JP2023529355A - 改善された安定性を有する核酸分子及びその用途 - Google Patents

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Abstract

ＲＮＡ干渉を誘導する二本鎖ＲＮＡ分子の構造的特徴に係り、さらに具体的には、改善された安定性を有する新たなＲＮＡｉ誘導核酸分子構造及びその用途に関する。該ＲＮＡｉ誘導用核酸分子は、標的遺伝子に対する発現抑制効率を維持させながら、二本鎖ＲＮＡ分子の体内安定性を顕著に増進させることができるが、多様な遺伝子を標的とする拡張可能なプラットホームとして、ＲＮＡ核酸分子は、従来のｓｉＲＮＡ分子を代替し、研究分野、及び臨床における多様な疾病の診断分野または治療分野において、有用に活用されうると期待される。

Description

本発明は、ＲＮＡ干渉を誘導する二本鎖ＲＮＡ分子の構造的特徴に係り、さらに具体的には、改善された安定性を有する新たなＲＮＡｉ誘導用核酸分子構造及びその用途に関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：RNA interference）は、標的遺伝子と相同である配列を有するセンス鎖、及びそれと相補的な配列を有するアンチセンス鎖によって構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により、塩基配列に特異的に転写された後、遺伝子の発現を調節する内因性メカニズムである。そのようなメカニズムは、カエノラブディティス・エレガンス（C. elegans）を含め、植物、ショウジョウバエ及び哺乳動物に至るまで、真核生物において、共通して保存されてきた。該ＲＮＡ干渉現象が起こる過程は、ｄｓＲＮＡが細胞内に入ってくれば、ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）複合体と結合し、アンチセンス（ガイド）鎖だけがｍＲＮＡ（messenger RNA）と塩基配列相補的に結合し、ＲＩＳＣ複合体に存在するエンドヌクレアーゼ（endonuclease）ドメインにより、標的ｍＲＮＡを分解すると知られている。
小さい干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：small interfering RNA）は、約１９個～約２９個のヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡｉ経路を介し、標的遺伝子のｍＲＮＡを特異的に分解することができる。該ｓｉＲＮＡは、そのような高い特異性、及び多様な標的遺伝子に対する容易な接近性を有し、さらに、１つのｓｉＲＮＡ分子が大量１，０００個のｍＲＮＡを分解することができ、標的遺伝子の発現を阻害することができる非常に効果的な手段とされてきた。そのような長所により、該ｓｉＲＮＡは、多様な臨床試験を介し、遺伝子治療剤としてその有効性が評価されてきたが、２０１８年０８月には、アルナイラム（Alnylam）のｓｉＲＮＡ治療剤（Patisiran）が、遺伝性トランスサイレチン媒介性（hATTR）アミロイド症成人患者の多発神経病症に対する治療剤として、米国ＦＤＡの承認を受け、最初のＲＮＡ干渉治療剤として承認された。しかしながら、該ｓｉＲＮＡの高い治療的潜在力にもかかわらず、血中において、酵素によって容易に分解され、小サイズにより、腎臓からいち早く除去され、安定性が低く、効率的に標的化された伝達システムの不足というように、依然として解決しなければならない課題が残っている。
そのような問題点を解決するために、リポソーム、脂質及び重合体のような多様な非ウイルス性担体（carrier）が広範囲に研究されてきたが、特に、陽イオン性ポリマーは、水に良好に溶解され、高い正電荷を有しており、該ｓｉＲＮＡと容易に結合され、血中に分布された多様なＲＮａｓｅから、該ｓｉＲＮＡの分解を低減させ、その伝達効率を高めることができる。しかしながら、陽イオン性物質は、潜在的細胞毒性と免疫反応誘導とにより、臨床適用に制限がよる。それに対する代案として、脂質、ペプチド、重合体またはタンパク質のような多様なモイエティを、該ｓｉＲＮＡに直接接合させ、該ｓｉＲＮＡを標的細胞に伝達する代案的戦略が開発されている。
一方、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）は、オリゴヌクレオチド類似体であり、ＤＮＡのデオキシリボース骨格がシュードペプチド骨格（pseudo-peptide backbone）で置換されており（Nieslsen et al., Science, 1991, 254, 1475）、ＰＮＡに存在するそれぞれのサブユニットまたは単量体は、前述の骨格に付着された天然または非天然の核塩基（nucleobase）を有している。該ＰＮＡは、そのような構造的変化により、相補的なＤＮＡ及びＲＮＡに対する高い親和力、核酸分解酵素（nuclease）及び蛋白質分解酵素（protease）に対する耐性、並びに生物学的環境における高い安定性を示すという長所を有する。また、ＰＮＡ／ＤＮＡ二本鎖体またはＰＮＡ／ＲＮＡ二本鎖体は、融解温度（Ｔｍ）によって決定されたとき、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖体またはＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖体に比べ、高い熱力学的安定性を示す。
Nieslsen et al., Science, 1991, 254, 1475
本発明者らは、標的遺伝子抑制効率には、大きく影響を与えずに、体内安定性を有意的に改善させることができる方法を開発するために、研究努力した結果、ＰＮＡと前述の核酸分子とを結合させた新規ＲＮＡｉ誘導核酸分子構造を開発し、それに基づき、本発明の完成に至った。
それにより、本発明は、二本鎖ＲＮＡ分子と、前記ＲＮＡ分子と結合されたＰＮＡを含むＲＮＡｉ誘導用核酸分子と、を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記核酸分子と細胞内担体とを含むＲＮＡｉ誘導用複合体を提供することを他の目的とする。
また、本発明は、前記複合体を含む遺伝子発現抑制用組成物を提供することをさらに他の目的とする。
しかしながら、本発明がなすべき技術的課題は、前述の課題に制限されるものではなく、言及されていない他の課題は、以下の記載から、当業者に明確に理解されうるであろう。
前述のような本発明の目的を達成するために、本発明は、目的核酸と相補的な領域を含む１５個ないし４９個のヌクレオチド長の第１鎖、及び前記第１鎖と相補的な結合を形成する２１個ないし６２個のヌクレオチド長の第２鎖によって構成された二本鎖ＲＮＡ分子と、前記第１鎖と結合された６個ないし１３個のヌクレオチド長のＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含むものの、
前記ＰＮＡのＮ末端が前記第１鎖３’末端と結合され、
前記ＰＮＡと前記第１鎖との結合領域は、グアニン（Ｇ：guanine）塩基またはシトシン（Ｃ：cytosine）塩基によってなる、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子を提供する。
本発明の一具現例として、前記結合領域は、第１鎖３’末端から、１ないし２のヌクレオチド領域、及び前記ＰＮＡのＮ末端から、１ないし２のヌクレオチド領域によって構成された群のうちから選択される１以上の領域を含むものでもある。
