CN113073098A - 抑制BACE1基因表达的siRNA修饰物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抑制BACE1基因表达的siRNA修饰物及其应用，该siRNA修饰物为对siRNA进行修饰得到的物质，所述siRNA为siB‑1、siB‑2、siB‑3或经过一个或两个以上核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且不改变原功能所得到的核酸分子；所述修饰包括2’氟代修饰、2’‑O‑甲基化修饰和硫代磷酸酯键修饰。本发明还提供了相应的siRNA衍生物、siRNA‑多肽缀合物及其制备方法。实验证明，本发明提供的siRNA修饰物、siRNA衍生物和siRNA‑多肽缀合物有效克服了现有技术中siRNA药物易被核酸酶降解的缺陷，并能有效富集到脑部组织及病灶。

Description

抑制BACE1基因表达的siRNA修饰物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抑制BACE1基因表达的siRNA修饰物及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种常见的具有破坏性的慢性神经系统变性疾病，会造成病人渐次低下心智功能，最后影响日常生活。其特点是进行性认知能力下降，不可逆的影响全部认知功能而导致日常活动严重受损和过早死亡。AD已经成为继心脏病、肿瘤、脑卒中后第四位引起成人死亡的病因。
AD的病理表现包括神经细胞外淀粉样斑块、细胞内神经纤维缠结和反应性小胶质细胞活化、轴突营养不及神经元和轴突丧失，大脑和特定的皮层下区域神经元和突触的损伤。造成显著的大脑区域萎缩，包括颞叶和顶叶以及部分前额叶和扣带回的衰退。由于AD病人脑区域内有大量的淀粉样蛋白沉积和神经纤维缠结，它们被认为是造成神经元损伤的主要原因，所以AD也被认为是一种蛋白质错误折叠造成的疾病。
AD是一种病因复杂但临床上无特效药的常见致死疾病，它的治疗目前非常棘手。目前只能进行药物治疗，如以多奈哌齐为代表的乙酰胆碱酯酶抑制剂和以美金刚为代表的N-甲基-D-天门冬氨酸受体拮抗剂，但上述药物无法延缓AD进程。
近期研究揭示，β-淀粉样蛋白在大脑中的过度累积是阿尔兹海默病典型的病理特征，而BACE1酶是产生这一蛋白的关键酶(用于分解淀粉样前体蛋白)。所以，抑制BACE1酶的表达可以有效预防和/或治疗AD。设计合适的小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)序列可以专一性的降低BACE1酶的表达。siRNA通过装载入沉默复合体(RNA-inducedsilencing complex，RISC)，与靶标基因的mRNA的靶核酸互补配对，使靶标基因的mRNA降解从而抑制靶标基因的表达。但是靶核酸存在种属间差异，增加了针对靶核酸的siRNA药物研发的困难，同时siRNA的稳定性较差，系统给药存在易被核酸酶降解的缺点。开发有效预防和/或治疗AD的siRNA及其药物存在临床研究的必要性和商业化的现实性。
目前，通过系统给药成功将BACE1 siRNA成功地递送至脑部的工作寥寥无几。在这些工作中，绝大多数的策略是利用经过靶向基团修饰的纳米颗粒或外泌体将包裹在其中的siRNA递送至脑部。这些体系的共同问题是siRNA与递送系统的药质比(药物与递送系统的质量比)低，通常情况下不高于1:10。此外，递送系统带来的毒副作用同样不容忽视。
因此，本领域技术人员希望开发新的抑制BACE1的siRNA药物，以克服现有技术中siRNA药物易被核酸酶降解、难以高效递送至脑部病灶等缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制BACE1基因表达的siRNA修饰物及其应用，该siRNA修饰物在已公开的siRNA序列上进行了修饰，从而显著提高了稳定性，克服了现有技术中siRNA药物易被降解的缺点。
为此，第一方面，本发明提供一种siRNA修饰物，为对siRNA进行修饰得到的物质，所述siRNA由正义链和反义链组成，所述siRNA为A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)siB-1；所述siB-1由SEQ ID NO.4所示的正义链和SEQ ID NO.5所示的反义链组成；
A2)siB-2；所述siB-2由SEQ ID NO.6所示的正义链和SEQ ID NO.7所示的反义链组成；
A3)siB-3，所述siB-3由SEQ ID NO.8所示的正义链和SEQ ID NO.9所示的反义链组成；
A4)将所述A1)、A2)或A3)经过1个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且不改变原功能，所得到的核酸分子；
