CN116194593A - 被称为“CTL-seq”(CRISPR Tag Linear-seq)的核酸酶中靶/脱靶编辑位点的提名方法 - Google Patents

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Abstract

一种以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点特别是Cas9的方法，其中在双链断裂处插入标签，包含所述标签与通用接头的区域包含独特分子索引(UMI)。通用测序引物结合的序列可以预先设计。一种设计52个碱基对的标签序列的方法，所述方法基于：(a)随机生成13个核苷酸的序列，其具有40–90％的GC含量，最大均聚物长度A:2、C:3、G:2、T:2，加权均聚物率<20，自折叠Tm<50℃，并且自身二聚体Tm<50℃；(b)移除与特定基因组完全对齐或者是均聚物或GG或CC二核苷酸基序的序列，并获得一组13‑mer；(c)选择所述13‑mer序列的含有一个或更少CC或GG二核苷酸基序的子集；(d)串联所述13‑mer子集序列中的四个序列，以形成随机52‑mer序列；(e)将所述随机52‑mer序列与基因组比对；(f)移除与所述基因组具有相似性的随机52‑mer序列，以产生52‑mer序列的子集；和(h)输出所述52‑mer序列的子集并生成互补链，以产生双链52个碱基对的标签序列。

Description

被称为“CTL-seq”(CRISPR Tag Linear-seq)的核酸酶中靶/ 脱靶编辑位点的提名方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月23日提交的美国临时专利申请号63/055,460的优先权，所述临时申请整体通过参考并入本文。
对序列表的参考
根据37 C.F.R.§1.821(c)，本申请与计算机可读形式的序列表一起提交。所述通过EFS提交的文本“013670-9056-WO01_sequence_listing_19-JUL-2021_ST25.txt”含有273个序列，于2021年7月19日创建，文件大小为153千字节，并整体通过参考并入本文。
技术领域
本文描述了以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法。
背景技术
CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)通过允许简单地引入遗传密码的变化而革新了基因组学。CRISPR系统例如Cas9和Cas12a蛋白被与Cas蛋白结合的RNA寡核苷酸序列(形成核糖核蛋白；RNP)引导到它们的靶，在那里所述酶在DNA序列中产生双链断裂(DSB)。天然细胞机制通常使用非同源末端连接(NHEJ)或同源性指导的修复(HDR)分子途径修复DSB。通过在中靶和脱靶位置处发生的NHEJ修复的DNA通常含有插入缺失(插入/缺失)，其可以引起突变并改变编码基因的功能。因此，鉴定这些位置对于反推中靶和脱靶编辑对生物学表型的影响是关键的。
迄今为止，尚不存在为CRISPR或其他核酸酶鉴定或提名脱靶编辑位点的“金标准”方法。已开发了许多方法。这些方法使用各种不同的策略，包括检测在DSB处组装的内源修复机制(Discover-Seq[1])、将DNA标签序列整合到宿主细胞基因组中(GUIDE-Seq；参见美国专利号9,822,407)、iGUIDE[2,3])或通过在体外切割DNA(BLISS[4]、CIRCLE-Seq[5]、SiteSeq[6])。
细胞或基于细胞(有时被称为体内)和生物化学(有时被称为体外)脱靶测定提名系统各自具有其优点。与DNA和表观遗传标记结合的蛋白质修改核酸酶活性的功能，表明细胞或基于细胞的方法可能更好地鉴定实际的编辑靶[7]。然而，生物化学方法提名了通过细胞或基于细胞的方法未鉴定到的位点，表明生物化学方法可能更加全面[5，6]。然而，这些当前的工具往往具有不完美的灵敏度[5，6](参见图1)。
需要一种以提高的准确性和灵敏度检测和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法。
发明内容
本文描述的一个实施方式是一种以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法，所述方法包括下述步骤：(a)将引导序列RNA(sgRNA)或双组分CRISPR RNA：反式激活crRNA(crRNA：tracrRNA)双链体、一种或多种标签序列和RNA引导的核酸内切酶共同递送到细胞；(b)将所述细胞温育一个时间段，所述时间段足以使双链断裂发生；(c)从所述细胞分离基因组DNA，将所述基因组DNA片段化，并将片段化的基因组DNA连接到含有通用接头序列的独特分子索引；(d)使用靶向所述标签和通用接头序列的引物扩增所连接的DNA片段，以产生第一组扩增的序列；(e)使用靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物尾部的通用测序引物扩增所述第一组扩增的序列，以产生第二组扩增的序列；(f)对合并的序列进行测序并获得测序数据；和(g)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点。在一种情况下，所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)尾部，以产生第二组扩增的序列。在另一种情况下，所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBot引物上的预先设计的非同源序列(SEQ ID NO：269–273)尾部，以产生第二组扩增的序列。在另一种情况下，所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBot引物上的预先设计的13-mer尾部，以产生第二组扩增的序列。在另一种情况下，步骤(g)包括在处理器上执行下述操作：(i)将所述测序数据与参考基因组比对；(ii)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点；和(iii)将所述比对、分析和结果数据作为自定义格式的文件、表格或图形输出。在另一种情况下，所述方法还在步骤(e)之后包括下述步骤：(e1)将所述第二组扩增的序列标准化以产生浓度标准化文库，将所述标准化文库与其他样品合并以产生合并文库；并继续进行步骤(f)–(i)。在另一种情况下，步骤(d)使用抑制PCR法。在另一种情况下，所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas酶、Cas表达载体、Cas蛋白或Cas RNP复合物。在另一种情况下，所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas9酶、Cas9表达载体、Cas9蛋白或Cas9 RNP复合物。在另一种情况下，所述细胞包括人类或小鼠细胞。在另一种情况下，所述时间段为约24小时至约96小时。在另一种情况下，将多种标签序列共同递送。在另一种情况下，所述标签序列包括包含52个碱基对的双链脱氧核糖寡核苷酸(dsDNA)。在另一种情况下，所述标签序列包含5′-端磷酸和在第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。在另一种情况下，所述标签序列包括包含SEQ ID NO：1–2或7–268的互补的顶部和底部链对的双链DNA。
本文描述的其他实施方式是使用本文描述的方法鉴定或提名的中靶和脱靶CRISPR编辑位点。
本文描述的另一个实施方式是一种设计52个碱基对的标签序列的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：(a)随机生成13个核苷酸的序列，其具有40–90％的GC含量，最大均聚物长度A:2、C:3、G:2、T:2，加权均聚物率<20，自折叠Tm<50℃，并且自身二聚体Tm<50℃；(b)移除与特定基因组完全对齐或者是均聚物或GG或CC二核苷酸基序的序列，并获得一组13-mer；(c)选择所述13-mer序列的含有一个或更少CC或GG二核苷酸基序的子集；(d)串联所述13-mer子集序列中的四个序列，以形成随机52-mer序列；(e)将所述随机52-mer序列与基因组比对；(f)移除与所述基因组具有相似性的随机52-mer序列，以产生52-mer序列的子集；和(h)输出所述52-mer序列的子集并生成互补链，以产生双链52个碱基对的标签序列。在一种情况下，所述基因组是人类或小鼠的。在另一种情况下，所述52个碱基对的标签序列不与所述基因组互补。在另一种情况下，所述方法还包括设计用于所述52个碱基对的标签序列的引物。在另一种情况下，所述52个碱基对的标签序列包含5′-端磷酸和在所述52个碱基对的标签序列的第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。在另一种情况下，所述方法包括合成包含所述52个碱基对的标签序列、所述52个碱基对的标签序列的互补体或用于所述52个碱基对的标签序列的引物的寡核苷酸。
本文描述的其他实施方式是使用本文描述的方法设计的一种或多种52个碱基对的标签序列。在一种情况下，所述52个碱基对的标签序列包括包含SEQ ID NO：1–2或7–268的顶部和底部链对的双链DNA。
本文描述的另一个实施方式是一种设计与权利要求23所述的52个碱基对的标签序列部分互补的引物和接头引物的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：(a)设计与标签序列的顶部和底部链部分互补的标签引物；和(b)设计与接头序列的顶部链部分互补的接头引物；其中：所述标签引物包含5′-通用尾部序列；并且所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物的尾部互补的序列。在一种情况下，所述5′-通用尾部序列与SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)、位点特异性区段、距3′-末端6个核苷酸的核糖核苷酸(rN)、3′-末端错配、3′-末端区块(3′-C3间隔物)、预先设计的非同源序列(SEQ ID NO：269–273)或预先设计的13-mer序列互补。在另一种情况下，所述与标签序列的顶部和底部链部分互补的引物包含与SP1序列(SEQ ID NO：7)互补的尾部序列，并且所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP2序列(SEQ ID NO：8)尾部互补的序列；或者所述与标签序列的顶部和底部链部分互补的引物包含与SP2序列(SEQ ID NO：8)互补的尾部序列，并且所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP1序列(SEQ ID NO：7)尾部互补的序列。在另一种情况下，使用与标签序列的顶部和底部链互补的引物和与接头序列的顶部链互补的引物进行的核酸分子的扩增产生了包含一部分所述标签序列、sgDNA序列和接头序列的PCR产物。在另一种情况下，所述方法还包括合成包含正向和反向标签引物和接头引物的序列的寡核苷酸。在另一种情况下，所述52个碱基对的标签序列和与所述52个碱基对的标签序列部分互补的引物，使用预测所述引物是否可能部分互补和具有形成引物二聚体的倾向的算法来设计和选择。
本文描述的其他实施方式是使用本文描述的方法设计的一种或多种与52个碱基对的标签序列部分互补的引物和一种或多种接头引物。在一种情况下，所述引物包含SEQID NO：3、4的序列，并且其中所述接头引物包含SEQ ID NO：5的序列。
本文描述的另一个实施方式是一种或多种双链52个碱基对的标签序列用于鉴定中靶和脱靶CRISPR编辑位点的用途。
附图说明