本発明の他の具現例として、前記第２鎖は、ＰＮＡとの結合部分を除いた残り領域において、第１鎖と相補的な結合を形成するものでもある。
本発明のさらに他の具現例として、前記ＲＮＡ分子の第２鎖は、１ないし５のヌクレオチドによって構成された３’オーバーハング（overhang）を有するものでもある。
本発明のさらに他の具現例として、前記ＲＮＡ分子は、１以上のリボヌクレオチドの糖構造、塩基構造、または前記リボヌクレオチド間の結合部位が化学的に変形（modification）されたものでもある。
本発明のさらに他の具現例として、前記化学的変形は、リボヌクレオチドの２’位置のＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮで置換され、前記Ｒは、Ｃ１－Ｃ６のアルキル、アルケニルまたはアルキニルでもある。
本発明のさらに他の具現例として、前記化学的変形は、バックボーンのホスホジエステル結合を、ボラノホスフェート（boranophosphate）またはホスホチオエート（phosphorothioate）で置換するものでもある。
本発明のさらに他の具現例として、前記目的核酸は、ｍＲＮＡ（messenger RNA）、microＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（piwi－interacting RNA）、ｎｃＲＮＡ（non－coding RNA）、コーディングＤＮＡ配列及び非コーディングＤＮＡ配列によってなる群のうちから選択されるいずれか一つでもある。
本発明のさらに他の具現例として、前記核酸分子は、体内安定性が増進されたものでもある。
また、本発明は、前記核酸分子と細胞内担体とを含むＲＮＡｉ誘導用複合体を提供する。
本発明の一具現例として、前記細胞内担体は、陽イオン性のポリマー、脂質、細胞透過性ペプチド（cell penetrating peptide）及び細胞標的リガンドによって構成された群のうちから選択されるものでもある。
本発明の他の具現例として、前記細胞透過性ペプチドのＮ末端は、前記核酸分子を構成するＰＮＡのＣ末端とも連結される。
また、本発明は、前記複合体を含む遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
また、本発明は、前記複合体を細胞に処理する段階を含む遺伝子発現抑制方法を提供する。
また、本発明は、前記複合体の遺伝子発現抑制用途を提供する。
本発明によるＲＮＡｉ誘導用核酸分子は、標的遺伝子に対する抑制効率を維持させながら、二本鎖ＲＮＡ分子の体内安定性を顕著に増進させることができるが、多様な遺伝子を標的とする拡張可能なプラットホームとしてのＲＮＡ核酸分子は、従来のｓｉＲＮＡ分子を代替し、研究分野、及び臨床における多様な疾病の診断または治療の分野において、有用に活用されうると期待される。
本発明の実施例で合成されたＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子の構造を図示したものであり、ＰＮＡのＮ末端がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖３’末端と連結され、センス鎖５’末端部分と相補的な結合を形成する構造を示した図である。 本発明の実施例で合成されたＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子の構造を図示したものであり、ＰＮＡのＣ末端がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖５’末端と連結され、センス鎖３’末端部分と相補的な結合を形成する構造を示した図である。 ｓｉＲＮＡ二本鎖（duplex）と７ｍｅｒ ＰＮＡとを、多様なモル濃度比（１：１ないし１：５）で混合したとき、複合体の形成（complexation）いかんを検証した結果であり、前述の図１Ａ（forward）構造及び図１Ｂ（reverse）構造の複合体形成いかんを分析して示した図である。 ｓｉＲＮＡ二本鎖と１０ｍｅｒ ＰＮＡとを、多様なモル濃度比（１：１ないし１：５）で混合したとき、複合体の形成いかんを検証した結果を示した図である。 ｓｉＲＮＡ二本鎖と５ｍｅｒ ＰＮＡとを、多様なモル濃度比（１：１ないし１：５）で混合したとき、複合体の形成いかんを検証した結果を示した図である。 本発明によるＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子につき、Native ＰＡＧＥを介して血清安定性分析を実施した結果であり、ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ複合体形態（complex form）に対するNative ＰＡＧＥ後のバンド強度を定量化した結果を示した図である。 本発明によるＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子につき、Native ＰＡＧＥを介して血清安定性分析を実施した結果であり、ＰＮＡが分離されたｓｉＲＮＡ二本鎖形態（duplex form）に対するNative ＰＡＧＥ後のバンド強度を定量化した結果を示した図である。 前述の図３Ａ及び図３ＢにおけるNative ＰＡＧＥ後のゲルイメージを示した結果である。 ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子におけるＰＮＡの位置（図１Ａ及び図１Ｂの構造）、及びＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される結合領域の塩基配列差による血清安定性を分析した結果であり、ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ複合体形態に対するNative ＰＡＧＥ後のバンド強度を定量化した結果を示した図である。 ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子におけるＰＮＡの位置（図１Ａ及び図１Ｂの構造）、及びＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される結合領域の塩基配列差による血清安定性を分析した結果であり、ＰＮＡが分離されたｓｉＲＮＡ二本鎖形態に対するNative ＰＡＧＥ後のバンド強度を定量化した結果を示した図である。 前述の図４Ａ及び図４ＢにおけるNative ＰＡＧＥ後のゲルイメージを示した結果である。 ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子において、ＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される結合領域の配列は、同一であり、ＰＮＡの位置だけ異なるそれぞれ、図１Ａの構造（＃１２）、及び図１Ｂの構造（＃１３）を有する核酸分子を利用し、ＰＮＡ位置差による血清安定性を分析した結果であり、ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ複合体形態に対するNative ＰＡＧＥ後のバンド強度を定量化した結果を示した図である。 ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子において、ＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される結合領域の配列は、同一であり、ＰＮＡの位置だけ異なるそれぞれ、図１Ａの構造（＃１２）、及び図１Ｂの構造（＃１３）を有する核酸分子を利用し、ＰＮＡ位置差による血清安定性を分析した結果であり、ＰＮＡが分離されたｓｉＲＮＡ二本鎖形態に対するNative ＰＡＧＥ後のバンド強度を定量化した結果を示した図である。 前述の図５Ａ及び図５ＢにおけるNative ＰＡＧＥ後のゲルイメージを示した結果である。 前記図１Ａに該当する同一構造を有するＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子において、ＰＮＡ長（５，７，１０ｍｅｒ）による血清安定性を分析した結果であり、ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ複合体形態に対するNative ＰＡＧＥ後のバンド強度を定量化した結果を示した図である。 前記図１Ａに該当する同一構造を有するＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子において、ＰＮＡ長（５，７，１０ｍｅｒ）による血清安定性を分析した結果であり、ＰＮＡが分離されたｓｉＲＮＡ二本鎖形態に対するNative ＰＡＧＥ後のバンド強度を定量化した結果を示した図である。 前述の図６Ａ及び図６ＢにおけるNative ＰＡＧＥ後のゲルイメージを示した結果である。 ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子がｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率に及ぼす影響を分析するために、インビトロ（in vitro）遺伝子発現抑制効率を分析した結果である。
本発明は、研究分野、多様な疾病の診断または治療の分野などにおいて、有用に活用されうるＲＮＡ核酸分子に係わるものであり、限定されていない数のデザインに拡張可能な基本プラットホームＲＮＡ核酸分子構造に関する。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明は、目的核酸と相補的な領域を含む１５個ないし４９個のヌクレオチド長の第１鎖、及び前記第１鎖と相補的な結合を形成する２１個ないし６２個のヌクレオチド長の第２鎖によって構成された二本鎖ＲＮＡ分子と、前記第１鎖と結合された６個ないし１３個のヌクレオチド長のＰＮＡ（peptide nucleic acid）と、を含むものの、
前記ＰＮＡのＮ末端が前記第１鎖３’末端と結合され、
前記ＰＮＡと前記第１鎖との結合領域は、グアニン（Ｇ：guanine）塩基またはシトシン（Ｃ：cytosine）塩基によってなるＲＮＡｉ（RNA interference）誘導用核酸分子を提供する。
本発明で使用される用語「ＲＮＡｉ（RNA interference）」とは、標的遺伝子のｍＲＮＡ（messenger RNA）と相同である配列を有する鎖と、それと相補的な配列を有する鎖とによって構成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により、塩基配列に特異的に標的遺伝子のｍＲＮＡ分解を誘導することにより、該標的遺伝子の発現を調節するメカニズムを意味する。
本発明において、前記二本鎖ＲＮＡは、目的核酸を標的とし、その発現を抑制する機能を有するものであり、望ましくはｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）でもある。
本発明で使用される用語「ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）」とは、配列特異的に標的遺伝子のｍＲＮＡを切断（cleavage）することにより、ＲＮＡｉ現象を誘導し、効率的な遺伝子発現抑制（gene silencing）を媒介する短い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を意味する。前記二本鎖は、センスＲＮＡ鎖、及びそれと相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖とによって構成される。該ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を抑制するので、効率的な遺伝子ノックダウン（knock－down）方法として、または遺伝子治療（gene therapy）の手段としても利用される。
前記第１鎖は、アンチセンス鎖（antisense strand）を意味するものであり、関心ある標的核酸（target nucleic acid）に、少なくとも５０％、望ましくは、７０％、さらに望ましくは、少なくとも８５％であり、最も望ましくは、１００％相補的なポリヌクレオチドであり、例えば、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例：microＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）、あるいはコーディングまたは非コーディングのＤＮＡ配列と、全体としてまたは一部として、相補的でもある。
本発明において、第１鎖は、目的核酸と相補的な領域を含む１５個ないし４９個のヌクレオチドによってなるものでもあり、望ましくは、１５個ないし３９個のヌクレオチド、さらに望ましくは、１５個ないし３０個のヌクレオチドによってなるものでもあるが、目的核酸により、それらに特異的なＲＮＡ分子の第１鎖長は、前記範囲内において、制限なしに調節されうる。
前記第２鎖は、センス鎖（sense strand）を意味するものであり、目的核酸と同一の核酸配列を有するポリヌクレオチドであり、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例：microＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｈｎＲＮＡ）、あるいはコーディングまたは非コーディングのＤＮＡ配列と、全体としてまたは一部として、同一のポリヌクレオチドを言う。
本発明において、第２鎖は、前記第１鎖と相補的な結合を形成する２１個ないし６２個のヌクレオチドによってなるものでもあり、望ましくは、２１個ないし５２個のヌクレオチド、さらに望ましくは、２１個ないし４３個のヌクレオチドによってなるものでもあるが、目的核酸により、それらに特異的なＲＮＡ分子の第２鎖長は、前記範囲内において、制限なしに調節されうる。
本発明において、前記結合領域は、第１鎖３’末端から、１ないし２のヌクレオチド領域、及び前記ＰＮＡのＮ末端から、１ないし２のヌクレオチド領域によって構成された群のうちから選択される１以上の領域を含むものでもあり、さらに望ましくは、２ヌクレオチド領域を含むものでもある。
本発明において、前記第２鎖は、ＰＮＡと相補的な結合を形成する部分を除いた残り領域において、第１鎖と相補的な結合を形成しうる。具体的には、本発明のＲＮＡｉ誘導用核酸分子を構成する全てのヌクレオチドが、相補的な結合対をなすことにより、核酸分子の両末端は、ブラント末端（blunt end）を形成しうる。
本発明において、前記ＲＮＡ分子の第２鎖は、１ないし５のヌクレオチドによって構成された３’オーバーハング（overhang）を有するものでもあり、望ましくは、３’－ヒドロキシ基を有しうる。
本発明において、前記ＲＮＡ分子の二本鎖のうち１以上のＲＮＡ鎖５’末端は、ホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェートまたはヒドロキシ基を有するものでもある。
