JP7292258B2 - 縦列反復配列を有するドナーdna修復鋳型を使用する部位特異的なdna改変 - Google Patents
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Description
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。2017年4月4日に作成された前記ASCIIコピーは、315642-1_SL.txtという名称であり、2,937バイトのサイズである。
材料:Cas-9組込み型細胞株(U2OS-Cas9細胞、HEK293T-Cas9細胞)、CRISPR RNA(crRNA)、トランス活性化crRNA(tracrRNA)、プラスミドSEC61B(EGFP)及びLMNA(EGFP)(RCA反応用の鋳型として使用した)及びDharmaFECT(商標) DUOトランスフェクション試薬(図中、DUOと略記される)は、Dharmacon, GE Healthcare社から入手した。微量遠心チューブ及び96ウェル細胞培養プレートはFisher Scientific社から入手した。dNTP及びランダム六量体プライマーはGE Healthcare Life Sciences社(Piscataway、NJ、USA)から入手し、アルファ-チオ-dNTPのSp異性体(Sp-dTTPaS、Sp-dGTPaS、Sp-dATPaS及びSp-dCTPaS等)はBiolog-Life Science Institute社(Bremen、Germany)から入手した。Phi29 DNAポリメラーゼ(1mg/ml)はEnzymatics社(Beverly、MA、USA)のものであった。オリゴヌクレオチド(PCR用のフォワード及びリバースプライマー、RCA用のプライマー等)はIntegrated DNA Technologies社(IDT Inc、Iowa、USA)から購入した。LongAmp(登録商標)Taq PCRキット、T4 DNAリガーゼ、制限酵素PvuI、HindIII、BamHI及びBglII、並びにエキソヌクレアーゼ(ラムダエキソヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼI)はNew England BioLabs社(登録商標)(NEB Inc.、MA、USA)からのものであった。MEM-RS(還元ナトリウム培地)、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、HEPESはHyClone, GE Healthcare社(Utah、US)から購入し、pH8のトリス緩衝液はAmbion(登録商標)社(MA、US)から入手した。D-グルコースはSigma Aldrich社(MO、USA)から購入し、10%のFBSはThermo Fisher Scientific社(MA、USA)から購入した。
付着細胞株U2OS-Cas9及びHEK293T-Cas9を以下の実験のために使用して、RCAドナーDNAのようなドナーポリヌクレオチドの効率を評価した。0日目に、細胞培養培地で処理した96ウェルプレートに細胞をプレーティングした。U2OS-Cas9細胞株のプレーティング密度は15×103細胞/ウェルであり、HEK293T細胞株のプレーティング密度は10×103細胞/ウェルであった。細胞を5%のCO2インキュベーター中37℃で終夜静置し、96ウェルプレートのウェルの内側表面への細胞の接着を誘導した。1日目に、培養細胞を細胞トランスフェクション実験のために使用した。トランスフェクション混合物を調製し、培地を吸引して細胞から除去した後、トランスフェクション混合物を細胞に加えた。
ドナーDNA修復鋳型としてRCA産物DNA又はプラスミドDNAを使用する遺伝子編集
RCA産物DNA及びドナープラスミド(100ng/μl)の両方を10mMのトリス(pH8.0)中で調製した。crRNA及びtracrRNAの2.5μMのストックを10mMのトリス(pH8.0)中で別々に調製した。遺伝子編集実験のための対照及び実験試料をTable 1(表1)に示すように調製した。MEM(非トランスフェクション対照又はNTC、試料番号1)、トランスフェクション試薬(試料番号2)、トランスフェクション試薬及びcrRNA:tracr RNA(ガイドRNA又はgRNA)(ドナーDNA修復鋳型なし、試料番号3)、並びにトランスフェクション試薬及びドナーDNA修復鋳型(ガイドRNAなし、試料番号4)のみを含有する試料を陰性対照として使用した。陽性対照は、トランスフェクション試薬及びgRNAの存在下でのドナーDNA修復鋳型として、GFPインサートを含有するドナープラスミドDNA(SEC61B又はLMNA)(試料番号5)又は鋳型としてドナープラスミドを使用して生成されたドナーRCA産物DNA(試料番号6)のいずれかを含有した。