图1显示了由三个生物学平行样共享的读出序列部分被示出在白色扇区中，而由两个平行样共享或存在于单一平行样中的读出序列被示出在黑色扇区中。表1示出了采取96孔格式的一式三份的4种不同gRNA的基于GUIDE-seq[3]的提名。gRNA复合物通过将等摩尔量的Alt-R crRNA-XT和Alt-R tracrRNA混合而产生。使用NucleofectorTM系统(Lonza)，将稳定表达Cas9的HEK293细胞用10μM gRNA和0.5μM dsODN GUIDE-seq标签转染。72hr后，分离基因组DNA(gDNA)。将基因组DNA片段化，并使用Lotus DNA文库制备试剂盒(IDT)连接接头。文库通过从插入的标签扩增到连接的接头来产生[3]。然后将文库在
Figure BDA0004113693960000061
平台上以成对末端方式进行测序。
图2显示了与可以通过rhAmpSeq靶向扩增所验证的相比，GUIDE-Seq发现更多的脱靶位置。所呈现的结果是在将gRNA序列(内部命名：AR、CTNNB1、EMX1、GRHPR、HPRT38087、HPRT38285、VEGFA)递送到稳定表达WT Cas9的HEK293细胞中时331个GUIDE-Seq提名的位点的集合。为每个引导序列设计的GUIDE-seq提名的脱靶占总参考基因组比对读出序列的≥0.1％，并且比对的所有参考基因组用一个rhAmpSeq组靶向。在后续实验中，将gRNA再次递送到相同细胞，并使用rhAmpSeq分析编辑。如果在处理条件下观察到的插入缺失以≥1％的水平≥未处理的对照样品，则靶被称为是“编辑的”。
图3示出了GUIDE-Seq标签整合率可变。所述图示出了对于靶向RAG1、RAG2和EMX1基因的引导序列来说，在靶向GUIDE-Seq提名的中靶/脱靶位点的rhAmpSeq组中具有插入缺失编辑的118个独特的Cas9中靶/脱靶位点的标签整合的百分率(标准化到编辑的％)。将每个引导序列与34个碱基对的GUIDE-Seq、dsODN标签通过核转染共同递送到稳定表达Cas9的HEK293细胞中。72hr后提取DNA，通过rhAmpSeq多重PCR扩增，在
Figure BDA0004113693960000062
MiSeq上测序，并通过自定义流程进行分析。所述标准化的标签整合率被计算为在含有所述标签序列的每个靶处测序的读出序列除以含有与参考基因组趋异的等位基因(指示Cas9编辑)的总读出序列的百分率。
图4示出了针对外来序列标签的rhAmpSeq引物的设计。卡通图示出了使用rhAmpSeq设计流程的设计过程的步骤，包括设计针对顶部(1)和底部(2)链的正向引物，舍弃不需要的引物，以及选择具有5′-重叠但没有3′-重叠序列的标签靶向引物，以使所述顶部/底部链引物二聚体形成发夹(3)。
图5示出了用于构建重叠引物设计的rhAmpSeq设计流程的概述。在所述流程中，将已知序列附加到每个标签序列的5′-末端和3′-末端上，对输入进行质量控制，并设计针对每个标签的顶部和底部链的测定法(示出在图4A中)。靶向每个标签链的引物是成对的，使得在靶向同一标签的引物之间RNA核苷酸的3′端的至少4个核苷酸不重叠，并对引物对进行排序和选择。Hg38和mm38首字母缩略词分别代表人类和小鼠基因组的版本。
图6示出了在重叠引物产生PCR扩增子的情况下的发夹形成。所述图示出了代表性的靶序列和来自于重叠引物区的不想要的短扩增子的发夹PCR产物，其中在所述PCR产物的3′-和5′-末端处具有互补的5’引物尾部末端。
图7示出了整合有指定单一标签(SEQ ID NO：9–40)或表5中描述的标签(SEQ IDNO：9–40、45–268)的合并物的靶位点的数量(黑色条)。斜纹条(CTLmax)示出了如果使用单一标签(SEQ ID NO：9–40)的组合，理论上可以发现的靶位点的最大数量(最多32个位点中的23个位点)。合并物A1含有所有单一标签(SEQ ID NO：9–40)。合并物B1–6各自含有16个不同标签(SEQ ID NO：45–268)。合并物C1含有所有测试的标签(SEQ ID NO：9–40、45–268)。整合事件使用内部数据分析工具来确定。
图8示出了整合有指定单一标签(SEQ ID NO：9–40)或表5中描述的标签(SEQ IDNO：9–40、45–268)的合并物的靶位点的数量(黑色条)。斜纹条(CTLmax)示出了如果使用单一标签(SEQ ID NO：9–40)的组合，理论上可以发现的靶位点的最大数量(最多53个位点中的47个位点)。合并物A1含有所有单一标签(SEQ ID NO：9–40)。合并物B1–6各自含有16个不同标签(SEQ ID NO：45–268)。合并物C1含有所有测试的标签(SEQ ID NO：9–40、45–268)。整合事件使用内部数据分析工具来确定。
具体实施方式
本文描述了以提高的准确性和灵敏度检测和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法。由于建立在以前的体内提名方法之上，细胞内环境信息得以维持。通过共同递送一组独特的预定的序列标签，提高了灵敏度。在一种情况下，所述共同递送的一组预定的独特标签可以在13–80的碱基对的范围内。在另一种情况下，所述共同递送的一组预定的标签可以包含13个碱基对的标签序列标签、26个碱基对的标签序列标签、39个碱基对的标签序列标签、52个碱基对的标签序列标签、65个碱基对的标签序列标签或78个碱基对的标签序列标签。在另一种情况下，所述独特的预定的标签是一组52个碱基对的标签序列标签(所述序列标签长度的增加提高了为rhPrimer找到良好引物着陆位点的能力)。这种限制据信可以通过使用不同于人类和小鼠基因组的多样化标签序列来缓解。由于建立在Integrated DNATechnologies(IDT)的rhAmp技术之上，特异性得以提高，所述技术使用RNA酶H2(深渊火球菌(Pyrococcus abyssi))解除对已正确退火到靶的引物的阻断，这产生较低的错误引发率。通过仅使用在5′-末端处含有预期标签序列的读出序列，可以进一步提高特异性。将抑制PCR并入到这种方法中允许易于使用。现有的体内方法(例如GUIDE-seq和iGUIDE)需要平行的PCR反应(2种合并物扩增)，通过退火到所述标签的顶部和底部链并从它们延伸来扩增。在这里，抑制PCR被用于允许同时扩增两种合并物而不会产生有问题的二聚体序列。
使用核转染将GUIDE-Seq dsDNA标签与一种引导RNA共同递送到组成性表达Cas9的HEK293细胞。参见美国专利号9,822,407，其以此类教导通过参考并入本文。通过这种方式，总共测试了四种不同的引导RNA。在所述细胞内，在所述表达的Cas9与引导RNA之间形成核糖核蛋白复合物(RNP)，引入双链断裂。修复的断裂可以含有所述共同递送的标签。在递送后，将细胞温育并提取得到的DNA。根据GUIDE-Seq方案进行靶扩增，并使用改良版本的GUIDE-Seq分析流程(github.com/aryeelab/guideseq)进行测定。将提名的靶在三个生物学平行样之间进行比较(独特的引导RNA+标签共同递送)。并非所有提名的靶都是所有生物学平行样共有的(共有/总提名的靶：分别为7/31、6/19、2/4、3/5；参见表1)。然而，归于任何靶的>90％的总读出序列归于共有的靶(平均值；参见图1)。
Figure BDA0004113693960000091
/>
Figure BDA0004113693960000101
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Figure BDA0004113693960000111
此外，提名的靶可能无法使用正交方法复制或检测。使用GUIDE-Seq方法，使用核转染将GUIDE-Seq DNA标签与6种引导序列中的每一者共同递送(每种标签与一种引导RNA递送)到组成性表达Cas9的HEK293细胞。设计了rhAmpSeq多重扩增子组来扩增所述提名的靶，并对生物学平行样中的编辑进行定量。在由GUIDE-Seq提名的331个靶中，只有41个(12％)可以用rhAmpSeq验证(参见图2)。
与引导RNA共同递送到稳定表达的CRISPR细胞系中的在NHEJ修复中使用的dsDNA标签序列以可变的比率掺入。在这里，将GUIDE-Seq dsDNA标签与6种引导序列中的每一者共同递送到组成性表达Cas9的HEK293细胞中。在另一种情况下，与CRISPR RNP共同递送的在NHEJ修复中使用的dsDNA标签序列以可变的比率掺入。在这里，将GUIDE-Seq dsDNA标签与6种引导序列中的每一者共同递送到组成性表达Cas9的HEK293细胞中。开发了rhAmpSeq组以扩增提名的靶，并且在生物学平行样中，使用自定义分析流程来分析标签整合率。这些结果证实标签被掺入到0–85％的被编辑的基因组拷贝中，随着靶而变(参见图3)。不受任何理论限制，假设所述比率随着序列环境而变。
本文描述了通过将Integrated DNA Technology的rhAmpSeqTM技术、抑制PCR和新的外来DNA序列设计相组合以提名宿主基因组中的核酸酶脱靶编辑位置，来提高信噪比的方法。
在这种方法中，将Cas9、sgRNA或双组分CRISPR RNA：反式激活crRNA(crRNA：tracrRNA)双链体和一种或多种双链DNA(dsDNA)标签序列递送到细胞。共同递送多种标签允许提高脱靶位点处的标签整合(参见下文)。所述标签序列具有明显不同于宿主基因组(即外来的)序列内容。在核酸酶引入DSB后，NHEJ修复将所述标签序列插入到靶位点中，形成已知的引物着陆位点。在细胞有时间修复所述DSB并可能进一步分裂后(例如72hr后)，分离基因组DNA，将其片段化(例如
Figure BDA0004113693960000121
剪切、基于酶的剪切、Tn5等)，将含有通用接头序列的独特分子索引(UMI)连接到片段化的DNA，并除去未连接的材料。接下来，通过靶向所述标签和通用接头序列的引物扩增DNA片段(第1轮PCR)。使用通用引物添加样品索引(PCR2)，对扩增的材料进行浓度标准化，与其他样品合并，并将合并的材料在/>
Figure BDA0004113693960000122
(或类似的)机器上测序。将所测序的读出序列与参考基因组比对，并且大量读出序列映射到的位点可以提名中靶/脱靶位置。
外来序列可以如下设计：产生>1百万个随机的13-mer序列，其具有40–90％的GC含量，最大均聚物长度A:2、C:3、G:2、T:2，加权均聚物率<20，自折叠Tm<50℃，并且自身二聚体Tm<50℃。从序列名单中移除与人类(GRCh38.p2；hg38)或小鼠(GRCh38.p4；mm38)参考基因组完全对齐或具有麻烦的基序序列(均聚物，主要是G-G或C-C二核苷酸基序)的序列，得到479个序列。
为了设计本文描述的52个碱基对的标签序列，选择了49个含有≤1个C或G二核苷酸的13-mer寡核苷酸序列，并产生了4个13-mer序列的10,000个独特组合。每个串联的序列(例如使用软件将4个13-mer序列粘贴在一行中)的长度是52个核苷酸。接下来，使用被称为bwa-psm的内部改良版本的bwa，将每个52个核苷酸的标签序列针对人类(GRCh38.p2)和小鼠(GRChm38.p4)基因组进行比对。bwa-psm的执行返回了直至限定阈值的所有可能的二次匹配。设计了一组标签序列(SEQ ID NO：1–2)，它们旨在作为一个组工作，并且与人类或小鼠基因组没有相似性(最大种子尺寸：7，种子编辑距离：2，最大编辑距离：21，最大空位开放：2，最大空位扩展：3，错配罚分：1，空位开放罚分：1，空位扩展罚分：1)。