所述修饰包括2’氟代修饰、硫代磷酸酯键修饰和2’-O-甲基化修饰；
所述2’氟代修饰是将核苷酸核糖2’位置上的羟基替换为氟原子；
所述硫代磷酸酯键修饰为将连接两个相邻核苷酸的磷酸二酯键中的氧原子替换为硫原子；
所述2’-O-甲氧基化修饰是将核苷酸核糖2’位置上的羟基替换为甲氧基。
进一步，所述修饰为：所述正义链和所述反义链中的每个核苷酸各自独立地进行了以下修饰：2’氟代修饰或2’-O-甲基化修饰；同时所述正义链和所述反义链各自独立地进行了硫代磷酸酯键修饰。
进一步，所述正义链的5’末端连续2个磷酸二酯键、所述反义链的5’末端连续2个磷酸二酯键和所述反义链的3’末端连续2个磷酸二酯键均进行了硫代磷酸酯键修饰。
进一步，所述正义链的5’末端第1至4位、第6位、第10至19位核苷酸进行了2’-O-甲基化修饰；进一步优选地，所述正义链的5’末端第5位、第7至9位核苷酸进行了2’氟代修饰。
进一步，所述反义链的5’末端第1位、第3至5位、第7位、第10至13位、第15位、第17至21位进行了2’-O-甲基化修饰；进一步优选地，所述反义链的5’末端第2位、第6位、第8至9位、第14位、第16位核苷酸进行了2’氟代修饰。
本发明的第二方面，提供一种siRNA衍生物，所述siRNA衍生物通过在所述siRNA修饰物上偶联一个或两个以上的式I所示的基团得到，
Figure BDA0002945531860000031
进一步，所述偶联为直接偶联或间接偶联。
在具体的实施方式中，所述siRNA衍生物为在所述siRNA修饰物的正义链3’末端连接式II(a)、式II(b)或式II(c)所示的基团：
Figure BDA0002945531860000041
所述连接的具体方式为：用式II(a)、式II(b)或式II(c)所示的基团取代所述siRNA衍生物的正义链的3’末端的羟基上的H。
进一步，所述siRNA衍生物还可以标记有荧光报告基团，所述荧光报告基团选自但不限于FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种。在优选的实施方式中，所述荧光报告基团标记在所述反义链的5’末端或3’末端。
本发明的第三方面，提供了所述siRNA衍生物的制备方法，包括，将式III所示化合物进行羟基保护后，与式IV所示化合物进行反应得到第一产物；将所述第一产物装入RNA固相合成仪，输入所述siRNA修饰物的序列进行固相合成，合成结束后进行脱保护，即制备得到所述siRNA衍生物，
Figure BDA0002945531860000051
其中，R1和R2各自独立地选自H或-CH2-O-(CH2)3-OH；
Figure BDA0002945531860000052
进一步，所述反应为取代反应。
进一步，用选自以下保护基中的一种进行羟基保护：三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基；优选为4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)。
进一步，通过氨解进行脱保护。
本发明的第四方面，提供制备所述siRNA衍生物的中间体，其为式III所示的化合物或其保护形式：
Figure BDA0002945531860000061
其中，R1和R2各自独立地选自H或-CH2-O-(CH2)3-OH。
进一步，所述保护形式为用选自以下保护基中的一种进行羟基保护：三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)和4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基；优选为4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMTr)。
本发明的第五方面，提供一种siRNA-多肽缀合物，其通过将本发明所述的siRNA衍生物与多肽进行偶联得到。
进一步，所述siRNA-多肽缀合物通过将本发明所述的siRNA衍生物与所述多肽通过点击化学反应进行偶联得到。
进一步，在所述点击化学反应中，通过氨解进行脱保护。
进一步，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGGK(N3)，其结构式如R(a)所示，
Figure BDA0002945531860000071
在具体的实施方式中，所述siRNA-多肽缀合物的结构式如式V(a)、V(b)或V(c)所示，
Figure BDA0002945531860000072
Figure BDA0002945531860000081
其中，Oligo表示本发明所述的siRNA，Peptide表示所述多肽。
