔中。
可以通过将反义化合物与合适的载体(如无菌无致热原水或磷酸盐缓冲盐水)组合来制备用于产生气溶胶的活性化合物(一种或多种的反义寡核苷酸化合物)的液体药物组合物。
包含反义化合物的固体颗粒组合物可任选地含有用以促进气溶胶形成的分散剂以及其它治疗性化合物。合适的分散剂是乳糖，它可以与反义化合物以任意合适的比例(如1:1的重量比)混合。
反义组合物可以按有效地抗支气管收缩、抗变态反应和/或抗炎的量施用，这样的量取决于正受治疗的疾病的程度、患者受试者的状况、具体制剂、施用途径、向受试者施用的时机等。一般来说，优选寡核苷酸的胞内浓度为0.05μM～50μM，或特别是更优选为0.2μM～5μM。对于向哺乳动物患者如人施用，通常使用约0.001mg/kg、0.01mg/kg、0.1mg/kg或1mg/kg至约50mg/kg或100mg/kg或更多的剂量。不过，也可以考虑其它剂量。根据活性化合物在任何具体制剂中的溶解性，日剂量可以分成一个或数个单位剂量施用。
包含反义化合物的液体颗粒的气溶胶可以通过任意合适的手段(如用喷雾器)产生。喷雾器是通过压缩气体(通常是空气或氧气)加速通过狭窄的文丘里喷嘴的方式或者经超声搅拌的方式，将活性成分的溶液或悬浮液转化成治疗性气溶胶雾的可商购获得的装置。用于喷雾器的合适制剂包含在液体载体中的活性反义寡核苷酸成分，其量最高可达制剂的40重量％，优选为少于20重量％。载体通常是水或水性醇稀溶液，优选通过添加例如氯化钠而使其与体液等渗。可任选的添加剂包括防腐剂(如果制剂不是无菌制备)，例如羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂、抗菌剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂和乳化剂和其它表面活性剂制剂。
包含一种或多种活性寡核苷酸酸化合物和药学可接受的表面活性剂的固体颗粒气溶胶还可以用任何固体颗粒药物气溶胶发生器产生。用于向受试者施用固体颗粒药物的气溶胶发生器产生可吸入的颗粒(如上所说明的)，并以适于人给药的速率产生一定体积的含有预定计量剂量的药物的气溶胶。活性寡核苷酸成分通常占制剂的0.1～100(重量比，w/w)。第二种类型的示例性气溶胶发生器包括计量剂量吸入器。计量剂量吸入器是加压式气溶胶配送器，通常在液化推进剂中含有活性成分的悬浮液或溶液制剂。使用时，这些装置通过适用于递送计量体积(通常为10μl～150μl)的阀排送制剂，以产生含有活性成分的细颗粒喷雾。合适的推进剂包括某些氯氟烃化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷或氢氟烷及其混合物。制剂还可以另外含有一种或多种助溶剂(如乙醇)、乳化剂和其它表面活性剂制剂(如油酸或脱水山梨醇三油酸酯)、抗氧化剂和合适的调味剂。无论是由固体颗粒还是由液体颗粒形成，气溶胶均可以通过气溶胶发生器以约1升/分钟～150升/分钟的速率产生。
本发明的制剂可以是用于口服、含服、肺内、直肠、子宫内、肿瘤内、颅内、鼻、肌内、皮下、血管内、鞘内、可吸入、透皮、皮内、腔内、可植入、离子电渗、眼、阴道、关节内、耳、静脉内、肌内、腺体内、器官内、淋巴内、可植入、缓释或肠溶包衣制剂。用于制剂的载体可以是例如固体和/或液体载体。
对于适于与本发明的寡核苷酸化合物一起组合以使组合物/制剂适合施用以治疗呼吸系统疾病的其它载体，可以参照“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，第17版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985。
在本发明的另一方面，提供了一种制造的物品，该物品包含包装材料，包装材料内含有可有效治疗与细胞cAMP减少或PDE水平升高有关的状况(包括炎症疾病)的药学可接受的反义寡核苷酸组合物。在一个实施方式中，所述组合物包含有效抑制PDE基因的反义寡核苷酸化合物，所述寡核苷酸化合物与该基因有至少50％的互补性。在另一方面，所述组合物包含至少2种反义寡核苷酸化合物，每种反义寡核苷酸化合物能下调不同的PDE基因，每种反义寡核苷酸化合物以该反义寡核苷酸化合物本身对下调其所针对的基因实际上无效的浓度存在，这些反义寡核苷酸化合物的组合可以有效下调这些反义寡核苷酸所针对的基因中的至少一种基因。
在一个实施方式中，所述物品的包装材料包含标签，该标签指示该组合物能用于治疗炎症疾病，并且还可以另外包括一个指示：所述疾病是多发性硬化症、接触性皮炎、变应性和非变应性眼病、类风湿性关节炎、脓毒性休克、骨质疏松症和认知障碍中的一种。
在另一个实施方式中，所述物品的包装材料包含标签，该标签指示该组合物能用于治疗炎性呼吸系统疾病，并还可以另外包括一个指示：所述疾病是COPD、哮喘、嗜酸性粒细胞性咳嗽、支气管炎、肺同种异体移植物的急性和慢性排斥反应、结节病、肺纤维化、鼻炎或鼻窦炎中的一种。
对于本发明的目的，所述包装材料可以是用于包装本发明的含有核苷酸的组合物的任何合适的材料，包括瓶或其他容器(塑料或玻璃)、纸盒、管或其它保护性包装材料。应当意识到的是，包装可以随寡核苷酸组合物的性质而变化，例如，液体制剂可以进行不同于气溶胶制剂的包装。
通过以下非限制性实例对本发明进行更详细的说明。
实例
材料和试剂