设计了与所述标签的顶部和底部链和接头序列(SEQ ID NO：6)的5′-末端互补的重叠rhAmpSeq V1引物(SEQ ID NO：3–4)(图4)。所述标签特异性引物(SEQ ID NO：3–4)含有与SP1和SP2引物序列(SEQ ID NO：7–8)匹配的5′-通用尾部序列、位点特异性区段、距3′-末端6个核苷酸的核糖核苷酸(rN)、3′-末端错配和3′-末端区块(3′-C3间隔物)。所述接头特异性引物(SEQ ID NO：5)靶向5′-P5接头序列(SEQ ID NO：6)的5′-末端，并且所述接头序列含有独特的分子索引(UMI)序列(表2)。所述引物被设计成靶向退火的标签的正链和负链，使得如果这些引物出人意料地形成二聚体，则形成的产物会形成发夹，从所述可用的反应模板除去寡核苷酸(例如抑制PCR)(图6A–B)。靶向所述标签的引物序列基于由IDT设计和实施的专有设计算法(具有面向公众的UI的算法的内部副本：www.idtdna.com/site/account？ReturnURL＝/site/order/designtool/index/R HAMPSEQ)来选择，所述算法选择性能最佳的引物对来扩增所打算的模板序列(图5)。评估引物序列与所有其他标签序列以及人类和小鼠初级基因组组装体两者的非特异性结合，以验证它们在与通用接头序列组合时并在人类或小鼠基因组DNA存在下不太可能形成脱靶扩增子。
所述引物需要成对工作，其中一个标签特异性引物(顶部或底部链)与接头特异性引物(SEQ ID NO：5)配对。当使用抑制PCR法扩增时，这导致含有一部分标签、gDNA和接头序列的分子的扩增(图4)。
Figure BDA0004113693960000131
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Figure BDA0004113693960000141
本文描述的一个实施方式是一种以提高的准确性和灵敏度鉴定并且鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法，所述方法包括下述步骤：(a)将引导序列RNA(sgRNA)或双组分CRISPR RNA：反式激活crRNA(crRNA：tracrRNA)双链体和一种或多种标签序列共同递送到细胞；(b)将所述细胞温育一个时间段；(c)从所述细胞分离基因组DNA，将所述基因组DNA片段化，并将片段化的基因组DNA连接到含有通用接头序列的独特分子索引；(d)使用靶向所述标签和通用接头序列的引物扩增所连接的DNA片段，以产生第一组扩增的序列；(e)使用靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物尾部的通用测序引物扩增所述第一组扩增的序列，以产生第二组扩增的序列；(f)对合并的序列进行测序并获得测序数据；和(g)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点。在一个实施方式中，所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)尾部，以产生第二组扩增的序列。在另一个实施方式中，所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBot上的预先设计的非同源序列(表6；SEQ IDNO：269–273)尾部，以产生第二组扩增的序列。在又一个实施方式中，所述通用引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的预先设计的13-mer尾部，以产生第二组扩增的序列。在一个实施方式中，步骤(g)包括在处理器上执行下述操作：(i)将所述测序数据与参考基因组比对；(ii)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点；和(iii)将所述比对、分析和结果数据作为表格或图形输出。在另一个实施方式中，所述方法还在步骤(e)之后包括下述步骤：(e1)将所述第二组扩增的序列标准化以产生浓度标准化文库，将所述标准化文库与其他样品合并以产生合并文库；并继续进行步骤(f)–(i)。在一种情况下，步骤(d)使用抑制PCR法。在另一种情况下，所述细胞组成性表达Cas酶、与Cas表达载体共同递送、与Cas蛋白共同递送或与Cas RNP复合物共同递送。在另一种情况下，所述细胞组成性表达Cas9酶、与Cas9表达载体共同递送、与Cas9蛋白共同递送或与Cas9 RNP复合物共同递送。在另一种情况下，所述细胞包括人类或小鼠细胞。在另一种情况下，所述时间段为约24小时至约96小时。在另一种情况下，将多种标签序列共同递送。在另一种情况下，所述标签序列包括包含52个碱基对的双链脱氧核糖寡核苷酸(dsDNA)。在另一种情况下，所述标签序列包含5′-端磷酸和在第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。在另一种情况下，所述标签序列包括包含SEQ ID NO：9–40或45–268的顶部和底部链对的双链DNA。
本文描述的另一个实施方式是使用本文描述的方法鉴定或提名的中靶和脱靶CRISPR编辑位点。
本文描述的另一个实施方式是一种设计52个碱基对的标签序列的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：(a)随机生成13个核苷酸的序列，其具有40–90％的GC含量，最大均聚物长度A:2、C:3、G:2、T:2，加权均聚物率<20，自折叠Tm<50℃，并且自身二聚体Tm<50℃；(b)移除与特定基因组完全对齐或者是均聚物或GG或CC二核苷酸基序的序列，并获得一组13-mer；(c)选择所述13-mer序列的含有一个或更少CC或GG二核苷酸基序的子集；(d)串联所述13-mer子集序列中的四个序列，以形成随机52-mer序列；(e)将所述随机52-mer序列与基因组比对；(f)移除与所述基因组具有相似性的随机52-mer序列，以产生52-mer序列的子集；和(h)输出所述52-mer序列的子集并生成互补链，以产生双链52个碱基对的标签序列。在一种情况下，所述基因组是人类或小鼠的。在另一种情况下，所述52个碱基对的标签序列不与所述基因组互补。在另一种情况下，所述方法还包括设计用于所述52个碱基对的标签序列的引物。在另一种情况下，所述52个碱基对的标签序列包含5′-端磷酸和在所述52个碱基对的标签序列的第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。在另一种情况下，所述方法包括合成包含所述52个碱基对的标签序列、所述52个碱基对的标签序列的互补体或用于所述52个碱基对的标签序列的引物的寡核苷酸。
本文描述的另一个实施方式是使用本文描述的方法设计的一种或多种52个碱基对的标签序列。在一种情况下，所述52个碱基对的标签序列包括包含SEQ ID NO：9–40或45–268的互补的顶部和底部链对的双链DNA。
本文描述的另一个实施方式是一种设计与本文描述的52个碱基对的标签序列部分互补的引物和接头引物的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：(a)设计与标签序列的顶部和底部链部分互补的标签引物；和(b)设计与接头序列的顶部链部分互补的接头引物；其中：所述标签引物包含与SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)互补的5′-通用尾部序列、位点特异性区段、距3′-末端6个核苷酸的核糖核苷酸(rN)、3′-末端错配、3′-末端区块(3′-C3间隔物)；并且所述接头引物包含与SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)互补的序列。在一种情况下，所述与标签序列的顶部和底部链部分互补的引物包含与所述SP1序列互补的序列，并且所述接头引物包含与所述SP2序列互补的序列；或者所述与标签序列的顶部和底部链部分互补的引物包含与所述SP2序列互补的序列，并且所述接头引物包含与所述SP1序列互补的序列。在另一种情况下，使用与标签序列的顶部和底部链互补的引物和与接头序列的顶部链互补的引物进行的核酸分子的扩增产生了包含一部分所述标签序列、sgDNA序列和接头序列的PCR产物。在另一种情况下，所述方法还包括合成包含正向和反向标签引物和接头引物的序列的寡核苷酸。
在本文描述的另一个实施方式中，所述52个碱基对的标签序列和与所述52个碱基对的标签序列部分互补的引物，使用预测所述引物是否可能部分互补和具有形成引物二聚体的倾向的算法来设计和选择。
本文描述的另一个实施方式是使用本文描述的方法设计的一种或多种与52个碱基对的标签序列部分互补的引物和一种或多种接头引物。在一种情况下，所述与52个碱基对的标签序列部分互补的引物包含SEQ ID NO：3、4的序列，并且所述接头引物包含SEQ IDNO：5的序列。
本文描述的另一个实施方式是一种或多种双链52个碱基对的标签序列用于鉴定中靶和脱靶CRISPR编辑位点的用途。
对于相关领域的普通技术人员来说，显然可以对本文描述的组合物、制剂、方法、过程和应用进行适合的修改和改编，而不背离其任何实施方式或方面的范围。所提供的组合物和方法是示例性的，并不打算限制任何特定实施方式的范围。本文公开的所有各种不同的实施方式、方面和选项可以以任何变化或迭代方式组合。本文描述的方法和过程的范围包括本文描述的实施方式、方面、选项、实例和偏好的所有实际或潜在组合。本文描述的方法可以省略任何组件或步骤，替代本文公开的任何组件或步骤，或者包括本文别处公开的任何组件或步骤。还应当理解，实施方式可以包括各种不同硬件、软件和电子组件的组合，并且可以以其他方式通过所述组合来实现。例如，可以使用各种不同的微处理器和专用集成电路(“ASIC”)，也可以使用各种不同语言的软件。此外，可以使用服务器和各种不同的计算设备，并且它们可以包括一个或多个处理单元、一个或多个计算机可读介质、一个或多个输入/输出接口以及连接所述组件的各种不同连接(例如系统总线)。如果在通过参考并入的任何专利或出版物中的任何术语的含义与本公开中使用的术语的含义冲突，则以本公开中的术语或短语的含义为准。此外，说明书仅公开和描述了示例性实施方式。本文引用的所有专利和出版物以其特定教导通过参考并入本文。
本文描述的本发明的各种不同实施方式和方面通过下述条款概述：
条款1.一种以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将引导序列RNA(sgRNA)或双组分CRISPR RNA：反式激活crRNA(crRNA：tracrRNA)双链体、一种或多种标签序列和RNA引导的核酸内切酶共同递送到细胞；
(b)将所述细胞温育一个时间段，所述时间段足以使双链断裂发生；
(c)从所述细胞分离基因组DNA，将所述基因组DNA片段化，并将片段化的基因组DNA连接到含有通用接头序列的独特分子索引；
(d)使用靶向所述标签和通用接头序列的引物扩增所连接的DNA片段，以产生第一组扩增的序列；
(e)使用靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物尾部的通用测序引物扩增所述第一组扩增的序列，以产生第二组扩增的序列；
(f)对合并的序列进行测序并获得测序数据；和
(g)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点。
条款2.条款1所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)尾部，以产生第二组扩增的序列。
条款3.条款1或2所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBot引物上的预先设计的非同源序列(SEQ ID NO：269–273)尾部，以产生第二组扩增的序列。
条款4.条款1-3中的任一项所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBot引物上的预先设计的13-mer尾部，以产生第二组扩增的序列。
条款5.条款1-4中的任一项所述的方法，其中步骤(g)包括在处理器上执行下述操作：
条款6.将所述测序数据与参考基因组比对；