本発明において前記ＲＮＡ分子は、自然に存在する（変形されていない）リボヌクレオチド単位構造を有することができ、１以上の化学的変形（modification）を有するように合成されるというような、化学的に変形されたものでもある。前記化学的変形を介し、ヌクレアーゼ（nuclease）に対する抵抗性増進、細胞内吸収（uptake）増大、細胞標的化（ターゲット特異性）向上、安定性増大、インターフェロン活性減少、免疫反応及びセンス効果のようなターゲット以外効果（off-target effect）低減、またはＲＩＳＣローディング（loading）増大（ＲＮＡｉ活性増大）のような効果を得ることができる。
本発明において、ＲＮＡ分子の化学的変形方法は、特別に制限されるものではなく、例えば、１以上のリボヌクレオチドの糖構造または塩基構造、あるいは前記リボヌクレオチド間の結合部位が化学的に変形されたものでもあり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する当業者であるならば、当該技術分野に公知された方法を利用し、所望する方式通りに、前記ＲＮＡ分子を合成して変形させることができるであろう。また、前記変形は、組み合わされた形態を含むものでもある。
本発明において、前記化学的変形は、核塩基変形されたリボヌクレオチド、すなわち、５番位置で変形されたウリジンまたはシチジン、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン；８番位置で変形されたアデノシン及びグアノシン、例えば、８－ブロモグアノシン；デアザ（deaza）ヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－アルキル化されたヌクレオチド及びＮ－アルキル化されたヌクレオチド、例えば、Ｎ６－メチルアデノシンのような、天然核塩基（nucleobase）の代わりに、非天然核塩基を含むリボヌクレオチドを含むものでもある。
また、糖変形されたリボヌクレオチドにおいて、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩ）、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２及びＣＮによってなる群から選択される置換基（Ｒは、Ｃ１－Ｃ６のアルキル、アルケニルまたはアルキニル）によっても置換される。
また、リボヌクレオチドにおいて、バックボーンのホスホジエステル結合は、ボラノホスフェート（boranophosphate）またはホスホチオエート（phosphorothioate）で置換されうる。
本発明で使用される用語「目的核酸」は、本発明の核酸分子において、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と相補的な結合を形成する核酸であり、望ましくは、ｓｉＲＮＡを介して発現を抑制する標的核酸を意味し、さらに望ましくは、ｍＲＮＡ、microＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（piwi－interacting RNA）、ｎｃＲＮＡ（non－coding RNA）、コーディングＤＮＡ配列及び非コーディングＤＮＡ配列によってなる群のうちから選択されるいずれか一つでもあるが、それらに制限されるものではない。
本発明において、核酸分子は、一般的に合成されたものでもあるが、それに制限されるものではない。すなわち、本発明において、前記核酸分子は、化学的または酵素学的に合成されたものでもある。本発明の二本鎖ＲＮＡ分子は、標準組み換え技法により、自然発生的遺伝子からも誘導されるが、その場合、発現を変化させる目的遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部分と、ヌクレオチド配列レベルにおいて、実質的に相補的なものと特徴とするのである。
本発明は、具体的な実施例を介し、本発明によるＲＮＡｉ誘導用核酸分子の体内安定性増進効果を確認した。
本発明の一実施例においては、本発明による構造のＲＮＡ核酸分子、及びその安定性効果比較のための対照群ＲＮＡ核酸分子を設計及び合成した（実施例２参照）。
本発明の他の実施例においては、前述のところで設計されたＲＮＡ核酸分子を構成する７ｍｅｒ及び１０ｍｅｒのＰＮＡと、二本鎖ＲＮＡとが、複合体を良好に形成することを確認した（実施例３参照）。
本発明のさらに他の実施例においては、本発明によるＲＮＡ核酸分子の安定性増進効果を確認し、対照群ＲＮＡ核酸分子との安定性比較により、本発明による核酸分子の構造が安定性を増進させうる特異的な構造であるということを確認した。また、ＰＮＡ長が７ｍｅｒ及び１０ｍｅｒである場合にのみ、安定性増進効果を確認した（実施例４及び５参照）。
本発明のさらに他の実施例においては、本発明による構造を有する核酸分子の遺伝子発現抑制効率を分析した結果、ヌクレオチドが追加された構造的変形をもってしても、遺伝子の発現抑制効率は、変化しないということを確認した（実施例６参照）。
前述のような実施例結果は、本発明によるＲＮＡ核酸分子は、本来の遺伝子発現抑制効率は、維持されながら、体内安定性を顕著に増進させることができるということを立証するものである。
それにより、本発明の他の態様として、本発明は、前記核酸分子と細胞内担体とを含むＲＮＡｉ誘導用複合体を提供する。
前記細胞内担体は、陽イオン性のポリマー、脂質、細胞透過性ペプチド（cell penetrating peptide）及び細胞標的リガンドによって構成された群のうちから選択されるものでもある。前述の陽イオン性ポリマー、陽イオン性脂質のような陽イオン性細胞伝達体は、インビトロ（in vitro）及びインビボ（in vivo）のいずれの状態においても、本発明の核酸分子を細胞内に伝達するためにも使用される。該陽イオン性細胞伝達体は、本発明の核酸分子と強く相互作用を行い、複合体を形成することにより、ＲＮＡｉを誘導する核酸分子が効果的に細胞内導入されるようにする。望ましくは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような陽イオン性のポリマーまたはリポソームを使用することができるが、それらに制限されるものではない。また、コレステロールのような脂質は、核酸分子に直接連結されるか、あるいは他の細胞伝達体に結合された後、核酸分子と結合することにより、間接的に連結されうる。
前記細胞透過性ペプチドは、細胞（膜）を透過し、細胞内部に侵透しうる能力または性質を有するペプチドを意味する。前記細胞透過性ペプチドは、細胞透過能を有するものであるならば、特別に制限されるものではなく、本発明が属する技術分野において当業者が所望する目的を達成するために、適切に選択することができるであろう。その非制限的な例示としては、ｄＮＰ２（ＫＩＫＫＶＫＫＫＧＲＫＫＩＫＫＶＫＫＫＧＲＫ（配列番号２）７）、Ｔａｔ（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２８））、Ｐｅｐ－１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２９））、ＭＰＧ（ＧＬＡＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３０））、ペネトラチン（penetratin）（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号３１））、ＫＡＬＡ（ＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＡＣＥＡ（配列番号３２））またはＣＡＤＹ（ＧＬＷＲＡＬＷＲＬＬＲＳＬＷＲＬＬＷＲＡ（配列番号３３））のアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらによって表されるものでもある。このとき、前記細胞透過性ペプチドは、前述の配列番号２７ないし３３で表されるアミノ酸配列と、それぞれ、７０％以上、望ましくは、８０％以上、さらに望ましくは、９０％以上、最も望ましくは、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むものでもある。
