JP2000037193A

JP2000037193A - 微量遺伝子解析のための核酸試料調製方法、調製された核酸試料およびこれを利用した核酸試料解析方法およびこれを利用するための試薬キットおよび解析サ―ビス

Info

Publication number: JP2000037193A
Application number: JP11138051A
Authority: JP
Inventors: Takamichi Muramatsu; 高道村松; Takeshi Fujita; 毅藤田; Masaharu Kiyama; 政晴木山; Takashi Irie; 隆史入江; Kazunobu Okano; 和宣岡野
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1998-05-20
Filing date: 1999-05-19
Publication date: 2000-02-08

Abstract

(57)【要約】【課題】微量遺伝子の発現解析を高分解能で実施でき
るシステムを提供すること。【解決手段】核酸試料中存在量の多いＡｂｕｎｄａｎ
ｔクラスの遺伝子は比較的容易に解析できることおよび
バイアスを利用して容易に選択的な除去ができることに
着目して、存在量の多い遺伝子を除去した核酸試料を得
て、これから微量遺伝子の発現解析を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸試料を調製す
る方法、特に試料中の微量遺伝子の解析に適した核酸試
料の調製方法、この調製方法によって得られた核酸試
料、この調製方法の実行に有用な試薬キットおよびこの
試料を使った解析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの体を構成している細胞は、２００
以上の種類に分けられ、さらに１つの細胞型には、微妙
に異なる種類が存在する。それぞれの細胞は、約１０万
種の遺伝子がコードされた共通のゲノムをもち、細胞型
に応じて数万種類の遺伝子を発現していると考えられて
いる。このような遺伝子の発現を調べることは、個々の
遺伝子の機能に関する知見を得るためだけではなく、生
命現象を解明するうえでますます重要になりつつある。
また、これまで少数の比較的限られた遺伝子を対象にし
た詳細な解析が行われてきた結果、多くの生命現象は複
数の遺伝子が協調的に働くことが分かってきた。さらに
ゲノムプロジェクトの流れとして、遺伝子と生命現象を
マクロにとらえるために遺伝子群の動態を調べる研究が
始められようとしている。このような状況下にあり、多
数の遺伝子をより詳細に解析する技術の必要性がうたわ
れている。

【０００３】近年、ＲＮＡのフィンガープリントを比較
することにより、遺伝子発現を解析する手法（ディファ
レンシャル・ディスプレー法（Liang,P., and Pardee,
A.B.(1992) Science 257,967-971）、モレキュラー・イ
ンデックス法（Kikuya Kato(1995) Nucleic Acids Re
s.,23,3685-3690）等）や、ＤＮＡチップを利用する方
法が開発され、発現している遺伝子を網羅的に解析でき
る可能性が生まれてきた。

【０００４】遺伝子発現は、その発現量から３クラスに
大きく分けられる。細胞あたり１２，０００コピー以上
のＡｂｕｎｄａｎｔクラス、約３００コピーのＩｎｔｅ
ｒｍｅｄｉａｔｅクラスそして１５コピー程度しかない
Ｒａｒｅクラスである。一方、発現遺伝子の種類に関し
ては、哺乳類においては細胞当たり数万種類におよび、
ほとんどの遺伝子はＲａｒｅクラスに属する。つまり細
胞内における発現遺伝子は、極微量にしか発現していな
い膨大な遺伝子種に、極少数ながら３〜４桁量の多い遺
伝子が混在している状態にある（例えば、Alberts,B.,
et al.（1989）Molecular biology of the cell， 2nd
edition. Garland Publishing Inc.）。

【０００５】現在、微量遺伝子解析には、平衡化ライブ
ラリー（Minoru S.H.Ko (1990) Nucleic Acids Res.,1
8,5705-5711）あるいはディファレンシャル・ディスプ
レー法、モレキュラー・インデックス法などのｍｕｌｔ
ｉｐｌｅｘＰＣＲをベースにした方法、ＤＮＡチップ
を使用する方法などが知られている。しかし、平衡化ラ
イブラリーは、遺伝子種間において存在量を均一化する
ため発現量に関する情報は失われること、ディファレン
シャル・ディスプレーなどのｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ
を用いた解析を行った場合、競合的なＰＣＲ反応が起こ
り、存在量の遺伝子に強いバイアスがかかるため通常の
ＰＣＲに比べ検出感度が低下し、Ｒａｒｅクラスの遺伝
子を検出することが難しくなることが知られている（Da
vid J. Bertioli, et al. (1995) Nucleic Acids Res.,
23,4520-4523）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、核酸試料中
の微量遺伝子の解析に適した核酸試料の調製方法、この
調製方法によって得られた核酸試料を提供することおよ
びこの試料を利用して微量遺伝子を解析する解析方法を
提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ディファ
レンシャル・ディスプレー法を用いた遺伝子発現解析を
行う過程で、核酸試料中存在量の多い遺伝子（Ａｂｕｎ
ｄａｎｔクラス）は比較的容易に解析できること、存在
量の多い遺伝子はバイアスがかかるためプローブを用い
て容易に選択的な除去ができ、したがって、解析すべき
核酸試料からあらかじめ存在量の多い遺伝子を除去した
核酸試料を用いて微量遺伝子の発現解析を行うと高精度
化が望めることに着目して本発明を完成したものであ
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】図１に本発明による微量遺伝子を
解析するための解析方法の基本手順を示す。１００は解
析の対象となる核酸試料を準備する過程、２００は核酸
試料中において一つあるいは複数の存在量が多い遺伝子
を、上記遺伝子と特異的に結合するプローブ担体を上記
核酸試料に混合し結合せしめて除去する過程、３００は
結合しなかった核酸試料を回収することにより微量遺伝
子を主体とする核酸試料を得る過程、４００は微量遺伝
子を解析する過程である。ここで、これらの過程１００
−３００、すなわち、解析の対象となる核酸試料から微
量遺伝子を主体とする核酸試料を得るまでの工程をより
詳細に見ると、次のようである。

【０００９】step１：核酸試料を生体試料から調製する
処理、 step２：プローブ担体を合成する処理、 step３：核酸試料とプローブ担体を混合し結合させる処
理、 step４：結合した遺伝子を除く処理、 step５：核酸試料を回収する処理。

