KR20230040370A - ″CTL-seq″(CRISPR Tag Linear-seq)로 지정된 뉴클레아제 온-/오프-타겟 편집 위치의 지정 방법 - Google Patents

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Abstract

본원은 향상된 정확도 및 민감도로 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하고 지정하는 방법을 개시한다.

Description

″CTL-seq″(CRISPR Tag Linear-seq)로 지정된 뉴클레아제 온-/오프-타겟 편집 위치의 지정 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 7월 23일에 출원된 미국 가출원 특허출원번호 63/055,460호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로서 통합된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 37 CFR § 1.821(c)에 따라 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식과 함께 출원된다. EFS를 통해 제출된 "013670-9056-WO01_sequence_listing_19-JUL-2021_ST25.txt,"는 273개의 서열을 포함하며, 2021년 7월 19일에 생성되었고, 153 Kbytes의 파일 크기를 가지며, 그 전문이 본원에 참조로서 통합된다.
기술 분야
향상된 정확도 및 민감도로 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하고 지정하는 방법이 본원에 개시된다.
일정한 간격을 두고 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeats: CRISPR)은 간단한 유전 부호(genetic code) 변경의 도입을 가능하게 함으로써 유전체학에 혁명을 일으켰다. Cas9 및 Cas12a 단백질과 같은 CRISPR 시스템은 Cas 단백질에 결합된 RNA 올리고뉴클레오티드 서열에 의해 타겟으로 가이드되며, 여기서 효소는 DNA 서열에 이중 가닥 절단(double stranded break, DSB)을 생성한다. 선천적 세포 기구(native cellular machinery)는 일반적으로 비상동 말단 연결 (Non-Homologous End Joining: NHEJ) 또는 상동성 유도 복구(Homology Directed Repair: HDR) 분자 경로를 사용하여 DSB를 복구한다. 온- 및 오프-타겟 위치에서 발생하는 NHEJ를 통해 복구된 DNA는 종종 인델 (indel)(삽입/결실)을 함유하며, 이는 돌연변이 및 인코딩된 유전자의 기능 변화를 유발할 수 있다. 따라서, 이러한 위치를 식별하는 것은 생물학적 표현형에 대한 온- 및 오프-타겟 편집의 영향을 디콘볼루션(deconvolution)하는데 중요하다.
현재까지 CRISPR 또는 기타 뉴클레아제에 대한 오프-타겟 편집 위치를 식별하거나 지정하는 "최적 표준(gold standard)" 방법은 존재하지 않는다. 많은 방법이 개발되어왔다. 이러한 방법은 DSB에 모인 내인성 복구 기구(endogenous repair machinery)(Discover-Seq [1])의 검출, DNA 태그 서열의 숙주 세포 게놈으로 통합(GUIDE-Seq; 미국 특허 번호 9,822,407 참조), iGUIDE[2, 3]), 또는 인 비트로 DNA 절단(BLISS[4], CIRCLE-Seq[5], SiteSeq[6])을 포함하는 다양한 전략을 사용한다.
세포 또는 세포 기반(인 비보라고도 함) 및 생화학적(인 비트로라고도 함) 오프-타겟 분석 지정 시스템은 각각 그들의 장점이 있다. DNA에 결합된 단백질 및 후생적(epigenetic) 표지는 뉴클레아제 활성 기능을 변경시키며, 이는 세포 또는 세포 기반 방법이 더 우수하게 실제 편집 타겟을 식별할 수 있음을 시사한다[7]. 그러나, 생화학적 방법은 세포 또는 세포 기반 방법을 통해 식별되지 않은 부위를 지정해왔으며, 이는 생화학적 방법이 더 포괄적(comprehensive)일 수 있음을 시사한다[5, 6]. 그럼에도 불구하고 이러한 현재 도구는 감도가 불완전한 민감도를 갖는 경향이 있다[5, 6](도 1 참조).
향상된 정확도 및 민감도로 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 발견하고 지정하는 방법이 필요하다.
본 명세서에 기술된 일 구체예는 향상된 정확도 및 민감도로 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하고 지정하는 방법으로서, 상기 과정은 (a) 가이드 서열 RNA(sgRNA) 또는 두-부분 CRISPR RNA:전사활성화 crRNA(crRNA:tracrRNA) 듀플렉스, 하나 이상의 태그 서열 및 RNA-가이드되는 엔도뉴클레아제를 세포에 공동-전달하는 단계; (b) 이중 가닥 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계; (c) 상기 세포로부터 게놈 DNA를 분리하고, 게놈 DNA를 단편화하고, 단편화된 게놈 DNA를 공통(universal) 어댑터 서열을 함유하는 고유한 분자 인덱스에 라이게이션(ligation)하는 단계; (d) 태그 및 공통 어댑터 서열을 타겟팅하는 프라이머를 사용하여 상기 라이게이션된 DNA 단편을 증폭시켜 제 1 증폭 서열 세트를 생성하는 단계; (e) Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 테일(tails)을 타겟팅하는 공통 시퀀싱 프라이머(universal sequencing primer)를 사용하여 제1 증폭 서열 세트를 증폭하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 단계; (f) 풀링된 서열을 시퀀싱하고 시퀀싱 데이터를 얻는 단계; 및 (g) 온-/오프-타겟 CRISPR 편집 유전자좌를 식별하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8) 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성한다. 또 다른 양상에서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 미리 디자인된 비상동적 서열 (서열번호 269-273) 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성한다. 또 다른 양상에서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 미리 디자인된 13-mer 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성한다. 또 다른 양상에서, 상기 단계 (g)는 프로세서 상에서: (i) 서열 데이터를 참조(reference) 게놈에 정렬하는 단계; (ii) 온-/오프-타겟 CRISPR 편집 유전자좌를 식별하는 단계; 및 (iii) 맞춤형 형식의 파일, 표 또는 그래픽으로 정렬, 분석 및 결과 데이터를 출력하는 단계를 수행하는 것을 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 단계 (e) 이후 (e1) 제2 증폭 서열 세트를 정규화하여 농도 정규화된 라이브러리를 생성하고, 정규화된 라이브러리를 다른 샘플들과 풀링하여 풀링된 라이브러리를 생성하는 단계; 및 상기 단계 (f)-(i)를 계속하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 단계 (d)는 억제(supression) PCR 방법을 사용한다. 또 다른 양상에서, 상기 RNA-가이드되는 엔도뉴클레아제는 내인성-발현 Cas 효소, Cas 발현 벡터, Cas 단백질, 또는 Cas RNP 복합체를 포함한다. 또 다른 양상에서, RNA-가이드되는 엔도뉴클레아제는 내인성-발현 Cas9 효소, Cas9 발현 벡터, Cas9 단백질, 또는 Cas9 RNP 복합체를 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 세포는 인간 또는 마우스 세포를 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 시간은 약 24시간 내지 약 96시간이다. 또 다른 양상에서, 상기 다수의 태그 서열은 공동-전달된다. 또 다른 양상에서, 상기 태그 서열은 52-염기쌍을 포함하는 이중-가닥 데옥시리불올리고뉴클레오티드(dsDNA)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 태그 서열은 5'-말단 인산염(phosphate), 및 1번째와 2번째, 2번째와 3번째, 50번째와 51번째, 및 51번째와 52번째 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 연결을 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 태그 서열은 서열번호 1-2 또는 7-268의 상보적인 상부 및 하부 가닥 쌍을 포함하는 이중 가닥 DNA를 포함한다.
본원에 기술된 다른 구체예는 본원에 기술된 방법을 사용하여 식별되거나 지정된 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위이다.
본원에 기술된 또 다른 구체예는 52-염기쌍 태그 서열을 디자인하는 방법으로서, 상기 방법은 프로세서 상에서 (a) 40-90% GC 함량, 최대 호모폴리머 길이 A:2, C:3, G:2, T:2, 가중 호모폴리머 비율<20, 자가-접힘(self-folding) T m < 50 °C, 및 자체-다이머 T m < 50 °C를 갖는 13-뉴클레오티드 서열을 무작위로 생성하는 단계; (b) 특정 게놈에 완벽하게 정렬되는 서열 또는 호모폴리머 또는 GG 또는 CC 디뉴클레오티드 모티프인 서열을 제거하고 13-mer 세트를 얻는 단계; (c) 하나 이하의 CC 또는 GG 디뉴클레오티드 모티프를 함유하는 13-mer 서열의 서브세트를 선별하는 단계; (d) 13-mer 서브세트 서열 중 4개를 이어(concatenate) 무작위 52-mer 서열을 형성하는 단계; (e) 상기 무작위 52-mer 서열을 게놈에 정렬하는 단계; (f) 상기 게놈과 유사성을 갖는 무작위 52-mer 서열을 제거하여 52-mer 서열의 서브세트를 생성하는 단계; 및 (h) 상기 52-mer 서열의 서브세트를 출력하고 상보적 가닥을 생성하여 이중 가닥 52-염기쌍 태그 서열을 생성하는 단계를 수행하는 것을 포함한다. 일 양상에서, 상기 게놈은 인간 또는 마우스이다. 또 다른 양상에서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 상기 게놈에 대해 비상보적이다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 52-염기쌍 태그 서열에 대한 프라이머를 설계하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 52-염기쌍 태그 서열의 5'-말단 인산염, 및 1번째와 2번째, 2번째와 3번째, 50번째와 51번째, 및 51번째와 52번째 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 52-염기쌍 태그 서열, 상기 52-염기쌍 태그 서열의 상보체, 또는 52-염기쌍 태그 서열에 대한 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 다른 구체예는 본원에 기재된 방법을 사용하여 디자인된 하나 이상의 52-염기쌍 태그 서열이다. 일 양상에서, 52-염기쌍 태그 서열은 서열번호 1-2 또는 7-268의 상부 및 하부 가닥 쌍을 포함하는 이중 가닥 DNA를 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 구체예는 청구항 23의 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 프라이머 및 어댑터 프라이머를 설계하는 방법으로서, 상기 방법은 프로세서 상에서 (a) 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 태그 프라이머를 디자인하는 단계; 및 (b) 어댑터 서열의 상부 가닥에 부분적으로 상보적인 어댑터 프라이머를 설계하는 단계를 수행하는 것을 포함하며; 여기서: 상기 태그 프라이머는 5'-공통 테일 서열을 포함하고; 및 상기 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 테일에 상보적인 서열을 포함한다. 일 양상에서, 상기 5'-공통 테일 서열은 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8), 유전자좌 특이적 분절, 3'-말단으로부터 6-뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드(rN), 3'-말단 미스매치, 3'-말단 블록(3′-C3 스페이서), 미리 디자인된 비상동 서열(서열번호269-273), 또는 미리 디자인된 13-mer 서열에 상보적이다. 또 다른 양상에서, 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 프라이머는 SP1 서열(서열번호 7)에 상보적인 테일 서열을 포함하고, 상기 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP2 서열(서열번호 8) 테일에 상보적인 서열을 포함하거나; 또는 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 프라이머는 SP2 서열(서열번호 8)에 상보적인 테일 서열을 포함하고, 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP1 서열(서열번호 7) 테일에 상보적인 서열을 포함한다. 또 다른 양상에서, 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 상보적인 프라이머 및 어댑터 서열의 상부 가닥에 상보적인 프라이머를 사용한 핵산 분자 증폭은 상기 태그 서열의 일부, sgDNA 서열 및 상기 어댑터 서열을 포함하는 PCR 산물을 생성한다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 정방향 및 역방향 태그 프라이머 및 어댑터 프라이머의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 52-염기쌍 태그 서열 및 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 프라이머를 디자인하고 프라이머가 부분적으로 상보적이고 프라이머-다이머를 형성하는 경향이 있을 가능성이 있는지 예측하는 알고리즘을 사용하여 선별한다.
본원에 기술된 다른 구체예는 본원에 기술된 방법을 사용하여 디자인된 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 하나 이상의 프라이머 및 하나 이상의 어댑터 프라이머이다. 일 양상에서, 상기 프라이머는 서열번호 3, 4의 서열; 및 어댑터 프라이머를 포함하며, 여기서 어댑터 프라이머는 서열번호 5의 서열을 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 구체예는 하나 이상의 이중-가닥 52-염기쌍 태그 서열의 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하기 위한 용도이다.