前記細胞透過性ペプチドが、前記ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子と共にＲＮＡｉ誘導用複合体を形成する場合、前記ペプチドのＮ末端は、前記核酸分子を構成するＰＮＡのＣ末端とも連結される。
前記ペプチドは、当業者に知られた通常のペプチド合成方法あるいは製造方法を介し、各ペプチドの純度が９０％以上になるようにも作製され、例えば、直接合成するか、あるいはペプチド製造会社に製造を依頼した後、購入して使用することができる。前記ペプチドは、当業者に知られた通常のペプチド合成方法あるいは製造方法を介し、Ｄ－formやＬ－form、配列のうち一部のみ、Ｄ－formやＬ－formによって構成されたペプチド、またはそれらのラセミ体形態にいずれも作製して使用されうる。また、ペプチドの安定性を高めるために、それ以外の当業界に公知された一般的な変形が可能である。本発明においては、望ましくは、固体相ペプチド合成（ＳＰＰＳ：solid phase peptide synthesis）方法を利用してペプチドを合成したが、前述のように、ペプチド合成の方法及び条件は、それらに制限されるものではない。
本発明のさらに他の態様として、本発明は、前記ＲＮＡｉ誘導用複合体を含む遺伝子発現抑制用組成物を提供する。
本願発明において「遺伝子」とは、最広義の意味として見なされなければならず、構造タンパク質または調節タンパク質を暗号化するものでもあり、病理学的条件と関連するものでもある。前記遺伝子は、内因性（endogeneous）遺伝子及び挿入遺伝子（Transgene）のいずれをも含む。該遺伝子の種類は、具体的なものに制限されるものではなく、当業者であるならば、目的によって適切に選択することができるであろう。
前記遺伝子発現抑制用組成物は、薬学的に許容可能な担体（carrier）を追加して含むものでもあり、該担体と共に製剤化されうる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤時、一般的に利用されるものであり、生物体を刺激せず、投与物質の生物学的な活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を言う。例えば、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、シクロデキストリン、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、リポソームなどを含むが、それらに限定されるものではなく、必要により、抗酸化剤、緩衝液のような他の通常の添加剤をさらに含むものでもある。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加し、水溶液・懸濁液・乳濁液のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化させることができる。適する薬学的に許容される担体及び製剤化については、レミントンの文献に開示されている方法を利用し、各成分により、望ましく製剤化することができる。本発明の薬学的組成物は、剤形に特別な制限はないが、注射剤、吸入剤、皮膚外用剤などに製剤化させることができる。
本発明の遺伝子発現抑制用組成物は、それを有効成分として含むいかなる剤形としても適用可能であり、目的とする方法により、経口投与されたり、非経口投与（例えば、静脈内（intravenous）、皮下（subcutaneous）、筋肉内（intramuscular）、腹腔内（intraperitoneal）、皮内（intradermal）、脊髄腔内（intrathecal）、脳実質内（intracerebroventricular）、粘膜内（mucosal）、吸入（inhalation）または局所への適用）されたりし、投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与の経路及び時間によって異なるが、当業者により、適切に選択されうる。
また、本発明は、前記組成物を含む遺伝子発現抑制用キットを提供する。
また、本発明は、前記ＲＮＡｉ誘導用複合体を処理する段階を含む遺伝子の発現抑制方法を提供する。前記複合体を処理する段階は、望ましくは、前記複合体を細胞内に導入させる過程をいずれも含む。
以下、本発明の理解の一助とするために、望ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものであるのみ、下記実施例により、本発明の内容が限定されるものではない。
実施例１．実験方法
１－１．ＰＮＡ合成
本実施例においては、レジンのＮ末端に、Ｎ末端がＦｍｏｃに保護されているアミノ酸のＣ末端を一つずつ結合する有機合成法である固体相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法を利用してＰＮＡを合成した。このとき、４種類のＰＮＡモノマー、すなわち、Ｆｍｏｃ－Ａ（Ｂｈｏｃ）－ａｅｇ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇ（Ｂｈｏｃ）－ａｅｇ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃ（Ｂｈｏｃ）－ａｅｇ－ＯＨ及びＦｍｏｃ－Ｔ－ａｅｇ－ＯＨを使用した。本実施例によるＰＮＡ候補群は、いずれも前述のところと同一の方法によって合成され、全ての反応は、加熱撹拌器（hot plate stirrer）において進められた。全ての反応において、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ：N,N-dimethyl formamide）を溶媒として使用し、ＰＮＡカップリングは、ＰＮＡ：ヘキサフルオロホスフェートベンゾトリアゾールテトラメチルウロニウム（ＨＳＴＵ：hexafluorophosphate benzotriazole tetramethyl uronium）：Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ：N,N-diisopropylethylamine）を１：１：２のモル比で混合した後、１時間反応させることによって進めた。次のＰＮＡを合成するためには、以前ＰＮＡのＦｍｏｃを除去しなければならず、そのために、８０％ ＤＭＦと２０％ピペリジン（piperidine）との溶液を使用し、常温で３０分間、脱保護（deprotecting）過程を実施した。全てのカップリング過程及び脱保護過程の間には、ＤＭＦと塩化メチレン（ＤＣＭ：dichloromethane）とを利用し、相互に３回ずつ洗浄する過程を実施した。