AIM-V培养基(Invitrogen，货号：31035-025)；Opti MEM I(Invitrogen，货号：31985-07，批号：1244206)；FBS(胎牛血清，Wisent，货号：80150)；青霉素，链霉素(GIBCO，货号：15140-122)；HEPES(Wisent，货号：26060CI)和L-谷氨酰胺(Gibco，货号：25030-081)；DMEM/F12(Wisent，货号：10090CV)；丙酮酸钠(Wisent，货号：25000-Ci)；无菌PBS(GIBCO，货号：25030-081)；0.25％胰蛋白酶和0.01％EDTA(Wisent，货号：25-052-Ci)；HBSS(Hank氏平衡盐溶液，Wisent，货号：21-022CV)；PHA(植物血凝素，Sigma，货号：L-9132，批号：015K88913)；Ficoll paque(Amersham，货号：17-1440-03)；Trizol(Invitrogen，货号：15596-018)；Dnase I(Fermentas，货号：EN0521)；Superscript First-Strand Synthesis System forRT-PCR试剂盒(Invitrogen，货号：11904-018)；dNTPs(Invitrogen，货号：10297-018)；oligo(dT)12-18：(Invitrogen，货号：11904-018)；Qiagen RNAeasy MiniKit(Qiagen，货号：74106)；QiaVac 24 Manifold(Qiagen，货号：19403)；一次性真空连接器(Vacconnector)(Qiagen，货号：19407)；RiboGreen QuantificationReagent(Invitrogen-Molecular probes，货号：R-11490)；Light-Cycler Instrument 1.5版(Roche，货号：3531414)；20ml反应用LC毛细管(Roche，货号：1909339)；LC FastStart DNA Master SYBR Green 1 PLUS(100ml)(Roche，货号：03752186001)；K3EDTA管(Greiner Bio-one，货号：455036B110306)；Cyclic AMPEIA Kit(Cayman，货号：581001)人TNF-αELISA试剂盒(BioSource货号：CHC-1754，批号：041703)；人IL-8/CXCL8ELISA试剂盒(Biosource，货号：CHC1303)；Human MCP-1/CCL2 ELISA试剂盒(Biosource，货号：KHC1012)；cAMP EIA试剂盒(Cayman，货号：581001)；人GMCSF ELISA(Medicorp，货号：CHC0904)；人IL-2ELISA(BD Biosciences，货号：555190)；ELISA读板仪(滤光片450nm，参比滤光片650nm，Biorad，680型)；Escort IV转染剂(Sigma-Aldrich，货号：3287，批号：094K0565)；hIL-1β(Peprotech，货号：11195D195)；Forskolin(Sigma-Aldrich货号：F3917)；Rolipram(Sigma-Aldrich货号：R6520，批号：022K4604)；Alamar Blue(Biosource货号：DAL1100)；12孔高结合力酶标板(Costar，货号：665102)；ELISA用TMB色原试剂(MediCorp，货号：SB01)；LipofectamineTM2000转染剂(Invitrogen，货号：11668-019)；Quantigene
Figure A200780018289D0016111124QIETU
 Screen Kit(Panomics，货号：QG-000-050)；20×SSC(3M NaCl，0.3M二水合柠檬酸钠，pH7.0)；十二烷基硫酸锂10％(重量体积比，w/v)(Sigma，货号：L9781)；设定在53℃、0％ CO2的培养箱；MW96 Plate Washer(Beckman Coulter)；Thermo Luminoskan(LabSystem)；EMEM(HyClone，货号：SH30024.01)；非必需氨基酸(HyClone，货号：30238.01)；BEBM(Clonetics，货号：CC-3171)；BEBM试剂盒(Clonetics，货号：3170)；人TNF-a(Peprotech，货号：300-01A)；人IFNγ(Peprotech，货号：315-05)。
细胞培养
在含有2mM L-谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、1.5g/l碳酸氢钠、1mM丙酮酸钠、10％ FBS、100U/mL青霉素和100微克/mL链霉素的DMEM中培养293细胞(人转化胚肾细胞系；ATCC货号：CRL-1573)。在含有2mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠、10％ FBS、100U/mL青霉素、100微克/mL链霉素的Ham氏F12培养基中培养A549(人肺癌细胞系；ATCC)。人外周血单核细胞(PBMC)(外周血单核细胞)得自健康的志愿者。PBMC通过来自正常供体的EDTA K3血的Ficoll-Hypaque密度梯度离心而分离。PBMC以2×106细胞/mL/孔铺板到含AIM-V培养基的12孔板中，所述含AIM-V培养基还添加有100U/mL青霉素、100微克/mL链霉素。在含有2mM L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、10％ FBS、100U/mL青霉素和100微克/mL链霉素的EMEM中培养CYNOM-K1细胞。在BEBM(500mL，添加有BPE 2ml；氢化可的松0.5ml；hEGF 0.5ml；肾上腺素0.5ml；转铁蛋白0.5ml；胰岛素0.5ml；视黄酸0.5ml；三碘甲状腺原氨酸0.05ml)中培养NHBE细胞。
细胞活力
用Alamar Blue试验按生产商的指南系统性地测定细胞活力。
反义物(antisense)的制备