도 1은 3개의 생물학적 복제물(biological replicate)에 공통되는 리드(reads)의 비율을 흰 섹터로 나타내며; 반면 2개의 복제물에 공통되거나 또는 단일 복제물에 존재하는 리드는 검은 섹터로 나타낸다. 표 1은 96-웰 포맷 내 3복제물(triplicate)에서 4개의 다른 gRNA에 대한 GUIDE-seq[3] 기반 지정(nomination)을 나타낸다. 등몰량의 Alt-R crRNA-XT 및 Alt-R tracrRNA를 혼합하여 gRNA 복합체를 생성하였다. Nucleofector™ 시스템(Lonza)을 사용하여 Cas9을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 10μM gRNA 및 0.5μM dsODN GUIDE-seq 태그로 형질감염(transfection)시켰다. 72시간 후, 게놈 DNA(gDNA)를 분리하였다. 게놈 DNA를 단편화하고 Lotus DNA 라이브러리 제작 키트(Lotus DNA library preparation kit, IDT)를 사용하여 어댑터를 라이게이션(ligation)하였다. 삽입된 태그부터 라이게이션된 어댑터까지의 증폭을 통해 라이브러리를 생성하였다[3]. 그런 다음 라이브러리를 Illumina® 플랫폼에서 페어드-엔드(paired-end) 방식으로 시퀀싱하였다.
도 2는 GUIDE-Seq가 rhAmpSeq 타겟 증폭을 통해 검증할 수 있는 것보다 더 많은 오프-타겟 위치를 발견함을 나타낸다. 제시된 결과는 WT Cas9를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에 gRNA 서열(내부 명칭: AR, CTNNB1, EMX1, GRHPR, HPRT38087, HPRT38285, VEGFA)을 전달한 경우의 331개의 GUIDE-Seq 지정 부위의 집합이다. 각 가이드에 대해 총 참조 게놈 정렬된 리드의 0.1% 이상으로 할당된 GUIDE-seq 지정 오프-타겟을 디자인하였으며 모든 참조 게놈 정렬된 하나의 rhAmpSeq 패널에 의해 타겟팅되었다. 후속 실험에서 gRNA를 동일한 세포에 다시 전달하고 rhAmpSeq로 편집을 분석했다. 처리된 조건이 처리되지 않은 대조군 샘플보다 관찰된 인델이 1% 이상인 경우, 타겟은 "편집됨"이라고 하였다.
도 3은 GUIDE-Seq 태그 통합 비율이 다양함을 보여준다. 그래프는 RAG1, RAG2 및 EMX1 유전자를 타겟팅하는 하는 가이드 서열의 GUIDE-Seq 지정된 온/오프- 타겟 유전자좌를 타겟팅하는 rhAmpSeq 패널에서 인델 편집이 있는 118개의 고유한 Cas9 온/오프-타겟 부위에 대한 태그 통합(% 편집으로 정규화됨)의 백분율을 나타낸다. 각 가이드는 34-염기쌍 GUIDE-Seq, dsODN 태그와 함께 Cas9를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에 뉴클레오펙션에 의해 공동-전달되었다. 72시간 후에 DNA를 추출하고 rhAmpSeq 다중 PCR로 증폭하고 Illumina® MiSeq으로 시퀀싱하고 맞춤형 파이프라인을 통해 분석했다. 정규화된 태그 통합률은 태그 서열을 함유하는 각 타겟에서의 시퀀싱된 리드를 참조 게놈과 다른 대립유전자를 포함하는 총 리드(Cas9 편집을 나타냄)로 나눈 백분율로 계산된다.
도 4는 외래(alien) 서열 태그에 대한 rhAmpSeq 프라이머의 디자인을 나타낸다. 카툰 다이어그램은 rhAmpSeq 디자인 파이프라인을 사용하는 디자인 과정의 단계들을 나타내며, 이는 상부 (1) 및 하부 (2) 가닥에 대한 정방향 프라이머의 디자인, 불필요한 프라이머 폐기, 및 5'-중첩(overlapping)은 가지면서 3'-중첩은 없는 서열을 갖는(상부/하부 가닥 프라이머 다이머(dimer)가 헤어핀이 되도록) 태그-타겟팅 프라이머를 선별하는 것을 포함한다.
도 5는 중첩 프라이머 디자인을 구성하는 데 사용되는 rhAmpSeq 디자인 파이프라인의 개요를 나타낸다. 상기 파이프라인에서, 공지된 서열을 각 태그 서열의 5'-말단 및 3'-말단에 부착하고, 인풋(inputs)을 품질 관리하고, 각 태그의 상부 및 하부 가닥에 대한 어세이(assay)(도 4A에 나타냄)를 디자인한다. 각 태그 가닥을 타겟팅하는 프라이머는 동일한 태그를 타겟팅하는 프라이머 간에 RNA 뉴클레오티드 3'의 4개 이상의 뉴클레오티드가 겹치지 않도록 쌍을 이루도록 하고, 프라이머 쌍을 순위화하고 선별한다. Hg38 및 mm38 약어는 각각 인간 및 마우스 게놈의 버전을 나타낸다.
도 6은 중첩 프라이머가 PCR 앰플리콘을 생성하는 경우 헤어핀 형성을 보여준다. 상기 다이어그램은 PCR 산물의 3'- 및 5'-말단에서 상보적인 5' 프라이머 테일 말단을 갖는 중첩 프라이머 영역으로부터의 바람직하지 않은 짧은 앰플리콘의 대표적인 타겟 서열 및 헤어핀 PCR 산물을 보여준다.
도 7은 특정 단일 태그(서열번호 9-40) 또는 표 5에 기술된 태그 풀(서열번호 9-40, 45-268)이 통합된 타겟 부위(검은색 막대)의 수를 나타낸다. 줄무늬 막대(CTLmax)는 단일 태그(서열번호 9-40)의 조합이 사용되는 경우 이론적으로 찾을 수 있는 최대 타겟 부위 수(최대 32개 부위 중 23개 부위)를 나타낸다. 풀 A1은 모든 단일 태그(서열번호 9-40)를 포함한다. 풀 B1-6은 각각 16개의 다른 태그를 포함한다(서열번호 45-268). 풀 C1은 테스트된 모든 태그를 포함한다(서열번호 9-40, 45-268). 통합 사건은 사내 데이터 분석 도구를 사용하여 결정되었다.
도 8은 특정 단일 태그(서열번호 9-40) 또는 표 5에 기술된 태그 풀(서열번호 9-40, 45-268)이 통합된 타겟 부위(검은색 막대)의 수를 나타낸다. 줄무늬 막대(CTLmax)는 단일 태그(서열번호 9-40)의 조합이 사용되는 경우 이론적으로 찾을 수 있는 최대 타겟 부위 수(최대 53개 부위 중 47개 부위)를 나타낸다. 풀 A1은 모든 단일 태그(서열번호 9-40)를 포함한다. 풀 B1-6은 각각 16개의 다른 태그를 포함한다(서열번호 45-268). 풀 C1은 테스트된 모든 태그를 포함한다(서열번호 9-40, 45-268). 통합 사건은 사내 데이터 분석 도구를 사용하여 결정되었다.
향상된 정확도 및 민감도로 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 발견하고 지정하는 방법이 본원에 개시된다. 세포 내 내용 정보(intracellular context information)는 이전의 인 비보 지정 방법을 기반으로 구축되어 유지된다. 민감도는 고유하고, 미리 정의된(predefined) 서열 태그 세트를 공동-전달함으로써 확대된다. 일 양상에서, 공동 전달된 미리 정의된 고유한 태그 세트는 13-80개의 염기쌍 범위일 수 있다. 또 다른 양상에서, 공동-전달된 미리 정의된 태그 세트는 13개의 염기쌍 태그 서열 태그들, 26개의 염기쌍 태그 서열 태그들, 39개의 염기쌍 태그 서열 태그들, 52개의 염기쌍 태그 서열 태그들, 65개의 염기쌍 태그 서열 태그들, 또는 78개의 염기쌍 태그 서열 태그들로 구성될 수 있다. 또 다른 양상에서, 상기 고유한 미리 정의된 태그는 52개 염기쌍 태그 서열 태그들의 세트이다 (증가된 서열 태그들의 길이는 rhPrimers의 우수한 프라이머 랜딩 부위(landing site)를 찾는 능력을 향상시킨다). 이러한 제한은 인간 및 마우스 게놈과 구별되는 다양한 태그 서열을 사용함으로써 완화되는 것으로 여겨진다. 특이성(specificity)은 RNAaseH2(Pyrococcus abyssi)를 사용하여 타겟에 올바르게 어닐링된 프라이머를 언블락(unblock)하는 IDT(Integrated DNA Technologies)의 rhAmp 기술을 기반으로 향상되며; 이는 잘못된 프라이밍 비율을 낮춘다. 특이성은 5'-말단에 예상되는 태그 서열을 함유하는 리드를 사용하여 타겟을 지정하는 것만으로 더욱 향상될 수 있다. 억제 PCR을 이 방법에 통합하면 간편한 사용이 가능하다. 이전의 인 비보 방법(예: GUIDE-seq 및 iGUIDE)은 태그의 상부 및 하부 가닥에 어닐링하고 이로부터 연장시킴으로써 증폭시키기 위해 병렬(parallel) PCR 반응(2 풀 증폭)을 필요로 한다. 여기에서, 억제 PCR을 사용하여 문제가 있는 다이머(dimer) 서열을 유발하지 않고 두 풀을 동시에 증폭할 수 있다.
뉴클레오펙션(nucleofection)을 사용하여 Cas9를 본질적으로(constitutively) 발현하는 HEK293 세포에 GUIDE-Seq dsDNA 태그를 하나의 가이드 RNA와 함께 공동-전달하였다. 이러한 교시에 대해 본원에 참고로 통합된 미국 특허 제9,822,407호를 참고하면 된다. 총 4개의 다른 가이드 RNA를 이러한 방식으로 테스트하였다. 발현된 Cas9와 가이드 RNA 간의 리보핵단백질 복합체(Ribonucleoprotein complexes: RNP)는 세포 내에서 형성되어 이중 가닥 절단을 유도한다. 복구된 절단은 공동-전달된 태그를 포함할 수 있다. 전달 후 세포를 인큐베이션하고 결과 DNA를 추출하였다. GUIDE-Seq 프로토콜에 따라 타겟 증폭을 수행하고 수정된 버전의 GUIDE-Seq 분석 파이프라인(github.com/aryeelab/guideseq)으로 분석했다. 3개의 생물학적 복제물(biological replicate) 사이에서 지정된 타겟을 비교하였다 (고유한 가이드 RNA + 태그 공동-전달). 모든 지정된 타겟이 모든 생물학적 복제물에 공통된 것은 아니였다 (공통 / 총 지정된 타겟: 각각 7/31, 6/19, 2/4, 3/5; 표 1 참조). 그러나, 임의의 타겟에 기인한 총 리드의 >90%는 공통 타겟에 기인하였다(평균; 도 1 참조).
표 1. 4개의 서로 다른 gRNA에 대해 식별된 오프-타겟 부위 및 온-타겟 부위와 비교한 오프-타겟 부위에서의 상대적 편집 수준
위치 C19orf84_BR1 C19orf84_BR2 C19orf84_BR3
chr19_51389306 100.00% 100.00% 100.00%
chr9_20224748 38.55% 16.43% 29.00%
chr4_28036434 16.33% 13.05% 14.36%
chr15_74256506 14.30% 18.18% 25.17%
chr2_171312919 11.40% 8.51% 7.93%
chr8_65742269 10.82% 1.17% 10.40%
chr13_96554656 8.70% 0.00% 0.00%
chr4_86807920 8.50% 9.21% 1.92%
chr3_124485356 6.57% 0.00% 0.00%
chr9_20330398 5.60% 0.00% 0.00%
chr11_71298123 5.12% 0.00% 0.00%
chr7_101729696 4.83% 0.00% 9.58%
chr19_10923882 3.67% 3.03% 0.00%
chr10_15548456 3.57% 15.38% 0.00%
chr12_117097457 2.80% 0.00% 2.60%
chr22_33493900 2.13% 0.00% 4.79%
chrX_149763439 2.13% 0.00% 3.83%
chr17_7435217 1.93% 0.00% 0.55%
chr12_26286721 1.74% 0.00% 5.06%
chr16_49704848 1.26% 5.01% 7.11%
chr12_51288216 1.06% 0.00% 0.00%
chr12_56010621 0.87% 0.00% 0.00%
chr13_29717148 0.48% 0.00% 0.00%
chr1_3088065 0.29% 0.00% 0.00%
chr15_73442915 0.19% 0.00% 0.55%
chr10_118045968 0.19% 0.00% 0.00%
chr14_102199972 0.00% 0.00% 0.68%
chr18_56334679 0.00% 0.00% 2.33%
chr21_36426137 0.00% 0.00% 2.19%
chr5_139002763 0.00% 0.00% 3.83%
chrX_58291642 0.00% 0.00% 3.83%
위치 C17orf99_BR1 C17orf99_BR2 C17orf99_BR3
chr17_78164110 100.00% 100.00% 100.00%
chr22_24471716 15.00% 13.24% 10.86%
chr10_101156881 6.22% 11.07% 9.79%
chr3_170476431 5.86% 3.97% 4.57%
chr17_17692965 4.94% 0.66% 8.62%
chr15_73400031 3.93% 4.63% 5.73%
chr19_15238775 0.00% 0.00% 2.56%
chr2_18362316 0.00% 0.00% 1.59%
chr2_171087784 0.00% 0.54% 0.84%
chr22_19959968 0.00% 1.26% 0.19%
chr22_32114104 0.00% 0.00% 4.06%
chr4_129034015 0.00% 0.00% 0.33%
chr5_61219030 0.00% 0.00% 0.33%
chr5_66209615 0.00% 0.00% 1.86%
chr7_69709389 0.00% 0.12% 2.75%
chr7_158662844 0.00% 1.44% 5.27%
chrX_9567397 0.00% 0.00% 0.23%
chr19_55657073 0.00% 0.66% 0.00%
chr22_43788032 0.00% 2.47% 0.00%
위치 C16orf90_BR1 C16orf90_BR2 C16orf90_BR3
chr16_3494817 100.00% 100.00% 100.00%
chr2_109189307 75.32% 4.27% 52.05%
chr22_24586001 45.45% 0.00% 0.00%
chr10_104736568 0.00% 0.00% 8.22%
위치 ATAD3C_BR1 ATAD3C_BR2 ATAD3C_BR3
chr1_1450685 100.00% 100.00% 100.00%
chr1_1503588 11.73% 10.07% 9.27%
chr1_1516015 2.47% 1.86% 5.14%
chr19_32167960 26.34% 0.93% 0.00%
chr2_111077960 0.00% 1.12% 0.00%
또한 지정된 타겟은 직교 방법(orthogonal method)을 사용하여 복제가능하거나 발견가능하지 않을 수 있다. GUIDE-Seq 방법을 사용하여, GUIDE-Seq DNA 태그를 각각 6개의 가이드(각 태그는 하나의 가이드 RNA와 함께 전달됨)와 함께 뉴클레오펙션을 사용하여 Cas9을 본질적으로 발현하는 HEK293 세포에 공동-전달하였다. rhAmpSeq 다중 앰플리콘 패널은 지정된 타겟을 증폭하도록 설계되었으며 생물학적 복제물에서 편집을 정량화했다. GUIDE-Seq에 의해 지정된 331개의 표적 중 rhAmpSeq로 검증할 수 있는 표적은 41개(12%)뿐이었다(도 2 참조).