本发明的第六方面，提供所述siRNA修饰物和/或所述siRNA衍生物和/或所述siRNA-多肽缀合物在制备产品方面的用途；所述产品的功能为以下B1)和/或B2)和/或B3)和/或B4)：
B1)预防和/或治疗阿尔兹海默症；
B2)抑制β-淀粉样蛋白纤维化；
B3)促进β-淀粉样蛋白纤维的解聚；
B4)降低β-淀粉样蛋白寡聚体含量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供靶向BACE1的siRNA修饰物，显著提高了siRNA的稳定性，克服了现有技术中siRNA药物易被降解的缺点。为了进一步提供一种能够成功将药物递送至脑部的系统给药方式，本发明开发了式III化合物作为linker，利用该linker构建得到了全新的siRNA衍生物和siRNA-多肽缀合物，该siRNA-多肽缀合物可高效、稳定地递送至脑部病灶。该递送体系还具有药质比高、毒副作用小等优点。
在本发明中siRNA衍生物可以包含的荧光基团起到示踪作用，荧光基团本身不影响siRNA衍生物、siRNA-多肽缀合物的生物学效应和功能。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1为siRNA及其修饰物在模拟溶酶体环境内稳定性检测结果；
图2为SD大鼠鞘内注射Cy5-siB-1M-RVG一周后脏器荧光信号强度；
图3为SD大鼠鞘内注射Cy5-siB-1M-2RVG一周后脏器荧光信号强度；
图4为SD大鼠鞘内注射Cy5-siB-1M-3RVG一周后脏器荧光信号强度；
图5为siRNA衍生物在模拟溶酶体环境内稳定性检测结果。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
在本公开中，BACE1是指gene ID为23621，其mRNA序列如Genbank注册号NM_001207048.2，NM_001207049.2，NM_012104.4，NM_138971.3，NM_138972.3，NM_138973.3(人源)所示的基因。Bace1是指gene ID为23821，其mRNA序列如Genbank注册号NM_001145947.2，NM_011792.6(小鼠源)；或Bace1是指gene ID为29392，其mRNA序列如Genbank注册号NM_019204.2(大鼠源)所示的基因。针对该基因的siRNA的具体位点如下表所示：
本公开中正义链如SEQ ID NO.4、反义链如SEQ ID NO.5的siRNA，其靶核酸序列如SEQ ID NO.1(GCUUUGUGGAGAUGGUGGA)所示，是指BACE1的NM_012104.4、NM_138972.3、NM_138971.3、NM_138973.3中第637-655位，或者指Bace1的NM_011792.6、NM_001145947.2中第659-667位和NM_019204.2中第603-621位的可以与SEQ ID NO.1所示的反义链相互杂交的片段。
正义链如SEQ ID NO.6、反义链如SEQ ID NO.7的siRNA，其靶核酸序列如SEQ IDNO.2(GACUGUGGCUACAACAUUC)所示，是指BACE1的NM_012104.4中第1785-1803位、NM_138972.3中第1710-1728位、NM_138971.3中第1653-1671位、NM_138973.3中第1578-1596位、NM_001207048.1中第1147-1165位、NM_001207049.1中第1072-1090位，或者指Bace1的NM_011792.6中第1807-1825位、NM_001145947.2中第1705-1723位和NM_019204.2中第1751-1769位的可以与SEQ ID NO.2所示的反义链相互杂交的片段。
正义链如SEQ ID NO.8、反义链如SEQ ID NO.9的siRNA，其靶核酸序列如SEQ IDNO.3(UGGACUGCAAGGAGUACAA)所示，是指BACE1的NM_012104.4中第1288-1306位、NM_138972.3中第1213-1231位、NM_138971.3中第1156-1174位、NM_138973.3中第1081-1099位、NM_001207048.1中第650-668位、NM_001207049.1中第575-593位，或者指Bace1的NM_011792.6、NM_001145947.2中第1310-1328位和NM_019204.2中第1254-1272位的可以与SEQID NO.3所示的反义链相互杂交的片段。
实施例1
本实施例提供表1所示的siRNA及siRNA修饰物。