【００１０】上記各stepにおいて、核酸試料とは、研究
対象である生体試料、例えば細胞、組織、個体などから
抽出した複数の遺伝子由来のｍＲＮＡ（メッセンジャー
ＲＮＡ）、ｍＲＮＡを含んだＴｏｔａｌＲＮＡ（全Ｒ
ＮＡ）あるいはｍＲＮＡに基づいて合成されたｃＤＮＡ
（相補ＤＮＡ）から構成された混合物を意味する。ま
た、遺伝子とは、発現し機能する塩基配列を表し、その
存在量の違いからＡｂｕｎｄａｎｔ、Ｉｎｔｅｒｍｅｄ
ｉａｔｅ、Ｒａｒｅの各クラスに分けた。本発明で除去
する遺伝子の対象はＡｂｕｎｄａｎｔクラスとＩｎｔｅ
ｒｍｅｄｉａｔｅクラスの一部であり、解析対象はＩｎ
ｔｅｒｍｅｄｉａｔｅクラスとＲａｒｅクラスの遺伝子
を意味している。

【００１１】本発明は、例えば以下のように実施するこ
とができる。

【００１２】step１は、生体試料に応じて公知の手法が
応用できる。例えばRNAの精製には、ＡＧＰＣ法（例え
ば、Chomoczynski,P. and Sacchi,N. (1987) Anal. Bio
chem., 162, 156-159）などあり、市販されている例え
ばＴＲＩＺＯＬＲｅａｇｅｎｔ（GIBCO BRL社）など
を使用することができる。first strand cDNAの合成は、
例えば、Sambrook,J.,ら（Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, 2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory
Press）の手法により、市販のキットを用いて行うこと
ができる。

【００１３】step２は、核酸試料から除去すべき遺伝子
(以下、除去遺伝子と称する）の選択を行う必要があ
る。生体試料中で比較的多量に発現している遺伝子に関
する情報は、以下のようにして得ることができる。現在
公開されているデータベース、例えばKousaku Okubo, K
enichi Matsubara et al.(IMCB, Osaka Univ.）が、行
っているヒトの各組織ごとの発現遺伝子データベースＢ
ｏｄｙＭａｐ（http://www.imcb.osaka-u.ac.jp/bodyma
p/）を利用する方法がある。あるいは情報がない場合に
も、実験的にＳＡＧＥ法（Victor E. Velculescue et a
l.(1995) Science,270,484-487）などにより比較的簡単
に調べることが可能である。また、除去遺伝子のほとん
どは、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれるほとんどの細
胞種で恒常的に発現している遺伝子であることが予想さ
れる。そのため生物種さえ同じであれば、選択した遺伝
子種の一部を変更するのみで他の生体試料においても利
用可能であることが多いと考えられる。

【００１４】プローブ配列は、以下の条件を満たすよう
設計する。除去遺伝子配列の一部と相補的な配列であ
り、かつその他の遺伝子と結合しにくい配列を選ぶこ
と、プローブ同士が対合しないこと、分子内水素結合し
にくい配列を選ぶこと、プローブと遺伝子とのＴｍ(融
解温度）が適当（４０〜７０度の範囲が望ましい）なこ
と。プローブの形態や材質などは、除去方法に応じて異
なるため後述する。

【００１５】step３−５は、以下の３通りの方法が利用
できる。ここで第一の方法は図２Ａ−図２Ｇ、図３Ａ−
図３Ｇ、図４Ａ−図４Ｅおよび図５Ａ−図５Ｇを、第二
の方法は図６Ａ−図６Ｆ、図７および図８Ａ−図８Ｂ
を、第三の方法は図９を、それぞれ参照しながら説明す
る。図２Ａ−図２Ｇ、図３Ａ−図３Ｇ、図４Ａ−図４Ｅ
および図５Ａ−図５Ｇでは、一つの除去遺伝子を対象に
した説明をしているが、除去遺伝子が複数ある場合は、
一つの核酸試料のそれぞれの除去遺伝子に対して同様に
設計、合成した複数種類プローブを準備し、順次実施す
ることができる。

【００１６】まず、第一の方法について述べる。

【００１７】図２Ａ−図２Ｇに示す例の場合：図２Ａは
準備した核酸試料の状態を示す。たとえば、ｍＲＮＡか
らなる核酸試料を使用する。ＴｏｔａｌＲＮＡでもよ
い。ここで、１は残すべき複数種の微量遺伝子、２は除
去すべき遺伝子(以後除去遺伝子という)を示す。図で
は、除去遺伝子２の方が試料中に少ないような印象を受
けるが、除去遺伝子２はＡｂｕｎｄａｎｔクラスのもの
であり、試料中に占める量は相対的に多いものである。

【００１８】図２Ｂは、準備した核酸試料中にプローブ
担体を加える処理を示す図である。プローブ担体３は、
除去遺伝子の３’末端付近と結合する配列をもつＤＮＡ
あるいは類似体、例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）を材質
としたものでなおかつ伸長反応を防ぐために３’末端を
修飾したものを用意する。このプローブ担体３の材質
は、配列に対する特異性が高く、酵素が認識できるもの
であればよい。

【００１９】なお、本実施例におけるプローブ担体３に
ついて以下に簡単に説明する。一般に、自動合成機を用
いたＤＮＡ合成方法のほとんどは、３’末端のヌクレオ
シドをアミノメチルポリスチレンやＣｏｎｔｒｏｌｌｅ
ｄ−ＰｏｒｅＧｌａｓｓ（ＣＰＧ）等の樹脂に結合さ
せた固相合成であり、合成が終了した後、樹脂から切り
離し、合成ＤＮＡが得られる。この方法に依ってプロー
ブを調製すると、３’末端を修飾したプローブを得るた
めには、さらに修飾反応を行う必要が生じる。そのた
め、樹脂から切り離した時には、既に３’末端が修飾さ
れているようにあらかじめ変えた樹脂結合ヌクレオシド
を用いたＤＮＡ合成方法、例えば、ヌクレオシドと樹脂
との結合部位を３’から２’に変え、３’の水酸基の代
わりに水素にした樹脂結合ヌクレオシドなどを用いたＤ
ＮＡ合成方法とすれば、再度の修飾反応は省略できる。

【００２０】したがって、本発明のように、多種類の除
去遺伝子に対応する３’末端修飾プローブを合成するた
めに、上述した方法を用いれば簡便に行える。また、市
販合成装置にこの手法を適用すると、特別な道具及び技
術を必要とせずにプローブを調製することができる。

【００２１】図２Ｃは準備した核酸試料中でプローブ担
体３が除去遺伝子２に結合する様子を説明する図であ
る。核酸試料とプローブ担体３を例えばマイクロチュー
ブ中で混合し、結合に適した条件（時間、反応液温度、
塩濃度、混入物など）に放置し、除去遺伝子２とプロー
ブ担体３を結合させる。反応槽は、マイクロチューブに
限らず、核酸の反応槽の壁への吸着が少なく、核酸試料
溶液の蒸発を防ぐ構造を持ち、外部あるいは内部からの
温度調節ができれよい。結合条件は、プローブ設計ソフ
ト例えばＯＬＩＧＯ(National Biosciences, Inc.)など
で算出できる。