NHEJ 복구에 사용되는 안정적으로 발현되는 CRISPR 세포주로 가이드 RNA와 함께 전달되는 dsDNA 태그 서열은 다양한 비율로 통합되었다. 여기에서, GUIDE-Seq dsDNA 태그는 각각 6개의 가이드와 함께 Cas9를 본질적으로 발현하는 HEK293 세포로 공동-전달되었다. 또 다른 양상에서, NHEJ 복구에 사용되는 CRISPR RNP와 함께 전달되는 dsDNA 태그 서열은 다양한 비율로 통합되었다. 여기에서, GUIDE-Seq dsDNA 태그는 각각 6개의 가이드와 함께 Cas9를 본질적으로 발현하는 HEK293 세포로 공동-전달되었다. rhAmpSeq 패널은 지정된 표적을 증폭하기 위해 개발되었으며, 생물학적 복제물에서 맞춤 분석 파이프라인을 사용하여 태그 통합 비율을 분석하였다. 이러한 결과는 태그가 타겟에 따라 다르게 편집된 게놈 카피의 0-85%에서 통합됨을 보여준다(도 3 참조). 임의의 이론에 얽매이지 않고, 상기 비율은 서열 내용(sequence context)에 따라 다르다는 가설을 세웠다.
본원에서는 숙주 게놈 내에서 뉴클레아제 오프-타겟 편집 위치를 지정하기 위한 Integrated DNA Technology의 rhAmpSeq?? 기술, 억제 PCR, 및 신규한 외래 DNA 서열 디자인을 합함으로써 신호대 잡음비(signal to noise ration)를 향상시키는 방법에 대해 기술한다.
이 방법에서 Cas9, sgRNA 또는 두-부분 CRISPR RNA:전사활성화 crRNA(crRNA:tracrRNA) 듀플렉스, 및 하나 이상의 이중 가닥 DNA(dsDNA) 태그 서열이 세포에 전달된다. 여러 태그를 공동-전달은 오프-타겟 부위에서의 향상된 태그 통합을 가능하게 한다 (하기 참조). 태그 서열은 숙주 게놈과 상당히 다른(즉, 이질적인) 서열 내용을 갖는다. 뉴클레아제가 DSB를 도입한 후, NHEJ 복구는 태그 서열을 타겟 부위에 삽입하여 공지된 프라이머 랜딩 부위를 형성한다. 세포가 DSB를 복구하고 가능한 추가 분열 시간을 가진 뒤 (예를 들어 72시간 후), 게놈 DNA를 분리하고, 단편화하고 (예: Covaris® 전단(shearing), 효소-기반 전단, Tn5 등), UMI(Unique Molecular Index)가 포함된 공통 어댑터 서열을 단편화된 DNA에 라이게이션하고, 라이게이션되지 않은 물질을 제거한다. 다음으로, DNA 단편을 태그 및 공통 어댑터 서열에 대한 타겟 프라이머를 사용하여 증폭시킨다 (라운드 1 PCR). 공통 프라이머를 사용하여 샘플 인덱스(PCR2)가 추가되고, 증폭된 물질이 농도 정규화되고, 다른 샘플과 풀링되며, 풀링된 물질이 Illumina®(또는 유사한) 기계에서 시퀀싱된다. 시퀀싱된 리드를 참조 게놈에 정렬시키고, 많은 수의 리드가 발견되는 유전자좌가 온/오프-타겟 위치로 지정될 수 있다.
외래 서열은 40-90% GC 함량, 최대 호모폴리머 길이 A:2, C:3, G:2, T:2, 가중 호모폴리머 비율<20, 자가-접힘 T m < 50 °C, 및 자체-다이머 T m < 50 °C를 갖는 1M 초과의 임의의 13-mer 서열을 생성하여 디자인하였다. 서열 리스트에서 인간(GRCh38.p2; hg38) 또는 마우스(GRCh38.p4; mm38) 참조 게놈에 대해 완벽하게 정렬되는 서열 또는 문제가 되는 모티프 서열(호모폴리머, 대부분의 GG 또는 CC 디뉴클레오티드 모티프)이 있는 서열을 제거하여 결과적으로 479 서열이 되었다.
본원에 기술된 52-염기쌍 태그 서열을 디자인하기 위해, 1개 이하의 C 또는 G 디뉴클레오티드를 포함하는 49개의 13-mer 올리고 서열을 선별하였고, 4개의 13-mer 서열의 10,000개의 고유한 조합을 생성하였다. 각각의 연결된 서열의 길이(예를 들어, 소프트웨어를 사용하여 4개의 13-mer 서열을 연속해서 붙임)는 52-뉴클레오티드이다. 다음으로, bwa-psm이라고 하는 bwa의 내부적으로 수정된 버전을 사용하여 각 52개 뉴클레오티드 태그 서열을 인간(GRCh38.p2) 및 마우스(GRChm38.p4) 게놈에 대해 정렬하였다. bwa-psm의 시행은 모든 2차 매치를 가능한 정해진 임계값까지 반환한다. 태그 서열 세트(서열번호1-2)는 인간 또는 마우스 게놈과 유사하지 않은 그룹으로 작동하도록 디자인하였다 (최대 시드 크기: 7, 시드 편집 거리(seed edit distance): 2, 최대 편집 거리: 21, 최대 갭(gap) 오픈: 2, 최대 갭 연장: 3, 미스매치 패널티: 1, 갭 오픈 패널티: 1, 갭 연장 패널티: 1).
중첩 rhAmpSeq V1 프라이머(서열번호 3-4)는 태그의 상부 및 하부 가닥 및 어댑터 서열(서열번호 6)의 5'-말단에 상보적으로 디자인되었다 (도 4). 태그-특이적 프라이머(서열번호 3-4)는 SP1 및 SP2 프라이머 서열(서열번호 7-8)과 매칭되는 5'-공통 테일 서열, 유전자좌 특이적 분절, 3'-말단으로부터 6-뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드(rN), 3'-말단 미스매치, 및 3'-말단 블록(3'-C3 스페이서)을 포함한다. 어댑터-특이적 프라이머(서열번호 5)는 5'-P5 어댑터 서열(서열번호 6)의 5'-말단을 타겟으로 하고, 어댑터 서열은 UMI(Unique Molecular Index) 서열을 포함한다(표 2). 프라이머는 어닐링된 태그의 플러스 및 마이너스 가닥을 타겟으로 하여 이러한 프라이머가 예기치 않게 다이머를 형성하는 경우 형성된 생성물이 헤어핀되어 사용 가능한 반응 템플릿(예: 억제 PCR)에서 올리고를 제거하도록 디자인되었다. (도 6A-B). 태그를 타겟팅하는 프라이머 서열은 IDT가 설계하고 구현한 독점 디자인 알고리즘을 기반으로 선택되었으며 (공개 UI가 있는 알고리즘의 내부 카피: www.idtdna.com/site/account?ReturnURL=/site/order/designtool/index/RHAMPSEQ), 이는 목적한 템플릿 서열을 증폭하기 위한 가장 최적으로 수행되는 프라이머 쌍을 선별한다. (도 5). 프라이머 서열은 공통 어댑터 서열과 결합될 때 및 인간 또는 마우스 게놈 DNA의 존재에서 오프-타겟 앰플리콘을 형성할 가능성이 없음을 확인하기 위해 다른 모든 태그 서열 및 인간 및 마우스 1차 게놈 집합(assembly)에 대한 비특이적 결합에 대해 평가되었다.
프라이머는 하나의 태그-특이적 프라이머(상부 또는 하부 가닥)가 어댑터-특이적 프라이머(서열번호 5)와 쌍을 이루는 쌍으로 작동하는 것이 바람직하였다. 이는 억제 PCR 방법을 사용하여 증폭될 때 태그의 일부, gDNA 및 어댑터 서열을 포함하는 분자의 증폭을 야기한다(도 4).
표 2. 첫 번째 개념 증명에 사용된 서열
타입 명칭 서열 (5'→3') 서열번호
태그 902217902916904257904625907201907281 T*C*GTTCGTTCCGCTCTAACCGGCGAATCTACCGCGCATATCTACGCCGCA*A*T 서열번호 1
태그 902217902916904257904625907201907281_rev A*T*TGCGGCGTAGATATGCGCGGTAGATTCGCCGGTTAGAGCGGAACGAAC*G*A 서열번호 2
태그 프라이머 pFWD.ID_Target1: 902217902916904257904625907201907281.127.150.1.SP1 acactctttccctacacgacgctcttccgatctTCTACCGCGCATATCTACrGCCGCT/3SpC3/ 서열번호 3
태그 프라이머 pFWD.ID_Target2: 902217902916904257904625907201907281.116.140.-1.SP1 acactctttccctacacgacgctcttccgatctATATGCGCGGTAGATTCGCrCGGTTT/3SpC3/ 서열번호 4
어댑터 프라이머 어댑터 프라이머 gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACArCAAGGC/3SpC3/ 서열번호 5
P5 어댑터 예시(Example) 서열 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTAGATCGCNNWNNWNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T 서열번호 6
SP1 시퀀싱 프라이머 1 acactctttccctacacgacgctcttccgatct 서열번호 7
SP2 시퀀싱 프라이머 2 gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatct 서열번호 8
"*"는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; "rN" 은 리보뉴클레오티드를 나타내며, 여기서 N은 "r"이 선행하는 뉴클레오티드이고; "/3SpC3/" 는 3'-C3 스페이서를 나타낸다.
