JP2024505151A - 脂質ナノ粒子球状核酸 - Google Patents

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エー．マーキン チャド
ジョセフ シングラ アンドリュー
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ノースウェスタン ユニバーシティ
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Abstract

疾患を治療するために、ＤＮＡ及びＲＮＡ治療剤を標的組織に送達し、副作用なしに持続的な利益を提供する必要がある。脂質ナノ粒子球状核酸は、ナノ粒子標的化及び組織特異性のためにＤＮＡ及びＲＮＡ配列を使用することによって、この満たされていない必要性に対処する。この脂質ＳＮＡ構造は、脂質粒子（核酸を充填した）又は従来のＳＮＡ（リポソーム及びゴールドコア）の両方とは著しく異なる生体分布特性を有する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年１月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／１３６，５０１号の優先権を米国特許法第１１９条（ｅ）の下で主張する。
政府の利益に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＣＡ２０８７８３、ＣＡ２２１７４７、及びＣＡ１９９０９１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本開示の一部である配列表を、明細書と同時にテキストファイルとして提出する。配列表を含むテキストファイルの名称は、「２０２１－００２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」であり、これは、２０２２年１月１０日に作成され、サイズは６４３バイトである。配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、治療及び診断の両方において多くの潜在的な用途を有するが、臨床的に関連する用量での効果的な送達は依然として課題である。これらの分子の構造は、それらの送達に制限を作り出す。これらの制限には、ヌクレアーゼによる急速な分解、不十分な生体内分布特性、標的組織内の低蓄積、及び細胞区画内の隔離が挙げられる。これらの問題に対処するために、核酸のための多くの異なるナノ粒子担体構造が探究されてきた。
脂質ナノ粒子は、オリゴヌクレオチドの細胞内送達及び細胞質認識、並びにメッセンジャーＲＮＡの発現を促進するのに有用である。しかしながら、特定の組織を標的とするそれらの能力は、内因性脂質輸送経路に依存すると考えられる（例えば、Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１０）１８：１３５７－１３６４を参照されたい）。この制限に対処しようとするには、脂質構造又はステロールの広範なスクリーニングがしばしば必要である［例えば、Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（２０１０）１０７：１８６４－１８６９、及びＰａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０２０）９８３を参照されたい］。これらの研究は、ナノ粒子構造とそれらの分布特性との間のいくつかの関係を明らかにしたが、予測可能なナノ粒子標的化能力を有するシステムを開発する必要性が残っている。
多くの疾患は、有害な遺伝子をサイレント化し、欠損遺伝子を置き換え、患者のＤＮＡ内の変異を編集する核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）ベースの治療薬によって治療することができる。しかしながら、体内では、活性配列は多くの場合、標的組織及び細胞に到達しない。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、核酸の最も効果的な担体のうちのいくつかである。ＬＮＰ担体は、到達しやすい標的への送達に有効であるが、多くの場合、血流及び肝臓の外側の細胞集団において顕著な増強を見出すために、数千の異なる担体構造をスクリーニングする必要がある。球状核酸（ＳＮＡ）構造は、既存のナノ粒子構造の表面上の短いＤＮＡ配列を使用してそれらの送達を標的とすることによって、このアプローチを促進する。半径方向に配向した外側の配列は、体内のナノ粒子の行き先及びその活性の両方を変化させる。外側のＤＮＡ配列は、遺伝子サイレンシング、遺伝子置換、又は遺伝子編集に使用される核酸を封入した関連するＬＮＰの送達を標的とする。外側のＤＮＡ配列は、ＬＮＰが送達される「アドレス」を提供する。ＤＮＡ配列の組み合わせは、多くの異なる構造を形成することができるため、この戦略は、ＬＮＰ構造に標的化、刺激応答性、及び診断能力を付加するための多数の選択肢を提供する。
本明細書に記載される技術の用途には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・治療用タンパク質の発現を容易にするためのＲＮＡの送達
・治療用遺伝子サイレンシングのための低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達
・ゲノム編集のための複数のＤＮＡ及びＲＮＡ鎖の送達
・診断のためのＤＮＡ及びＲＮＡプローブの送達
・免疫系を調節するように設計されたＤＮＡ及びＲＮＡ鎖の送達
・ＤＮＡ及びＲＮＡ治療薬と他の医薬品との同時送達
・封入された医薬品の標的化送達
本明細書に記載される技術の利点には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・異なるＤＮＡ、ＲＮＡ配列を送達する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）構造が存在すること
・副作用のない標的組織への送達は、この分野の中心的な課題であること
・ＬＮＰを標的とするための２つの主なアプローチ：１．）新規の脂質構造及びＬＮＰ組成物の合成、並びに２．）標的化ペプチド、抗体でＬＮＰ表面を装飾すること、があること
・脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）が、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列でＬＮＰの表面を飾ること
・ＬＮＰ－ＳＮＡの表面上のＤＮＡ及びＲＮＡ配列が、機能を増強し、ナノ粒子の組織標的化を変化させること
・これが、ＤＮＡ及びＲＮＡが多くの異なる構造を形成することができ、理論的には、高い特異性で任意の標的に結合するように設計されているため、高度にモジュール化されたプラットフォームを表すこと