【００２２】図２Ｄは、プローブ担体３と除去遺伝子２
とが結合状態にある核酸試料にリボヌクレアーゼＨを加
える処理を示す図である。

【００２３】図２Ｅは、除去遺伝子２のプローブ担体３
とが特異的かつ十分に結合した配列領域がリボヌクレア
ーゼＨによって分解される状態を説明する図である。こ
の分解の結果、除去遺伝子２は３’末端付近を分解され
て４に示すようなものになる。ここで、リボヌクレアー
ゼＨにはE.coli Ribonuclease Hの他にもThermus therm
ophilus Ribonuclease H(TOYOBO社)など耐熱性など広範
囲の結合条件において活性を持ったものがあり、結合条
件に応じて利用することができる。また、リボヌクレア
ーゼＨ以外でもＤＮＡ−ＲＮＡの水素結合に対して特異
的に作用し分解する酵素あるいは化合物でもよい。

【００２４】図２Ｆは核酸試料に加えたリボヌクレアー
ゼＨを失活させる処理を示す図、図２Ｇは核酸試料にＤ
Ｎａｓｅ処理を行い、核酸試料からプローブ担体３をＤ
ＮＡ分解酵素などを使用して除去する処理を示す図であ
る。かくして、プローブ担体３によって識別される除去
遺伝子２が除去された核酸試料を得ることが出来る。

【００２５】図３Ａ−図３Ｇに示す例の場合：上述した
図２Ａ−図２Ｇに示した除去遺伝子２に対する処理は、
複数のプローブ担体を用いることにより、より効果的に
除去できるものに改善できる。図３Ａ−図３Ｇにこれを
示す。

【００２６】図３Ａは、図２Ａと同様、準備した核酸試
料の状態を示す。

【００２７】図３Ｂは、図２Ｂと同様、準備した核酸試
料中にプローブ担体を加える処理を示す図であるが、こ
の実施例では、プローブ担体を２種類の配列の異なるプ
ローブとした。ここで、プローブ担体３は、除去遺伝子
の３’末端付近と結合する配列をもつＤＮＡあるいは類
似体、例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）を材質としたもの
を用意する。一方、プローブ担体３’は、除去遺伝子の
３’末端付近よりは離れた位置で結合する配列をもつＤ
ＮＡあるいは類似体、例えばＰＮＡ（ペプチド核酸）を
材質としたものを用意する。これらのプローブ担体３、
３’の材質は、配列に対する特異性が高く、酵素が認識
できるものであればよいのはもちろんである。この場合
でも、図２Ｂに関して説明したと同様のプローブとする
のが良いことは言うまでもなかろう。

【００２８】図３Ｃは、図２Ｂと同様、準備した核酸試
料中でプローブ担体が除去遺伝子２に結合する様子を説
明する図である。この実施例では、プローブ担体を３お
よび３’の二つとしたから、図に示したように、除去遺
伝子２にプローブ担体３が結合する場合、除去遺伝子２
にプローブ担体３’が結合する場合および除去遺伝子２
にプローブ担体３、３’が結合する場合の三通りとな
る。

【００２９】図３Ｄは、図２Ｄと同様、プローブ担体
３、３’と除去遺伝子２とが結合状態にある核酸試料に
リボヌクレアーゼＨを加える処理を示す図である。

【００３０】図３Ｅは、除去遺伝子２のプローブ担体
３、３’とが特異的かつ十分に結合した配列領域がリボ
ヌクレアーゼＨによって分解される状態を説明する図で
ある。この実施例は、三通りのプローブ担体３、３’の
結合があるから、リボヌクレアーゼＨによって分解され
る状態も三通りとなる。この分解の結果、除去遺伝子２
は３’末端付近を分解されて４に示すようなものになる
のは図２Ｅとおなじである。ここでも、リボヌクレアー
ゼＨは図２Ｅの説明と同様いろいろあり、リボヌクレア
ーゼＨ以外でもよい。

【００３１】図３Ｆは核酸試料に加えたリボヌクレアー
ゼＨを失活させる処理を示す図、図３Ｇは核酸試料から
プローブ担体３をＤＮＡ分解酵素などを使用して除去す
る処理を示す図である。

【００３２】このように複数のプローブ担体を用いるこ
とによりより、より確実に除去遺伝子とプローブ担体と
を結合させることが可能となるから、結果として、効率
よく除去遺伝子を除くことが出来る。もちろんプローブ
担体の種類は２種類に限らず、もっと多くのものとして
も良い。

【００３３】この実施例におけるプローブも前述したも
のと同様である。

【００３４】図４Ａ−図４Ｅに示す例の場合：次いで、
図２Ａ−図２Ｇのようにして調製した核酸試料であるｍ
ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する手法を説明する。

【００３５】図４Ａは上述した方法で調製した核酸試料
の状態を示す図である。すなわち、複数種類のｍＲＮＡ
である微量遺伝子１と除去遺伝子２の３’末端付近を分
解された除去遺伝子４が混在している。

【００３６】図４Ｂはこの核酸試料にプライマーを加え
ｃＤＮＡ合成を行わせる処理を示す図である。ここでは
ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを使用した例を示してい
るが、使用するプライマーは発現解析手法に依存する。
例えばディファレンシャル・ディスプレー法では、ｏｌ
ｉｇｏ（ｄＴ）プライマーの３’末端にＡ、Ｇあるいは
Ｃいずれかを、付加したものなどを使う。

【００３７】図４ＣはｃＤＮＡ合成反応が進む状態を示
す図である。ｃＤＮＡ合成反応は、逆転写酵素(例え
ば、GIBCO BRL社のSuper Script II RT）を用いて行
う。微量遺伝子１のｃＤＮＡ合成反応は通常の通りに進
行し、ｃＤＮＡ５が合成されるが、プローブ担体３との
結合により、３’末端付近が分解されプライマーとの対
合部分が分離されてしまった除去遺伝子４のｃＤＮＡ合
成反応は、分離された点で止まってしまい、ｃＤＮＡ５
を合成できない。

【００３８】図４Ｄは、核酸試料にＲＮａｓｅ処理を施
して、核酸試料からＲＮＡを取り除く処理を示す図であ
る。

【００３９】図４Ｅは、その結果、除去遺伝子２を含ま
ないｃＤＮＡ５からなる核酸試料が調製された状況を示
す図である。

【００４０】図３Ａ−図３Ｇに示した形で得られた核酸
試料であるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する手法の説明
は省略するが、図４と同様、プローブ担体３あるいは
３’により分解された位置でｃＤＮＡ合成反応が停止す
ることにより、除去遺伝子２を含まないｃＤＮＡからな
る核酸試料が調製される。