将硫代磷酸DNA反义物(Sigma Genosys)和硫代磷酸FANA反义物(Topigen、Montreal或UCDN，Calgary)重新悬浮在无菌水中，并稀释在Opti-MEM中以进行转染。实例中的DNA(非FANA)寡核苷酸的参比为硫代磷酸DNA寡核苷酸。
细胞的反义处理
A549细胞系：
将细胞经胰蛋白酶消化并重新悬浮在处于无抗生素条件的添加有10％血清的HAM-F12培养基(0.5×105细胞/孔，48孔板)中，然后在37℃培养过夜。第二天，将粘附细胞以附图说明中所示浓度用反义物/Lipofectamine复合物(比率为1μg寡核苷酸：1μL Lipofectamine)转染，在37℃培养一定时间。
293细胞系：
将细胞经胰酶消化并悬浮在处于无抗生素条件的添加有10％血清的DMEM培养基(1×105细胞/孔，48孔板)中，然后在37℃培养过夜。第二天，将粘附细胞以图说明中所示浓度用反义物/Lipofectamine复合物(比率为1μg寡核苷酸：1μL Lipofectamine)转染，并在37℃培养一定时间。
PBMC
分离当日，将PBMC在AIM-V培养基中铺板(2.0×106/ml，12孔板)。将反义物与Escort IV试剂(Sigma)复合(比率为1μg寡核苷酸：0.5μL Escort IV)，然后以图中所示浓度添加。将细胞在37℃、5％ CO2、潮湿(humidity)下培养18～24小时。
CYNOM-K1细胞系：
将细胞经胰蛋白酶消化并重新悬浮在处于无抗生素条件的添加有10％血清的EMEM培养基中(0.5×105细胞/孔，200μL，48孔板)，然后在37℃培养过夜。第二天，将粘附细胞以附图说明中所示浓度用反义物/Lipofectamine 2000复合物(比率为1μg寡核苷酸：2μL Lipofectamine)转染，并在37℃培养一定时间。
NHBE细胞：
将细胞经胰蛋白酶消化并重新悬浮在处于无抗生素条件的BEBM完全培养基中(0.5×105细胞/孔，200μL，48孔板)，然后在37℃培养过夜。第二天，将粘附细胞以附图说明中所示浓度用反义物/Lipofectamine 2000复合物(比率为1μg寡核苷酸：1μL Lipofectamine)转染，并在37℃培养一定时间。
RNA提取
根据RNAeasy微量试剂盒(mini kit)程序用Qiagen的QiaVac 24歧管从细胞沉淀中提取RNA并根据Fermentas方法用DNase-I处理。根据生产商程序(Invitrogen-Molecular探针)用RiboGreen试剂定量RNA。
逆转录(RT)
使用RT-PCR用Superscript First-Strand Synthesis System试剂盒，在20μL的总反应体积中进行第一链cDNA的制备。首先将1μg的RNA与0.5mM的各种dNTP、0.5μg oligo(dT)12-18一起在65℃变性5分钟，在冰上冷却至少1分钟。将混合物在42℃培养2分钟，加入另一份预混物，该预混物含有1×第一链缓冲液、10mM DTT和40单位SuperScript II RT。反应在42℃培养10分钟，在50℃培养1小时并在70℃加热失活15分钟。
实时PCR
在0.4mM各种PCR引物和4μL的LC FastStart DNA Master SYBR Green 1PLUS的存在下，在20μL的总体积中使PCR反应混合物与3μL的cDNA反应。步骤1(变性)：95℃，10分钟(斜率(slope)20℃/秒)；步骤2(40个循环)：95℃，(斜率20℃/秒)；57℃或59℃，5秒(斜率20℃/秒)；72℃，10秒(斜率20℃/秒)；步骤3(解链曲线)：95℃，(斜率20℃/秒)；70℃，30秒(斜率20℃/秒)；95℃，0秒(斜率0，1℃/秒)；步骤4(冷却)：40℃，30秒(斜率20℃/秒)。用于各基因的PCR引物序列描述于表3中。使用RelQuant程序(Roche)进行PCR产物的量化。
Quantigene测定
收获细胞，并在来自Quantigene
Figure A200780018289D0016111124QIETU
试剂盒的1×裂解混合物中在53℃裂解30分钟。在特异性探针组的存在下在Quantigene
Figure A200780018289D0016111124QIETU
捕获板中在53℃将细胞裂解物杂交过夜，使用Luminoskan通过发光信号将mRNA表达线性量化。
细胞测定：(ELISA，EIA)
A549细胞
在转染期结束时，用IL-1β(10ng/ml)将A549细胞培养4小时。收获上清液，并使用ELISA分析人IL-8、人MCP-1和人GM-CSF。
PBMC
在过夜转染后，用6小时将PHA(10μg/mL)添加到细胞中。在收获细胞之前，将一些细胞用Rolipram(10μg/mL)或Forskolin(2μM)处理30分钟。收集上清液，并冷冻直至按照生产商的指南进行IL-2和TNF-α ELISA。对裂解的细胞沉淀进行细胞内cAMP水平测定，冷冻裂解物，直至按照生产商的程序进行cAMPEIA的时候。
NHBE细胞：
在转染期结束时，用细胞因子混合物(500U/mL TNF-α+10ng/mL IL1-β+10ng/mL IFNγ)将NHBE细胞刺激4小时，通过ELISA测定上清液中的MCP-1蛋白分泌，根据AlamarBlue测定测量的细胞活力进行归一化。
实例1：反义物的组成和体外效力
此试验中制备的反义寡核苷酸的序列和组成如表1a、1b、1c和1d所示。所有寡核苷酸均通过阴离子交换HPLC或凝胶电泳进行了纯化，并经使用SephadexG-25珠的尺寸排阻色谱除盐。表1a-1d中列出的一些被选序列的效力在图1A和1b中显示，图1A和1b显示了用所示AON进行转染之后，细胞中的特异性PDE亚型的基因表达的减少。图1A显示了细胞系(用于PDE3A、PDE3B和PDE7A的A549或者用于PDE4A、PDE4B和PDE4D的293细胞)在用特异性AON过夜转染之后具有降低的靶亚型水平。针对PDE3A/B、PDE4D和PDE7A，用Quantigene