본원에 기술된 일 구체예는 향상된 정확도 및 민감도로 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하고 지정하는 방법으로서, 상기 과정은: (a) 가이드 서열 RNA(sgRNA) 또는 두-부분 CRISPR RNA:전사활성화 crRNA(crRNA:tracrRNA) 듀플렉스, 및 하나 이상의 태그 서열을 세포에 공동-전달하는 단계; (b) 일정 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계; (c) 상기 세포로부터 게놈 DNA를 분리하고, 게놈 DNA를 단편화하고, 단편화된 게놈 DNA를 공통 어댑터 서열을 함유하는 고유한 분자 인덱스에 라이게이션하는 단계; (d) 태그 및 공통 어댑터 서열을 타겟팅하는 프라이머를 사용하여 상기 라이게이션된 DNA 단편을 증폭시켜 제 1 증폭 서열 세트를 생성하는 단계; (e) Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 테일을 타겟팅하는 공통 시퀀싱 프라이머를 사용하여 제1 증폭 서열 세트를 증폭하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 단계; (f) 풀링된 서열을 시퀀싱하고 시퀀싱 데이터를 얻는 단계; 및 (g) 온-/오프-타겟 CRISPR 편집 유전자좌를 식별하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8) 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성한다. 또 다른 구체예에서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 미리 디자인된 비상동적 서열 (서열번호 269-273) 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성한다. 또 다른 구체예에서, 상기 공통 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 미리 디자인된 13-mer 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성한다. 일 구체예에서, 상기 단계 (g)는 프로세서 상에서 (i) 서열 데이터를 참조 게놈에 정렬하는 단계; (ii) 온-/오프-타겟 CRISPR 편집 유전자좌를 식별하는 단계; 및 (iii) 표 또는 그래픽으로 정렬, 분석 및 결과 데이터를 출력하는 단계를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 단계 (e) 이후 (e1) 제2 증폭 서열 세트를 정규화하여 농도 정규화된 라이브러리를 생성하고, 정규화된 라이브러리를 다른 샘플들과 풀링하여 풀링된 라이브러리를 생성하는 단계; 및 상기 단계 (f)-(i)를 계속하는 단계를 추가로 포함한다. 일 양상에서, 상기 단계 (d)는 억제 PCR 방법을 사용한다. 또 다른 양상에서, 상기 세포는 Cas 효소를 본질적으로 발현하거나, Cas 발현 벡터와 함께 공동-전달되거나, Cas 단백질과 함께 공동-전달되거나, 또는 Cas RNP 복합체와 함께 공동-전달된다. 또 다른 양상에서, 상기 세포는 Cas9 효소를 본질적으로 발현하거나, Cas9 발현 벡터와 함께 공동-전달되거나, Cas9 단백질과 함께 공동-전달되거나, 또는 Cas9 RNP 복합체와 함께 공동-전달된다. 또 다른 양상에서, 상기 세포는 인간 또는 마우스 세포를 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 일정 시간은 약 24시간 내지 약 96시간이다. 또 다른 양상에서, 상기 다수의 태그 서열은 공동-전달된다. 또 다른 양상에서, 상기 태그 서열은 52-염기쌍을 포함하는 이중-가닥 데옥시리불올리고뉴클레오티드(dsDNA)를 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 태그 서열은 5'-말단 인산염, 및 1번째와 2번째, 2번째와 3번째, 50번째와 51번째, 및 51번째와 52번째 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 태그 서열은 서열번호 9-40 또는 45-268의 상부 및 하부 가닥 쌍을 포함하는 이중 가닥 DNA를 포함한다.
본원에 기술된 또 다른 구체예는 본원에 기술된 방법을 사용하여 식별되거나 지정된 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위이다.
본원에 기술된 또 다른 구체예는 52-염기쌍 태그 서열을 디자인하는 방법으로서, 상기 방법은 프로세서 상에서 (a) 40-90% GC 함량, 최대 호모폴리머 길이 A:2, C:3, G:2, T:2, 가중 호모폴리머 비율<20, 자가-접힘 Tm < 50 °C, 및 자체-다이머 Tm < 50 °C를 갖는 13-뉴클레오티드 서열을 무작위로 생성하는 단계; (b) 특정 게놈에 완벽하게 정렬되는 서열 또는 호모폴리머 또는 GG 또는 CC 디뉴클레오티드 모티프인 서열을 제거하고 13-mer 세트를 얻는 단계; (c) 하나 이하의 CC 또는 GG 디뉴클레오티드 모티프를 함유하는 13-mer 서열의 서브세트를 선별하는 단계; (d) 13-mer 서브세트 서열 중 4개를 이어 무작위 52-mer 서열을 형성하는 단계; (e) 상기 무작위 52-mer 서열을 게놈에 정렬하는 단계; (f) 상기 게놈과 유사성을 갖는 무작위 52-mer 서열을 제거하여 52-mer 서열의 서브세트를 생성하는 단계; 및 (h) 상기 52-mer 서열의 서브세트를 출력하고 상보적 가닥을 생성하여 이중 가닥 52-염기쌍 태그 서열을 생성하는 단계를 포함한다. 일 양상에서, 상기 게놈은 인간 또는 마우스이다. 일 양상에서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 게놈에 대해 비상보적이다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 52-염기쌍 태그 서열에 대한 프라이머를 설계하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 52-염기쌍 태그 서열의 5'-말단 인산염, 및 1번째와 2번째, 2번째와 3번째, 50번째와 51번째, 및 51번째와 52번째 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 52-염기쌍 태그 서열, 상기 52-염기쌍 태그 서열의 상보체, 또는 52-염기쌍 태그 서열에 대한 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 구체예는 본원에 기재된 방법을 사용하여 디자인된 하나 이상의 52-염기쌍 태그 서열이다. 일 양상에서, 52-염기쌍 태그 서열은 서열번호 9-40 또는 45-268의 상보적인 상부 및 하부 가닥 쌍을 포함하는 이중 가닥 DNA를 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 구체예는 청구항 23의 52-염기쌍 태그 서열 및 어댑터 프라이머에 부분적으로 상보적인 프라이머를 디자인하는 방법으로서, 상기 방법은 프로세서 상에서: (a) 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 태그 프라이머를 디자인하는 단계; 및 (b) 어댑터 서열의 상부 가닥에 부분적으로 상보적인 어댑터 프라이머를 설계하는 단계를 수행하는 것을 포함하며; 여기서: 상기 태그 프라이머는 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8)에 상보적인 5'-공통 테일 서열, 유전자좌 특이적 분절, 3'-말단으로부터 6-뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드(rN), 3'-말단 미스매치, 및 3'-말단 블록(3′-C3 스페이서)을 포함하고; 및 상기 어댑터 프라이머는 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8)에 상보적인 서열을 포함한다. 일 양상에서, 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 프라이머는 SP1 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 상기 어댑터 프라이머는 SP2 서열에 상보적인 서열을 포함하거나; 또는 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 프라이머는 SP2 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 상기 어댑터 프라이머는 SP1 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 또 다른 양상에서, 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 상보적인 프라이머 및 어댑터 서열의 상부 가닥에 상보적인 프라이머를 사용한 핵산 분자 증폭은 상기 태그 서열의 일부, sgDNA 서열 및 상기 어댑터 서열을 포함하는 PCR 산물을 생성한다. 또 다른 양상에서, 상기 방법은 정방향 및 역방향 태그 프라이머 및 어댑터 프라이머의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기술된 또 다른 구체예에서, 상기 52-염기쌍 태그 서열 및 상기 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 프라이머를 디자인하고 프라이머가 부분적으로 상보적이고 프라이머-다이머를 형성할 경향을 가질 가능성을 예측하는 알고리즘을 사용하여 선별한다.
본원에 기술된 다른 구체예는 본원에 기술된 방법을 사용하여 디자인된 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 하나 이상의 프라이머 및 하나 이상의 어댑터 프라이머이다. 일 양상에서, 상기 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 프라이머는 서열번호 3, 4를 포함하고; 상기 어댑터 프라이머는 서열번호5의 서열을 포함한다.
본원에 기재된 또 다른 구체예는 하나 이상의 이중-가닥 52-염기쌍 태그 서열의 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하기 위한 용도이다.
본원에 기술된 조성물, 제형, 방법, 과정 및 적용에 대한 적절한 변형 및 각색이 이의 임의의 구체예 또는 양상의 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 제공된 조성물 및 방법은 예시적이며 임의의 특정 구체예의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 개시된 모든 다양한 구체예, 양상 및 선택은 임의의 변형 또는 반복으로 조합될 수 있다. 본원에 기재된 방법 및 과정의 범위는 본원에 기재된 구체예, 양상, 선택, 실시예 및 선호(preference)의 모든 실제적 또는 잠재적인 조합을 포함한다. 본원에 기재된 방법은 임의의 구성요소 또는 단계를 생략하거나, 본원에 개시된 임의의 구성요소 또는 단계를 대체하거나, 본원의 다른 곳에 개시된 임의의 구성요소 또는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 구체예들은 다양한 하드웨어, 소프트웨어 및 전자 구성요소의 조합을 포함하고 이로 인해 실행될 수 있다고 이해되어야 한다. 예를 들어, 다양한 언어의 소프트웨어와 마찬가지로 다양한 마이크로프로세서 및 ASICs(application specific integrated circuits)가 활용될 수 있다. 또한, 서버 및 다양한 컴퓨팅 장치가 사용될 수 있으며 하나 이상의 처리 장치(processing unit), 하나 이상의 컴퓨터-판독 가능 매체(computer-readable medium), 하나 이상의 입력/출력 인터페이스, 및 구성 요소를 연결하는 다양한 연결(예: 시스템 버스)을 포함할 수 있다. 참조에 의해 포함된 임의의 특허 또는 간행물의 임의의 용어의 의미가 본 개시에서 사용된 용어의 의미와 상충하는 경우, 본 개시에서의 용어 또는 구문의 의미가 우선된다. 또한, 본 명세서는 단지 예시적인 구체예를 개시하고 기술한다. 본원에 인용된 모든 특허 및 간행물은 이의 구체적인 교시를 위해 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기재된 발명의 다양한 구체예 및 양상은 다음 절(clause)에 의해 요약된다:
절 1. 향상된 정확도 및 민감도로 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하고 지정하는 방법으로서,
(a) 가이드 서열 RNA(sgRNA) 또는 두-부분 CRISPR RNA:전사활성화 crRNA(crRNA:tracrRNA) 듀플렉스, 하나 이상의 태그 서열 및 RNA-가이드되는 엔도뉴클레아제를 세포에 공동-전달하는 단계;
(b) 이중 가닥 절단이 일어나기에 충분한 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계;
(c) 상기 세포로부터 게놈 DNA를 분리하고, 게놈 DNA를 단편화하고, 단편화된 게놈 DNA를 공통 어댑터 서열을 함유하는 고유한 분자 인덱스에 라이게이션하는 단계;
(d) 태그 서열 및 공통 어댑터 서열을 표적화하는 프라이머를 사용하여 상기 라이게이션된 DNA 단편을 증폭시켜 제1 증폭 서열 세트를 생성하는 단계;
(e) Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 테일을 타겟팅하는 공통 시퀀싱 프라이머를 사용하여 제1 증폭 서열 세트를 증폭하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 단계;
(f) 풀링된 서열을 시퀀싱하고 시퀀싱 데이터를 얻는 단계; 및
(g) 온-/오프- 타겟 CRISPR 편집 유전자좌를 식별하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
절 2. 제1절에 있어서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8) 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 것인 방법.
절 3. 제1절 또는 제2절에 있어서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 미리 디자인된 비상동적 서열 (서열번호 269-273) 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 것인 방법.
절 4. 제1절 내지 제3절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBot 프라이머의 미리 디자인된 13-mer 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 것인 방법.
절 5. 제1절 내지 제4절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 단계 (g)는 프로세서 상에서:
절 6. 서열 데이터를 참조 게놈에 정렬하는 단계;
(a) (ii) 온-/오프-타겟 CRISPR 편집 유전자좌를 식별하는 단계; 및
(b) (iii) 맞춤형 형식의 파일, 표 또는 그래픽으로 정렬, 분석 및 결과 데이터를 출력하는 단계를 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
절 7. 제1절 내지 제5절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 단계 (e) 다음에
(a) (e1) 제2 증폭 서열 세트를 정규화하여 농도 정규화된 라이브러리를 생성하고, 정규화된 라이브러리를 다른 샘플들과 풀링하여 풀링된 라이브러리를 생성하는 단계; 및 상기 단계 (f)-(i)를 계속하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
절 8. 제1절 내지 제6절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 단계 (d)는 억제 PCR 방법을 사용하는 것인 방법.
절 9. 제1절 내지 제7절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 RNA-가이드 엔도뉴클레아제는 내인성-발현(endogenously-expressed) Cas 효소, Cas 발현 벡터, Cas 단백질, 또는 Cas RNP 복합체를 포함하는 것인 방법.
절 10. 제1절 내지 제8절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 RNA-가이드되는 엔도뉴클레아제는 내인성-발현 Cas9 효소, Cas9 발현 벡터, Cas9 단백질, 또는 Cas9 RNP 복합체를 포함하는 것인 방법.
절 11. 제1절 내지 제9절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 세포는 인간 또는 마우스 세포를 포함하는 것인 방법.
절 12. 제1절 내지 제10절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 기간은 약 24시간 내지 약 96시간인 것인 방법.
절 13. 제1절 내지 제11절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 다수의 태그 서열이 공동-전달되는 것인 방법.
절 14. 제1절 내지 제12절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 태그 서열은 52-염기쌍을 포함하는 이중-가닥 데옥시리보올리고뉴클레오티드(dsDNA)를 포함하는 것인 방법.
절 15. 제1절 내지 제13절 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태그 서열은 5'-말단 인산염, 및 1번째와 2번째, 2번째와 3번째, 50번째와 51번째, 및 51번째와 52번째 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인 방법.