【００４１】上記第一の方法においては、図２Ｄ−図２
Ｇ、図３Ｄ−図３Ｇに示した分解反応とこれに伴う処理
過程を省略することもできる。この方法の一つは結合領
域を切断する活性を持ったプローブ担体(例えば、リボ
サイムなど)を利用することである。このような担体を
使用すれば、図２Ｃ、図３Ｃのように担体が結合した結
果として、図２Ｄ、図３Ｄの操作をしなくても、自ずと
図４Ａに示す状態が実現できることになる。

【００４２】図５Ａ−図５Ｅに示す例の場合：図５Ａは
この実施例で使用するｍＲＮＡからなる核酸試料の状態
を示す図である。図２Ａと同様、核酸試料は残すべき複
数種の微量遺伝子１および除去遺伝子２とが混在したも
のである。

【００４３】図５Ｂは、準備した核酸試料中にプローブ
担体を加える処理を示す図である。プローブ坦体３は、
除去遺伝子２の３’末端付近と結合する配列をもちＴｍ
（融解温度）がｃＤＮＡ合成プライマーと少なくとも同
等、理想的には高くなるように設計したものでなおかつ
伸長反応を防ぐために３’末端を修飾したものを用意す
る。材質は、ＤＮＡ（ＤＮＡはそのままでは分解される
ので、たとえば、phosphorothioatesなどで修飾する必
要がある）あるいは類似体、例えばＰＮＡ（ペプチド核
酸）とし配列に対する特異性が高く、逆転写酵素に分解
されないものであれあばよく、３’末端の修飾は、デオ
キシ化やアミノ化などで実現できる。また、この場合で
も、図２Ｂに関して説明したと同様のプローブとするの
が良いことは言うまでもなかろう。

【００４４】図５Ｃは準備した核酸試料中でプローブ担
体３が除去遺伝子２に結合する様子を説明する図であ
る。この結合は図２Ｃで説明したと同様で良い。

【００４５】図５Ｄはこの核酸試料にプライマーを加え
ｃＤＮＡ合成を行わせる処理を示す図である。ここで
も、図４Ｂと同様、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを使
用した例を示しているが、合成プライマーやｃＤＮＡ合
成反応の条件は前述の方法と同様、変形がありうる。

【００４６】図５ＥはｃＤＮＡ合成反応が進む状態を示
す図である。ｃＤＮＡ合成反応は、図４Ｃで説明したと
同様の条件で良い。この実施例では、除去遺伝子２は
３’末端付近にプローブ３が結合しているためｃＤＮＡ
５の合成が阻害される。

【００４７】図５Ｆは、核酸試料にＲＮａｓｅ処理を施
して、核酸試料からＲＮＡを取り除く処理を示す図であ
る。

【００４８】図５Ｇは、その結果、除去遺伝子２を含ま
ないｃＤＮＡからなる核酸試料が調製された状況を示す
図である。

【００４９】なお、ここでは、プローブを結合させた
（図５Ｃ）後に合成プライマーを加えた（図５Ｄ）が、
プローブ坦体３とプライマーを同時に加えた後、プロー
ブ坦体の結合条件を満たした後、ｃＤＮＡ合成を行って
も良い。また、結合は、水素結合の力によるが、プロー
ブ坦体３に光ラベル等を施したものを用意し、結合させ
た後光照射等で除去遺伝子と、プローブ坦体を共有結合
させても良い。また、本実施例におけるプローブ坦体３
は図２Bで説明したのと同様である。

【００５０】次に、第二の方法について図６Ａ−図６Ｆ
を参照しながら述べる。本方法の特徴は、プローブを固
相に固定することにある。核酸試料は、ｍＲＮＡ、firs
t strand cDNAのいずれでも行うことができる。プロー
ブの配列は除去遺伝子中のいずれの領域を対象において
も良いが、発現解析において調べる領域が予測される場
合は、同じ領域を使うほうが良い。例えば、ディファレ
ンシャル・ディスプレー法では、３’領域を解析するの
で３’領域をプローブにする。プローブを固定化する固
相としては、ビーズ、ガラスプレート、マイクロチュー
ブなど形状はいずれでも良いがプローブを高密度に固定
できる事が必要であること、表面の材質はＤＮＡの吸着
の少ないものが良い。ここでは、ビーズを使った場合の
うち、特に磁気ビーズの場合を説明をする。

【００５１】図６Ａは対象とする核酸試料含む溶液１２
をマイクロチューブ１１に用意する処理である。この場
合でも、図２Ａで説明したように、たとえば、ｍＲＮＡ
からなる核酸試料あるいはＴｏｔａｌＲＮＡでもよ
い。そして、この核酸試料には残すべき複数種の微量遺
伝子１５および除去遺伝子１６とが混在する。

【００５２】図６Ｂは、除去遺伝子２と相補関係にある
プローブ１４を固定したビーズ１３を用意する処理であ
る。ビーズとしては、市販されているもの、例えばダイ
ナル社のダイナビーズ、パーセプティブ社のＢｉｏＭａ
ｇなどが使用できる。固定は、例えば以下のようにして
行う。５’末をビオチンラベル化したプローブ１４を合
成し、表面にストレプトアビジンがコートされているビ
ーズと緩衝液中で混合するとアビジン−ビオチン結合に
よりプローブを固定化できる。

【００５３】図６Ｃは、マイクロチューブ１１中で、準
備した固相化プローブ担体１４と核酸試料１２を混合
し、結合に適した条件に放置し（第一の手法での説明を
参照）、除去遺伝子１６とプローブ１４を特異的に結合
させる処理である。この結果、除去遺伝子１６がプロー
ブ１４に結合してビーズ表面に捕らえられるのに対し
て、残すべき微量遺伝子１５は核酸試料中を漂遊する。

【００５４】図６Ｄは磁石を用いてマイクロチューブ１
１の局所にビーズ群１７を集める処理を示す。

【００５５】図６Ｅ、図６Ｆはマイクロチューブ１１に
はビーズ群１７を残し、反応後の核酸試料を別のチュー
ブ１８に移す処理を示す。

【００５６】この結果マイクロチューブ１８に除去遺伝
子を含まないｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡからなる核酸試
料が回収される。