(a)(ii)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点；和
(b)(iii)将所述比对、分析和结果数据作为自定义格式的文件、表格或图形输出。
条款7.条款1-5中的任一项所述的方法，其还在步骤(e)之后包括下述步骤：
(a)(e1)将所述第二组扩增的序列标准化以产生浓度标准化文库，将所述标准化文库与其他样品合并以产生合并文库；并继续进行步骤(f)–(i)。
条款8.条款1-6中的任一项所述的方法，其中步骤(d)使用抑制PCR法。
条款9.条款1-7中的任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas酶、Cas表达载体、Cas蛋白或Cas RNP复合物。
条款10.条款1-8中的任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas9酶、Cas9表达载体、Cas9蛋白或Cas9RNP复合物。
条款11.条款1-9中的任一项所述的方法，其中所述细胞包括人类或小鼠细胞。
条款12.条款1-10中的任一项所述的方法，其中所述时间段为约24小时至约96小时。
条款13.条款1-11中的任一项所述的方法，其中将多种标签序列共同递送。
条款14.条款1-12中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包括包含52个碱基对的双链脱氧核糖寡核苷酸(dsDNA)。
条款15.条款1-13中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包含5′-端磷酸和在第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。
条款16.条款1-14中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包括包含SEQ IDNO：1–2或7–268的互补的顶部和底部链对的双链DNA。
条款17.一种中靶和脱靶CRISPR编辑位点，其使用条款1-15中的任一项所述的方法鉴定或提名。
条款18.一种设计52个碱基对的标签序列的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：
(a)随机生成13个核苷酸的序列，其具有40–90％的GC含量，最大均聚物长度A:2、C:3、G:2、T:2，加权均聚率<20，自折叠Tm<50℃，并且自身二聚体Tm<50℃；
(b)移除与特定基因组完全对齐或者是均聚物或GG或CC二核苷酸基序的序列，并获得一组13-mer；
(c)选择所述13-mer序列的含有一个或更少CC或GG二核苷酸基序的子集；
(d)串联所述13-mer子集序列中的四个序列，以形成随机52-mer序列；
(e)将所述随机52-mer序列与基因组比对；
(f)移除与所述基因组具有相似性的随机52-mer序列，以产生52-mer序列的子集；和
(h)输出所述52-mer序列的子集并生成互补链，以产生双链52个碱基对的标签序列。
条款19.条款17所述的方法，其中所述基因组是人类或小鼠的。
条款20.条款17或18所述的方法，其中所述52个碱基对的标签序列不与所述基因组互补。
条款21.条款17-19中的任一项所述的方法，其还包括设计用于所述52个碱基对的标签序列的引物。
条款22.条款17-20中的任一项所述的方法，其中所述52个碱基对的标签序列包含5′-端磷酸和在所述52个碱基对的标签序列的第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。
条款23.条款17-21中的任一项所述的方法，其还包括合成包含所述52个碱基对的标签序列、所述52个碱基对的标签序列的互补体或用于所述52个碱基对的标签序列的引物的寡核苷酸。
条款24.一种或多种52个碱基对的标签序列，其使用条款17-22所述的方法设计。
条款25.条款23所述的52个碱基对的标签序列，其中所述52个碱基对的标签序列包括包含SEQ ID NO：1–2或7–268的顶部和底部链对的双链DNA。
条款26.一种设计与条款23所述的52个碱基对的标签序列部分互补的引物和接头引物的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：
(a)设计与标签序列的顶部和底部链部分互补的标签引物；和
(b)设计与接头序列的顶部链部分互补的接头引物；
(c)其中：
(d)所述标签引物包含5′-通用尾部序列；并且
(e)所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物的尾部互补的序列。
条款27.条款25所述的方法，其中所述5′-通用尾部序列与SP1或SP2序列(SEQ IDNO：7、8)、位点特异性区段、距3′-末端6个核苷酸的核糖核苷酸(rN)、3′-末端错配、3′-末端区块(3′-C3间隔物)、预先设计的非同源序列(SEQ ID NO：269–273)或预先设计的13-mer序列互补。
条款28.条款25或26所述的方法，其中所述与标签序列的顶部和底部链部分互补的引物包含与SP1序列(SEQ ID NO：7)互补的尾部序列，并且所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP2序列(SEQ ID NO：8)尾部互补的序列；或者所述与标签序列的顶部和底部链部分互补的引物包含与SP2序列(SEQ ID NO：8)互补的尾部序列，并且所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP1序列(SEQ ID NO：7)尾部互补的序列。
条款29.条款25-27中的任一项所述的方法，其中使用与标签序列的顶部和底部链互补的引物和与接头序列的顶部链互补的引物进行的核酸分子的扩增产生了包含一部分所述标签序列、sgDNA序列和接头序列的PCR产物。
条款30.条款25-28中的任一项所述的方法，其还包括合成包含正向和反向标签引物和接头引物的序列的寡核苷酸。
条款31.条款17-21和25-29中的任一项所述的方法，其中所述52个碱基对的标签序列和与所述52个碱基对的标签序列部分互补的引物，使用预测所述引物是否可能部分互补和具有形成引物二聚体的倾向的算法来设计和选择。
条款32.一种或多种与52个碱基对的标签序列部分互补的引物和一种或多种接头引物，其使用条款22-25所述的方法来设计。
条款33.条款32所述的引物和接头引物，其中所述引物包含SEQ ID NO：3、4的序列，并且其中所述接头引物包含SEQ ID NO：5的序列。
条款34.一种或多种双链52个碱基对的标签序列的用途，其用于鉴定中靶和脱靶CRISPR编辑位点。
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实施例
实施例1
这项实验证实了当使用长度为52个碱基对并且遗传序列不同的双链DNA标签时，标签整合效率提高。使用的序列示出在表3–5中。双链标签通过顶部链和互补的底部链(表3–4；SEQ ID NO：9–40或45–268)的杂交来产生。将16个不同的标签设计分别与靶向EMX1基因座的引导RNA一起引入到组成性表达Cas9的HEK293细胞中。或者，将16个标签的任一合并物或112个标签的一个合并物与靶向EMX1基因座的引导RNA一起引入到组成性表达Cas9的HEK293细胞中。引导RNA以10μM的浓度电穿孔，而单一标签或合并的标签以0.5μM的终浓度递送。标签整合水平通过使用rhAmpSeq引物(SEQ ID NO：3–4)的靶向扩增来确定，富集EMX1引导RNA的已知中靶和脱靶位点。所述用于EMX1的rhAmpSeq合并物由32个位点组成，其代表了经验确定的中靶和脱靶位点。将扩增的产物在
Figure BDA0004113693960000252
MiSeq上测序，并使用定制软件来确定标签整合水平。这个实施例显示了在单一标签构建物之间标签整合效率各不相同，范围在最多32个位点中的6个(CTL021)至13个(CTL169、CTL079、CTL002)位点之间，因此是序列依赖性的(单一标签，图7)。通过采用单一标签结果的数学联合，计算出23个位点的假设数量(CTLmax，图7)。测试并证明了将标签合并物组合会提高标签整合的可能性的假设(合并的标签，表，图7)。合并物A1由单一标签中表述的标签组成(参见表5)，并证实了在最多32个位点中检测出21个标签整合事件，这高于使用任何单一标签所实现的。同样地，合并物B3证实了在最多32个位点中的21个位点处的标签整合。同样地，显示了合并物之间的可变性(合并的标签，图7)，表明标签设计的优化可以潜在地最大化标签整合。
Figure BDA0004113693960000251
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Figure BDA0004113693960000261
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Figure BDA0004113693960000271
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Figure BDA0004113693960000281
实施例2
这项实验证实了当使用长度为52个碱基对并且遗传序列不同的双链DNA标签时，标签整合效率提高。使用的序列示出在表3–5中。双链标签通过顶部链和互补的底部链(SEQID NO：9–40或45–268)的杂交来产生。将16个不同的标签设计分别与靶向AR基因座的引导RNA一起引入到组成性表达Cas9的HEK293细胞中。或者，将16个标签的任一合并物或112个标签的一个合并物与靶向AR基因座的引导RNA一起引入到组成性表达Cas9的HEK293细胞中。引导RNA以10μM的浓度电穿孔，而单一标签或合并的标签以0.5μM的终浓度递送。标签整合水平通过使用rhAmpSeq引物(SEQ ID NO：3–4)的靶向扩增来确定，富集AR引导RNA的已知中靶和脱靶位点。所述用于AR的rhAmpSeq合并物由53个位点组成，其代表了经验确定的中靶和脱靶位点。将扩增的产物在
Figure BDA0004113693960000282
MiSeq上测序，并使用定制软件来确定标签整合水平。这个实施例显示了在单一标签构建物之间标签整合效率各不相同，范围在最多53个位点中的35个(CTL085、CTL134)至41个(CTL002)位点之间，因此是序列依赖性的(单一标签，表5，图8)。
通过采用单一标签结果的数学联合，计算出47个位点的假设数量(CTLmax，图8)。测试并证明了将标签合并物组合会提高标签整合的可能性的假设(合并的标签，表5，图8)。合并物B4(参见表5)证实了在最多53个位点中检测出44个标签整合事件，这高于使用任何单一标签所实现的。同样地，显示了合并物之间的可变性(合并的标签，表5，图8)，表明标签设计的优化可以潜在地最大化标签整合。
Figure BDA0004113693960000291
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Figure BDA0004113693960000301
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Figure BDA0004113693960000311
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Figure BDA0004113693960000321
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Figure BDA0004113693960000331
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Figure BDA0004113693960000341