・ＤＮＡ及びＲＮＡが、センサーとして有用であり、脂質ナノ粒子からの治療及び診断（セラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ））用構造を設計するために使用することができること
したがって、いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）を提供し、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含み、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも１０％は、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合する。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの１００％は、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約５～約１０００個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約１００～約１０００個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、約４００個のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約５～約１００ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約１０～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、一本鎖、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、一本鎖、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、標的化オリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、標的化オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、ｎは７である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、アプタマーである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子基質ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む。なお更なる実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）、又はアプタザイムである。いくつかの実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせから構成される。更なる実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、阻害性オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子タンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ遺伝子編集因子基質である。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）、又はアプタザイムである。更なる実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチドである。更なる実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ、又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。様々な実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、約５～約５０００ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、約１０～約４５００ヌクレオチド長である。なお更なる実施形態では、封入されたオリゴヌクレオチドは、約１５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、複数の封入されたオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。様々な実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチドは、阻害性オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ遺伝子編集因子基質、又はそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである。更なる実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ、又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは、約１０～約５０ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、複数の封入されたオリゴヌクレオチドは、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、Ｃ１２－２００、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約５０％であるイオン化可能な脂質のモル分率を含む。更なる実施形態では、リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約１％～約２５％であるリン脂質のモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の３．５％であるか、又は約３．５％であるリン脂質のモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ステロールは、３β－ヒドロキシコレスト－５－エン（コレステロール）、９，１０－セココレスタ－５，７，１０（１９）－トリエン－３β－オール（ビタミンＤ３）、９，１０－セコエルゴスタ－５，７，１０（１９），２２－テトラエン－３β－オール（ビタミンＤ２）、カルシポトリオール、２４－エチル－５，２２－コレスタジエン－３β－オール（スチグマステロール）、２２，２３－ジヒドロスチグマステロール（β－シトステロール）、３，２８－ジヒドロキシ－ルペオール（ベツリン）、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、２４α－メチルコレステロール（カンペステロール）、２４－エチルコレスタ－５，２４（２８）Ｅ－ジエン－３β－オール（フコステロール）、２４－メチルコレスタ－５，２２－ジエン－３β－オール（ブラシカステロール）、２４－メチルコレスタ－５，７，２２－トリエン－３β－オール（エルゴステロール）、９，１１－デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は１つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約２５％～約４５％であるステロールのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の４５％であるか、又は約４５％であるステロールのモル分率を含む。