【００５７】図７および図８Ａ−図８Ｂは、この第二の
方法における図６Ｄ−図６Ｆの処理の別の実施例に有用
な装置の例を示す。

【００５８】図７は、二重の膜構造を有する遠心チュー
ブとした例である。７０１は第１の容器で、上面には
蓋、底部には濾過膜７０３を備える。濾過膜７０３はプ
ローブ担体１３を物理的あるいは化学的に保持する構造
を持つものであり、例えばポアサイズが十分大きく核酸
を透過するが、ビーズ等に固相化したプローブ担体に結
合している除去遺伝子は物理的に透過できない構造を持
ったもの、あるいは、プローブと親和性を持つ物質を使
ったもの、例えば、プローブにはビオチン標識したもの
を、膜にはストレプトアビジンがぬれているもの等が使
用できる。７０４は第２の容器で上部が第１の容器７０
１の下部に係合し、内部に濾過膜７０５を備える。濾過
膜７０５は、核酸を保持するが水、無機塩類は透過さ
せ、核酸を濃縮できる構造のもの、例えば既存の限外ろ
過膜が使える。７０６は第３の容器であり、上部が第２
の容器７０２の下部に係合する。なお、この遠心チュー
ブの構造と類似のものに、たとえば、Amicon社製のマイ
クロピュアEZとマイクロコン等のような遠心チューブが
ある。

【００５９】この三つの容器がセットになった状態で、
第１の容器７０１に前述した方法で得られた核酸試料を
入れ、適当な遠心力を作用させると、ビーズ等に固相化
したプローブ担体に結合している除去遺伝子１６は第１
の容器７０１内に残り、微量遺伝子１５は第２の容器７
０４内に補捉される。もちろん、プローブ１４で処理で
きなかった除去遺伝子は微量遺伝子１５とともに、第２
の容器７０４内に残る。第３の容器７０６には、不要な
液体が集められる。

【００６０】第２の容器７０４内に補捉された遺伝子に
は、微量遺伝子１５のみならず、プローブ１４で処理で
きなかった除去遺伝子も含まれるから、これに含まれる
除去遺伝子については、プローブを変えて処理すること
が必要となるが、これについては、追って説明する。

【００６１】図８Ａ−図８Ｂは、遺伝子の分離を遠心力
によらず、電気泳動によるものとした例であり、図８Ａ
は断面図を、図８Ｂは平面図を示す。８０１は電気泳動
槽で、内部に濾過膜８０３および濾過膜８０５を備え
る。濾過膜８０３の構成は濾過膜７０３と同じで良い。
濾過膜８０５の構成は濾過膜７０５と同じで良い。電気
泳動槽８０１の内部は、濾過膜８０３および濾過膜８０
５で仕切られた８０２、８０４および８０６の三つの槽
を構成する。槽８０２の左端部には電極８１１が、槽８
０６の右端部には電極８１２がそれぞれ設けられる。そ
れぞれの電極には電源８１０から所定の電位が付与され
る。

【００６２】槽８０２には前述した方法で得られた核酸
試料を入れ、槽８０４および８０６は適当な緩衝液を入
れる。槽８０２の核酸試料の量が少ないときは、この槽
にも、緩衝液を入れるのが良い。電源８１０から所定の
電位を作用させると、ビーズ等に固相化したプローブ担
体に結合している除去遺伝子１６は槽８０２内に残り、
微量遺伝子１５は槽８０４内に補捉される。もちろん、
プローブ１４で処理できなかった除去遺伝子は微量遺伝
子１５とともに、槽８０４内に残る。

【００６３】槽８０４内に補捉された遺伝子には、微量
遺伝子１５のみならず、プローブ１４で処理できなかっ
た除去遺伝子も含まれるから、これに含まれる除去遺伝
子については、プローブを変えて処理することが必要と
なるのは、図７の場合と同じである。

【００６４】図７および図８Ａ−図８Ｂの構成で、第２
の容器７０４、槽８０４に遺伝子を集めるための駆動力
としては、上述の方法にかぎられず、試料溶液をポンプ
などにより物理的に移動させることによっても良い。

【００６５】次に、図９を参照しながら第三の方法につ
いて述べる。本方法は、上記第一、第二の方法の除去精
度を上げる手法である。上述した説明において、１回の
処理で、すべての除去遺伝子を取り除くことが出来れば
ベストであるが、１回の処理ですべてが除去できるない
場合もありうる。複数の除去遺伝子を精度よく取り除く
ためには、それぞれの除去遺伝子の除去状態を検出しな
がら取り除くことが有効である。そこで第三の方法で
は、第一、第二の方法によって回収されたものから除去
の程度をモニターし、必要であれば更に除去の対象とな
る遺伝子を除去する過程を連続的に行うものである。

【００６６】図９で示す例は、第二の方法による結果を
より高精度化する例である。９０１は核酸試料を準備す
る工程、９０２はプローブ担体と除去遺伝子とを結合さ
せる工程および９０３はプローブと結合しなかった遺伝
子を含む核酸試料を回収する工程であり、ここまでの工
程は、上記第二の方法と同様に行う。

【００６７】次に、９０４はプローブに結合した遺伝子
の定量と純度の計測を行う工程であり、例えば図６Ａ−
図６Ｆで説明したビーズ１３を使用した方法の場合、図
６Ｅに示すビーズ群１７（核酸試料を回収した後のビー
ズ群）に緩衝液を加え、結合している遺伝子を解離させ
るために加熱する。解離した除去遺伝子をＲＴ−ＰＣＲ
法などによって定量する。９０５は除去操作を繰り返す
かどうかの判断を行う工程であり、９０４の工程の定量
結果に応じて、除去操作の繰り返しの要否を決定する。

【００６８】この判断は、回収した核酸試料中に含まれ
る除去遺伝子が微量遺伝子と同程度の濃度になるまで除
去を繰り返すことを意味している。除去操作を繰り返す
かどうかの判断は結合せずに回収された核酸試料につい
て行ってもよい。除去操作を繰り返すとの判断になった
ときは、処理９０２−９０３の工程を再度行う。除去操
作の繰り返すしと不要との判断になったとき、工程９０
６に示すように、微量発現遺伝子を主体とする核酸試料
が得られる。すなわち、除去遺伝子が微量遺伝子と同程
度の濃度となれば、この核酸試料では、元々微量発現遺
伝子であった遺伝子も十分な比重を占める主要遺伝子と
なるから、電気泳動をしても、他の除去遺伝子の陰に隠
れてしまうということはなくなる。

【００６９】以上のように除去遺伝子を定量しながら除
去作業を繰り返し行うことにより除去の精度が向上す
る。また、プローブ担体として、上記ビーズのかわりに
除去遺伝子をアレイ化したＤＮＡチップを利用した場
合、除去遺伝子の定量が即時に行える。