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Figure BDA0004113693960000351
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Figure BDA0004113693960000361
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Figure BDA0004113693960000371
Figure BDA0004113693960000372
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序列表
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<151> 2020-07-23
<160> 273
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<212> DNA
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<223> 合成的
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attgcggcgt agatatgcgc ggtagattcg ccggttagag cggaacgaac ga 52
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<212> DNA
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tctatatgcg cggtagattc gccggttt 58
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaatgat acggcgacca ccgagatcta 60
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<223> 硫代磷酸酯连键
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<212> DNA
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acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
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gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atct 34
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tcgcgacagt agtcgttcgg ctaggtacct attaccgcgt agttagcggc gt 52
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acgccgctaa ctacgcggta ataggtacct agccgaacga ctactgtcgc ga 52
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<223> 合成的
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cgcgctacta ggtgcgtcga attggtaccg atccgcaata cactactcgc gc 52
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<212> DNA
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<223> 合成的
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<223> 合成的
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gcgcgattaa ggtcggacga gcggttacca attcgacgca ccgctcgtta cc 52
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acctagcgcc gaacggacga gcggttacca atacgccgca cctagcgccg aa 52
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<212> DNA
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<223> 合成的
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gcgcacatag tcgcgcggta ataggtacct taatcgcgca cctagtcgcg ta 52
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<212> DNA
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<223> 合成的
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gtcgcgcagt gtagcgcgat taaggtacct attaccgcgt cgcgacagta gt 52
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actactgtcg cgacgcggta ataggtacct taatcgcgct acactgcgcg ac 52
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<212> DNA
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<223> 合成的
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tcgctcgatt ggttacgcgc actacttatg cgctcgactc gttcggctag gt 52
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<212> DNA
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<223> 合成的
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<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 28
acctagccga acgagtcgag cgcataagta gtgcgcgtaa ccaatcgagc ga 52
<210> 29
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<223> 合成的
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<221> misc_structure
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<220>
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<212> DNA
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acgacgacta ggttatggta cggcgttagc gcgagtagta ccttagtccg cg 52
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<212> DNA
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<223> 合成的
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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actagtgcga cgaactactg tcgcgaacct attaccgcga ccaatcgagc ga 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
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tcgtcgcact agtcgcatta gtcggtagta gtacgcggta taggtagcgc gt 52
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<212> DNA
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<220>
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cgcggtaata ggtcgcggta ataggtacga gcggtagtca cactactcgc gc 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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tcggcgagta gtttagtgcg agcgtaagta gtgcgcgtaa ccaatcgagc ga 52
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<212> DNA
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gtcgcgcagt gtagcgcggt tatggtacca taaccgcgca ctagtgcgac ga 52
<210> 101
<211> 52
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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<400> 101
tatgcgctcg actgcgcgat taaggtaatg tcgaaccgca gtagtacgcg gt 52
<210> 102
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 102
actagcgcga caacgactat gtgcgcacca attcgacgct acgcgcacta ct 52
<210> 103
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 103
aactactcgc cgacttgtac ggcggtacca attcgacgca actaatccgc gc 52
<210> 104
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