更なる実施形態では、ステロールはコレステロールである。なお更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の４５％であるか、又は約４５％であるコレステロールのモル分画を含む。いくつかの実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、２０００ダルトン（Ｄａ）のポリエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、脂質－ＰＥＧ－マレイミドである。更なる実施形態では、脂質－ＰＥＧ－マレイミドは、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジパルミトリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約１．５％～約３．５％である脂質－ＰＥＧコンジュゲートのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の１．５％であるか、又は約１．５％である脂質－ＰＥＧコンジュゲートのモル分率を含む。様々な実施形態では、イオン化可能な脂質と封入されたオリゴヌクレオチドとの間の質量比は、約２０：１～約５：１である。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアに封入された治療剤を更に含む。更なる実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した治療剤を
更に含む。更なる実施形態では、治療剤は、抗体若しくは抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した標的化ペプチド、標的化抗体、又はそれらの組み合わせを更に含む。
いくつかの態様では、本開示は、本開示の複数の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は治療剤を更に含む。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、本開示の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）又は組成物とハイブリダイズさせるステップを含む、遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、ポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドのシェル内の１つ以上のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズは、遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性でポリヌクレオチドの長さにわたって生じる。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現はインビボで阻害される。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の発現はインビトロで阻害される。
いくつかの態様では、本開示は、ｔｏｌｌ様受容体を有する細胞を、本開示の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）又は組成物と接触させることを含む、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性を上方調節するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、ＴＬＲアゴニストである１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ｔｏｌｌ様受容体は、ｔｏｌｌ様受容体１、ｔｏｌｌ様受容体２、ｔｏｌｌ様受容体３、ｔｏｌｌ様受容体４、ｔｏｌｌ様受容体５、ｔｏｌｌ様受容体６、ｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、ｔｏｌｌ様受容体９、ｔｏｌｌ様受容体１０、ｔｏｌｌ様受容体１１、ｔｏｌｌ様受容体１２、ｔｏｌｌ様受容体１３、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本方法はインビトロで実施される。いくつかの実施形態では、本方法はインビボで実施される。
いくつかの態様では、本開示は、ｔｏｌｌ様受容体を有する細胞を、本開示の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）又は組成物と接触させることを含む、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性を下方調節するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、ＴＬＲアンタゴニストである１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ｔｏｌｌ様受容体は、ｔｏｌｌ様受容体１、ｔｏｌｌ様受容体２、ｔｏｌｌ様受容体３、ｔｏｌｌ様受容体４、ｔｏｌｌ様受容体５、ｔｏｌｌ様受容体６、ｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、ｔｏｌｌ様受容体９、ｔｏｌｌ様受容体１０、ｔｏｌｌ様受容体１１、ｔｏｌｌ様受容体１２、ｔｏｌｌ様受容体１３、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本方法はインビトロで実施される。いくつかの実施形態では、本方法はインビボで実施される。
いくつかの態様では、本開示は、障害を治療する方法であって、有効量の、本開示の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）又は組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、投与することが、障害を治療する、方法を提供する。いくつかの実施形態では、障害は、がん、感染症、自己免疫疾患、又はそれらの組み合わせである。