【００７０】この結果、遺伝子解析の操作は、微量発現
遺伝子を主体とする核酸試料を対象に行われることにな
るから、高精度の分析結果が得られる。

【００７１】本発明の検証実験本発明のように、微量発現遺伝子を主体とする核酸試料
を調製することの有効性を調べるため、除去遺伝子の存
在が微量遺伝子の解析に及ぼす影響を調べた。実験材料
は、両端に同じ配列を持つ１０種類の大きさの異なるマ
ウスの遺伝子を用いた。１０種類（分子量の大きなもの
からＡ−Ｊ）のうち１種類（Ｈ遺伝子）だけ存在量を変
化させた核酸試料を調製し、両端の配列を用いてディフ
ァレンシャル・ディスプレー法による解析を行った。以
下に詳細を説明する。

【００７２】核酸試料の調製は、以下のように行った。
１０種類の遺伝子の調製は、蛍光ディファレンシャル・
ディスプレー法（村松高道新版植物のPCR実験プロ
トコール 138-143 秀潤社)に従い、マウスRNAを電気泳
動で分離し、１０種類の大きさの異なるＡ−Ｈ遺伝子を
ゲルから切りだし、ベクター（Promega社、pGEM-T vect
or System ）にクローニングした。プラスミドは市販の
キット（BIO 101社、RPM kit）を用いて精製した。精製
したプラスミドを鋳型にユニバーサルプライマー（配列
表：配列番号１、２）を用いた通常の方法に従いＰＣＲ
（パーキンエルマー社、AmpliTaqおよびGeneAmp PCR Sy
stem 9600）し、Ａ−Ｈ遺伝子をそれぞれ増幅した。Ｐ
ＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲＰｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎＫｉｔ（QIAGEN社）を用いて精製後、分光
器(日立製作所、U-3210）により定量した。それぞれ定
量した遺伝子を用いて、Ｈ遺伝子以外の遺伝子の存在量
は一定、Ｈ遺伝子（除去遺伝子）が１、１００、５０
０、１,０００、５,０００、１０,０００倍存在する試
料を絶対量を変えて２種類、合計１２サンプル調製し
た。これを表１に示す。

【００７３】

【表1】

【００７４】（ＰＣＲ反応による核酸試料の増幅）増幅
に使用したプライマーは以下の通りである。

【００７５】ａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒ：配列表：配
列番号３Ａｒｂｉｔｒａｒｙｐｒｉｍｅｒ(OPERON TECHNOLOG
Y, Inc.)：配列表：配列番号４Ａ−Ｈ遺伝子の末端には、上記プライマーの配列が等し
く存在している。また、ａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒの
５’末端には検出のため、蛍光体（Texas-Red）が標識
してある。

【００７６】ＰＣＲの反応液は、蛍光ディファレンシャ
ル・ディスプレー法に従い、以下の通り調製した。

【００７７】混合液の組成は表２に示した。

【００７８】

【表２】

【００７９】１μｌの核酸試料１〜１２に表２に示した
混合液１９μｌをそれぞれ加え２０μｌとしＰＣＲ反応
液とした。ＰＣＲの温度サイクルは、最初の１サイクル
目は、９４℃で３ｍｉｎ、４０℃で５ｍｉｎそして７２
℃で５ｍｉｎ、それ以降は、９４℃で２０ｓｅｃ、４０
℃で２ｍｉｎ、７２℃で１ｍｉｎからなるサイクルを２
４回行った後、７２℃で５ｍｉｎ反応した。

【００８０】（ＰＣＲ産物の検出）ＰＣＲ産物のうち
２．０μｌに等量のｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ(９
８% formamide,１０mM EDTA,０.０１% Methyl violet)
を加え、８０℃で２ｍｉｎ処理しサンプルとした。サン
プルを変性アクリルアミドゲル（６％LongRanger(FMC
社)）,６.１M Urea,１.２xTBE）で電気泳動し、蛍光イ
メージスキャナー（TaKaRa社、 FMBIO）で検出した。

【００８１】図１０に結果を示した。レーン１〜１２
は、それぞれ表1で示した核酸試料１〜１２のＰＣＲ反
応産物を分離したものである。レーン１〜６に対してレ
ーン７〜１２は１００倍量の遺伝子を含んでいる核酸試
料を解析したものである。Ａ−Ｈで示すバンドがそれぞ
れの遺伝子由来の産物を示す。また、１００〜８００の
数字は、分子量マーカーの塩基長（bp）を示している。

【００８２】レーン１、２および７、８は、Ｈ遺伝子が
等量および１００倍含まれている核酸試料の反応産物で
あり、すべての遺伝子が一様に増幅されていることを示
している。一方、レーン３、４、５、６および９、１
０、１１、１２は、５００倍以上のＨ遺伝子が存在する
核酸試料の結果を示しているが、核酸試料１〜６あるい
はおよび７〜１２にＨ遺伝子を除く遺伝子が等量含まれ
ていたにもかかわらず、バンドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、
Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊが示すように、レーン１、２および７、
８に比べバンドが明らかに薄く、均一な遺伝子の増幅が
阻害されていることを示している。

【００８３】このことは、核酸試料中にＡｂｕｎｄａｎ
ｔクラスの遺伝子（Ｈ遺伝子）が存在するとＲａｒｅク
ラスの遺伝子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ）
の検出が困難になることを示している。逆に、このよう
に存在量の差の大きな核酸試料から存在量の多い遺伝子
（Ｈ遺伝子）を取り除くことにより微量な遺伝子（Ａ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ）を検出することが可
能になることを示している。

【００８４】さらに、レーン１〜６とレーン７〜１２を
比較すると後者には、核酸試料中１００倍量の遺伝子を
含んでいるにもかかわらず結果はほぼ同様である。これ
は、存在する絶対量を増やしても存在比の大きな遺伝子
が含まれているかぎり微量遺伝子の増幅を阻害すること
を示している。

【００８５】この検証実験の結果によれば、微量遺伝子
の発現解析の際に存在量の多い遺伝子を取り除く核酸試
料の処理方法が有効であることを示した。本実験ではＰ
ＣＲを用いた検出法で効果を調べたが、発現量の解析と
してプローブあるいはプライマーの結合を伴う手法であ
るかぎり同様な効果が得られると考えられる。

【００８６】なお、冒頭に述べたように、従来遺伝子の
変異を調べる遺伝子診断が行われてきたが、近年ｍＲＮ
Ａの発現様式を網羅的に見るＲＮＡプロファイリングと
疾病との関係を調べる研究が盛んに行われ始めた。近い
将来このようなＲＮＡプロファイリングを応用した遺伝
子診断法が確立すること考えられる。ＲＮＡプロファイ
リングのサンプルとして考えられるのは、症状を呈して
いる組織であるが、現実的には組織からバイオプシーを
行いｍＲＮＡを調製することは技術的な困難と患者の苦
痛を伴う。また、期待される予防診断への応用を考えれ
ばサンプルとして末梢血を用いることが有効となる。そ
の場合、本発明を末梢血から得られた核酸試料の調製に
応用することが重要であり、以下に詳細を述べるように
このような発展は可能である。