编号为siB-1的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该核苷酸序列与BACE1的mRNA序列(NM_012104.4，NM_138971.3，NM_138972.3，NM_138973.3)及Bace1的mRNA序列(NM_001145947.2，NM_011792.6，NM_019204.2)中SEQ ID NO.1(GCUUUGUGGAGAUGGUGGA)相同；siB-1的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中1-19位核苷酸序列与SEQ ID NO.1的靶核酸互补。
编号为siB-2的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，该核苷酸序列与BACE1的mRNA序列(NM_001207048.1，NM_001207049.1，NM_012104.4，NM_138971.3，NM_138972.3，NM_138973.3)及Bace1的mRNA序列(NM_001145947.2，NM_011792.6，NM_019204.2)中SEQ IDNO.2(GACUGUGGCUACAACAUUC)相同；siB-2的反义链核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其中1-19位核苷酸序列与SEQ ID NO.2所示的靶核酸互补。
编号为siB-3的正义链核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，该核苷酸序列与BACE1的mRNA序列(NM_001207048.1，NM_001207049.1，NM_012104.4，NM_138971.3，NM_138972.3，NM_138973.3)及Bace1的mRNA序列(NM_001145947.2，NM_011792.6，NM_019204.2)中SEQ IDNO.3(UGGACUGCAAGGAGUACAA)所示的靶核酸相同；siB-3的反义链核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，其中1-19位核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示的靶核酸互补。
名称为siB-1的siRNA正义链和反义链经过化学修饰后得到的siRNA修饰物名称为siB-1M，其修饰方式如表1所示。
名称为siB-2的siRNA正义链和反义链经过化学修饰后得到的siRNA修饰物名称为siB-2M，其修饰方式如表1所示。
名称为siB-3的siRNA正义链和反义链经过化学修饰后得到的siRNA修饰物名称为siB-3M，其修饰方式如表1所示。
本实施例所提供的siRNA的寡聚核苷酸单链按照本领域公知的方法进行化学合成。其中m代表其左侧的核苷酸残基中戊糖基团为2’-甲氧基核糖基，f代表其左侧的核苷酸残基中戊糖基团为2’-氟代核糖基；s代表其左右两侧的核糖核苷酸残基间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
表1 siRNA序列信息
Figure BDA0002945531860000111
Figure BDA0002945531860000121
实施例2
将人类胰腺癌细胞株PANC-1用含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基接种细胞于24孔板，接种密度为5×104细胞/孔，每孔0.5mL培养基，37℃培养过夜。
第二日将24孔板中细胞培养液吸弃，Mock组每孔加入0.5mL新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，其他待转染组每孔加入0.5mL新鲜Opti-MEM无血清培养基(赛默飞世尔公司)。待转染组分别将1.5μL浓度为20μM实施例1中的siB-1、siB-2、siB-3、siB-1M、siB-2M、siB-3M用48.5μL Opti-MEM无血清培养基稀释；将1μL LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)稀释于49μL Opti-MEM无血清培养基中，混匀后室温下孵育5分钟；混合稀释的siRNA和稀释的LipofectamineTM 2000，轻轻混匀，室温静置20分钟，以便允许复合物的形成。在接种有PANC-1细胞的24孔板中按照每孔100μL加入上述最终混合溶液，siRNA的最终浓度约为50nM。细胞于37℃培养4小时，再向每孔中加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，继续在37℃培养过夜。