Figure A200780018289D0016111124QIETU
测定(Panomics)对PDE mRNA表达水平进行量化，并使用实时PCR量化PDE4A/4B的表达。相对于对照基因(β2M、Ppib或HPRT)的表达将PDE亚型水平归一化，并将这些水平与未处理细胞的表达水平相比较。
尽管所设计的大多数反义寡核苷酸对PDE亚型具有特异性，但是一些AON，特别是对于PDE4亚型，表现出对于超过一种的PDE4亚型的靶敲除的双特异性。表1c中列出的序列描述了使用单种AON表现出超过一种的靶基因敲除的AON。图1b显示了为双靶特异性而设计的这些AON的功效。AON TOP 1545(SEQ ID NO.14)和TOP 1556(SEQ ID NO.24)各自可识别PDE4B亚型和PDE4D亚型之间所共有的基因序列(表1c)，表明有对于PDE4B和PDE4D的靶基因敲除，而AON.TOP 1507(SEQ ID NO.10)和1508(SEQ ID NO.11)可有效降低转染细胞中的PDE4A和PDE4D的mRNA水平，这两种AON可识别PDE4A和PDE4D亚型之间所共有的序列(表1c)。数据以用对照错配或正义AON序列得到的抑制水平与用它们各自的PDE特异性AON序列得到的抑制％相比较而确定的特异性抑制％表示。
实例2：AON递送对细胞的生物学功能的影响
本实例涉及AON对不同细胞类型的生物学功能、特别是细胞因子和趋化因子分泌的功效。细胞因子和趋化因子是细胞激活和募集的重要介质。通过引起免疫细胞(如嗜中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞)募集的细胞因子的分泌，肺上皮细胞可以在炎症呼吸系统疾病的病理生理学中发挥重要作用。白细胞介素-8(IL-8/CXCL8)和单核细胞化学引诱物蛋白-1(MCP-1/CCL2)水平在COPD患者中上升(Szilasi M等，Pathology Oncology Research.2006 12：52-60)。IL-8和MCP-1水平可以分别参与嗜中性粒细胞和巨噬细胞募集。IL-8和MCP-1均由肺上皮细胞系A549响应IL-1β的刺激而分泌。受刺激的A549细胞还分泌粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)，这是已知激活嗜中性粒细胞和巨噬细胞以增强功能的细胞因子。图2显示了在AON过夜转染然后用IL-1β刺激4小时之后，A549细胞中对PDE4D亚型具有特异性的AON TOP 1497(SEQ ID NO.90)限制趋化因子IL-8/CXCL-8和MCP-1/CCL2和细胞因子GM-CSF分泌的功效。使用此测定使得能够核实参与肺上皮细胞的炎症介质释放的PDE亚型。在图2中，清楚说明了在A549细胞中PDE4D经TOP 1497(SEQ ID NO.90)抑制的贡献，而PDE7A在这些细胞中对于趋化因子和细胞因子的释放没有贡献，尽管用AON TOP1716(SEQ ID NO.92)进行转染成功降低了此基因的mRNA水平。图2显示了在用AON转染后功能的变化，特别是通过减少可以发生在肺上皮细胞中的炎症介质分泌而降低炎症潜能。
图3显示了AON限制不同细胞类型，特别是人外周血单核细胞(PBMC)的生物学功能的功效。PBMC指分泌细胞因子，特别是已知激活巨噬细胞的TNFα和已知激活并刺激T细胞和NK细胞的IL-2的免疫细胞的混合群。用靶向PDE亚型的AON转染过夜然后在第二天用植物血凝素(PHA)刺激的人PBMC与用错配或正义AON序列转染的PBMC相比分泌较少的TNFα和IL-2(图3)。用所述AON对PBMC进行转染导致了这些细胞类型的炎症潜能的降低。在COPD中，炎性细胞和激活的上皮细胞的促炎介质和化学引诱物的释放有助于进一步提高炎症水平(Szilasi M等，Pathology Oncology Research.2006 12：52-60)。
可以预期的是，对PDE基因表达的抑制将导致PDE活性降低，而这又导致细胞内cAMP的增多。图3显示了用靶向特异性PDE亚型的AON进行的转染导致了PBMC中的胞内cAMP水平的升高(右轴)。数据表示了用PDE特异性AON转染后，PBMC中的细胞因子或cAMP水平与用错配或正义序列转染后的水平相比的变化。
细胞因子在包括哮喘和COPD在内的所有疾病的慢性炎症调控中起关键作用。TNF-α是在若干炎症疾病中表达的最重要的促炎细胞因子之一。TNFα水平在患有COPD的患者的诱导唾液中显著升高(Keatings等，Am.J.Respir.Crit.CareMed.1996；153；530-534.)。此外，有证据表明重量下降的COPD患者表现出来自循环细胞的TNFα释放增多，并且TNFα可能引发骨骼肌细胞的细胞凋亡，导致在患有严重COPD的一些患者中可见到的特征性肌肉消瘦和恶病质(De Godoy等，Am.J.Respir.Crit.Care Med.1996，153，633-637.)。TNF-α诱导了包括其本身和IL-8在内的许多促炎细胞因子的基因表达。细胞因子，特别是TNFα，是显示出增多和/或在炎症呼吸系统疾病的病理生理学中发挥作用并参与组织破坏的介质。
PDE4抑制剂经细胞内环AMP增多导致了来自炎性细胞的细胞因子和趋化因子释放的减少(Torphy，Am.J.Respir.Crit.Care Med.1998，157，351-370)。与皮质类固醇相反，PDE4抑制剂对嗜中性粒细胞具有强的抑制效果(Au等，Br.J.Pharmacol.1998，123，1260-1266.)，表明它们可用于COPD的抗炎治疗。有初步证据表明，PDE4抑制剂西洛司特改善了患有COPD的患者的肺功能和症状，这可能是由于细胞因子抑制所致(Compton等，Lancet.2001，358，265-270)。