その後、固体相レジンから合成されたＰＮＡを分離するために、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ：trifluoroacetic acid）：トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ：triisopropylsilane）：蒸溜水（９５：２．５：２．５）で構成されたクリベージ（cleavage）溶液で合成が完了されしたレジンを２時間撹拌しながら反応を進めた後、石綿フィルタでレジンを濾し出した。次に、濾過された溶液中の溶液を、窒素気体下で蒸発させ、沈殿物が生じれば、冷たく保管したジエチルエーテル（diethylether）で沈澱させ、沈澱されたＰＮＡは、乾燥させた後、蒸溜水に溶かして凍結乾燥させた。その後、凍結乾燥が完了されたＰＮＡは、蒸溜水やアセトニトリル（ＡＣＮ：acetonitrile）などに溶かし、逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ：high-performance liquid chromatography）を使用し、分離させて精製した。このとき、移動相溶媒としては、Solvent Ａ（蒸溜水９９．９％及びＴＦＡ ０．１％）とSolvent Ｂ（蒸溜水９．９％、アセトニトリル９０％及びＴＦＡ ０．１％）を使用した。ＨＰＬＣ移動相は、Solvent Ａ ９０％とSolvent Ｂ １０％とでもって始め、Solvent Ｂが１％／分勾配で増加しながら分離が進められるようにした。分離されたペプチド溶液は、液体窒素で急速冷却させた後、凍結乾燥させ、溶媒を除去した後、ＤＥＰＣ（diethyl pyrocarbonate water）に溶かして実験に使用した。
１－２．ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子の製造
前記実施例１－１の方法によって合成されたＰＮＡとｓｉＲＮＡとが複合体を形成した核酸分子を製造するために、融解温度（Ｔｍ：melting temperature）より高い温度に加熱した後、徐々に冷やし、アニーリング（annealing）する方式を使用した。さらに詳細には、ｓｉＲＮＡのセンス鎖（sense strand）：ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（antisense strand siRNA）：ＰＮＡを１：１：２のモル比で混合し、アニーリングバッファとＤＥＰＣ水とを添加した後、１００℃に加熱されたヒーティングブロック（heating block）で２分間煮沸した。その後、該ヒーティングブロックの温度を常温に設定し、サンプルを徐々に冷やした。前記アニーリングバッファは、１Ｍ tris（ｐＨ８．０）緩衝液、５Ｍ ＮａＣｌ及びＤＥＰＣ水を５：２：９３の体積比で混合し、５Ｘにして使用した。
ＰＮＡとｓｉＲＮＡとの複合体形成いかんは、１８％ Native ＰＡＧＥ（polyacylamide gel electrophoresis）ゲルにおいて、Nativeポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を実施して確認した。その後、GelRed（登録商標）を利用し、ゲルを４０分間染色した後、結果を確認した。
１－３．安定性分析
前記実施例１－２の方法で製造したＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子につき、血清安定性を分析した。そのために、１００％マウス血清を利用し、前記ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子を、血清と１：４の比率で混合した後、３７℃で培養した。培養後の０，１，２，４，８，１２，２４時間ごとに、０．５Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ：ethylene diaminetetraacetic acid）（ｐＨ８．０）で処理して反応を中止させ、１５％ NativeゲルでNative ＰＡＧＥを利用して確認した。該ゲルは、GelRed（登録商標）を使用し、４０分間染色させた後、結果を確認し、対照群としては、マウス血清に露出させていない同一モル数の核酸分子を使用した。その後、ゲルイメージ上に示されたバンドの強度を定量し、対照群バンドの強度と比較して比率で示した。
１－４．インビトロ（in vitro）遺伝子発現抑制効率の分析
前記実施例１－２の方法によって製造されたＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子の標的遺伝子であるＧＦＰに係わる発現抑制効率を調べるために、下記方法によって実験を進めた。さらに具体的には、ヒト２９３Ａ細胞を３８４ウェルプレートに分注し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ培地を利用し、３７℃、ＣＯ２の条件で一晩培養した。次に、ＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子それぞれを、ＴＯＭ（transfection optimized medium）（ＴＲ００４－０１）４０μＬを基準に、基準１ｎＭ，１０ｎＭまたは５０ｎＭになるように、ＲＮＡｉＭａｘ（Thermo Fisher Scientific）を利用し、形質感染（transfection）させた。
また、形質感染を進めて４８時間後、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２をＤＭＥＭに、１：５，０００に希釈した後、それぞれのウェルに５μＬずつ追加して入れた後、３０分間培養した。次に、Cytation ５（BioTek）装備でもって、ＤＡＰＩ波長及びＧＦＰ波長を、各ウェル別に、４ヵ所ずつイメージングした後、ＤＡＰＩ maskを基準、それぞれの細胞を個別化させた。その後、核周辺２０μｍのＧＦＰ値を細胞ごとに求め、それを基に、各ウェルによるmean－ＧＦＰ値を得た。得られたmean－ＧＦＰ値をExcelにexportし、ＧｒａｐｈＰａｄ Prism ８プログラムを利用し、発現抑制効率を比較するためのグラフとして示した。
実施例２．ＲＮＡ核酸分子の設計及び合成
２－１．本発明のＲＮＡ核酸分子の設計及び合成
本発明者らは、本発明によるＲＮＡ分子構造を満足する多様な核酸分子をデザインし、このとき、それぞれのＲＮＡ分子は、融解温度（Ｔｍ）が類似したものになるように、配列をデザインした。前記各ＲＮＡ分子に係わる具体的な情報は、下記表１に整理して示した。
Figure 2023529355000002
前記表１から分かるように、本発明によるＲＮＡ分子を合成するために、ＧＦＰ特異的ｓｉＲＮＡの二本鎖を一例にし、多様な核酸分子を合成した。
すなわち、各ＲＮＡ分子において、ＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される部分の４個ヌクレオチド、すなわち、連結部位のＰＮＡ末端から２個のヌクレオチド、及びアンチセンス鎖末端から２個のヌクレオチドは、いずれもＧ及びＣによって構成されるか（＃２）、あるいはいずれか一方の末端にのみ、Ｇ及びＣが位置するようにデザインされている（＃３及び＃４）。
また、前記表１のＲＮＡ分子構造をさらに多様化させるために、下記表２のように、ＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される部分の４個ヌクレオチドがいずれもＧ及びＣによってなりながら、ＰＮＡ長だけ５ｍｅｒ（＃９）及び１０ｍｅｒ（＃１０）である場合のＲＮＡ分子を追加してデザインした。