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别检测转染了Mock、siB-1、siB-2、siB-3、siB-1M、siB-2M、siB-3M的PANC-1细胞中BACE1 mRNA的表达量。具体步骤为培养转染的细胞24小时后，使用RNA isolator(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号R401-01-AA)提取细胞中的总RNA；分别取1μg总RNA按照反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司，货号AT311-03)的使用方法反转录得到cDNA。使用实时荧光定量PCR mix试剂盒(上海翊圣生物科技有限公司，货号11201ES08)，以cDNA为模板按照试剂盒说明书的步骤进行BACE1 mRNA的表达量的检测。其中，用于扩增BACE1和作为内参基因的GAPDH的PCR引物如表2所示。
表2人源BACE1及GAPDH引物信息
Figure BDA0002945531860000131
siRNA及siRNA修饰物对BACE1 mRNA表达水平的抑制率按如下等式计算，计算结果见表3所示：
抑制率＝[1-(实验组BACE1 mRNA的表达量/实验组GAPDH mRNA的表达量)/(Mock组BACE1 mRNA的表达量/Mock组GAPDH mRNA的表达量)]×100％。
表3针对BACE1基因的siRNA及其修饰物在PANC-1细胞上的抑制效率
组别 抑制率
siB-1 45％
siB-2 31％
siB-3 35％
siB-1M 45％
siB-2M 44％
siB-3M 44％
实施例3模拟溶酶体环境稳定性测试
在0.2mL EP管中加入2.72μL Tritosomes(Xenotech,R0610.LT)，31.28μL柠檬酸钠溶液(pH5.0)，再分别加入6μL浓度为20μM实施例1中的siB-1、siB-2、siB-3、siB-1M、siB-2M、siB-3M，混匀。37℃恒温孵育(酶终浓度0.2mU/μL，柠檬酸钠终浓度15mM)。在预定时间点(0min，2h，4h，6h，8h，24h，48h，72h)各取出5μL混合液，加入到15μL 9M的尿素中变性，立即于-80℃冰箱中冻存。8个时间点取样完成后，各样品的每个时间点处理样品取10μL进行体积比为20％的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)凝胶电泳。配制含20％制胶液的聚丙烯酰胺凝胶，使用上述样品10μL与2μL上样缓冲液(宝生物工程(大连)有限公司)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen公司，货号11494)染色15分钟后进行成像。
siRNA及siRNA修饰物在模拟溶酶体环境中的稳定性检测结果如图1所示。由图1可知，经修饰得到的siB-1M、siB-2M和siB-3M的稳定性显著提高，在模拟溶酶体环境中孵育72h仍具有良好的稳定性。
实施例4制备Cy5-siB-1M-RVG
Figure BDA0002945531860000141
将化合物A(10mg，1.45μmol)和化合物B(52mg，14.5μmol)用无水乙腈溶解配制成浓度为0.1M的溶液，加入干燥的分子筛，装于DNA/RNA固相合成仪修饰单体的位置，输入目标的RNA序列和修饰进行固相合成。合成结束后取下固相合成载体进行氨解等脱保护，脱保护溶液用正丁醇进行沉淀。-20℃下放置30min后高速离心倒去上清，沉淀物用DEPC水进行溶解，测定粗品的含量，然后进行HPLC纯化得到化合物C产率23.7％。并对收集峰进行质谱(MS)鉴定。化合物C理论分子量为10488.2，实测值为10488.8。
其中，化合物C中的Oligo表示siB-1M的正义链；磷酸酯基中与所述Oligo相连接的-O-与所述siB-1M正义链3’末端核苷酸的3’碳直接相连。
将化合物C与Peptide-Azide(序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGGK(N3)，购自上海吉尔生化有限公司)通过点击化学反应偶联，然后进行Cy5荧光标记，最后与siB-1M的反义链退火得到siRNA-多肽缀合物Cy5-siB-1M-RVG。
实施例5制备Cy5-siB-1M-2RVG
Figure BDA0002945531860000151
将化合物D(10mg，1.27μmol)和化合物B(68.4mg，19.05μmol)用无水乙腈溶解配制成浓度为0.1M的溶液，加入干燥的分子筛，装于DNA/RNA固相合成仪修饰单体的位置，输入目标的RNA序列和修饰进行固相合成。合成结束后取下固相合成载体进行氨解等脱保护，脱保护溶液用正丁醇进行沉淀。-20℃下放置30min后高速离心倒去上清，沉淀物用DEPC水进行溶解，测定粗品的含量，然后进行HPLC纯化得到化合物E，产率19.8％。并对收集峰进行质谱(MS)鉴定。化合物E理论分子量为15083.7，实测值为15083.7。