ＬＮＰ－ＳＮＡの合成を表示する。核酸を搭載したＬＮＰは、エタノール希釈法によって形成される。ＰＨ４．０で１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液中に溶解したＤＮＡ又はＲＮＡを、脂質及びエタノール中のコレステロールに３：１の体積比で混合する。次に、脂質－ＰＥＧ－マレイミド（赤丸）を含有するＬＮＰを室温で２時間、３’－ＳＨ ＤＮＡ（青色）と混合し、ＬＮＰ－ＳＮＡをもたらす。 封入されたｍＲＮＡを有するＬＮＰ－ＳＮＡの特性を示す。（Ａ）３．５％ＤＯＰＥ、４５％コレステロール、５０％Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭａ、及び封入されたＬｕｃ２ ｍＲＮＡを有する１．５％ＤＭＰＥ－ＰＥＧ（２０００）－マレイミドから構成されるＬＮＰ－ＳＮＡの３回のＮａｎｏＳｉｇｈｔ実行の平均のプロット。（Ｂ）同じＳＮＡのクライオＴＥＭ画像。 ＤＮＡのＬＮＰへのコンジュゲーション及び確認されたＬＮＰ－ＳＮＡの形成を示す。１％アガロースゲルをＴＡＥ緩衝液で実行すると、室温で２時間振盪した後、Ｔ２１ ＤＮＡのＬＮＰへのコンジュゲーションが確認された。Ｃｙ５．５で標識されたＴ２１－ＳＨ ＤＮＡ配列の１当量を、３．５ｍｏｌ％のＣ１４－ＰＥＧ（２０００）－マレイミドを含有する製剤に添加した。遊離Ｃｙ５．５ＤＮＡ（レーン１）よりも高いＭＷでのバンドの存在は、それらが脂質－ＰＥＧにコンジュゲートされたことを示した。 細胞アッセイにおけるＬＮＰ－ＳＮＡの活性を示す。（Ａ）Ｒａｗ２６４．７細胞株中で遊離ｄｓＤＮＡと混合したＢ－３３ＬＮＰ－ＳＮＡ、２’３’－ｃＧＡＭＰ、及びＢ－３３ＬＮＰ－ＳＮＡのＩＲＦ３誘導（赤いリボンは９５％Ｃ．Ｉ．を表し、ｎ＝３個の生物学的に独立した複製物）。（Ｂ）Ｂ－３５ＳＮＡは、封入されたｓｉＧＦＰ対照を有するＢ－３５製剤と比較して、Ｕ８７－ＭＧ－Ｌｕｃ２細胞株におけるＬｕｃ２発現をサイレント化する（２４時間、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ（商標）アッセイを使用して細胞生存率に正規化、ｎ＝３個の生物学的に独立した複製物）。（Ｃ）Ｂ－３５ＳＮＡは、その表面にＤＮＡがコンジュゲートされていない同等のＬＮＰ製剤と比較して、Ｌｕｃ２遺伝子サイレンシングを増強する（２４時間、未処理の細胞発光に正規化、片側スチューデントｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、ｎ＝３個の生物学的に独立した複製物）。 Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＬＮＰ－ＳＮＡを使用した主要な器官へのｍＲＮＡ送達を示す。ＬＮＰ－ＳＮＡは、同等のＬＮＰと比較して、肝臓ｍＲＮＡの発現を増強した。外側尾静脈を介して０．１ｍｇｋｇ－１のＬｕｃ ｍＲＮＡを投与した６時間後に、採取した臓器で発光を検出した。ＬＮＰ－ＳＮＡは、ｍＲＮＡ発現に関して臓器特異的な機能を示した。０．１ｍｇｋｇ－１のＬｕｃ ｍＲＮＡを投与した６時間後に、採取した臓器で発光を検出した。（片側スチューデントｔ検定、＊＝ｐ＜０．０５、各ドットは、処置あたり４～７個の生物学的に独立した複製物を有する、生物学的に独立した複製物を表す）。 ＬＮＰ－ＳＮＡ ｍＲＮＡ発現プロファイルが配列依存性であることを示す。（Ａ）処置による肝臓、肺、及び脾臓におけるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）ｍＲＮＡ。Ｌｕｃ ｍＲＮＡによる０．１ｍｇｋｇ－１でのＬＮＰ又はＬＮＰ－ＳＮＡのＢ－１９製剤の投与の６時間後に、採取した臓器で発光を検出した。（Ｂ）ＬＮＰ及びＴ－ＳＮＡは著しい肝臓ｍＲＮＡ発現を示すが、Ｇ－ＳＮＡはそうではない。（Ｃ）Ｇ－ＳＮＡは、ＬＮＰ及びＴ－ＳＮＡに匹敵するレベルで脾臓におけるｍＲＮＡ発現を示す。（Ｔ－ＳＮＡは、Ｔ２１－ＳＨ ＤＮＡで官能化されたＬＮＰであり、Ｇ－ＳＮＡは、（ＧＧＴ）７－ＳＨ ＤＮＡ配列で官能化されたＬＮＰであり、Ｎ＝４個の生物学的に独立した複製物である）。 実施例２に記載されているＣｒｅシステムの描写を提供する。 外側（ＧＧＴ）７ＤＮＡ配列で官能化されたＬＮＰ－ＳＮＡが、著しい肝臓ゲノム編集を引き起こさなかったことを示す。これは、０．３ｍｇｋｇ－１のＣｒｅ ｍＲＮＡの注射の２日後のＡｉ１４マウスの肝臓フローサイトメトリーデータによって示された。（Ａ）内皮細胞中のｔｄＴｏｍ陽性細胞の測定。（Ｂ）肝細胞中のｔｄＴｏｍ陽性細胞（Ｃ）肝臓Ｂ細胞中のｔｄＴｏｍ陽性細胞（Ｄ）Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞中のｔｄＴｏｍ陽性細胞。 ＧＧＴ配列で官能化されたＬＮＰ－ＳＮＡが、脾臓単球におけるＣｒｅ ｍＲＮＡによるゲノム編集を引き起こしたことを示す。図９は、０．３ｍｇｋｇ－１のＣｒｅ ｍＲＮＡの注射の２日後のＡｉ１４マウスの脾臓フローサイトメトリーデータを表示する。 （ＧＧＴ）７外側配列及びＤＯＰＥヘルパー脂質が、主要な脾臓細胞型へのＬＮＰ－ＳＮＡの増強された送達を可能にしたことを示す実験の結果を表示する。
疾患を治療するために、ＤＮＡ及びＲＮＡ治療薬を標的組織に送達し、副作用なしに持続的な利益を提供する必要がある。脂質ナノ粒子球状核酸は、ナノ粒子標的化及び組織特異性のためにＤＮＡ及びＲＮＡ配列を使用することによって、この満たされていない必要性に対処する。脂質ＳＮＡ構造は、脂質粒子（核酸を充填した）又は従来のＳＮＡ（リポソーム及びゴールドコア）の両方とは著しく異なる生体分布特性を有する。
本明細書で使用される場合、「標的化オリゴヌクレオチド」は、ＬＮＰ－ＳＮＡを特定の組織及び／又は特定の細胞型に向けるオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドはアプタマーである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したアプタマーを含み、アプタマーは、特定の細胞型の表面上の１つ以上の受容体に結合するように設計されている。いくつかの実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくはそれ以上であるか、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくはそれ以上である。更なる実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０未満である。更なる実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎは７である。いくつかの実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はオリゴヌクレオチド小分子コンジュゲートである。