절 16. 제1절 내지 제14절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 태그 서열은 서열번호 1-2 또는 7-268의 상보적인 상부 및 하부 가닥 쌍을 포함하는 이중 가닥 DNA를 포함하는 것인 방법.
절 17. 제1절 내지 제15절 중 어느 한 절의 방법을 사용하여 식별되거나 지정된 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위.
절 18. 52-염기쌍 태그 서열을 디자인하는 방법으로서, 상기 방법은 프로세서 상에서
(a) 40-90% GC 함량, 최대 호모폴리머 길이 A:2, C:3, G:2, T:2, 가중 호모폴리머 비율<20, 자가-접힘 Tm < 50 °C, 및 자체-다이머 Tm < 50 °C를 갖는 13-뉴클레오티드 서열을 무작위로 생성하는 단계;
(b) 특정 게놈에 완벽하게 정렬되는 서열 또는 호모폴리머 또는 GG 또는 CC 디뉴클레오티드 모티프인 서열을 제거하고 13-mer 세트를 얻는 단계;
(c) 하나 이하의 CC 또는 GG 디뉴클레오티드 모티프를 함유하는 13-mer 서열의 서브세트를 선별하는 단계;
(d) 13-mer 서브세트 서열 중 4개를 이어(concatenate) 무작위 52-mer 서열을 형성하는 단계;
(e) 무작위 52-mer 서열을 게놈에 정렬하는 단계;
(f) 상기 게놈과 유사성을 갖는 무작위 52-mer 서열을 제거하여 52-mer 서열의 서브세트를 생성하는 단계; 및
(g) 52-mer 서열의 서브세트를 출력하고 상보적 가닥을 생성하여 이중 가닥 52-염기쌍 태그 서열을 생성하는 단계를 수행하는 것을 포함하는 것인, 방법.
절 19. 제17절에 있어서, 상기 게놈은 인간 또는 마우스인 것인 방법.
절 20. 제17절 또는 제18절에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 게놈에 비-상보적인 것인 방법.
절 21. 제17절 내지 제19절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열에 대한 프라이머를 디자인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
절 22. 제17절 내지 제20절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 5'-말단 인산염, 및 52-염기쌍 태그 서열의 1번째와 2번째, 2번째와 3번째, 50번째와 51번째, 및 51번째와 52번째 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인 방법.
절 23. 제17절 내지 제21절 중 어느 한 절에 있어서, 52-염기쌍 태그 서열, 상기 52-염기쌍 태그 서열의 상보체, 또는 52-염기쌍 태그 서열에 대한 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
절 24. 제17절 내지 제22절의 방법을 사용하여 설계된 하나 이상의 52-염기쌍 태그 서열.
절 25. 제23절에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 서열번호 1-2 또는 7-268의 상부 및 하부 가닥 쌍을 포함하는 이중 가닥 DNA를 포함하는 것인 52-염기쌍 태그 서열.
절 26. 제23절의 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 프라이머 및 어댑터 프라이머를 디자인하는 방법으로서, 상기 방법은 프로세서 상에서
(a) 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 태그 프라이머를 디자인하는 단계; 및
(b) 어댑터 서열의 상부 가닥에 부분적으로 상보적인 어댑터 프라이머를 설계하는 단계를 수행하는 것으 포함하며;
(c) 여기서:
(d) 상기 태그 프라이머는 5'-공통 테일 서열을 포함하고; 및
(e) 상기 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 테일에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 방법.
절 27. 제25절에 있어서, 상기 5'-공통 테일 서열은 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8), 유전자좌 특이적 분절, 3'-말단으로부터 6-뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드(rN), 3'-말단 미스매치, 3'-말단 블록(3′-C3 스페이서), 미리 디자인된 비상동 서열(서열번호 269-273), 또는 미리 디자인된 13-mer 서열에 상보적인 것인, 방법.
절 28. 제25절 또는 제26절에 있어서, 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 프라이머는 SP1 서열(서열번호 7)에 상보적인 테일 서열을 포함하고 상기 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP2 서열(서열번호 8) 테일에 상보적인 서열을 포함하거나; 또는 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 프라이머는 SP2 서열(서열번호 8)에 상보적인 테일 서열을 포함하고 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP1 서열(서열번호 7) 테일에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 방법.
절 29. 제25절 내지 제27절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 상보적인 프라이머 및 어댑터 서열의 상부 가닥에 상보적인 프라이머를 사용한 핵산 분자의 증폭은 상기 태그 서열의 일부, sgDNA 서열 및 상기 어댑터 서열을 포함하는 PCR 산물을 생성하는 것인, 방법.
절 30. 제25절 내지 제28절 중 어느 한 항에 있어서, 정방향 및 역방향 태그 프라이머 및 어댑터 프라이머의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
절 31. 제17절 내지 제21절 및 제25절 내지 제29절 중 어느 한 절에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열 및 상기 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 프라이머를 디자인하고 상기 프라이머가 부분적으로 상보적이고 프라이머-다이머를 형성하는 경향이 있을 가능성이 있는지 예측하는 알고리즘을 사용하여 선별하는 것인 방법.
절 32. 제22절 내지 제25절의 방법을 사용하여 디자인된 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 하나 이상의 프라이머 및 하나 이상의 어댑터 프라이머.
절 33. 제32절에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3, 4의 서열; 및 어댑터 프라이머를 포함하고, 상기 어댑터 프라이머는 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인 프라이머.
절 34. 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하기 위한 하나 이상의 이중 가닥 52-염기쌍 태그 서열의 용도.
참조
1. Wienert et al., "Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-seq," Science 364(6437): 286-289 (2019).
2. Nobles et al., "IGUIDE: An improved pipeline for analyzing CRISPR cleavage specificity," Genome Biol. 20(14): 4-9 (2019).
3. Tsai et al., "GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases," Nature Biotechnol. 33(2): 187-197 (2015).
4. Yan et al., "BLISS is a versatile and quantitative method for genome-wide profiling of DNA double-strand breaks," Nature Commun. 8: 15058 (2017).
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7. Char and Moosburner, "Unraveling CRISPR-Cas9 genome engineering parameters via a library- on-library approach," Nature Methods 12(9): 823-826 (2015).
8. Rand et al., "Headloop suppression PCR and its application to selective amplification of methylated DNA sequences," Nucleic Acids Res. 33(14) :e127 (2005).
실시예
실시예 1
이 실험은 52-염기쌍 길이와 다양한 유전자 서열을 가진 이중 가닥 DNA 태그를 사용할 때 태그 통합의 효율성 증가를 보여준다. 사용된 서열은 표 3-5에 나타내었다. 이중 가닥 태그는 상부 가닥 및 상보적인 하부 가닥의 혼성화에 의해 생성되었다 (표 3-4; 서열번호 9-40 또는 45-268). 16개의 다른 태그 디자인을 EMX1 유전자좌를 타겟으로 하는 가이드 RNA와 함께 Cas9를 본질적으로 발현하는 HEK293 세포에 각각 도입시켰다. 대안적으로, 16개 태그의 풀들 또는 112개 태그의 하나의 풀을 EMX1 유전자좌를 타겟으로 하는 가이드 RNA와 함께 Cas9를 본질적으로 발현하는 HEK293 세포에 도입시켰다. 가이드 RNA는 10 μM의 농도로 전기천공한 반면, 단일 태그 또는 풀링된 태그는 0.5 μM의 최종 농도로 전달되었다. 태그 통합 수준은 rhAmpSeq 프라이머(서열번호 3-4)를 사용한 타겟팅된 증폭에 의해 결정되었으며, 이는 EMX1 가이드 RNA의 공지된 온- 및 오프-타겟 부위를 풍부하게 한다. EMX1에 대한 rhAmpSeq 풀은 32개 부위로 구성되며, 이는 실험적으로(empirically) 결정된 ON 및 OFF 타겟 유전자좌를 나타낸다. 증폭된 생성물은 Illumina® MiSeq에서 시퀀싱되었으며 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 태그 통합 수준을 결정하였다. 이 실시예는 태그 통합 효율이 최대 32개 부위 중 6개(CTL021)내지 13개(CTL169, CTL079, CTL002) 부위의 범위로 단일 태그 구축물(construct) 간에 개별적으로 다르며, 따라서 서열 의존적이라는 것을 보여준다(단일 태그, 도 7). 단일 태그 결과의 수학적 합집합을 취함으로써, 23개 부위의 가상 수를 계산하였다(CTLmax, 도 7). 태그 풀을 결합하면 태그 통합의 가능성이 증가할 것이라는 가설이 테스트되었고 증명되었다(풀링된 태그, 표, 도 7). 풀 A1은 단일 태그(표 5 참조)에 나타난 태그로 구성되며, 최대 32개 부위 중 21개의 태그 통합 사건이 발견되었고, 이는 임의의 단일 태그로 달성된 것 보다 더 높다. 마찬가지로, 풀 B3은 최대 32개 부위 중 21개 부위에서 태그 통합을 보여주었다. 다시, 풀 간의 변동성이 나타났는데 (풀링된 태그, 도 7), 이는 태그 디자인의 최적화가 잠재적으로 태그 통합을 최대화할 수 있음을 나타낸다.