其中，化合物E中的Oligo表示siB-1M的正义链；磷酸酯基中与所述Oligo相连接的-O-与所述siB-1M正义链3’末端核苷酸的3’碳直接相连。
将化合物E与Peptide-Azide(序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGGK(N3)，购自上海吉尔生化有限公司)通过点击化学反应偶联，然后进行Cy5荧光标记，最后与siB-1M的反义链退火得到siRNA-多肽缀合物Cy5-siB-1M-2RVG。
实施例6制备Cy5-siB-1M-3RVG
Figure BDA0002945531860000161
将化合物F(10mg，1.17μmol)和化合物B(84.1mg，23.4μmol)用无水乙腈溶解配制成0.1M浓度的溶液，加入干燥的分子筛，装于DNA/RNA固相合成仪修饰单体的位置，输入目标的RNA序列和修饰进行固相合成。合成结束后取下固相合成载体进行氨解等脱保护，脱保护溶液用正丁醇进行沉淀。-20℃下放置30min后高速离心倒去上清，沉淀物用DEPC水进行溶解，测定粗品的含量，然后进行HPLC纯化得到化合物G，产率14.6％。并对收集峰进行质谱(MS)鉴定。化合物G理论分子量为19347.06，实测值为19347.2。
其中，化合物G中的Oligo表示siB-1M的正义链；磷酸酯基中与所述Oligo相连接的-O-与所述siB-1M正义链3’末端核苷酸的3’碳直接相连。
将化合物G与Peptide-Azide(序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGGK(N3)，购自上海吉尔生化有限公司)通过点击化学反应偶联，然后进行Cy5荧光标记，最后与siB-1M的反义链退火得到siRNA-多肽缀合物Cy5-siB-1M-3RVG。
实施例7
本实施例检测了Cy5-siB-1M-RVG、Cy5-siB-1M-2RVG和Cy5-siB-1M-3RVG经过鞘内注射后在大鼠体内的分布情况。
SD大鼠购买于维通利华，6-8周龄，雌性。分别将实施例4-6制备得到的Cy5-siB-1M-RVG、Cy5-siB-1M-2RVG和Cy5-siB-1M-3RVG用生理盐水调整浓度至1000ng/μL，按0.25mg/kg剂量分别对大鼠进行鞘内注射，未处理动物做阴性对照。给药后1周对动物进行解剖，分离大脑、脑干、颌下腺、胸腺、心脏、肺、肝、脾及肾，用小动物成像系统进行成像，对荧光信号强度进行定量的结果如图2至图4所示。
实施例8
在0.2mL EP管中加入2.72μL Tritosomes(Xenotech,R0610.LT)，31.28μL柠檬酸钠溶液(pH5.0)，再分别加入6μL浓度为20μM实施例4-6制备得到的Cy5-siB-1M-RVG、Cy5-siB-1M-2RVG和Cy5-siB-1M-3RVG，混匀。37℃恒温孵育(酶终浓度0.2mU/μL，柠檬酸钠终浓度15mM)。在预定时间点(0min，2h，4h，6h，8h，24h，48h，72h)各取出5μL混合液，加入到15μL9M的尿素中变性，立即于-80℃冰箱中冻存。8个时间点取样完成后，各样品的每个时间点处理样品取10μL进行体积比为20％的聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)凝胶电泳。配制含20％制胶液的聚丙烯酰胺凝胶，使用上述样品10μL与2μL上样缓冲液(宝生物工程(大连)有限公司)混合，然后上样，在80mA恒流条件下电泳60分钟左右。电泳结束后，用1×Sybr Gold染料(Invitrogen公司，货号11494)染色15分钟后进行成像。
检测结果如图5所示，根据图5，Cy5-siB-1M-RVG、Cy5-siB-1M-2RVG和Cy5-siB-1M-3RVG具有良好的稳定性，在模拟溶酶体环境中孵育72h仍未发生明显降解。
实施例9
将人类胰腺癌细胞株PANC-1用含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基接种细胞于24孔板，接种密度为4×105细胞/孔，每孔0.5mL培养基，37℃培养过夜。