本明細書で使用される場合、「免疫刺激性オリゴヌクレオチド」は、免疫応答を刺激（例えば、誘導又は増強）することができるオリゴヌクレオチドである。免疫刺激性オリゴヌクレオチドの典型的な例は、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及び二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。「ＣｐＧモチーフ」は、シトシン－グアニンジヌクレオチド配列である。一本鎖ＲＮＡ配列は、ｔｏｌｌ様受容体８及び９によって認識することができ、二本鎖ＲＮＡ配列は、ｔｏｌｌ様受容体３によって認識することができ、二本鎖ＤＮＡは、ｔｏｌｌ様受容体３及び環状ＧＭＰ－ＡＭＰ合成酵素（ｃＧＡＳ）によって認識することができる。
「阻害性オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、ｍＲＮＡをリボソーム内のタンパク質に翻訳することを妨げることによって、又は１つ以上の標的遺伝子若しくはｍＲＮＡに特異的に結合（ハイブリダイズ）し、それによって標的タンパク質の発現又は生物学的活性を低下させる、標的タンパク質のうちの１つ以上をコードする遺伝子又はｍＲＮＡのいずれかに十分に相補的である、タンパク質の産生又は発現を低下させるオリゴヌクレオチドを指す。阻害性オリゴヌクレオチドには、単離又は合成の短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ又はＤＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ、キメラアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ模倣物、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、先天性免疫受容体のＤＮＡ又はＲＮＡ阻害剤、アプタマー、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数の指示対象が含まれる。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合には交換可能である。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値又は範囲を変更するために使用される場合、一般に、記載された値又は範囲の２０パーセント以内、例えば、１０パーセント以内、５パーセント以内、４パーセント以内、３パーセント以内、２パーセント以内、又は１パーセント以内を意味する。
特に明記しない限り、本明細書で企図される全ての範囲は、端点及び端点間の全ての数の両方を含む。範囲に関連した「約」又は「約」の使用は、範囲の両端に適用される。したがって、「約２０～３０」は、少なくとも指定された端点を含む「約２０～約３０」をカバーすることを意図している。
脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）
脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）は、オリゴヌクレオチドで装飾された脂質ナノ粒子コアから構成される。脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含む。コア及びシェル特性の組み合わせのために、構築物は、例えば、限定されないが、核酸送達に関して、従来のリポソームＳＮＡ及びゴールドＳＮＡよりも利点を有する。オリゴヌクレオチドシェルのオリゴヌクレオチドは、様々な方向に配向され得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、半径方向外向きに配向される。オリゴヌクレオチドシェルは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合した１個以上のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドシェルの球状アーキテクチャは、トランスフェクション剤とは独立したほぼ全ての細胞への侵入、ヌクレアーゼ分解に対する耐性、配列に基づく機能、標的化、及び診断を含む、従来の核酸送達方法よりも独自の利点を与える。
いくつかの態様では、本開示は、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）を提供し、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含み、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも１０％は、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合する。様々な実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した標的化ペプチド、標的化抗体、又はそれらの組み合わせを含む。そのような標的化ペプチドは、例えば、限定されないが、標的細胞の表面マーカーに結合する抗体Ｆａｂ断片及び異なるｐＨ環境で荷電するように設計されたペプチドである。様々な実施形態では、１つ以上の遺伝子編集オリゴヌクレオチドは、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コア中に封入される。そのような遺伝子編集オリゴヌクレオチドは、例えば、限定されないが、遺伝子編集因子タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ遺伝子編集因子基質（例えば、ガイドＲＮＡ）、又はそれらの組み合わせである。
したがって、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、Ｃ１２－２００、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、同様の脂質／リピドイド構造、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又はそれらの組み合わせである。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、リン脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。