ドナープラスミドDNA又はドナーRCA産物DNAの最終濃度は試料5及び試料6において200ng/ウェルであった。6つの別々の微量遠心チューブを使用して、下記のTable 1(表1)のように試薬を混合した。DharmaFECT(商標) DUOストック溶液をMEM-RS中に希釈し、希釈したDharmaFECT(商標) DUOを室温(30℃)で5分間インキュベートした後に各々のウェルに加えた。35μLの希釈したDharmaFECT(商標) DUOをトランスフェクション用のあらゆるウェルにおいて使用した。希釈したDharmaFECT(商標) DUOを加えた後、各ウェル中の混合物を30℃で20分間インキュベートした。ドナーDNA修復鋳型を除く試薬組成物の混合物を以下では「トランスフェクション混合物」と称する。
チオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた二本鎖RCA産物DNAの組込み効率
プラスミドDNAのローリングサークル増幅(RCA)
試薬の調製:プラスミドDNA鋳型のRCAは、縦列反復配列を有する高分子量の、ハイパーブランチのコンカテマーをもたらす。水、反応緩衝液、プライマー及びphi29酵素を含むRCA試薬を、ライゲートされる鋳型及びdNTPの添加の前に予備洗浄して、オフターゲット増幅を最小化した。エキソヌクレアーゼ耐性プライマー及びヌクレオチド(dNTP)を含有するプライマー-ヌクレオチド溶液(プライマー-ヌクレオチド混合液)を、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII及び一本鎖DNA結合タンパク質(SSBタンパク質)の組合せとインキュベートすることにより、プライマー-ヌクレオチド混合液の汚染を除去した。任意選択でエキソヌクレアーゼの存在下(使用されるDNAポリメラーゼが非プルーフリーディングDNAポリメラーゼを含む場合)で二価の陽イオン(例えば、Mg2+)とインキュベートすることにより、DNAポリメラーゼを含有する酵素混合液の汚染を除去した。プラスミドDNA鋳型の増幅は、そのような汚染除去した酵素混合液及びプライマー-ヌクレオチド混合液を使用して行った。例えば、200ngのPhi29 DNAポリメラーゼを含有するポリメラーゼ溶液を、15mMのKCl、20mMのMgCl2、0.01%のTween-20及び1mMのTCEPを含有する5μLの50mMのHEPES緩衝液(pH=8.0)中で0.1単位のエキソヌクレアーゼIIIとインキュベートした。インキュベーションは、30℃で約60分又は4℃で12時間のいずれかで行った。汚染除去したPhi29 DNAポリメラーゼ溶液を氷浴に移した後、エキソヌクレアーゼIIIの事前の不活性化なしで標的RCAアッセイにおいて使用した。
dsRCA産物DNAを長いコンカテマーとして又はエンドヌクレアーゼを使用する制限消化後にトランスフェクトした。コンカテマー化したdsRCA産物をPvu Iを用いる制限消化に供して、直鎖状の単一コピーのDNA断片を生成した。本明細書において言及される単一コピーのDNA断片は、縦列反復配列の1つの単一の配列である。縦列反復配列からの単一の配列は、PvuIのような制限酵素を用いるRCAの制限消化により形成される。PvuIによる制限処理のために37℃で18時間dsRCAの試料をインキュベートした。完全な消化後、処理したDNA試料を上記のようにエタノール沈殿させ、TET緩衝液中に再懸濁させた。dsRCA増幅産物をエタノール沈殿後の150μlのTET緩衝液中に再懸濁させた。DNAゲル電気泳動による分析のためにこの工程の後に10マイクロリットルの懸濁したdsRCAを回収した。残りの140μlの懸濁したdsRCAを上記のように150単位のPvu Iを用いて適切な緩衝液中で消化させた。
チオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた一本鎖RCA産物DNAの組込み効率
プラスミドDNA鋳型:プラスミドpHR-EGFP-SEC61B(SEC61B)はTurboGFP遺伝子のインサートを含有した一方、プラスミドLMNA(pHR-EGFP-LMNA)はEGFP遺伝子のインサートを含有した。ssRCA産物を生成するためにプラスミドpHR-EGFP-SEC61B及びプラスミドpHR-EGFP-LMNAの500ngのプラスミドDNAを反応混合物(100μlの最終容量)中に加えた。