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<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 104
cgcggattaa ggtcttgtac ggcggtacct agccgaacgt acgcgcacta ct 52
<210> 105
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 105
tagcgcgtca agacttgtac ggcggtaccg atccgcaatg cactcgacgg tt 52
<210> 106
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 106
cgcattagtc ggtgcggcgt attggtacga cgactaggta ccaatacgcc gc 52
<210> 107
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<220>
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<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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tacgcgcact acttacgcga ctaggtaccg atcgctagtc gacgcgctgt ta 52
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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acgacgacta ggtaccgccg acttatacgc cgctaactaa taggtagcgc gt 52
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<212> DNA
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<220>
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cggatcgacg gttgcgcgag tagtgtagta gtacgcggtt acactgcgcg ac 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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attgcggatc ggtaccgccg acttataccg atccgcaatt cgctcgattg gt 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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actactgtcg cgatcgtcgc actagttacg ctcgcactaa ttgcggatcg gt 52
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 121
ggtaacgagc ggttctcgcg cactaattag tgcgcgagaa ccatactacg cg 52
<210> 122
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<221> misc_structure
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<223> 硫代磷酸酯连键
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actactcgcg ctagcgcgat taaggtacct taatcgcgca actactcgcc ga 52
<210> 123
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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<400> 123
tacgcgcact actcttgtac ggcggtacca attcgacgca accgtcgagt gc 52
<210> 124
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
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<221> misc_structure
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<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 124
aaccgtcgat ccgattgcgg atcggtacct taatcgcgca ctagtgcgac ga 52
<210> 125
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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agtagtgcgc gtatacactg cgcgacacac tactcgcgca ccttaatccg cg 52
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<212> DNA
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<220>
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<221> misc_structure
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acgccgtacc atacgcggta ataggtagta gtgcgcgtat tcggcgctag gt 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
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<221> misc_structure
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tagcgcgtca agaacctagc gttgcgataa gtcggcggta gtagtacgcg gt 52
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<220>
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<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
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<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 128
cgcattagtc ggtaatctag ccgcgaacca taaccgcgca ccgatcgcta gt 52
<210> 129
<211> 52
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<221> misc_structure
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<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 129
tatggtacgg cgtgcggcgt attggtacgc cgctaactaa taagtcggcg gt 52
<210> 130
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<221> misc_structure
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<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 130
gcgcggttat ggtgcggcgt attggtacga gcggtagtca accgctcgtc cg 52
<210> 131
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 131
cgactatgtg cgcaactact cgccgaacca taaccgcgct atgcgctcga ct 52
<210> 132
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 132
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<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
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<400> 182
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<210> 184
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<212> DNA
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<220>
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acctagcgcc gaacggacga gcggttacta ctgtcgcgac ttgtacggcg gt 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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acgcgctacc tataccgcgt actactaccg actaatgcga ctagtgcgac ga 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
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aaccgtcgag tgcgcgcgag tagtgtacgc cgctaactag cgtcgaattg gt 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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tcgctcgatt ggttacgcgc actacttacg ctcgcactaa actactcgcc ga 52
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<212> DNA
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<220>