由于TNFα被视作炎性和慢性呼吸系统疾病的共同特征，所以本发明提供了治疗多种炎性疾病的广泛治疗应用。
实例3：用2’-FANA化学修饰的AON表明对靶基因敲除有增强的功效和延长的作用
本实例涉及对AON进行FANA化学修饰时的PDE特异性AON的增强功效。表2a-2g描述了用FANA残基修饰的AON的组成。在图4中，将A549细胞用图4中所提供的说明所示处于硫代磷酸组合物(PS-DNA)中的或者含有FANA碱基修饰(PS-FANA；TOP1497-F1(SEQ ID NO.72)、TOP-1497-F5(SEQ ID NO.76)、TOP1497-F6(SEQ ID NO.77))的PDE4D特异性AON TOP 1497(SEQ ID NO.90)转染24小时。PDE4D mRNA敲除使用Quantigene
Figure A200780018289D0016111124QIETU
测定(Panomics)来确定，并相对于β2M基因表达将PDE水平归一化。用FANA单体对TOP 1497序列进行的修饰(TOP 1497-F1(SEQ ID NO.72))增强了AON以100ng～400ng的剂量抑制靶基因表达的功效，清楚显示出此修饰对于AON活性的有利之处(图4a)。2’-F-ANA修饰有望增强AON的稳定性，使其更抗核苷酶消化，这会延长其活性。在图4b中，对单剂量的PDE4D特异性AON TOP 1497的不同制剂的随时间的比较清楚显示出含有2’-F-ANA的AON与PS-DNA AON相比具有长达48小时的持续抑制活性。在转染后48小时时，AON的PS-DNA制剂未观察到抑制，不过，即使仅用2’-F-ANA修饰AON TOP 1497-F6(SEQ ID NO.77)19个碱基中的5个，也足以将抑制效果维持到此时间点。通过在用TOP 1497-F5(SEQ ID NO.76)和TOP1497-F1(SEQ ID NO.72)转染之后将更多2’-F-ANA残基引入到所示原序列中，持续抑制得到提高。AON中更大量的2’-F-ANA组成获得了最长的效果，不过通过过夜转染(24小时)，含有7个残基的PS-FANA获得了同含有11个残基的PS-FANA类似的抑制水平。
实例4：用2’F-ANA化学修饰的AON保持了在细胞中的生物学功能
本实例涉及PDE特异性AON的2’-F-ANA化学修饰减少细胞的炎性响应的容限。图2显示出PDE特异性AON减少肺上皮细胞分泌趋化因子的功效。在图5中，研究了含有2’-F-ANA的AON对A549生物学功能的影响。用作为PS-DNA的PDE4B/4D双特异性AON TOP 1545(SEQ ID NO.14)或者用2’-F-ANA修饰TOP 1545-F3(SEQ ID NO.85)转染的A549细胞，在A549细胞中转染含有2’-F-ANA的AON时，与未修饰AON相比，表现出更高的抑制趋化因子分泌的水平。
在原代细胞，特别是人PBMC中，含有2’-F-ANA的AON保持有生物学功效得到了证实。PDE4B/4D特异性AON TOP 1545-F3(SEQ ID NO.85)与PDE7A特异性AON TOP 1731-F2(SEQ ID NO.53)在第二种反义物存在时提高了它们各自的靶基因的抑制，尽管该反义序列与其他靶基因不具有同源性(图6a)。在图6a中，实心柱表示两种AON各自以低剂量(3.2nM)组合使用时，与AON以低和高剂量(6.3nM)单独使用时相比，对PDE4B、PDE4D或PDE7A的靶基因mRNA的特异性抑制％，表明含有2-F-ANA的AON在原代免疫细胞中保持了靶基因敲除的功能。对于生物学功能，用PDE4B/4D双特异性TOP1545-F3(SEQ ID NO.85)与PDE7A特异性AON TOP 1731-F2(SEQ ID NO.53)的组合对PBMC进行的转染导致TNF-α和IL-2的分泌同时受到抑制。含有2’-F-ANA的AON保持了它们降低免疫细胞的炎性潜能的功能性。
图6a中的结果还显示了将对两种不同靶基因具有特异性的AON组合同时施用于细胞时发生的增强效果。尽管AON以在单独使用时对它们的靶基因几乎没有效果乃至没有效果的浓度施用，但在组合时，AON诱导出对它们各自靶(对于TOP 1545-F3(SEQ ID NO.85)，为PDE4B和PDE4D；而对于TOP 1731-F2(SEQID NO.53)，为PDE7A)的基因表达的显著抑制。
实例5：PDE4B/4D AON对细胞分裂调控基因的影响
表1c描述了具有对PDE4B和PDE4D的双特异性的TOP1545AON的序列。TOP 1549(SEQ ID NO.17)AON的序列与胸苷酸合成酶(TYMS)基因序列具有100％的同源性，并且与PDE4B和PDE4D相比具有5个碱基对错配。TOP 1549(SEQ ID NO.17)AON在6小时转染后以剂量响应方式(200ng、400ng和800ng)抑制其靶基因表达(TYMS)。虽然与TYMS基因序列相比具有5个碱基对错配，但是含有2’-F-ANA的TOP 1545(SEQ ID NO.14)AON在6小时转染后也有效抑制293细胞中TYMS基因的表达。TYMS是DNA合成的关键限速酶，并且在一些癌症中被上调。TOP 1545(SEQ ID NO.14)AON具有这样的潜能：不仅通过降低PDE4B和PDE4D mRNA水平而抑制PDE功能，而且还通过其对TYMS基因表达的影响而发挥抑制细胞增殖的作用。此图表明，TOP1545(SEQ ID NO.14)是具有对磷酸二酯酶4(PDE4)和胸苷酸合成酶(TS)的双特异性的新型反义分子。