更なる実施形態では、ステロールは、３β－ヒドロキシコレスト－５－エン（コレステロール）、９，１０－セココレスタ－５，７，１０（１９）－トリエン－３β－オール（ビタミンＤ３）、９，１０－セコエルゴスタ－５，７，１０（１９），２２－テトラエン－３β－オール（ビタミンＤ２）、カルシポトリオール、２４－エチル－５，２２－コレスタジエン－３β－オール（スチグマステロール）、２２，２３－ジヒドロスチグマステロール（β－シトステロール）、３，２８－ジヒドロキシ－ルペオール（ベツリン）、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、２４α－メチルコレステロール（カンペステロール）、２４－エチルコレスタ－５，２４（２８）Ｅ－ジエン－３β－オール（フコステロール）、２４－メチルコレスタ－５，２２－ジエン－３β－オール（ブラシカステロール）、２４－メチルコレスタ－５，７，２２－トリエン－３β－オール（エルゴステロール）、９，１１－デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は１つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、２０００ダルトン（Ｄａ）のポリエチレングリコールを含む。更なる実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、脂質－ＰＥＧ－マレイミドである。なお更なる実施形態では、脂質－ＰＥＧ－マレイミドは、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジパルミトリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、又はそれらの組み合わせである。
ＬＮＰ－ＳＮＡは、約１ナノメートル（ｎｍ）～約５００ｎｍ、約１ｎｍ～約４００ｎｍ、約１ｎｍ～約３００ｎｍ、約１ｎｍ～約２００ｎｍ、約１ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１ｎｍ～約１００ｎｍ、約１ｎｍ～約９０ｎｍ、約１ｎｍ～約８０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約７０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約６０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約５０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約４０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約３０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約２０ｎｍの直径、約１ｎｍ～約１０ｎｍ、約１０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１４０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１３０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１２０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１１０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約１００ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約９０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約８０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約７０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約６０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約５０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約４０ｎｍの直径、約１０ｎｍ～約３０ｎｍの直径、又は約１０ｎｍ～約２０ｎｍの直径のサイズの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、若しくは１０ｎｍの直径であるか、少なくとも１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、若しくは１０ｎｍの直径であるか、又は約１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、若しくは１０ｎｍ未満の直径である（又は複数のＬＮＰ－ＳＮＡが存在する場合、平均直径である）。いくつかの実施形態では、複数のＬＮＰ－ＳＮＡのサイズは、約１０ｎｍ～約１５０ｎｍ（平均直径）、約１０ｎｍ～約１４０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約１３０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約１２０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約１１０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約１００ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約８０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約７０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約６０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約５０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約４０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約３０ｎｍの平均直径、約１０ｎｍ～約２０ｎｍの平均直径、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径、約４０ｎｍ～約１００ｎｍの平均直径、約４０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径、約４０ｎｍ～約８０ｎｍの平均直径、約５０ｎｍ～約２００ｎｍの平均直径、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの平均直径、約５０ｎｍ～約１００ｎｍの平均直径、約５０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径、又は約５０ｎｍ～約８０ｎｍの平均直径である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの直径（又は複数のＬＮＰ－ＳＮＡの平均直径）は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０～約２００ｎｍ、又は約４０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、方法で使用されるナノ粒子のサイズは、それらの特定の使用又は用途によって必要に応じて変化する。サイズの変動は、有利には、ＬＮＰ－ＳＮＡの特定の物理的特性、例えば、本明細書に記載されるように、オリゴヌクレオチドが結合し得る表面積の量を最適化するために使用される。ＬＮＰ－ＳＮＡの前述の直径は、脂質ナノ粒子コア自体の直径、又は脂質ナノ粒子コア及びそれに結合するオリゴヌクレオチドのシェルの直径に適用することができることが理解されるであろう。