표 3. 두 번째 개념 증명에 사용된 서열
명칭 서열 (5′→3′) 서열번호
CTL085_TOP_tag /5Phos/A*C*GAGCGGTAGTCACCTAGTCGTCGTACCAATTCGACGCACACTACTCGC*G*C 서열번호 9
CTL085_BOT_tag /5Phos/G*C*GCGAGTAGTGTGCGTCGAATTGGTACGACGACTAGGTGACTACCGCTC*G*T 서열번호 10
CTL169_TOP_tag /5Phos/T*A*GCGCGAGTAGTCGGACGAGCGGTTACCAATACGCCGCACCTTAATCCG*C*G 서열번호 11
CTL169_BOT_tag /5Phos/C*G*CGGATTAAGGTGCGGCGTATTGGTAACCGCTCGTCCGACTACTCGCGC*T*A 서열번호 12
CTL137_TOP_tag /5Phos/T*C*GCGACAGTAGTCGTTCGGCTAGGTACCTATTACCGCGTAGTTAGCGGC*G*T 서열번호 13
CTL137_BOT_tag /5Phos/A*C*GCCGCTAACTACGCGGTAATAGGTACCTAGCCGAACGACTACTGTCGC*G*A 서열번호 14
CTL042_TOP_tag /5Phos/C*G*CGCTACTAGGTGCGTCGAATTGGTACCGATCCGCAATACACTACTCGC*G*C 서열번호 15
CTL042_BOT_tag /5Phos/G*C*GCGAGTAGTGTATTGCGGATCGGTACCAATTCGACGCACCTAGTAGCG*C*G 서열번호 16
CTL051_TOP_tag /5Phos/G*G*TAACGAGCGGTGCGTCGAATTGGTAACCGCTCGTCCGACCTTAATCGC*G*C 서열번호 17
CTL051_BOT_tag /5Phos/G*C*GCGATTAAGGTCGGACGAGCGGTTACCAATTCGACGCACCGCTCGTTA*C*C 서열번호 18
CTL167_TOP_tag /5Phos/T*T*CGGCGCTAGGTGCGGCGTATTGGTAACCGCTCGTCCGTTCGGCGCTAG*G*T 서열번호 19
CTL167_BOT_tag /5Phos/A*C*CTAGCGCCGAACGGACGAGCGGTTACCAATACGCCGCACCTAGCGCCG*A*A 서열번호 20
CTL026_TOP_tag /5Phos/T*A*CGCGACTAGGTGCGCGATTAAGGTACCTATTACCGCGCGACTATGTGC*G*C 서열번호 21
CTL026_BOT_tag /5Phos/G*C*GCACATAGTCGCGCGGTAATAGGTACCTTAATCGCGCACCTAGTCGCG*T*A 서열번호 22
CTL068_TOP_tag /5Phos/G*T*CGCGCAGTGTAGCGCGATTAAGGTACCTATTACCGCGTCGCGACAGTA*G*T 서열번호 23
CTL068_BOT_tag /5Phos/A*C*TACTGTCGCGACGCGGTAATAGGTACCTTAATCGCGCTACACTGCGCG*A*C 서열번호 24
CTL138_TOP_tag /5Phos/A*A*CCGTCGATCCGCGCGTAGTATGGTACCGATCCGCAATACTAGCGCGAC*A*A 서열번호 25
CTL138_BOT_tag /5Phos/T*T*GTCGCGCTAGTATTGCGGATCGGTACCATACTACGCGCGGATCGACGG*T*T 서열번호 26
CTL079_TOP_tag /5Phos/T*C*GCTCGATTGGTTACGCGCACTACTTATGCGCTCGACTCGTTCGGCTAG*G*T 서열번호 27
CTL079_BOT_tag /5Phos/A*C*CTAGCCGAACGAGTCGAGCGCATAAGTAGTGCGCGTAACCAATCGAGC*G*A 서열번호 28
CTL063_TOP_tag /5Phos/A*C*TGCGAGCGTACTTGTCGCGCTAGTACCAATTCGACGCAACCGCTCGTC*C*G 서열번호 29
CTL063_BOT_tag /5Phos/C*G*GACGAGCGGTTGCGTCGAATTGGTACTAGCGCGACAAGTACGCTCGCA*G*T 서열번호 30
CTL168_TOP_tag /5Phos/C*G*CATTAGTCGGTGCGGCGTATTGGTAACCGCTCGTCCGACGCGCTACCT*A*T 서열번호 31
CTL168_BOT_tag /5Phos/A*T*AGGTAGCGCGTCGGACGAGCGGTTACCAATACGCCGCACCGACTAATG*C*G 서열번호 32
CTL021_TOP_tag /5Phos/A*T*TGCGGATCGGTGCGTCGAATTGGTAACCGCTCGTCCGTACGCGCACTA*C*T 서열번호 33
CTL021_BOT_tag /5Phos/A*G*TAGTGCGCGTACGGACGAGCGGTTACCAATTCGACGCACCGATCCGCA*A*T 서열번호 34
CTL151_TOP_tag /5Phos/T*C*GGCGAGTAGTTGCGCGGTTATGGTACCATAACCGCGCAGTAGTACGCG*G*T 서열번호 35
CTL151_BOT_tag /5Phos/A*C*CGCGTACTACTGCGCGGTTATGGTACCATAACCGCGCAACTACTCGCC*G*A 서열번호 36
CTL002_TOP_tag /5Phos/A*C*TAGCGATCGGTACCTAGCGCCGAAACCTATTACCGCGACCTAGCGTTG*C*G 서열번호 37
CTL002_BOT_tag /5Phos/C*G*CAACGCTAGGTCGCGGTAATAGGTTTCGGCGCTAGGTACCGATCGCTA*G*T 서열번호 38
CTL134_TOP_tag /5Phos/T*A*GCGCGTCAAGAGCGCGGTTATGGTTTCGGCGCTAGGTTAACAGCGCGT*C*G 서열번호 39
CTL134_BOT_tag /5Phos/C*G*ACGCGCTGTTAACCTAGCGCCGAAACCATAACCGCGCTCTTGACGCGC*T*A 서열번호 40
GuideSeq_TOP_tag /5Phos/G*T*TTAATTGAGTTGTCATATGTTAATAACGGT*A*T 서열번호 41
GuideSeq_BOT_tag /5Phos/A*T*ACCGTTATTAACATATGACAACTCAATTAA*A*C 서열번호 42
EMX1 protospacer GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA 서열번호 43
AR protospacer GTTGGAGCATCTGAGTCCAG 서열번호 44
"/5Phos/" 는 5'-포스페이트 모이어티를 나타내고; "*"는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
실시예 2
이 실험은 52-염기쌍 길이와 다양한 유전자 서열을 가진 이중 가닥 DNA 태그를 사용할 때 태그 통합의 효율성 증가를 보여준다. 사용된 서열은 표 3-5에 나타내었다. 이중 가닥 태그는 상부 가닥과 상보적인 하부 가닥의 혼성화에 의해 생성되었다 (서열번호 9-40 또는 45-268). 16개의 다른 태그 디자인을 AR 유전자좌를 표적으로 하는 가이드 RNA와 함께 Cas9를 본질적으로 발현하는 HEK293 세포에 각각 도입시켰다. 대안적으로, 16개 태그의 풀들 또는 112개 태그의 하나의 풀을 AR 유전자좌를 타겟으로 하는 가이드 RNA와 함께 Cas9를 본질적으로 발현하는 HEK293 세포에 도입시켰다. 가이드 RNA는 10 μM의 농도로 전기천공한 반면, 단일 태그 또는 풀링된 태그는 0.5 μM의 최종 농도로 전달되었다. 태그 통합 수준은 rhAmpSeq 프라이머(서열번호 3-4)를 사용한 타겟팅된 증폭에 의해 결정되었으며, 이는 AR 가이드 RNA의 공지된 온- 및 오프-타겟 부위를 풍부하게 한다. AR에 대한 rhAmpSeq 풀은 53개 부위로 구성되며 이는 실험적으로 결정된 ON 및 OFF 타겟 유전자좌를 나타낸다. 증폭된 생성물은 Illumina® MiSeq에서 시퀀싱되었으며 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 태그 통합 수준을 결정하였다. 이 실시예는 태그 통합 효율이 최대 53개 부위 중 35개(CTL085, CTL134)내지 41개(CTL002) 부위의 범위로 단일 태그 구축물 간에 개별적으로 다르며, 따라서 서열 의존적이라는 것을 보여준다(단일 태그, 표 5, 도 8).
단일 태그 결과의 수학적 합집합을 취함으로써, 47개 부위의 가상 수를 계산하였다(CTLmax, 도 8). 태그 풀을 결합하면 태그 통합의 가능성이 증가할 것이라는 가설이 테스트되었고 증명되었다(풀링된 태그, 표 5, 도 8). 풀 B4(표 5 참조)는 최대 53개 사이트에서 44개의 태그 통합 사건이 발견되었음을 입증했으며, 이는 임의의 단일 태그로 달성된 것보다 높다. 다시, 풀 간의 변동성이 나타났는데 (풀링된 태그, 표 5, 도 8), 이는 태그 디자인의 최적화가 잠재적으로 태그 통합을 최대화할 수 있음을 나타낸다.
표 4. 태그 서열
명칭 서열 (5′→3′) 서열번호
CTL085_TOP_tag /5Phos/A*C*GAGCGGTAGTCACCTAGTCGTCGTACCAATTCGACGCACACTACTCGC*G*C 서열번호 45
CTL169_TOP_tag /5Phos/T*A*GCGCGAGTAGTCGGACGAGCGGTTACCAATACGCCGCACCTTAATCCG*C*G 서열번호 46
CTL137_TOP_tag /5Phos/T*C*GCGACAGTAGTCGTTCGGCTAGGTACCTATTACCGCGTAGTTAGCGGC*G*T 서열번호 47
CTL042_TOP_tag /5Phos/C*G*CGCTACTAGGTGCGTCGAATTGGTACCGATCCGCAATACACTACTCGC*G*C 서열번호 48
CTL051_TOP_tag /5Phos/G*G*TAACGAGCGGTGCGTCGAATTGGTAACCGCTCGTCCGACCTTAATCGC*G*C 서열번호 49
CTL167_TOP_tag /5Phos/T*T*CGGCGCTAGGTGCGGCGTATTGGTAACCGCTCGTCCGTTCGGCGCTAG*G*T 서열번호 50
CTL026_TOP_tag /5Phos/T*A*CGCGACTAGGTGCGCGATTAAGGTACCTATTACCGCGCGACTATGTGC*G*C 서열번호 51
CTL068_TOP_tag /5Phos/G*T*CGCGCAGTGTAGCGCGATTAAGGTACCTATTACCGCGTCGCGACAGTA*G*T 서열번호 52
CTL138_TOP_tag /5Phos/A*A*CCGTCGATCCGCGCGTAGTATGGTACCGATCCGCAATACTAGCGCGAC*A*A 서열번호 53
CTL079_TOP_tag /5Phos/T*C*GCTCGATTGGTTACGCGCACTACTTATGCGCTCGACTCGTTCGGCTAG*G*T 서열번호 54
CTL063_TOP_tag /5Phos/A*C*TGCGAGCGTACTTGTCGCGCTAGTACCAATTCGACGCAACCGCTCGTC*C*G 서열번호 55
CTL168_TOP_tag /5Phos/C*G*CATTAGTCGGTGCGGCGTATTGGTAACCGCTCGTCCGACGCGCTACCT*A*T 서열번호 56
CTL021_TOP_tag /5Phos/A*T*TGCGGATCGGTGCGTCGAATTGGTAACCGCTCGTCCGTACGCGCACTA*C*T 서열번호 57
CTL151_TOP_tag /5Phos/T*C*GGCGAGTAGTTGCGCGGTTATGGTACCATAACCGCGCAGTAGTACGCG*G*T 서열번호 58
CTL002_TOP_tag /5Phos/A*C*TAGCGATCGGTACCTAGCGCCGAAACCTATTACCGCGACCTAGCGTTG*C*G 서열번호 59
CTL134_TOP_tag /5Phos/T*A*GCGCGTCAAGAGCGCGGTTATGGTTTCGGCGCTAGGTTAACAGCGCGT*C*G 서열번호 60
CTL085_BOT_tag /5Phos/G*C*GCGAGTAGTGTGCGTCGAATTGGTACGACGACTAGGTGACTACCGCTC*G*T 서열번호 61
CTL169_BOT_tag /5Phos/C*G*CGGATTAAGGTGCGGCGTATTGGTAACCGCTCGTCCGACTACTCGCGC*T*A 서열번호 62
CTL137_BOT_tag /5Phos/A*C*GCCGCTAACTACGCGGTAATAGGTACCTAGCCGAACGACTACTGTCGC*G*A 서열번호 63
CTL042_BOT_tag /5Phos/G*C*GCGAGTAGTGTATTGCGGATCGGTACCAATTCGACGCACCTAGTAGCG*C*G 서열번호 64
CTL051_BOT_tag /5Phos/G*C*GCGATTAAGGTCGGACGAGCGGTTACCAATTCGACGCACCGCTCGTTA*C*C 서열번호 65
CTL167_BOT_tag /5Phos/A*C*CTAGCGCCGAACGGACGAGCGGTTACCAATACGCCGCACCTAGCGCCG*A*A 서열번호 66
CTL026_BOT_tag /5Phos/G*C*GCACATAGTCGCGCGGTAATAGGTACCTTAATCGCGCACCTAGTCGCG*T*A 서열번호 67
CTL068_BOT_tag /5Phos/A*C*TACTGTCGCGACGCGGTAATAGGTACCTTAATCGCGCTACACTGCGCG*A*C 서열번호 68
CTL138_BOT_tag /5Phos/T*T*GTCGCGCTAGTATTGCGGATCGGTACCATACTACGCGCGGATCGACGG*T*T 서열번호 69
CTL079_BOT_tag /5Phos/A*C*CTAGCCGAACGAGTCGAGCGCATAAGTAGTGCGCGTAACCAATCGAGC*G*A 서열번호 70
CTL063_BOT_tag /5Phos/C*G*GACGAGCGGTTGCGTCGAATTGGTACTAGCGCGACAAGTACGCTCGCA*G*T 서열번호 71
CTL168_BOT_tag /5Phos/A*T*AGGTAGCGCGTCGGACGAGCGGTTACCAATACGCCGCACCGACTAATG*C*G 서열번호 72
CTL021_BOT_tag /5Phos/A*G*TAGTGCGCGTACGGACGAGCGGTTACCAATTCGACGCACCGATCCGCA*A*T 서열번호 73