Figure 2023529355000003
前述の表１及び表２に開示されたＲＮＡ分子は、図１Ａに図示されているように、ＰＮＡのＮ末端がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖３’末端と連結され、前記ＰＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖５’末端領域に相補的に結合されている構造である。
前記核酸分子配列において、アンチセンス鎖と連結されたＰＮＡ配列は、イタリック体で表示されており、ＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される部位の４個ヌクレオチドは、下線で表示されている。
２－２．対照群ＲＮＡ核酸分子設計及び合成
本発明者らは、前記実施例２－１で合成された本発明によるＲＮＡ核酸分子との効果を比べるための対照群として核酸分子をデザインし、具体的な情報は、下記表３に示した。
Figure 2023529355000004
前記対照群ＲＮＡ分子において、＃５は、図１Ａの構造を有するものであるか、あるいはＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される部位の４個ヌクレオチドが、Ｔ（Ｕ）及びＡだけによって構成されたものとしてデザインされている。
また、図１Ｂに図示されているように、図１Ａの構造と相反するように、ＰＮＡのＣ末端がｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖５’末端に連結され、前記ＰＮＡ配列がｓｉＲＮＡのセンス鎖３’末端に相補的に結合されている構造のＲＮＡ分子をデザインした（＃７及び＃８）。さらに具体的には、前記ＲＮＡ分子において、ＰＮＡとアンチセンス鎖とが連結される部分の４個ヌクレオチド、すなわち、連結部位のＰＮＡ末端から２個のヌクレオチド、及びアンチセンス鎖末端から２個のヌクレオチドは、いずれもＧ及びＣによって構成されるか（＃７）、あるいはいずれもＴ（Ｕ）及びＡが位置するようにデザインされている（＃８）。
実施例３．ＰＮＡと二本鎖ＲＮＡの複合体形成確認
本発明者らは、前記実施例２－１及び２－２でそれぞれデザインされたＰＮＡと二本鎖ＲＮＡとが結合して複合体を形成するか否かということを確認した。
そのために、長さが５，７及び１０ｍｅｒであるＰＮＡそれぞれにつき、二本鎖ＲＮＡに対するＰＮＡのモル濃度比（molar ratio）を、１：１ないし１：５と異なるものにした条件において、複合体形成いかんを観察した。
具体的には、本発明によるＲＮＡ核酸分子である＃２（７ｍｅｒ）、＃９（５ｍｅｒ）、＃１０（１０ｍｅｒ）、及び対照群ＲＮＡ核酸分子である＃７に該当するＰＮＡ及びｓｉＲＮＡ二本鎖を利用した。前記実施例１－２の方法によって実験を進目、１８％ Nativeゲルを利用し、Native ＰＡＧＥを実施して観察した。
その結果、図２Ａないし図２Ｃに示されているように、ＰＮＡが７ｍｅｒ及び１０ｍｅｒである場合、１：１ないし１：５モル比において、いずれもＰＮＡ－ｓｉＲＮＡ核酸分子が形成されたということが示された。それに反し、５ｍｅｒ ＰＮＡの場合には、ｓｉＲＮＡ二本鎖のバンドとバンドとの位置差がほとんどないと見られ、核酸分子が形成されていないことを確認し、それは、５ｍｅｒ ＰＮＡのＴｍが２０．２℃であるので、常温で分離（dissociation）されるためであると判断された。
実施例４．ＰＮＡ位置、及びＰＮＡ－ＡＳ結合領域の塩基配列による安定性比較
本発明者らは、まず、前記実施例２－１でデザインされて合成された本発明によるＲＮＡ核酸分子の血清安定性を分析した。そのために、表１の核酸分子＃２，＃３及び＃４を利用し、前記実施例１－３の方法によって血清安定性を分析し、その結果を定量化し、グラフに示した。
その結果、図３Ａに示されているように、本発明によるＲＮＡ核酸分子である＃２、＃３及び＃４のいずれにおいても、血清安定性が顕著に増大していると示され、図３Ｂから分かるように、前記核酸分子において、ＰＮＡが分離された二本鎖ＲＮＡ形態の安定性も、高く維持されるということが分かった。そのような結果は、図３Ｃに示されているように、ゲルイメージ上に示されたバンドの強度を介して確認することができる。
前記結果に基づき、本発明者らは、本発明によるＲＮＡ核酸分子の安定性増進効果が、構造に特異的であるか否かということを確認するために、前記実施例２－２で合成された表３の対照群ＲＮＡ核酸分子との安定性を比較した。
その結果、図４Ａに示されているように、図１ＢのＰＮＡが、ＲＮＡのアンチセンス鎖５’末端に結合した構造を有する核酸分子（＃７、＃８）と比較し、本発明による図１Ａの構造を有する核酸分子（＃２、＃３、＃４）の安定性が顕著に高く示され、ＰＮＡが結合された複合体形態だけではなく、図４Ｂから分かるように、ＰＮＡが分離された二本鎖ＲＮＡの安定性も、類似した傾向を示した。そのような結果は、図４Ｃのゲルイメージ上のバンド強度を介して確認することができる。
また、本発明者らは、本発明による図１Ａの構造を有するＲＮＡ核酸分子において、ＲＮＡのアンチセンス鎖と結合するＰＮＡ末端の２個ヌクレオチド、及びＰＮＡと結合するアンチセンス鎖末端の２個ヌクレオチドの塩基配列が、安定性に重要な影響を及ぼすか否かということを確認するために、前記４個のヌクレオチドが、いずれもＴ（Ｕ）とＡとによってのみ構成された対照群核酸分子（＃５）との安定性を比較した。
その結果、図４Ａないし図４Ｃから分かるように、本発明による核酸分子（＃２、＃３、＃４）とは異なり、前記４個のヌクレオチドがいずれもＴ（Ｕ）とＡとによってのみ構成されている核酸分子（＃５）の場合には、安定性が顕著に低下すると示され、そのような結果は、ＰＮＡが結合された複合体形態だけではなく、ＰＮＡが分離された二本鎖ＲＮＡにおいても、類似して示された。
ただし、本発明者らは、図４ＡのＰＮＡが結合された複合体形態の結果において、ＰＮＡ－アンチセンス鎖が結合される部位の塩基配列に係わりなく、図１Ａの構造を有する核酸分子（＃２、＃３、＃４、＃５）が、図１Ｂ構造の核酸分子（＃７、＃８）に比べ、安定性が高いということを確認した。しかしながら、二本鎖ＲＮＡに係わる図４Ｂにおいては、ＰＮＡ－アンチセンス鎖が結合される部位が、Ｔ（Ｕ）及びＡで構成された核酸分子の場合、図１Ａ構造の核酸分子（＃５）が、図１Ｂの構造を有する核酸分子（＃８）より安定性が若干低く示されていることを確認した。それにより、本発明者らは、ＰＮＡ位置による安定性をさらに正確に比較するために、下記表４に示されているＲＮＡ核酸分子を追加して合成した。
Figure 2023529355000005
具体的には、ＰＮＡ－アンチセンス鎖結合部位の塩基配列及びＰＮＡ配列のような他の条件は、いずれも同一であり、ＰＮＡの位置だけが異なる＃１２核酸分子及び＃１３核酸分子を利用し、ＰＮＡ位置による安定性をさらに正確に比較分析した。その結果、図５Ａないし図５Ｃに示されているように、本願発明による図１Ａの構造を有するＲＮＡ核酸分子（＃１２）の安定性が顕著に高く示され、ＰＮＡが分離された二本鎖ＲＮＡ形態においても、類似した結果を確認した。
前述の結果を介し、本発明によるＲＮＡ核酸分子のＰＮＡの結合位置、及びＰＮＡ－アンチセンス鎖結合領域が安定性増進に重要な影響を及ぼすということが分かった。
実施例５．ＰＮＡ長による安定性の比較