オリゴヌクレオチド
本開示は、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）を提供する。本明細書に記載されるように、脂質ナノ粒子コアは、封入されたオリゴヌクレオチドを含む。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくはそれ以上であるか、又は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくはそれ以上である。更なる実施形態では、標的化オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０未満である。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎは７である。様々な実施形態では、（ＧＧＴ）ｎ配列は、オリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端にある。様々な実施形態では、（ＧＧＴ）ｎ配列は、ナノ粒子コアの近位又は遠位にある。様々な実施形態では、（ＧＧＴ）ｎ配列は、ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドの末端にあり、（ＧＧＴ）ｎ配列は、ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドの末端にあるか、又はその両方である。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドには、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、それらの修飾形態、又はそれらの組み合わせが含まれる。本明細書に記載の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖である。本開示の任意の態様又は実施形態では、オリゴヌクレオチドは、検出可能なマーカーを含む。
本明細書に記載されるように、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間結合を有するものを含む、オリゴヌクレオチドの修飾形態もまた、本開示によって企図される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全て又は部分的にペプチド核酸である。他の修飾ヌクレオシド間結合は、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。更に他の修飾オリゴヌクレオチドとしては、１つ以上のユニバーサル塩基を含むものが挙げられる。「ユニバーサル塩基」とは、著しい構造不安定化を伴わずに水素結合を形成することによって、核酸中のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵのうちのいずれか１つへの結合を置き換えることができる分子を指す。ユニバーサル塩基類似体と組み込まれたオリゴヌクレオチドは、例えば、ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして機能することができる。ユニバーサル塩基の例には、５’－ニトロインドール－２’－デオキシリボシド、３－ニトロピロール、イノシン、及びヒポキサンチンが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。本明細書で使用される「核酸塩基」という用語又はその複数形は、本明細書で論じられ、それ以外は当技術分野で知られている変形形態と交換可能である。ヌクレオチド又は核酸塩基は、天然に存在する核酸塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、及びＵを含む。天然に存在しない核酸塩基には、例えば、限定するものではないが、キサンチン、ジアミノプリン、８－オキソ－Ｎ６－メチルアデニン、７－デアザキサンチン、７－デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４－エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’－エタノ－２，６－ジアミノプリン、５－メチルシトシン（ｍＣ）、５－（Ｃ３～Ｃ６）－アルキニル－シトシン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２－ヒドロキシ－５－メチル－４－トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、並びにＢｅｎｎｅｒら、米国特許第５，４３２，２７２号及びにＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２５：ｐｐ ４４２９－４４４３に記載の「天然に存在しない」核酸塩基が挙げられる。「核酸塩基」という用語には、既知のプリン及びピリミジン複素環だけでなく、その複素環類似体及び互変異性体も含まれる。更に、天然に存在する及び天然に存在しない核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）、Ｓａｎｇｈｖｉによる、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３の１５章、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３－７２２（特に、６２２及び６２３頁を参照されたい）、並びにｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊ．Ｉ．Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｃｏｏｋ，Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ １９９１，６，５８５－６０７に開示されているものが挙げられ、これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、最も古典的な意味でのヌクレオシド塩基ではないが、ヌクレオシド塩基として機能する、ある特定の「ユニバーサル塩基」を含む核酸塩基のように機能し得る複素環式化合物などの化合物を含む天然に存在しないヌクレオチドのカテゴリーである１つ以上の「ヌクレオシド塩基」又は「塩基単位」も含む。ユニバーサル塩基には、３－ニトロピロール、任意選択で置換されたインドール（例えば、５－ニトロインドール）、及び任意選択で置換されたヒポキサンチンが含まれる。他の望ましいユニバーサル塩基には、当該技術分野において既知のユニバーサル塩基を含む、ピロール、ジアゾール、又はトリアゾール誘導体が挙げられる。