ssRCA産物DNAを長いコンカテマーとして又はエンドヌクレアーゼを使用する制限消化後にトランスフェクトした。コンカテマー化したssRCA産物をPvu Iを用いる制限消化に供して、実施例2に記載されるように単一コピーのDNA断片を生成した。PvuIによる制限処理のために37℃で18時間ssRCA DNA試料をインキュベートした。完全な消化後、処理されたDNA試料を実施例1に記載のようにエタノール沈殿させ、TET緩衝液中に再懸濁させた。ssRCA増幅産物をエタノール沈殿後の50μlのTET緩衝液中に再懸濁させた。5マイクロリットルの懸濁したssRCAをDNAゲル電気泳動を使用して分析した。縦列反復RCA DNAを消化して二本鎖DNA制限部位を生成させてDNAにニックを入れるために、ssRCA DNAの以下の処理が必要とされた。残りの45μlの懸濁したssRCAを30ピコモルの20塩基デオキシリボオリゴヌクレオチド(オリゴ)配列に加え、該配列は、ssRCA産物DNAを20塩基オリゴ配列とアニールさせるためにssRCA産物上の適切な制限部位に相補的であり、該制限部位の中心にあった。アニーリング後、ssRCA DNA:20塩基オリゴハイブリッドをPvu Iの存在下37℃で18時間インキュベートした。Pvu I処理したssRCA DNA:20塩基オリゴハイブリッドを上記のようにエタノール沈殿させ、35μlのTET緩衝液中に再懸濁させた。再懸濁されたら、ssRCAのDNA濃度を分光光度的に決定した。ドナーとしてプラスミドDNA(対照)と比較したチオエート化ヌクレオチドを有するローリングサークル増幅(RCA)ssDNA(試験)の組込み効率を遺伝子編集システムを使用して決定した。全ての他のパラメーターを同じに保って、トランスフェクション混合物に100ナノグラムの各ssRCAドナーDNAを加えた。ドナープラスミドをRCA用の鋳型として使用してRCAドナーDNAを生成した。縦列反復ssRCA DNA(ssRCAドナーDNA)を生成し、実施例1に記載のように制限エンドヌクレアーゼによる制限消化に供した。dNTPとチオエート化dNTPとの混合物を増幅反応の間に使用した。チオエート化ヌクレオチドを異なるレベル(1:40-高レベル、1:400-低レベル)でssRCA産物中に組み込んで、相同組換え修復経路(HDR)を通じたチオエート化ssRCAドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を評価した。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的をトランスフェクションのために使用した。
チオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた二本鎖及び一本鎖RCA産物DNAの組込み効率
ドナーとしてプラスミドDNA(対照)と比較した、一本鎖及び二本鎖の両方の、チオエート化ヌクレオチドを有するRCA DNA(試験)の組込み効率を遺伝子編集システムを使用して決定した。縦列反復dsRCA DNA及びssRCA DNAを実施例2及び実施例3にそれぞれ記載されるように調製した。全ての他のパラメーターを同じに保って、トランスフェクション混合物に100ナノグラムのdsRCA及びssRCAドナーDNAを加えた。ドナープラスミドをRCA用の鋳型として使用してRCAドナーを生成した。縦列反復dsRCA及びss RCA DNAを実施例2に記載されるようにPvu Iによる制限消化に供して単一コピーのRCAドナーDNAを生成した。チオエート化dNTPを異なるレベルでRCA産物中に組み込んで、相同組換え修復経路(HDR)を通じたドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を評価した。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的をトランスフェクションのために使用した。
チオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされていない一本鎖及び二本鎖RCA産物DNAの組込み効率
ドナーとしてプラスミドDNA(対照)と比較したチオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされていないコンカテマーssRCA及びdsRCA DNA(試験)の組込み効率を遺伝子編集システムを使用して決定した。全ての他のパラメーターを実施例2~4と同じに保って、トランスフェクション混合物に100ナノグラムのコンカテマーssRCAドナーDNA及びdsRCAドナーDNAのそれぞれを加えた。ドナープラスミドをRCA用の鋳型として使用してドナーDNAとしてssRCA及びdsRCAを生成した。縦列反復配列を有するコンカテマーssRCAドナーDNA及びdsRCAドナーDNAを実施例1に記載されるようにPvu I制限エンドヌクレアーゼを使用して生成した。チオエート化dNTPを異なるレベル(1:40、1:400)でssRCA産物及びdsRCA産物中に組み込んだ。相同組換え修復経路(HDR)を通じたドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を決定した。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的をトランスフェクションのために使用した。