【００８７】末梢血中には、赤血球、白血球、血小板な
どの血液細胞が多く含まれており、その他の極少数の細
胞例えば癌の転移細胞などが存在する場合などが考えら
れる。こうした複数の細胞が混在する状態では、より複
雑な遺伝子発現が予想され、特に微量発現遺伝子におい
ては正確な情報を得るために発現量の差異の問題を解決
することが重要である。以上の理由から本発明はこのよ
うな末梢血における遺伝子診断を目的とした遺伝子発現
解析に有効である。主な血液細胞の種類と数は、細胞の
分子生物学第３版（教育社）ｐ１１６４に示されている
がこのうち解析の対象となるものは、核を持たない赤血
球や血小板を除いた白血球である。前述のデータベース
ＢｏｄｙＭａｐには、顆粒球（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔ
ｅ）、Ｔ細胞（ＣＤ＋４Ｔｃｅｌｌ、ＣＤ＋８Ｔｃｅｌ
ｌ）など主な種類の白血球細胞における発現遺伝子の種
類と発現量が調べられている。ＢｏｄｙＭａｐでは、各
組織から調製した５００〜１０００のｃＤＮＡをランダ
ムにシーケンスしその出現頻度から遺伝子発現を調べて
いる。１細胞中に発現している総遺伝子が約３００，０
００とすると出現頻度が１の場合で約３００〜６００コ
ピーの遺伝子発現に相当する。そこで末梢血の遺伝子診
断には、除去遺伝子を顆粒球（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔ
ｅ）、Ｔ細胞（ＣＤ＋４Ｔｃｅｌｌ、ＣＤ＋８Ｔｃｅｌ
ｌ）データベースから出現頻度２以上（６００〜１２０
０コピー）の遺伝子とし本発明を適用できる。また、本
発明により調製した末梢血の核酸試料は、レトロウイル
スなどＲＮＡをゲノムに持つ感染症の高感度な診断など
本来ゲノム上に存在しない遺伝子にも応用できる。その
ような場合、診断薬としてあらかじめ必要となるプロー
ブや試薬等を用意したキットを提供することが出来る。

【００８８】本発明は、今後重要となる微量遺伝子の同
時計測を可能とする核酸試料の調製法およびこれを基礎
にした高分解能の分析方法を提供するものであり、これ
までの微量遺伝子解析の多くが検出の特異性を挙げる方
法であるのに対して多量に存在する遺伝子を取り除くと
いう新規な方法である。したがって、本発明により核酸
試料から微量遺伝子の解析に適した核酸試料を提供する
ことが出来るから、本発明を遺伝子分析サービスの形で
実施することにより、サービスの利用者は前処理として
の多量に存在する遺伝子の除去作業の手間を省いた効率
良い分析を行うことが出来る。

【００８９】

【発明の効果】本発明により、微量遺伝子の解析に適し
た核酸試料の調製方法およびこれを基礎にした高分解能
の分析方法が提供される。

【００９０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列：AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCG 配列番号：２配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列：GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTG 配列番号：３配列の長さ：１７配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列：GTTTTTTTTT TTTTTTG 配列番号：４配列の長さ：１０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成DNA 配列：GGTCTGGTTG

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による微量遺伝子を解析するための解析
方法の基本手順を示す図。

【図２】（ａ）−（ｇ）は、図１で説明した解析の対象
となる核酸試料から微量遺伝子を主体とする核酸試料を
得る五つの工程のうちの後半の三つの工程の一つの実施
例のフローの一部を示す図。

【図３】（ａ）−（ｇ）は、図１で説明した解析の対象
となる核酸試料から微量遺伝子を主体とする核酸試料を
得る五つの工程のうちの後半の三つの工程の他の実施例
のフローの一部を示す図。

【図４】（ａ）−（ｅ）は、図２または図３に続く残り
の工程のフローを示す図。

【図５】（ａ）−（ｇ）は、図２に示す実施例の一部を
変更した実施例のフローを示す図。

【図６】（ａ）−（ｆ）は、図２で説明した核酸試料か
ら微量遺伝子を主体とする核酸試料を得る五つの工程の
うちの後半の三つの工程の他のの実施例のフローの一部
を示す図。