CTL151_BOT_tag /5Phos/A*C*CGCGTACTACTGCGCGGTTATGGTACCATAACCGCGCAACTACTCGCC*G*A 서열번호 74
CTL002_BOT_tag /5Phos/C*G*CAACGCTAGGTCGCGGTAATAGGTTTCGGCGCTAGGTACCGATCGCTA*G*T 서열번호 75
CTL134_BOT_tag /5Phos/C*G*ACGCGCTGTTAACCTAGCGCCGAAACCATAACCGCGCTCTTGACGCGC*T*A 서열번호 76
CTL161_TOP_tag /5Phos/T*A*CACTGCGCGACACTGCGAGCGTACACCTTAATCGCGCTAGTTAGCGGC*G*T 서열번호 77
CTL164_TOP_tag /5Phos/A*A*CCGTCGAGTGCACCGCGTACTACTAATGTCGAACCGCTACGCGCACTA*C*T 서열번호 78
CTL030_TOP_tag /5Phos/C*G*CGGACTAAGGTGCGCGAGTAGTGTTACGCGCACTACTAATCTAGCCGC*G*A 서열번호 79
CTL088_TOP_tag /5Phos/A*C*TAGTGCGACGAACTACTCGCGCTAACCAATTCGACGCACCGATCGCTA*G*T 서열번호 80
CTL148_TOP_tag /5Phos/A*A*TGTCGAACCGCGCGCGAGTAGTGTACCATAACCGCGCACCTTAGTCCG*C*G 서열번호 81
CTL152_TOP_tag /5Phos/G*C*GTCGAATTGGTACCGCCGACTTATACCAATACGCCGCATAGGTAGCGC*G*T 서열번호 82
CTL007_TOP_tag /5Phos/A*C*CTAGTAGCGCGGCGTCGAATTGGTACTAGCGCGACAACGCGTAGTATG*G*T 서열번호 83
CTL141_TOP_tag /5Phos/A*C*CGCTCGTTACCGCGCGATTAAGGTACGCCGCTAACTACGGTACGGTCG*G*T 서열번호 84
CTL064_TOP_tag /5Phos/A*C*CGCCGACTTATCGTTCGGCTAGGTACCAATTCGACGCACTGCGAGCGT*A*C 서열번호 85
CTL158_TOP_tag /5Phos/A*C*CTTAATCCGCGACTGCGAGCGTACACCTATTACCGCGCGACGCGCTGT*T*A 서열번호 86
CTL066_TOP_tag /5Phos/A*C*GACGACTAGGTACCGCTCGTTACCTCTTGACGCGCTAACCAATTCGAC*G*C 서열번호 87
CTL144_TOP_tag /5Phos/A*C*CATACTACGCGGCGGTTCGACATTACCATAACCGCGCTAGTGCGAGCG*T*A 서열번호 88
CTL107_TOP_tag /5Phos/C*T*TGTACGGCGGTGCGGCGTATTGGTACCAATACGCCGCTCGTCGCACTA*G*T 서열번호 89
CTL149_TOP_tag /5Phos/G*T*ACGCTCGCAGTACCGCCGACTTATACCTTAATCGCGCACTAGCGCGAC*A*A 서열번호 90
CTL008_TOP_tag /5Phos/A*C*GACGACTAGGTTATGGTACGGCGTTAGCGCGAGTAGTACCTTAGTCCG*C*G 서열번호 91
CTL099_TOP_tag /5Phos/A*C*GAGCGGTAGTCATAGGTAGCGCGTTCTTGACGCGCTAACCGATCGCTA*G*T 서열번호 92
CTL089_TOP_tag /5Phos/A*C*CGATCCGCAATGCGTCGAATTGGTACCATAACCGCGCACCGCCGTACA*A*G 서열번호 93
CTL081_TOP_tag /5Phos/A*C*TAGTGCGACGAACTACTGTCGCGAACCTATTACCGCGACCAATCGAGC*G*A 서열번호 94
CTL075_TOP_tag /5Phos/A*C*CGCCGTACAAGTCGCGACAGTAGTAACCGCTCGTCCGTTCGGCGCTAG*G*T 서열번호 95
CTL160_TOP_tag /5Phos/T*C*GTCGCACTAGTCGCATTAGTCGGTAGTAGTACGCGGTATAGGTAGCGC*G*T 서열번호 96
CTL133_TOP_tag /5Phos/A*C*CAATTCGACGCTAGTTAGCGGCGTACACTACTCGCGCGCACTCGACGG*T*T 서열번호 97
CTL076_TOP_tag /5Phos/C*G*CGGTAATAGGTCGCGGTAATAGGTACGAGCGGTAGTCACACTACTCGC*G*C 서열번호 98
CTL024_TOP_tag /5Phos/T*C*GGCGAGTAGTTTAGTGCGAGCGTAAGTAGTGCGCGTAACCAATCGAGC*G*A 서열번호 99
CTL045_TOP_tag /5Phos/G*T*CGCGCAGTGTAGCGCGGTTATGGTACCATAACCGCGCACTAGTGCGAC*G*A 서열번호 100
CTL009_TOP_tag /5Phos/T*A*TGCGCTCGACTGCGCGATTAAGGTAATGTCGAACCGCAGTAGTACGCG*G*T 서열번호 101
CTL055_TOP_tag /5Phos/A*C*TAGCGCGACAACGACTATGTGCGCACCAATTCGACGCTACGCGCACTA*C*T 서열번호 102
CTL101_TOP_tag /5Phos/A*A*CTACTCGCCGACTTGTACGGCGGTACCAATTCGACGCAACTAATCCGC*G*C 서열번호 103
CTL135_TOP_tag /5Phos/C*G*CGGATTAAGGTCTTGTACGGCGGTACCTAGCCGAACGTACGCGCACTA*C*T 서열번호 104
CTL155_TOP_tag /5Phos/T*A*GCGCGTCAAGACTTGTACGGCGGTACCGATCCGCAATGCACTCGACGG*T*T 서열번호 105
CTL122_TOP_tag /5Phos/C*G*CATTAGTCGGTGCGGCGTATTGGTACGACGACTAGGTACCAATACGCC*G*C 서열번호 106
CTL080_TOP_tag /5Phos/A*C*CTAGTAGCGCGGCGCGGTTATGGTACCGACTAATGCGACTAGCGATCG*G*T 서열번호 107
CTL126_TOP_tag /5Phos/A*C*TACTCGCGCTAACCTAGTCGTCGTAATCTAGCCGCGATACGCTCGCAC*T*A 서열번호 108
CTL098_TOP_tag /5Phos/A*C*CGCCGCTATACGCGCGATTAAGGTGTACGCTCGCAGTCGCGGACTAAG*G*T 서열번호 109
CTL038_TOP_tag /5Phos/T*A*CGCGCACTACTAACCGTCGAGTGCGTACGCTCGCAGTACCGATCGCTA*G*T 서열번호 110
CTL139_TOP_tag /5Phos/G*T*CGCGCAGTGTATAACAGCGCGTCGTTAGTGCGCGAGAACGACGACTAG*G*T 서열번호 111
CTL010_TOP_tag /5Phos/G*C*GTCGAATTGGTCGCGTAGTATGGTACCGCCGCTATACACCAATACGCC*G*C 서열번호 112
CTL034_TOP_tag /5Phos/T*A*CGCGCACTACTTACGCGACTAGGTACCGATCGCTAGTCGACGCGCTGT*T*A 서열번호 113
CTL117_TOP_tag /5Phos/A*C*GCCGCTAACTATAGTTAGCGGCGTACCAATTCGACGCAACTAATCCGC*G*C 서열번호 114
CTL035_TOP_tag /5Phos/C*G*CGGACTAAGGTTAGTTAGCGGCGTTACGCGCACTACTACCGATCCGCA*A*T 서열번호 115
CTL121_TOP_tag /5Phos/A*C*GACGACTAGGTACCGCCGACTTATACGCCGCTAACTAATAGGTAGCGC*G*T 서열번호 116
CTL106_TOP_tag /5Phos/C*G*GATCGACGGTTGCGCGAGTAGTGTAGTAGTACGCGGTTACACTGCGCG*A*C 서열번호 117
CTL059_TOP_tag /5Phos/A*T*TGCGGATCGGTACCGCCGACTTATACCGATCCGCAATTCGCTCGATTG*G*T 서열번호 118
CTL157_TOP_tag /5Phos/A*C*TGCGAGCGTACACTGCGAGCGTACACCTTAATCGCGCACCGCTCGTTA*C*C 서열번호 119
CTL015_TOP_tag /5Phos/A*C*TACTGTCGCGATCGTCGCACTAGTTACGCTCGCACTAATTGCGGATCG*G*T 서열번호 120
CTL110_TOP_tag /5Phos/G*G*TAACGAGCGGTTCTCGCGCACTAATTAGTGCGCGAGAACCATACTACG*C*G 서열번호 121
CTL123_TOP_tag /5Phos/A*C*TACTCGCGCTAGCGCGATTAAGGTACCTTAATCGCGCAACTACTCGCC*G*A 서열번호 122
CTL014_TOP_tag /5Phos/T*A*CGCGCACTACTCTTGTACGGCGGTACCAATTCGACGCAACCGTCGAGT*G*C 서열번호 123
CTL131_TOP_tag /5Phos/A*A*CCGTCGATCCGATTGCGGATCGGTACCTTAATCGCGCACTAGTGCGAC*G*A 서열번호 124
CTL062_TOP_tag /5Phos/A*G*TAGTGCGCGTATACACTGCGCGACACACTACTCGCGCACCTTAATCCG*C*G 서열번호 125
CTL044_TOP_tag /5Phos/A*C*GCCGTACCATACGCGGTAATAGGTAGTAGTGCGCGTATTCGGCGCTAG*G*T 서열번호 126
CTL043_TOP_tag /5Phos/T*A*GCGCGTCAAGAACCTAGCGTTGCGATAAGTCGGCGGTAGTAGTACGCG*G*T 서열번호 127
CTL118_TOP_tag /5Phos/C*G*CATTAGTCGGTAATCTAGCCGCGAACCATAACCGCGCACCGATCGCTA*G*T 서열번호 128
CTL128_TOP_tag /5Phos/T*A*TGGTACGGCGTGCGGCGTATTGGTACGCCGCTAACTAATAAGTCGGCG*G*T 서열번호 129
CTL067_TOP_tag /5Phos/G*C*GCGGTTATGGTGCGGCGTATTGGTACGAGCGGTAGTCAACCGCTCGTC*C*G 서열번호 130
CTL020_TOP_tag /5Phos/C*G*ACTATGTGCGCAACTACTCGCCGAACCATAACCGCGCTATGCGCTCGA*C*T 서열번호 131
CTL006_TOP_tag /5Phos/T*A*GTTAGCGGCGTACCGCTCGTTACCACCTTAATCGCGCACCATACTACG*C*G 서열번호 132
CTL017_TOP_tag /5Phos/C*G*CATTAGTCGGTAGTAGTGCGCGTAAACCGCTCGTCCGTTAGTGCGCGA*G*A 서열번호 133
CTL057_TOP_tag /5Phos/T*A*GCGCGAGTAGTACCGACTAATGCGTCTCGCGCACTAAGACTACCGCTC*G*T 서열번호 134
CTL078_TOP_tag /5Phos/T*A*CGCTCGCACTATCGCTCGATTGGTACCGCCGCTATACACCATAACCGC*G*C 서열번호 135
CTL031_TOP_tag /5Phos/A*C*CAATCGAGCGAAGTCGAGCGCATAACGCGCTACCTATACGCCGCTAAC*T*A 서열번호 136
CTL136_TOP_tag /5Phos/A*C*CTTAATCCGCGACTGCGAGCGTACACCGACTAATGCGACTACTGTCGC*G*A 서열번호 137
CTL165_TOP_tag /5Phos/A*G*TAGTGCGCGTATCGCTCGATTGGTTCTTGACGCGCTAGTATAGCGGCG*G*T 서열번호 138
CTL039_TOP_tag /5Phos/T*C*GTCGCACTAGTCGGTACGGTCGGTGCGCACATAGTCGTATGGTACGGC*G*T 서열번호 139
CTL036_TOP_tag /5Phos/C*G*CGGATTAAGGTAGTCGAGCGCATAACCGCGTACTACTACGACGACTAG*G*T 서열번호 140
CTL048_TOP_tag /5Phos/C*G*ACTATGTGCGCTACGCTCGCACTAACACTACTCGCGCACCTAGCGCCG*A*A 서열번호 141
CTL053_TOP_tag /5Phos/A*C*CGCCGACTTATTCTCGCGCACTAATCGTCGCACTAGTAACCGTCGATC*C*G 서열번호 142
CTL072_TOP_tag /5Phos/A*C*CTAGCGTTGCGACCGACTAATGCGGGTAACGAGCGGTTATGGTACGGC*G*T 서열번호 143
CTL096_TOP_tag /5Phos/C*G*CGCTACTAGGTCGCGGTAATAGGTACCTAGCGTTGCGACCTAGTCGCG*T*A 서열번호 144
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CTL061_BOT_tag /5Phos/A*C*CGCCGCTATACACTGCGAGCGTACTTCGGCGCTAGGTGTATAGCGGCG*G*T 서열번호 259
CTL166_BOT_tag /5Phos/A*C*TACTCGCGCTAGCGGCGTATTGGTAACCGCTCGTCCGGCGCGAGTAGT*G*T 서열번호 260
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CTL105_BOT_tag /5Phos/A*C*CTAGTAGCGCGTAGTTAGCGGCGTTTAGTGCGCGAGAGTACGCTCGCA*G*T 서열번호 266
CTL109_BOT_tag /5Phos/C*T*TGTACGGCGGTCGCGGACTAAGGTTCGCGGCTAGATTACCGACCGTAC*C*G 서열번호 267
CTL032_BOT_tag /5Phos/T*A*GTTAGCGGCGTAATCTAGCCGCGAATAGGTAGCGCGTAACTACTCGCC*G*A 서열번호 268
"/5Phos/" 는 5'-포스페이트 모이어티를 나타내고; "*"는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다.