チオエート化ヌクレオチドを有する又は有しない二本鎖PCRドナーの組込み効率
遺伝子編集のためのトランスフェクション用のドナーDNAとしてのPCR DNAの調製:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用してトランスフェクション実験用の鋳型を調製した。これらの鋳型は、完全なセットのdNTP又はdNTPとアルファ-チオ-dNTPのSp異性体(例えば、40:1の比のdATP対Sp-ATP-α-S)との混合物のいずれかを使用して合成した。PCRにおける各dNTP又はdNTPとアルファ-チオ-dNTPとの混合物の最終濃度は300μMであった。dNTP又は異なる比のdNTP及びアルファ-チオ-dNTPを使用する各PCRを3連で調整した。Table 2(表2)に示されるように、フォワードプライマーはSEC61Bフォワードラムダ耐性プライマー(配列番号6)であった一方、リバースプライマーはSEC61Bリバースリン酸(配列番号5)であった。各プライマーを0.5μMの濃度でPCRに含めた。
チオエート化ヌクレオチドの存在下又は非存在下でDNAミニサークルから生成された二本鎖RCAドナーDNAの組込み効率
DNAミニサークル鋳型の生成:
ドナーDNAプラスミドを使用してPCRを介して直鎖状二本鎖DNAを合成した。Table 2(表2)に記載されるように(配列番号8~11)、5'及び3'の両末端に特有の制限部位(それぞれNheI及びSpeI)を有するドナーDNAの隣接相同アーム上にプライマーを設計した。DNAミニサークルを作製するために、両方のエンドヌクレアーゼを用いてdsDNAを消化して、相補的な付着オーバーハングを製造した。T4 DNAリガーゼを使用してこの消化されたDNAをライゲートした。制限消化及びライゲーション工程は、20UのSpeI、10UのNheI、400UのT4リガーゼ、1mMのATP、100μg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)、100mMのNaCl、10mMのMgCl2、50mMのトリス-HCl(pH7.5)及び10mMのジチオトレイトール(DTT)を含有する反応混合物を使用して逐次的(例えば、異なるチューブ中)又は同時(例えば、同じチューブ中)に実行した。全てのライゲーション産物(DNAミニサークル)をその後にエキソヌクレアーゼI及びエキソヌクレアーゼIIIを用いて処理してあらゆる残存した直鎖状DNA断片を消化した。ライゲーション産物を80℃で20分間インキュベートすることによりエキソヌクレアーゼを熱不活性化した。エキソヌクレアーゼの熱不活性化後、5μL(25ngのDNA)の完了したライゲーション反応液を、Phi29 DNAポリメラーゼを使用する等温RCA反応のために直接的に用いた。
DNAミニサークル鋳型のRCAは、最小限の発現配列の縦列反復の高分子量の、ハイパーブランチのコンカテマーをもたらす。水、反応緩衝液、プライマー、及びphi29酵素を含むRCA試薬を、ライゲートされる鋳型及びdNTPの添加の前に予備洗浄して、実施例2に記載されるようにオフターゲット増幅を最小化した。DNAミニサークルの増幅は、そのような汚染除去した酵素混合液及びプライマー-ヌクレオチド混合液を使用して行った。例えば、200ngのPhi29 DNAポリメラーゼを含有するポリメラーゼ溶液を、15mMのKCl、20mMのMgCl2、0.01%のTween-20及び1mMのTCEPを含有する5μLの50mMのHEPES緩衝液(pH=8.0)中で0.1単位のエキソヌクレアーゼIIIとインキュベートした。インキュベーションは、30℃で約60分又は4℃で12時間のいずれかで行った。汚染除去したPhi29 DNAポリメラーゼ溶液を氷浴に移した後、エキソヌクレアーゼIIIの事前の不活性化なしで標的RCAアッセイにおいて使用した。
プラスミドDNA鋳型から生成されたdsRCAドナーDNA又は合成により調製したDNA最小環状鋳型から生成されたdsRCAドナーDNAの組込み効率に対するチオエート化塩基の効果を決定した。この実施例では、超らせんプラスミドDNA、直鎖状化プラスミドDNA、DNAミニサークル及び直鎖化DNAミニサークルを対照として使用した。全ての他のパラメーターを同じに保ったまま、100ナノグラムの各ドナーDNAをトランスフェクション混合物に加えた。超らせんプラスミドDNA及び合成の最小環状DNAをRCA用の鋳型として使用してdsRCAドナーDNAを生成した。HEK293T Cas9組込み型細胞株をトランスフェクションのために使用した。dsRCA DNAを方法に記載したように生成した。チオエート化dNTPを異なるレベル(1:40、1:400)でRCA産物中に組み込んでHDRを通じたdsRCAドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を評価した。