在文献中还描述了将PDE4抑制剂作为cAMP提高剂；对PDE4的抑制阻断了cAMP分解成AMP，从而导致了cAMP的积累。为人熟知的是，高胞内水平的cAMP能够有效地杀灭体外癌细胞。
胸苷酸合成酶(TYMS)对于大多数生物而言是DNA合成和细胞分裂所必需的单磷酸胸腺嘧啶的来源，所以是明显的抗癌靶。TYMS除了其编码区中的一小段17个连续核苷酸之外，其在结构上与PDE无关。TOP1545(SEQ ID NO.14)靶向在TYMS与PDE4B和PDE4D之间的该同源性区域，使TOP1545(SEQ ID NO.14)成为独特的抗癌化合物。
实例6：AON的体外潜力
本实例显示了用PDE4D/4B特异性AON TOP1572-F2(SEQ ID NO.122；图8A)或者PDE7A特异性AON TOP1731-F3(SEQ ID NO.54，图8B)转染的CYNOM-K1猴细胞中基因表达的减少。与未转染的细胞相比，PDE4D和PDE4BmRNA水平分别降低了53％和66％(图8A)，PDE7A基因表达降低了70％(图8B)。
实例7：AON递送对细胞生物学功能的影响
本实例涉及PDE4D/4B特异性AON TOP1572-F2(SEQ ID NO.122)和TOP1545(SEQ ID NO.14)降低PDE4D mRNA表达水平(图9A)和减少响应细胞因子混合物(500U/mL TNF-α+10ng/mL IL1-β+10ng/mL IFNγ)4小时刺激的NHBE细胞中受刺激的MCP-1细胞因子分泌(图9B)的功效。TOP1572-F2(SEQIDNO.122)减少了71％的PDE4D mRNA表达水平，同时相应地抑制了34％的MCP-1分泌。类似地，相对于用相应对照转染的细胞，TOP1545(SEQ ID NO.14)减少了36％的PDE4D mRNA表达水平，同时相应地抑制了46％的MCP-1分泌。
实例8：AON递送对细胞中生物学功能的影响
本实例涉及PDE特异性AON抑制经PHA刺激的人外周血单核细胞(PBMC)的促炎细胞因子分泌的功效。PBMC是包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞在内的白细胞的混合群，所有这些细胞都可以被刺激而释放促炎细胞因子。用PDE4B/4D特异性TOP 1572(图10)转染过夜然后第二天用有丝分裂原植物血凝素(PHA，10μg/ml)刺激6小时的人PBMC，与用PHA刺激但不进行转染的那些细胞相比，分泌的促炎细胞因子IL-2减少了51％(图10A)，而TNF-α减少了42％(图10B)。类似地，与不进行转染但用PHA刺激的那些PBMC相比，用PDE7A特异性AON TOP 1731转染的PBMC(图11)分泌的IL-2减少了48％，而TNF-α减少了60％。
实例9：TOP 1572和TOP 1731组合时抑制免疫应答的增强功效
本实例涉及AON组合时减少经PHA刺激的PBMC的IL-2分泌的效果。用各为3.1nM的TOP 1572-F2(SEQ ID NO.122)和TOP 1731-F3(SEQ ID NO.54)转染的PBMC导致了与每种AON单独以3.1nM或6.3nM剂量转染后观察到的抑制水平更高的IL-2抑制水平(33％)(图12)。在本实例中，低剂量TOP 1572-F2获得了少于10％的IL-2抑制，而高剂量(6.3nM)获得了24％的IL-2抑制(图12)。对于TOP 1731-F3，低剂量(3.1nM)获得了20％的IL-2抑制，当剂量增大到6.3nM时，该水平在统计上并不上升(22％抑制)(图12)。TOP 1572-F2与TOP 1731-F3的组合产生了33％的IL-2分泌抑制可能是由于同时靶向PDE4B、PDE4D和PDE7A的不同PDE亚型所致(图12)。
实例10：细胞系中的PS-DNA和PS-FANA化学性质的比较
本实例比较了在减少靶mRNA表达方面PS-DNA AON的功效与PS-FANAAON的功效。TOP1572-F2形式(SEQ ID NO.122)在同时减少PDE4D(图13A)和PDE4B(图13B)的mRNA表达方面表现出比标准PS-DNA形式TOP1572(SEQ IDNO.40)更长的持续作用时间。在293细胞中进行72小时转染之后，TOP1572-F3仍减少了72％的PDE4B mRNA表达和55％的PDE4D mRNA表达，而TOP1572功效对于PDE4B降低了18％，而对于PDE4D降低了29％。在更低剂量时也观察到FANAAON活性的上升。TOP1731-F3 FANA形式(SEQ ID NO.54)在阻断以125nM和75nM剂量转染48小时的A549细胞中的PDE7A mRNA表达方面优于PS-DNA形式TOP1731(SEQ ID NO.2)(图14)。
尽管已在本文中对本发明的优选实施方式进行了说明，但本领域技术人员会理解到，在不背离本发明的实质和所附权利要求的范围的情况下可以对本发明作出变动。本说明书中引用的所有文件通过引用结合于此。
表1a
Figure A200780018289D00461
表1b
Figure A200780018289D00462
表1c
表1d
Figure A200780018289D00481
表2a
Figure A200780018289D00482
表2b
Figure A200780018289D00491
表2c
Figure A200780018289D00492
表2d
Figure A200780018289D00493
表2e
Figure A200780018289D00494
表2f
Figure A200780018289D00501
表2g
Figure A200780018289D00502
表3
Figure A200780018289D00511
Figure A200780018289D00512
序列表
<110>Topigen Pharmaceuticals Inc.