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tcgtcgcact agtgcgcggt tatggtacca taaccgcgct acactgcgcg ac 52
<210> 197
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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<210> 198
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
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agtagtgcgc gtagcgtcga attggtgcgc acatagtcgt tgtcgcgcta gt 52
<210> 199
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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<400> 199
gcgcggatta gttgcgtcga attggtaccg ccgtacaagt cggcgagtag tt 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 200
agtagtgcgc gtacgttcgg ctaggtaccg ccgtacaaga ccttaatccg cg 52
<210> 201
<211> 52
<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 201
aaccgtcgag tgcattgcgg atcggtaccg ccgtacaagt cttgacgcgc ta 52
<210> 202
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 202
gcggcgtatt ggtacctagt cgtcgtacca atacgccgca ccgactaatg cg 52
<210> 203
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 203
accgatcgct agtcgcatta gtcggtacca taaccgcgcc gcgctactag gt 52
<210> 204
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 204
tagtgcgagc gtatcgcggc tagattacga cgactaggtt agcgcgagta gt 52
<210> 205
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 205
accttagtcc gcgactgcga gcgtacacct taatcgcgcg tatagcggcg gt 52
<210> 206
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 206
actagcgatc ggtactgcga gcgtacgcac tcgacggtta gtagtgcgcg ta 52
<210> 207
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 207
acctagtcgt cgttctcgcg cactaacgac gcgctgttat acactgcgcg ac 52
<210> 208
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
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<222> (2)..(3)
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<222> (51)..(52)
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
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<223> 合成的
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<220>
<221> misc_structure
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<220>
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<221> misc_structure
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<221> misc_structure
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<400> 229
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<221> misc_structure
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<221> misc_structure
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<400> 230
acgagcggta gtcttagtgc gcgagacgca ttagtcggta ctactcgcgc ta 52
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
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<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
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<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 231
gcgcggttat ggtgtatagc ggcggtacca atcgagcgat agtgcgagcg ta 52
<210> 232
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 232
tagttagcgg cgtataggta gcgcgttatg cgctcgactt cgctcgattg gt 52
<210> 233
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
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<221> misc_structure
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<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 259
accgccgcta tacactgcga gcgtacttcg gcgctaggtg tatagcggcg gt 52
<210> 260
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 260
actactcgcg ctagcggcgt attggtaacc gctcgtccgg cgcgagtagt gt 52
<210> 261
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
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<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 261
gcgcgagtag tgtacctagc gttgcgcgcg gattaaggta ctagtgcgac ga 52
<210> 262
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<223> 5'-磷酸
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<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<222> (2)..(3)
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<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
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<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 262
gcggttcgac attacctagc gttgcgcgca ttagtcggta cctagtagcg cg 52
<210> 263
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
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<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
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<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 263
gtcgcgcagt gtaacctagc gttgcgtcgc gacagtagtg actaccgctc gt 52
<210> 264
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
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<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
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<220>
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<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 264
accgctcgtt accactagcg atcggtacca tactacgcgt acgcgactag gt 52
<210> 265
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 265
cgcaacgcta ggtagtcgag cgcatacgca ttagtcggta atgtcgaacc gc 52
<210> 266
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