次に、ＲＮＡ核酸分子において、ＰＮＡ長が核酸分子の安定性に影響を及ぼすか否かということを分析し、最も効果的に安定性を増進させることができるＰＮＡ長を決定するために、前述の表１及び表２の核酸分子＃９（ＰＮＡ ５ｍｅｒ）、＃２（ＰＮＡ ７ｍｅｒ）及び＃１０（ＰＮＡ １０ｍｅｒ）を利用し、前記実施例１－３の方法により、血清安定性を分析し、その結果を定量化させてグラフに示した。
実験結果、図６Ａないし図６Ｃに示されているように、ＰＮＡ長が５ｍｅｒである場合には、ｓｉＲＮＡ二本鎖と結合されたＲＮＡ分子が形成されていない一方、７ｍｅｒ及び１０ｍｅｒである場合には、安定性が類似して示され、７ｍｅｒである場合が若干高く示された。また、ＰＮＡが分離されたＲＮＡ二本鎖形態においても、７ｍｅｒ及び１０ｍｅｒである場合、安定性がいずれも類似した程度に、７ｍｅｒにおいて、若干高いということを確認した。
前記結果から、ＰＮＡ長が７ｍｅｒである場合、構造体の安定性が最も高いレベルに増進されることが分かった。
実施例６．目的遺伝子の発現抑制効率確認
本発明者らは、本発明によるＲＮＡ核酸分子の構造を満足するために、Naive ｓｉＲＮＡにヌクレオチドを追加したことが、本来の遺伝子発現抑制効率に影響を及ぼすか否かということを確認した。そのために、ＰＮＡが結合されていない形態のＧＦＰ ｓｉＲＮＡ二本鎖（＃１）を対照群にし、本発明のＲＮＡ核酸分子（＃２、＃３及び＃４）の遺伝子発現抑制効率を、実施例１－４の方法によって分析した。
その結果、図７に示されているように、ＲＮＡ核酸分子の場合、対照群と比較し、変更された構造を有するにもかかわらず、ｓｉＲＮＡの遺伝子発現抑制効率が維持されることを確認した。
それを介し、本発明によるＲＮＡ核酸分子は、二本鎖ＲＮＡの遺伝子発現抑制効率は、維持させながら、体内安定性は、顕著に増進させることができるということを確認した。
本発明の技術的思想や、必須な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解することができるであろう。従って、以上で記述された実施例は、全ての面において、例示的な物であり、限定的ではないと理解されなければならない。
本発明によるＲＮＡｉ誘導用核酸分子は、多様な遺伝子を標的とする拡張可能なプラットホームとして、顕著に優秀な体内安定性を有するが、研究分野、または臨床における多様な疾病の診断分野または治療分野において、有用に活用されうると期待される。

Claims (14)

  1. 目的核酸と相補的な領域を含む１５個ないし４９個のヌクレオチド長の第１鎖、及び前記第１鎖と相補的な結合を形成する２１個ないし６２個のヌクレオチド長の第２鎖によって構成された二本鎖ＲＮＡ分子と、
    前記第１鎖と結合された６個ないし１３個のヌクレオチド長のＰＮＡ（peptide nucleic acid）と、を含むが、
    前記ＰＮＡのＮ末端が前記第１鎖３’末端と結合され、
    前記ＰＮＡと前記第１鎖との結合領域は、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）塩基によってなる、ＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  2. 前記結合領域は、第１鎖３’末端から、１ないし２のヌクレオチド領域、及び前記ＰＮＡのＮ末端から、１ないし２のヌクレオチド領域によって構成された群のうちから選択される１以上の領域を含むことを特徴とする請求項１に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  3. 前記第２鎖は、ＰＮＡとの結合部分を除いた残り領域において、第１鎖と相補的な結合を形成することを特徴とする、請求項１または２に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  4. 前記ＲＮＡ分子の第２鎖は、１ないし５のヌクレオチドによって構成された３’オーバーハングを有することを特徴とする、請求項１または２に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  5. 前記ＲＮＡ分子は、１以上のリボヌクレオチドの糖構造、塩基構造、または前記リボヌクレオチド間の結合部位が化学的に変形されたことを特徴とする、請求項１または２に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  6. 前記化学的変形は、リボヌクレオチドの２’位置のＯＨ基が、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＣＮで置換され、前記Ｒは、Ｃ１－Ｃ６のアルキル、アルケニルまたはアルキニルであることを特徴とする請求項５に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  7. 前記化学的変形は、バックボーンのホスホジエステル結合をボラノホスフェートまたはホスホチオエートで置換することを特徴とする請求項５に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  8. 前記目的核酸は、ｍＲＮＡ（messenger RNA）、microＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（piwi－interacting RNA）、ｎｃＲＮＡ（non－coding RNA）、コーディングＤＮＡ配列及び非コーディングＤＮＡ配列によってなる群のうちから選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１または２に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  9. 前記核酸分子は、体内安定性が増進されたことを特徴とする、請求項１または２に記載のＲＮＡｉ誘導用核酸分子。
  10. 請求項１または２に記載の核酸分子と、
    細胞内担体とを含む、ＲＮＡｉ誘導用複合体。
  11. 前記細胞内担体は、陽イオン性のポリマー、脂質、細胞透過性ペプチド及び細胞標的リガンドによって構成された群のうちから選択されることを特徴とする請求項１０に記載のＲＮＡｉ誘導用複合体。
  12. 前記細胞透過性ペプチドのＮ末端は、前記核酸分子を構成するＰＮＡのＣ末端と連結されたことを特徴とする請求項１１に記載のＲＮＡｉ誘導用複合体。
  13. 請求項１０に記載の複合体を含む、遺伝子発現抑制用組成物。
  14. 請求項１０に記載の複合体を細胞に処理する段階を含む、遺伝子発現抑制方法。
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CA2818662C (en) * 2010-10-22 2021-07-06 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Nucleic acid molecule inducing rna interference, and uses thereof
EP3514236A1 (en) * 2012-05-22 2019-07-24 Olix Pharmaceuticals, Inc. Rna-interference-inducing nucleic acid molecule able to penetrate into cells, and use therefor

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