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<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
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Figure A200780018289D00581
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<211>19
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<220>
<221>misc_feature
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Figure A200780018289D00583
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<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，6，7，8，11，12，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>42
Figure A200780018289D00584
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<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
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<220>
<221>misc_feature
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Figure A200780018289D00591
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<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
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<220>
<221>misc feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，13，14，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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Figure A200780018289D00593
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<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，13，14，15，16，17，18
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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Figure A200780018289D00594
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<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，15，16，17，18，19，20
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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Figure A200780018289D00601
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<213>Human
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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Figure A200780018289D00602
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<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>49
Figure A200780018289D00603
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<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，16，17，18，19
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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Figure A200780018289D00604
<210>51
<211>19
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<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，12，13，14，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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Figure A200780018289D00611
<210>52
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<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，16，17，18，19，20，21
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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Figure A200780018289D00612
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，18，19，20，21
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>53
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，18，19，20，21
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>54
Figure A200780018289D00614
<210>55
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
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<223>第1，2，12，13，14，15，16，17，18，19，
     20，21位的核苷酸是2’-脱氧2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>55
Figure A200780018289D00621
<210>56
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，16，17，18，19，20，21
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>56
Figure A200780018289D00622
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，16，17，18，19，20，21
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>57
Figure A200780018289D00623
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，14，15，16，17，18，19
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>58
Figure A200780018289D00624
<210>59
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，16，17，18，19，20，21
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>59
Figure A200780018289D00631
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，7，8，9，17，18，19，
     20位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，7，15，16，17，18，19，
     20位的核苷酸是2’-脱氧2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>61
Figure A200780018289D00633
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，7，14，15，16，17，18，
     19，20位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>63
Figure A200780018289D00642
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，8，9，10，14，15，19，20
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>64
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，5，8，10，11，12，14，17，18
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>65
Figure A200780018289D00644
<210>66
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，13，14，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>66
Figure A200780018289D00651
<210>67
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，7，8，9，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>67
<210>68
<211>17
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<213>Human
<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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Figure A200780018289D00653
<210>69
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<213>Human
<220>
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<223>第1，2，3，4，5，12，13，14，15，16，17，
     18，19位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>69
Figure A200780018289D00654
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<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第3，4，8，9，12，13，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>70
Figure A200780018289D00661
<210>71
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第11，12，13，14，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>71
Figure A200780018289D00662
<210>72
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>72
Figure A200780018289D00663
<210>73
<211>19
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<213>Human
<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
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<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第5，6，7，8，12，13，14，15
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>miscc_feature
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<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，5，6，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>75
Figure A200780018289D00672
<210>76
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>76
Figure A200780018289D00673
<210>77
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第15，16，17，18，19
     位的核廿酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>77
Figure A200780018289D00674
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，7，15，16，17，18，19，
     20位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>78
Figure A200780018289D00681
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，7，15，16，17，18，19，
     20位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>丁二醇连接子
<400>79
Figure A200780018289D00682
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，12，13，14，15，16，17，18，
     19，20位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>丁二醇连接子
<400>80
Figure A200780018289D00683
<210>81
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，12，13，14，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>81
<210>82
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，6，14，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>82
Figure A200780018289D00692
<210>83
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，12，13，14，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>83
Figure A200780018289D00693
<210>84
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，13，14，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>84
Figure A200780018289D00694
<210>85
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，14，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>85
Figure A200780018289D00701
<210>86
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，11，12，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>86
Figure A200780018289D00702
<210>87
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，3，5，7，9，11，13，15，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>87
Figure A200780018289D00703
<210>88
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，7，8，9，14，15，16，17
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>88
Figure A200780018289D00704
<210>89
<211>20
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>89
Figure A200780018289D00705
<210>90
<211>19
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>90
Figure A200780018289D00711
<210>91
<211>19
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>91
Figure A200780018289D00712
<210>92
<211>17
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>92
Figure A200780018289D00713
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<400>93
Figure A200780018289D00714
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<211>21
<212>DNA
<213>Human
<400>94
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<211>22
<212>DNA
<213>Human
<400>95
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<211>22
<212>DNA
<213>Human
<400>96
Figure A200780018289D00717
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<400>97
Figure A200780018289D00718
<210>98
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<400>98
Figure A200780018289D00719
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<400>99
Figure A200780018289D00721
<210>100
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<400>100
Figure A200780018289D00722
<210>101
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<400>101
<210>102
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<400>102
Figure A200780018289D00724
<210>103
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<400>103
Figure A200780018289D00725
<210>104
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<400>104
Figure A200780018289D00726
<210>105
<211>28
<212>DNA
<213>Human
<400>105
Figure A200780018289D00727
<210>106
<211>23
<212>DNA
<213>Human
<400>106
Figure A200780018289D00728
<210>107
<211>26
<212>DNA
<213>Human
<400>107
Figure A200780018289D00731
<210>108
<211>22
<212>DNA
<213>Human
<400>108
Figure A200780018289D00732
<210>109
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<400>109
Figure A200780018289D00733
<210>110
<211>17
<212>DNA
<213>Human
<400>110
Figure A200780018289D00734
<210>111
<211>20
<212>DNA
<213>Human
<400>111
Figure A200780018289D00735
<210>112
<211>23
<212>DNA
<213>Human
<400>112
Figure A200780018289D00736
<210>113
<211>19
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>113
<210>114
<211>15
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>114
<210>115
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，10，11，18，19，20，21
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>115
Figure A200780018289D00741
<210>116
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，5，6，10，11，12，18，19，20，21
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<400>116
Figure A200780018289D00742
<210>117
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，16，17，18，19，20，21
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>肌苷
<400>117
Figure A200780018289D00743
<210>118
<211>21
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，17，18，19，20，21
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>肌苷
<400>118
Figure A200780018289D00751
<210>119
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>肌苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>肌苷
<400>119
Figure A200780018289D00752
<210>120
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，7，8，9，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>肌苷
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>肌苷
<400>120
Figure A200780018289D00753
<210>121
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，4，5，14，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>肌苷
<400>121
Figure A200780018289D00761
<210>122
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>肌苷
<400>122
Figure A200780018289D00762
<210>123
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，7，8，9，15，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)(11)
<223>肌苷
<400>123
Figure A200780018289D00763
<210>124
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<220>
<221>misc_feature
<222>(11)..(11)
<223>肌
<400>124
Figure A200780018289D00771
<210>125
<211>19
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，16，17，18，19
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<400>125
Figure A200780018289D00772
<210>126
<211>15
<212>DNA
<213>Human
<220>
<221>misc_feature
<223>所有的核苷酸都是通过硫代磷酸酯键连接起来的.