Claims (12)
- in vitroにおける真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法であって、
DNAミニサークル鋳型を用いてローリングサークル増幅(RCA)を実施し、ドナー修復鋳型を作製する工程であって、前記ドナー修復鋳型が複数の縦列反復配列を含むローリングサークル増幅(RCA)産物DNAである、ローリングサークル増幅(RCA)を実施する工程、並びに、
意図する改変部位を有する前記内因性標的DNAを、
(i)前記意図する改変部位において又はその近くにおいて前記内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成された遺伝子編集システムであって、CRISPR-Cas9システムである、遺伝子編集システム、及び
(ii)前記ドナーDNA修復鋳型
と接触させる工程を含み、
a.前記複数の縦列反復配列のそれぞれが、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含み、
b.前記ドナー5'隣接配列及び前記ドナー3'隣接配列が、前記内因性標的DNA中の前記意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的であり、
c. 前記複数の縦列反復配列のそれぞれがホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む、
方法。 - 前記真核細胞を前記遺伝子編集システム及び前記ドナーDNA修復鋳型とインキュベートする工程により、前記遺伝子編集システム及び前記ドナーDNA修復鋳型を前記真核細胞中に導入する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記遺伝子編集システム及び前記ドナーDNA修復鋳型が、同時に前記真核細胞中に導入される、請求項2に記載の方法。
- 前記CRISPR-Cas9システムを導入する工程が、
前記真核細胞を1つ又は複数のDNAコンストラクトとインキュベートする工程
を含み、前記1つ又は複数のDNAコンストラクトが、
a)crRNA配列及びtracrRNA配列を含むガイドRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記真核細胞中で作動可能な第1の調節エレメント、及び
b)Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記真核細胞中で作動可能な第2の調節エレメント
を含み、成分(a)及び成分(b)が同じ又は異なるDNAコンストラクト上に位置する、請求項1に記載の方法。 - 前記CRISPR-Cas9システムを導入する工程が、Cas9タンパク質及びシングルガイドRNA(sgRNA)、又はcrRNAとtracrRNAとの組合せのいずれかを前記真核細胞に導入する工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記外因性ドナーDNA配列のサイズが、10塩基対から1kbまでの範囲内である、請求項1に記載の方法。
- 前記ドナーDNA修復鋳型が、二本鎖RCA産物DNA、一本鎖RCA産物DNA、又は一本鎖RCA産物DNAと二本鎖RCA産物DNAとの組合せである、請求項1に記載の方法。
- 前記ドナーDNA修復鋳型が、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む一本鎖RCA産物DNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記ドナーDNA修復鋳型が、ホスホロチオエート化ヌクレオチドを含む二本鎖RCA産物DNAである、請求項7に記載の方法。
- 前記ドナーDNA修復鋳型が、前記ドナー5'隣接配列及び前記ドナー3'隣接配列により隣接された前記外因性ドナーDNA配列からなる最小限のDNA配列の複数の反復からなる一本鎖又は二本鎖RCA産物DNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記内因性標的DNAの前記部位特異的改変が、前記二本鎖切断において前記内因性標的DNA中に前記外因性ドナーDNA配列を組み込む工程を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖切断において前記内因性標的DNA中に前記外因性ドナーDNA配列を組み込む工程が、内因性標的DNAの改変のための相同組換え修復を含む、請求項11に記載の方法。
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