第二日将24孔板中细胞培养液吸弃，Mock组每孔加入0.5mL新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，其他待转染组每孔加入0.5mL新鲜Opti-MEM无血清培养基(赛默飞世尔公司)。待转染组分别将1.5μL浓度为20μM实施例4-6制备得到的Cy5-siB-1M-RVG、Cy5-siB-1M-2RVG和Cy5-siB-1M-3RVG用48.5μL Opti-MEM无血清培养基稀释；将1μLLipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)稀释于49μL Opti-MEM无血清培养基中，混匀后室温下孵育5分钟；混合稀释的siRNA衍生物和稀释的LipofectamineTM 2000，轻轻混匀，室温静置20分钟，以便允许复合物的形成。在接种有PANC-1细胞的24孔板中按照每孔100μL加入上述最终混合溶液，siRNA衍生物的最终浓度约为50nM。细胞于37℃培养4小时，再向每孔中加入1mL含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，继续在37℃培养过夜。
通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)分别检测转染了Mock、siB-1、siB-2、siB-3、siB-1M、siB-2M、siB-3M的PANC-1细胞中BACE1 mRNA的表达量，并计算抑制率(mRNA的检测及抑制率的计算具体见实施例2)。检测结果如表4所示：
表4针对BACE1基因的siRNA衍生物在PANC-1细胞上的抑制效率
组别 抑制率
Cy5-siB-1M-RVG 40％
Cy5-siB-1M-2RVG 44％
Cy5-siB-1M-3RVG 52％
根据表4所示的结果，在siB-1M上偶联RVG基团后，对其抑制效率无任何不良影响；甚至意外发现了在偶联3个RGV基团后，Cy5-siB-1M-3RVG的抑制率有了显著提升。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 北京理工大学
<120> 抑制BACE1基因表达的siRNA修饰物及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcuuugugga gauggugga 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacuguggcu acaacauuc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
uggacugcaa ggaguacaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcuuugugga gauggugga 19
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uccaccaucu ccacaaagcu g 21
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacuguggcu acaacauuc 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaauguugua gccacagucu u 21
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uggacugcaa ggaguacaa 19
<210> 9
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uuguacuccu ugcaguccau u 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgcacgatg acttcaggac 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gccactgaca caccatgag 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaaggctgg ggctcatttg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aggggccatc cacagtcttc 20
<210> 14
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<222> (33)
<223> 修饰有叠氮基团
<400> 14
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Lys

Claims (12)

1.一种siRNA修饰物，其为对siRNA进行修饰得到的物质，所述siRNA由正义链和反义链组成，所述siRNA为A1)、A2)、A3)或A4)：
A1)siB-1；所述siB-1由SEQ ID NO.4所示的正义链和SEQ ID NO.5所示的反义链组成；
A2)siB-2；所述siB-2由SEQ ID NO.6所示的正义链和SEQ ID NO.7所示的反义链组成；