<220>
<221>misc_feature
<223>第1，2，3，13，14，15
     位的核苷酸是2’-脱氧-2’-氟代阿糖核苷酸.
<400>126
Figure A200780018289D00773

Claims (56)

1.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸具有一个碱基序列，该碱基序列选自构成如下的组：(i)SEQ ID NOS.1～92和113～126以及(ii)包含一个碱基插入、缺失或置换的SEQ ID NOS.1～92和113～126。
2.如权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有选自SEQ ID NOS.1～92和113～126所组成的组中的一个碱基序列。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有一个磷酸二酯主链。
4.如权利要求1所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有一个硫代磷酸酯主链。
5.如权利要求4所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸的至少一个核苷酸是2′-脱氧-2′-氟代阿糖核苷酸。
6.如权利要求5所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸选自SEQ ID NOS.41～88和115～126所组成的组。
7.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1～6中任一项所述的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸与一种药学可接受的载体的组合。
8.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1～6中任一项所述的寡核苷酸中的至少两种寡核苷酸与一种药学可接受的载体的组合。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸中的一种第一寡核苷酸是针对PDE7A的。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸的一种第二寡核苷酸是针对PDE4B和PDE4D的。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸是选自SEQ ID NOS.41～88和115～126所组成的组。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.2和SEQ ID NO.14。
13.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.2和SEQ ID NO.24。
14.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.2和SEQ ID NO.37。
15.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.2和SEQ ID NO.40。
16.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.2和SEQ ID NO.85。
17.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.2和SEQ ID NO.122。
18.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.53和SEQ ID NO.14。
19.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.53和SEQ ID NO.24。
20.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.53和SEQ ID NO.37。
21.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.53和SEQ ID NO.40。
22.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.53和SEQ ID NO.85。
23.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.53和SEQ ID NO.122。
24.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.54和SEQ ID NO.14。
25.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.54和SEQ ID NO.24。
26.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.54和SEQ ID NO.37。
27.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.54和SEQ ID NO.40。
28.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.54和SEQ ID NO.85。
29.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述至少两种寡核苷酸为SEQID NO.54和SEQ ID NO.122。
30.一种用于治疗患有与cAMP减少有关的疾病的受试者的方法，所述方法包括施用权利要求7～29中任一项所述的药物组合物。
31.一种用于治疗受试者的呼吸道炎症的方法，所述方法包括施用权利要求7～29中任一项所述的药物组合物。
32.如权利要求31所述的方法，其中，所述呼吸道炎症是由下述疾病中的任一种所引起：慢性阻塞性肺病、哮喘、嗜酸性粒细胞性咳嗽、支气管炎、肺同种异体移植物的急性和慢性排斥反应、结节病、肺纤维化、鼻炎、鼻窦炎、病毒感染或肿瘤疾病。
33.如权利要求32所述的方法，其中，所述疾病是慢性阻塞性肺病。
34.权利要求7～29中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗与cAMP减少有关的疾病的药物中的应用。
35.权利要求7～29中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗呼吸道炎症的药物中的应用。
36.如权利要求35所述的应用，其中，所述呼吸道炎症是由下述疾病中的任一种所引起：慢性阻塞性肺病、哮喘、嗜酸性粒细胞性咳嗽、支气管炎、肺同种异体移植物的急性和慢性排斥反应、结节病、肺纤维化、鼻炎、鼻窦炎、病毒感染或肿瘤疾病。
37.如权利要求36所述的应用，其中，所述疾病是慢性阻塞性肺病。
38.权利要求7～29中任一项所述的药物组合物用于治疗与cAMP减少有关的疾病的应用。
39.权利要求7～29中任一项所述的药物组合物用于治疗呼吸道炎症的应用。
40.如权利要求39所述的应用，其中，所述呼吸道炎症是由下述疾病中的任一种所引起：慢性阻塞性肺病、哮喘、嗜酸性粒细胞性咳嗽、支气管炎、肺同种异体移植物的急性和慢性排斥反应、结节病、肺纤维化、鼻炎、鼻窦炎、病毒感染或肿瘤疾病。
41.如权利要求40所述的应用，其中，所述疾病是慢性阻塞性肺病。
42.一种药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ ID NO.54和SEQ IDNO.122的两种寡核苷酸以及一种药学可接受的载体。
43.一种寡核苷酸，所述寡核苷酸与PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A1、PDE7A2、PDE7A3和PDE7B中的至少一种的mRNA有至少80％互补性，其中，所述寡核苷酸的至少一个核苷酸是2′-脱氧-2′-氟代阿糖核苷酸。
44.如权利要求43所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述mRNA有至少85％互补性。
45.如权利要求43所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述mRNA有至少90％互补性。
46.如权利要求43所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述mRNA有至少95％互补性。
47.如权利要求43所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述mRNA有100％互补性。
48.如权利要求43所述的寡核苷酸，所述寡核苷酸具有一个碱基序列，该碱基序列选自构成如下的组：(i)SEQ ID NOS.1～92和113～126以及(ii)包含一个碱基插入、缺失或置换的SEQ ID NOS.1～92和113～126。
49.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求43～48中任一项所述的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸与一种药学可接受的载体的组合。
50.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求43～48中任一项所述的寡核苷酸中的至少两种寡核苷酸与一种药学可接受的载体的组合。
51.一种用于治疗患有与cAMP减少有关的疾病的受试者的方法，所述方法包括施用权利要求49～50中任一项所述的药物组合物。
52.一种用于治疗患有呼吸道炎症的受试者的方法，所述方法包括施用权利要求49～50中任一项所述的药物组合物。
53.权利要求49～50中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗与cAMP减少有关的疾病的一种药物中的应用。
54.权利要求49～50中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗呼吸道炎症的一种药物中的应用。
55.权利要求49～50中任一项所述的药物组合物用于治疗与cAMP减少有关的疾病的应用。
56.权利要求49～50中任一项所述的药物组合物用于治疗呼吸道炎症的应用。
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