【図７】本発明の実施例におけるプローブに結合しなか
った核酸試料の回収に有用な装置の一例の断面を示す
図。

【図８】（ａ）および（ｂ）は本発明の実施例における
プローブに結合しなかった核酸試料の回収に有用な装置
の一例の断面と使用法および平面を示す図。

【図９】本発明の実施例である解析の対象となる核酸試
料から微量遺伝子を主体とする核酸試料を得る工程の他
の実施例のフローを示す図。

【図１０】本発明の効果を検証するためのアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果を示す写真。

【符号の説明】

１００−４００：本発明の処理過程、１：残すべき微量
遺伝子、２：除去遺伝子、３：除去遺伝子の３’末端付
近と結合する配列をもつDNAあるいは類似体、４：除去
遺伝子２の３’末端付近が分解された遺伝子、１１，１
９：マイクロチューブ、１３：プローブ担体（ビー
ズ）、１４：プローブ、１７：除去遺伝子、１６：残す
べき微量遺伝子、１８：ビーズ、７０１：第１の容器、
７０３：濾過膜、７０４：第２の容器、７０５：濾過
膜、７０６：第３の容器、８０１：電気泳動槽、８０
３：濾過膜、８０５：濾過膜、８０２、８０４および８
０６：濾過膜８０３および濾過膜８０５で仕切られた三
つの槽、８１０：電源、８１１，８１２：電極。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者木山政晴埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地株式会社日立製作所基礎研究所内 (72)発明者入江隆史東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者岡野和宣東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸試料を処理する方法であって、解析さ
れるための複数種類の配列をもつ核酸試料と、上記核酸
試料の一部の配列と特異的に結合する既知の配列を持つ
一種類または複数種のプローブ担体とを準備し、上記核
酸試料と上記プローブ担体を混合し結合せしめ、次に上
記プローブ担体に結合しなかった上記核酸試料を回収す
ることからなる核酸調製方法。
【請求項２】核酸試料を処理する方法であって、解析さ
れるための複数種類の配列をもつ核酸試料と、上記核酸
試料の一部の配列と特異的に結合する既知の配列を持つ
一種類または複数種のプローブ担体とを準備し、上記核
酸試料と上記プローブ担体を混合し結合せしめ、次に上
記プローブ担体に結合した配列を分解酵素あるいは酵素
活性を持つプローブ担体自身を用いて処理することによ
り、上記プローブ担体と結合しなかった上記核酸試料あ
るいは上記核酸試料を基に合成した核酸試料を回収する
ことからなる核酸調製方法。
【請求項３】核酸試料を処理する方法であって、解析さ
れるための複数種類の配列をもつ核酸試料と、上記核酸
試料の一部の配列と特異的に結合する既知の配列を持ち
かつ3’末から合成反応が行われないような構造を持つ
とともに分解反応に耐性を持った一種類または複数種の
プローブ坦体とを準備し、上記核酸試料と上記プローブ
坦体を混合し結合せしめ、次に上記核酸試料を基に核酸
試料を合成した核酸試料を回収することからなる核酸調
製法。
【請求項４】プローブ担体をビーズあるいは基板上など
の固相に固定する請求項１または２記載の核酸調製方
法。
【請求項５】プローブ担体に結合した遺伝子の定量およ
び純度の計測を行い核酸調製操作の繰り返しの要否を決
定する請求項１または２記載の核酸調製方法。
【請求項６】プローブ担体がビーズあるいは基板上など
の固相である請求項５記載の核酸調製方法。
【請求項７】解析の対象となる核酸試料を準備する過
程、核酸試料中において一つあるいは複数の存在量が多
い遺伝子を上記遺伝子と特異的に結合するプローブ担体
を上記核酸試料に混合し結合せしめて除去する過程およ
び結合しなかった核酸試料を回収することにより微量遺
伝子を得る過程より得られたことを特徴とする核酸試
料。
【請求項８】解析されるための複数種類の配列をもつ核
酸試料と、上記核酸試料の一部の配列と特異的に結合す
る既知の配列を持つ一種類または複数種のプローブ担体
とを準備し、上記核酸試料と上記プローブ担体を混合し
結合せしめ、次に上記プローブ担体に結合した配列を分
解酵素あるいは酵素活性を持つプローブ担体自身を用い
て処理することにより、上記プローブ担体と結合しなか
った上記核酸試料あるいは上記核酸試料を基に合成した
核酸試料を回収して得られた核酸試料。
【請求項９】解析の対象となる核酸試料を準備する過
程、核酸試料中において一つあるいは複数の存在量が多
い遺伝子を上記遺伝子と特異的に結合するプローブ担体
を上記核酸試料に混合し結合せしめて除去する過程およ
び結合しなかった核酸試料を回収することにより微量遺
伝子を得る過程を経て得られたことを特徴とする核酸試
料。
【請求項１０】解析の対象となる核酸試料を準備する過
程、核酸試料中において一つあるいは複数の存在量が多
い遺伝子を上記遺伝子と特異的に結合するプローブ担体
を上記核酸試料に混合し結合せしめて除去する過程、結
合しなかった核酸試料を回収することにより微量遺伝子
を得る過程および微量遺伝子を解析する過程よりなるこ
とを特徴とする遺伝子解析方法。
【請求項１１】解析の対象となる核酸試料中の一つある
いは複数の存在量が多い遺伝子と特異的に結合するプロ
ーブ担体の合成方法であって、３’末端ヌクレオチドの
３’に水酸基が生じないような樹脂結合ヌクレオシドを
用いたプローブ合成方法。
【請求項１２】解析の対象となる核酸試料を準備し、核
酸試料中において一つあるいは複数の存在量が多い遺伝
子を上記遺伝子と特異的に結合するプローブ担体を上記
核酸試料に混合し結合せしめて除去し、結合しなかった
核酸試料を回収することにより微量遺伝子を得て、微量
遺伝子を解析するための遺伝子解析に使用するための、
プローブ担体に結合した核酸試料を除去する装置であっ
て、二つの濾過部分を持ち、第１の濾過部分には、プロ
ーブ担体に結合した核酸を物理的あるいは化学的に保持
する構造を持ち、第２の濾過部分には核酸を保持するが
水、無機塩類は透過させ、核酸を濃縮できる構造を持っ
たプローブ担体に結合した核酸試料を除去する装置。
【請求項１３】第１の濾過部分から第２の濾過部分に核
酸を移動させるために、該核酸に電気泳動による力を作
用させるための構造を有する請求項１２記載のプローブ
担体に結合した核酸試料を除去する装置。
【請求項１４】核酸試料を受領すること、該核酸試料中
において一つあるいは複数の存在量が多い遺伝子を上記
遺伝子と特異的に結合するプローブ担体を上記核酸試料
に混合し結合せしめて除去すること、結合しなかった核
酸試料を回収することにより微量遺伝子を主体とする核
酸試料を得ることおよび該微量遺伝子を主体とする核酸
試料を提供することを特徴とする遺伝子解析サービス。
【請求項１５】解析の対象となる核酸試料を準備する過
程、核酸試料中において一つあるいは複数の存在量の多
い遺伝子を上記遺伝子と特異的に結合するプローブ担体
と上記核酸試料を混合し結合せしめて除去する過程およ
び結合しなかった核酸試料を回収する過程を実行するた
めの試薬キットであって、該キットは存在量の多い遺伝
子と結合する配列を持ったプローブ担体を構成要素とす
る試薬キット。
【請求項１６】解析の対象となる核酸試料を準備する過
程、核酸試料中において一つあるいは複数の存在量の多
い遺伝子を上記遺伝子と特異的に結合するプローブ担体
と上記核酸試料を混合し結合せしめ次に結合部分を分解
酵素て除去する過程および結合しなかった核酸試料を回
収する過程を実行するための試薬キットであって、該キ
ットは存在量の多い遺伝子と結合する配列を持ち、3
‘末からの伸長反応ができないような構造を持ったプロ
ーブ担体を構成要素とする試薬キット。
【請求項１７】解析の対象となる核酸試料を準備する過
程、核酸試料中において一つあるいは複数の存在量の多
い遺伝子を上記遺伝子と特異的に結合するプローブ担体
と上記核酸試料を混合し結合せしめ次に結合部分を分解
酵素て除去する過程および結合しなかった核酸試料を回
収する過程を実行するための試薬キットであって、該キ
ットは存在量の多い遺伝子と結合する配列を持ち、3
‘末からの伸長反応ができないような構造を持ち、核酸
と結合した部位を分解する活性を有するプローブ担体を
構成要素とする試薬キット。
【請求項１８】解析の対象となる核酸試料を準備する過
程および核酸試料中において一つあるいは複数の存在量
の多い遺伝子を上記遺伝子と特異的に結合するプローブ
担体と上記核酸試料を混合し結合せしめ次に上記核酸試
料を基に合成した核酸試料を回収する過程を実行するた
めの試薬キットであって、該キットは存在量の多い遺伝
子と結合する配列を持ち、3‘末からの伸長反応ができ
ないような構造を持ち、分解反応に耐性を持ったプロー
ブ担体を構成要素とする試薬キット。