표 5. 태그 서열들의 풀
풀
풀에
존재하는
태그 		풀 A1 풀 B1 풀 B2 풀 B3 풀 B4 풀 B5 풀 B6 풀 C1
CTL085 CTL161 CTL089 CTL098 CTL062 CTL048 CTL018 풀 A1
CTL169 CTL164 CTL081 CTL038 CTL044 CTL053 CTL115 풀 B1
CTL137 CTL030 CTL075 CTL139 CTL043 CTL072 CTL033 풀 B2
CTL042 CTL088 CTL160 CTL010 CTL118 CTL096 CTL047 풀 B3
CTL051 CTL148 CTL133 CTL034 CTL128 CTL150 CTL108 풀 B4
CTL167 CTL152 CTL076 CTL117 CTL067 CTL084 CTL041 풀 B5
CTL026 CTL007 CTL024 CTL035 CTL020 CTL142 CTL061 풀 B6
CTL068 CTL141 CTL045 CTL121 CTL006 CTL102 CTL166
CTL138 CTL064 CTL009 CTL106 CTL017 CTL154 CTL012
CTL079 CTL158 CTL055 CTL059 CTL057 CTL112 CTL052
CTL063 CTL066 CTL101 CTL157 CTL078 CTL145 CTL153
CTL168 CTL144 CTL135 CTL015 CTL031 CTL060 CTL094
CTL021 CTL107 CTL155 CTL110 CTL136 CTL016 CTL095
CTL151 CTL149 CTL122 CTL123 CTL165 CTL159 CTL105
CTL002 CTL008 CTL080 CTL014 CTL039 CTL056 CTL109
CTL134 CTL099 CTL126 CTL131 CTL036 CTL162 CTL032
표 6. 비상동적 테일
명칭 서열 (5′→3′) 서열번호
H1 ACGCGACTATACGCGCAATATGGT 서열번호 269
H2 CTAGCGATACTACGCGATACGAGAT 서열번호 270
H3 CATAGCGGTATTACGCGAGATTACGA 서열번호 271
H4 CGCGAGTACGTACGATTACCG 서열번호 272
H5 ACGCGCGACTATACGCGCCTC 서열번호 273
SEQUENCE LISTING <110> INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES INC. MCNEILL, Matthew TURK, Rolf RETTIG, Garrett BLACK, Ellen SUN, Youngming SAILOR, Chris WANG, Yu GUNDERSON, Keith KINNEY, Kyle <120> METHODS FOR NOMINATION OF NUCLEASE ON-/OFF-TARGET EDITING LOCATIONS, DESIGNATED "CTL-seq" (CRISPR Tag Linear-seq) <130> 013670-9056-WO01 <150> US 63/055,460 <151> 2020-07-23 <160> 273 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_structure <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (2)..(2) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (50)..(51) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (51)..(52) <223> phosphorothioate linkage <400> 1 tcgttcgttc cgctctaacc ggcgaatcta ccgcgcatat ctacgccgca at 52 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_structure <222> (1)..(1) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (2)..(3) <223> phosphorothioate 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_structure <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphate <220> <221> misc_structure <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (2)..(3) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (50)..(51) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (51)..(52) <223> phosphorothioate linkage <400> 257 aatctagccg cgatagttag cggcgtacct taatcgcgct agcgcgagta gt 52 <210> 258 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_structure <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphate <220> <221> misc_structure <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (2)..(3) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (50)..(51) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (51)..(52) <223> phosphorothioate linkage <400> 258 tacgcgcact actgcgtcga attggtgcgc ggattagttg cgtcgaattg gt 52 <210> 259 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_structure <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphate <220> <221> misc_structure <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (2)..(3) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (50)..(51) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (51)..(52) <223> phosphorothioate linkage <400> 259 accgccgcta tacactgcga gcgtacttcg gcgctaggtg tatagcggcg gt 52 <210> 260 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_structure <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphate <220> <221> misc_structure <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (2)..(3) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (50)..(51) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (51)..(52) <223> phosphorothioate linkage <400> 260 actactcgcg ctagcggcgt attggtaacc gctcgtccgg cgcgagtagt gt 52 <210> 261 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_structure <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphate <220> <221> misc_structure <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (2)..(3) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (50)..(51) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (51)..(52) <223> phosphorothioate linkage <400> 261 gcgcgagtag tgtacctagc gttgcgcgcg gattaaggta ctagtgcgac ga 52 <210> 262 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_structure <222> (1)..(1) <223> 5'-phosphate <220> <221> misc_structure <222> (1)..(2) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (2)..(3) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (50)..(51) <223> phosphorothioate linkage <220> <221> misc_structure <222> (51)..(52) <223> phosphorothioate linkage <400> 262 gcggttcgac attacctagc gttgcgcgca ttagtcggta cctagtagcg cg 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Claims (33)

  1. 향상된 정확도 및 민감도로 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하고 지정하는 방법으로서,
    (a) 가이드 서열 RNA(sgRNA) 또는 두-부분 CRISPR RNA:전사활성화 crRNA(crRNA:tracrRNA) 듀플렉스, 하나 이상의 태그 서열 및 RNA-가이드되는 엔도뉴클레아제를 세포에 공동-전달(co-deliver)하는 단계;
    (b) 이중 가닥 절단(double strand breaks)이 일어나기에 충분한 시간 동안 세포를 인큐베이션하는 단계;
    (c) 상기 세포로부터 게놈 DNA를 분리하고, 게놈 DNA를 단편화하고, 단편화된 게놈 DNA를 공통(universal) 어댑터 서열을 함유하는 고유한 분자 인덱스에 라이게이션(ligation)하는 단계;
    (d) 태그 서열 및 공통 어댑터 서열을 표적화하는 프라이머를 사용하여 상기 라이게이션된 DNA 단편을 증폭시켜 제1 증폭 서열 세트를 생성하는 단계;
    (e) Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 테일(tails)을 타겟팅하는 공통 시퀀싱 프라이머를 사용하여 제1 증폭 서열 세트를 증폭하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 단계;
    (f) 풀링된 서열을 시퀀싱하고 시퀀싱 데이터를 얻는 단계; 및
    (g) 온-/오프- 타겟 CRISPR 편집 유전자좌를 식별하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8) 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 미리 디자인된 비상동적 서열 (서열번호 269-273) 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공통 시퀀싱 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBot 프라이머의 미리 디자인된 13-mer 테일을 타겟하여 제2 증폭 서열 세트를 생성하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (g)는 프로세서 상에서:
    (i) 서열 데이터를 참조(reference) 게놈에 정렬하는 단계;
    (ii) 온-/오프-타겟 CRISPR 편집 유전자좌를 식별하는 단계; 및
    (iii) 맞춤형 형식의 파일, 표 또는 그래픽으로 정렬, 분석 및 결과 데이터를 출력하는 단계를 수행하는 것을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (e) 다음에
    (e1) 제2 증폭 서열 세트를 정규화하여 농도 정규화된 라이브러리를 생성하고, 정규화된 라이브러리를 다른 샘플들과 풀링하여 풀링된 라이브러리를 생성하는 단계; 및 상기 단계 (f)-(i)를 계속하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 억제(supression) PCR 방법을 사용하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-가이드되는 엔도뉴클레아제는 내인성-발현(endogenously-expressed) Cas 효소, Cas 발현 벡터, Cas 단백질, 또는 Cas RNP 복합체를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-가이드되는 엔도뉴클레아제는 내인성-발현 Cas9 효소, Cas9 발현 벡터, Cas9 단백질, 또는 Cas9 RNP 복합체를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 인간 또는 마우스 세포를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시간은 약 24시간 내지 약 96시간인 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 태그 서열은 공동-전달되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태그 서열은 52-염기쌍을 포함하는 이중-가닥 데옥시리보올리고뉴클레오티드(dsDNA)를 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태그 서열은 5'-말단 인산염(phosphate), 및 1번째와 2번째, 2번째와 3번째, 50번째와 51번째, 및 51번째와 52번째 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 연결을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태그 서열은 서열번호 1-2 또는 7-268의 상보적인 상부 및 하부 가닥 쌍을 포함하는 이중 가닥 DNA를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 식별되거나 지정된 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위.
  17. 52-염기쌍 태그 서열을 디자인하는 방법으로서, 상기 방법은 프로세서 상에서
    (a) 40-90% GC 함량, 최대 호모폴리머 길이 A:2, C:3, G:2, T:2, 가중 호모폴리머 비율<20, 자가-접힘(self-folding) Tm < 50 °C, 및 자체-다이머 Tm < 50 °C를 갖는 13-뉴클레오티드 서열을 무작위로 생성하는 단계;
    (b) 특정 게놈에 완벽하게 정렬되는 서열 또는 호모폴리머 또는 GG 또는 CC 디뉴클레오티드 모티프인 서열을 제거하고 13-mer 세트를 얻는 단계;
    (c) 하나 이하의 CC 또는 GG 디뉴클레오티드 모티프를 함유하는 13-mer 서열의 서브세트를 선별하는 단계;
    (d) 13-mer 서브세트 서열 중 4개를 이어(concatenate) 무작위 52-mer 서열을 형성하는 단계;
    (e) 상기 무작위 52-mer 서열을 게놈에 정렬하는 단계;
    (f) 상기 게놈과 유사성을 갖는 무작위 52-mer 서열을 제거하여 52-mer 서열의 서브세트를 생성하는 단계; 및
    (h) 52-mer 서열의 서브세트를 출력하고 상보적 가닥을 생성하여 이중 가닥 52-염기쌍 태그 서열을 생성하는 단계를 수행하는 것을 포함하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 게놈은 인간 또는 마우스인 것인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 상기 게놈에 비상보적인 것인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열에 대한 프라이머를 디자인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 5'-말단 인산염, 및 52-염기쌍 태그 서열의 1번째와 2번째, 2번째와 3번째, 50번째와 51번째, 및 51번째와 52번째 뉴클레오티드 간 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인 방법.
  22. 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열, 상기 52-염기쌍 태그 서열의 상보체(complement), 또는 상기 52-염기쌍 태그 서열에 대한 프라이머를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  23. 제17항 내지 제22항의 방법을 사용하여 디자인된 하나 이상의 52-염기쌍 태그 서열.
  24. 제23항에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열은 서열번호 1-2 또는 7-268의 상부 및 하부 가닥 쌍을 포함하는 이중 가닥 DNA를 포함하는 것인 52-염기쌍 태그 서열.
  25. 제23항의 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 프라이머 및 어댑터 프라이머를 디자인하는 방법으로서, 상기 방법은 프로세서 상에서
    (a) 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 태그 프라이머를 디자인하는 단계; 및
    (b) 어댑터 서열의 상부 가닥에 부분적으로 상보적인 어댑터 프라이머를 디자인하는 단계를 수행하는 것을 포함하며;
    여기서:
    상기 태그 프라이머는 5'-공통 테일 서열(universal tail sequence)을 포함하고; 및
    상기 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 테일에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 5'-공통 테일 서열은 SP1 또는 SP2 서열(서열번호 7, 8), 유전자좌 특이적 분절(segment), 3'-말단으로부터 6-뉴클레오티드의 리보뉴클레오티드(rN), 3'-말단 미스매치, 3'-말단 블록(3'-C3 스페이서), 미리 디자인된 비상동 서열(서열번호 269-273), 또는 미리 디자인된 13-mer 서열에 상보적인 것인, 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 프라이머는 SP1 서열(서열번호 7)에 상보적인 테일 서열을 포함하고 상기 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머의 SP2 서열(서열번호 8) 테일에 상보적인 서열을 포함하거나; 또는 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 부분적으로 상보적인 프라이머는 SP2 서열(서열번호 8)에 상보적인 테일 서열을 포함하고 상기 어댑터 프라이머는 Tag-pTOP 또는 Tag-pBOT 프라이머 상의 SP1 서열(서열번호 7) 테일에 상보적인 서열을 포함하는 것인, 방법.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 태그 서열의 상부 및 하부 가닥에 상보적인 프라이머 및 어댑터 서열의 상부 가닥에 상보적인 프라이머를 사용한 핵산 분자의 증폭은 상기 태그 서열의 일부, sgDNA 서열 및 상기 어댑터 서열을 포함하는 PCR 산물을 생성하는 것인, 방법.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 정방향 및 역방향 태그 프라이머 및 어댑터 프라이머의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  30. 제17항 내지 제21항 및 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 52-염기쌍 태그 서열 및 상기 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 프라이머를 디자인하고, 상기 프라이머가 부분적으로 상보적이어서 프라이머-다이머를 형성하는 경향이 있을 가능성이 있는지 예측하는 알고리즘을 사용하여 선별하는 것인, 방법.
  31. 제22항 내지 제25항의 방법을 사용하여 디자인된 52-염기쌍 태그 서열에 부분적으로 상보적인 하나 이상의 프라이머 및 하나 이상의 어댑터 프라이머.
  32. 제31항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 3, 4의 서열; 및 어댑터 프라이머를 포함하고, 상기 어댑터 프라이머는 서열번호 5의 서열을 포함하는 것인 프라이머.
  33. 온- 및 오프-타겟 CRISPR 편집 부위를 식별하기 위한 하나 이상의 이중 가닥 52-염기쌍 태그 서열의 용도.
KR1020237005951A 2020-07-23 2021-07-22 ″CTL-seq″(CRISPR Tag Linear-seq)로 지정된 뉴클레아제 온-/오프-타겟 편집 위치의 지정 방법 KR20230040370A (ko)

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