A3)siB-3，所述siB-3由SEQ ID NO.8所示的正义链和SEQ ID NO.9所示的反义链组成；
A4)将所述A1)、A2)或A3)经过一个或两个以上核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且不改变原功能，所得到的核酸分子；
所述修饰为：将所述正义链和所述反义链中的每个核苷酸各自独立地进行了以下修饰：2’氟代修饰或2’-O-甲基化修饰；同时所述正义链和所述反义链各自独立地进行了硫代磷酸酯键修饰。
2.如权利要求1所述的siRNA修饰物，其特征在于，所述正义链的5’末端连续2个磷酸二酯键、所述反义链的5’末端连续2个磷酸二酯键和所述反义链的3’末端连续2个磷酸二酯键均进行了硫代磷酸酯键修饰。
3.如权利要求1或2所述的siRNA修饰物，其特征在于，所述正义链的5’末端第1至4位、第6位、第10至19位核苷酸进行了2’-O-甲基化修饰；
优选地，所述正义链的5’末端第5位、第7至9位核苷酸进行了2’氟代修饰；
优选地，所述反义链的5’末端第1位、第3至5位、第7位、第10至13位、第15位、第17至21位进行了2’-O-甲基化修饰；
优选地，所述反义链的5’末端第2位、第6位、第8至9位、第14位、第16位核苷酸进行了2’氟代修饰。
4.一种siRNA衍生物，其通过在权利要求1-3任一项所述的siRNA修饰物上偶联一个或两个以上的式I所示的基团得到，
Figure FDA0002945531850000021
5.如权利要求4所述的siRNA衍生物，其特征在于，所述siRNA衍生物为在所述siRNA修饰物的正义链3’末端连接式II(a)、式II(b)或式II(c)所示的基团：
Figure FDA0002945531850000022
Figure FDA0002945531850000031
6.如权利要求4或5所述的siRNA衍生物，其特征在于，所述siRNA衍生物还可以标记荧光报告基团；优选地，所述荧光报告基团选自但不限于FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种。
7.权利要求4-6任一项所述的siRNA衍生物的制备方法，其特征在于，包括：将式III所示化合物进行羟基保护后，与式IV所示化合物进行反应得到第一产物；将所述第一产物装入RNA固相合成仪，输入所述siRNA修饰物的序列进行固相合成，合成结束后进行脱保护，即制备得到所述siRNA衍生物，
Figure FDA0002945531850000032
其中，R1和R2各自独立地选自H或-CH2-O-(CH2)3-OH；
Figure FDA0002945531850000033
优选地，用选自以下保护基中的一种进行羟基保护：三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基和4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基。
8.一种siRNA-多肽缀合物，其特征在于，其通过将权利要求4-6任一项所述的siRNA衍生物与多肽进行偶联得到。
9.如权利要求8所述的siRNA-多肽缀合物，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGGGGK(N3)，其结构式如R(a)所示，
Figure FDA0002945531850000041
优选地，所述siRNA-多肽缀合物的结构式如式V(a)、V(b)或V(c)所示，
Figure FDA0002945531850000042
Figure FDA0002945531850000051
其中，Oligo表示权利要求4-6任一项所述的siRNA，Peptide表示所述多肽。
10.一种中间体，其为式III所示的化合物或其保护形式：
Figure FDA0002945531850000061
其中，R1和R2各自独立地选自H或-CH2-O-(CH2)3-OH。
11.如权利要求10所述的中间体，其特征在于，所述保护形式为用选自以下保护基中的一种进行羟基保护：三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4’-二甲氧基三苯甲基和4,4’,4”-三甲氧基三苯甲基。
12.权利要求1-3任一项所述的siRNA修饰物和/或权利要求4-6任一项所述的siRNA衍生物和/或权利要求8-9任一项所述的siRNA-多肽缀合物在制备产品方面的用途；所述产品的功能为以下B1)和/或B2)和/或B3)和/或B4)：
B1)预防和/或治疗阿尔兹海默症；
B2)抑制β-淀粉样蛋白纤维化；
B3)促进β-淀粉样蛋白纤维的解聚；
B4)降低β-淀粉样蛋白寡聚体含量。
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