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<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 266
acctagtagc gcgtagttag cggcgtttag tgcgcgagag tacgctcgca gt 52
<210> 267
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
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<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 267
cttgtacggc ggtcgcggac taaggttcgc ggctagatta ccgaccgtac cg 52
<210> 268
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1)
<223> 5'-磷酸
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (2)..(3)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (50)..(51)
<223> 硫代磷酸酯连键
<220>
<221> misc_structure
<222> (51)..(52)
<223> 硫代磷酸酯连键
<400> 268
tagttagcgg cgtaatctag ccgcgaatag gtagcgcgta actactcgcc ga 52
<210> 269
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 269
acgcgactat acgcgcaata tggt 24
<210> 270
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 270
ctagcgatac tacgcgatac gagat 25
<210> 271
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 271
catagcggta ttacgcgaga ttacga 26
<210> 272
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 272
cgcgagtacg tacgattacc g 21
<210> 273
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 273
acgcgcgact atacgcgcct c 21

Claims (33)

1.一种以提高的准确性和灵敏度鉴定和提名中靶和脱靶CRISPR编辑位点的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)将引导序列RNA(sgRNA)或双组分CRISPR RNA：反式激活crRNA(crRNA：tracrRNA)双链体、一种或多种标签序列和RNA引导的核酸内切酶共同递送到细胞；
(b)将所述细胞温育一个时间段，所述时间段足以使双链断裂发生；
(c)从所述细胞分离基因组DNA，将所述基因组DNA片段化，并将片段化的基因组DNA连接到含有通用接头序列的独特分子索引；
(d)使用靶向所述标签和通用接头序列的引物扩增所连接的DNA片段，以产生第一组扩增的序列；
(e)使用靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物尾部的通用测序引物扩增所述第一组扩增的序列，以产生第二组扩增的序列；
(f)对合并的序列进行测序并获得测序数据；和
(g)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP1或SP2序列(SEQ ID NO：7、8)尾部，以产生第二组扩增的序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBot引物上的预先设计的非同源序列(SEQ ID NO：269–273)尾部，以产生第二组扩增的序列。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述通用测序引物靶向Tag-pTOP或Tag-pBot引物上的预先设计的13-mer尾部，以产生第二组扩增的序列。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中步骤(g)包括在处理器上执行下述操作：
(i)将所述测序数据与参考基因组比对；
(ii)鉴定中靶/脱靶CRISPR编辑位点；和
(iii)将所述比对、分析和结果数据作为自定义格式的文件、表格或图形输出。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其还在步骤(e)之后包括下述步骤：
(e1)将所述第二组扩增的序列标准化以产生浓度标准化文库，将所述标准化文库与其他样品合并以产生合并文库；并继续进行步骤(f)–(i)。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中步骤(d)使用抑制PCR法。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas酶、Cas表达载体、Cas蛋白或Cas RNP复合物。
9.根据权利要求1-8中的任一项所述的方法，其中所述RNA引导的核酸内切酶包括内源表达的Cas9酶、Cas9表达载体、Cas9蛋白或Cas9 RNP复合物。
10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中所述细胞包括人类或小鼠细胞。
11.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述时间段为约24小时至约96小时。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中将多种标签序列共同递送。
13.根据权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包括包含52个碱基对的双链脱氧核糖寡核苷酸(dsDNA)。
14.根据权利要求1-13中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包含5′-端磷酸和在第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。
15.根据权利要求1-14中的任一项所述的方法，其中所述标签序列包括包含SEQ IDNO：1–2或7–268的互补的顶部和底部链对的双链DNA。
16.一种中靶和脱靶CRISPR编辑位点，其使用根据权利要求1-15中的任一项所述的方法鉴定或提名。
17.一种设计52个碱基对的标签序列的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：
(a)随机生成13个核苷酸的序列，其具有40–90％的GC含量，最大均聚物长度A:2、C:3、G:2、T:2，加权均聚物率<20，自折叠Tm<50℃，并且自身二聚体Tm<50℃；
(b)移除与特定基因组完全对齐或者是均聚物或GG或CC二核苷酸基序的序列，并获得一组13-mer；
(c)选择所述13-mer序列的含有一个或更少CC或GG二核苷酸基序的子集；
(d)串联所述13-mer子集序列中的四个序列，以形成随机52-mer序列；
(e)将所述随机52-mer序列与基因组比对；
(f)移除与所述基因组具有相似性的随机52-mer序列，以产生52-mer序列的子集；和
(h)输出所述52-mer序列的子集并生成互补链，以产生双链52个碱基对的标签序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述基因组是人类或小鼠的。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述52个碱基对的标签序列不与所述基因组互补。
20.根据权利要求17-19中的任一项所述的方法，其还包括设计用于所述52个碱基对的标签序列的引物。
21.根据权利要求17-20中的任一项所述的方法，其中所述52个碱基对的标签序列包含5′-端磷酸和在所述52个碱基对的标签序列的第1与第2位、第2与第3位、第50与第51位和第51与第52位核苷酸之间的硫代磷酸酯连键。
22.根据权利要求17-21中的任一项所述的方法，其还包括合成包含所述52个碱基对的标签序列、所述52个碱基对的标签序列的互补体或用于所述52个碱基对的标签序列的引物的寡核苷酸。
23.一种或多种52个碱基对的标签序列，其使用根据权利要求17-22所述的方法设计。
24.根据权利要求23所述的52个碱基对的标签序列，其中所述52个碱基对的标签序列包括包含SEQ ID NO：1–2或7–268的顶部和底部链对的双链DNA。
25.一种设计与根据权利要求23所述的52个碱基对的标签序列部分互补的引物和接头引物的方法，所述方法包括在处理器上执行下述操作：
(a)设计与标签序列的顶部和底部链部分互补的标签引物；和
(b)设计与接头序列的顶部链部分互补的接头引物；
其中：
所述标签引物包含5′-通用尾部序列；并且
所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物的尾部互补的序列。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述5′-通用尾部序列与SP1或SP2序列(SEQ IDNO：7、8)、位点特异性区段、距3′-末端6个核苷酸的核糖核苷酸(rN)、3′-末端错配、3′-末端区块(3′-C3间隔物)、预先设计的非同源序列(SEQ ID NO：269–273)或预先设计的13-mer序列互补。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述与标签序列的顶部和底部链部分互补的引物包含与SP1序列(SEQ ID NO：7)互补的尾部序列，并且所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP2序列(SEQ ID NO：8)尾部互补的序列；或者所述与标签序列的顶部和底部链部分互补的引物包含与SP2序列(SEQ ID NO：8)互补的尾部序列，并且所述接头引物包含与Tag-pTOP或Tag-pBOT引物上的SP1序列(SEQ ID NO：7)尾部互补的序列。
28.根据权利要求25-27中的任一项所述的方法，其中使用与标签序列的顶部和底部链互补的引物和与接头序列的顶部链互补的引物进行的核酸分子的扩增产生了包含一部分所述标签序列、sgDNA序列和接头序列的PCR产物。
29.根据权利要求25-28中的任一项所述的方法，其还包括合成包含正向和反向标签引物和接头引物的序列的寡核苷酸。
30.根据权利要求17-21和25-29中的任一项所述的方法，其中所述52个碱基对的标签序列和与所述52个碱基对的标签序列部分互补的引物，使用预测所述引物是否可能部分互补和具有形成引物二聚体的倾向的算法来设计和选择。
31.一种或多种与52个碱基对的标签序列部分互补的引物和一种或多种接头引物，其使用根据权利要求22-25所述的方法来设计。
32.根据权利要求31所述的引物和接头引物，其中所述引物包含SEQ ID NO：3、4的序列，并且其中所述接头引物包含SEQ ID NO：5的序列。
33.一种或多种双链52个碱基对的标签序列的用途，其用于鉴定中靶和脱靶CRISPR编辑位点。
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