オリゴヌクレオチドの例には、修飾された骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含有するものが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格にリン原子を有するもの及び骨格にリン原子を有さないものが含まれる。ヌクレオシド間骨格にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味の範囲内であるとみなされる。
リン原子を含む修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び正常な３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、並びに１つ以上のヌクレオチド間結合が３’－３’、５’－５’又は２’－２’結合である逆向きの極性を有するものが挙げられる。最も３’側のヌクレオチド間結合にあるただ１つの３’－３’結合を含む、すなわち、塩基がない（ヌクレオチドがない、若しくはその場所に水酸基を有する）場合があるただ１つの逆向きのヌクレオシド残基を有するオリゴヌクレオチドも企図される。塩、混合塩、及び遊離酸形態も企図される。上記のリン含有結合の調製を教示する代表的な米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号及び同第５，６２５，０５０号が挙げられ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、ヘテロ原子とアルキル若しくはシクロアルキルとが混合されたヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖のヘテロ原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルフォキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びメチレンチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファミン酸骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；並びにＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分が混在するその他の骨格がある。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号及び同第５，６７７，４３９号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
なお更なる実施形態では、１つ以上の糖及び／又はヌクレオチド単位の１つ以上のヌクレオチド間結合の両方が「天然に存在しない」基で置き換えられている、オリゴヌクレオチド模倣物がある。オリゴヌクレオチドの塩基は、ハイブリダイゼーションのために維持される。いくつかの態様では、この実施形態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を企図する。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格で置き換えられる。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号、並びにＮｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
なお更なる実施形態では、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオシドが提供され、米国特許第５，４８９，６７７号及び同第５，６０２，２４０号に記載の－ＣＨ２－ＮＨ－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－、－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－及び－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ２－ＣＨ２－を含む。米国特許第５，０３４，５０６号に記載されるモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも企図される。
様々な形態では、オリゴヌクレオチド中の２つの連続するモノマー間の結合は、－ＣＨ２－、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＲＨ－、＞Ｃ＝Ｏ、＞Ｃ＝ＮＲＨ、＞Ｃ＝Ｓ、－Ｓｉ（Ｒ”）２－、－ＳＯ－、－Ｓ（Ｏ）２－、－Ｐ（Ｏ）２－、－ＰＯ（ＢＨ３）－、－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－、－Ｐ（Ｓ）２－、－ＰＯ（Ｒ”）－、－ＰＯ（ＯＣＨ３）－、及び－ＰＯ（ＮＨＲＨ）から選択される２～４個の、望ましくは３個の基／原子からなり、式中、ＲＨは、水素及びＣ１～４－アルキルから選択され、Ｒ”は、Ｃ１～６－アルキル及びフェニルから選択される。そのような結合の例示的な例は、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨＯＨ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ５を含む）、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－、－ＮＲＨ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲＨ－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－ＣＨ２－－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－Ｏ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＳ－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－Ｃ（＝ＮＲＨ）－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－ＣＨ２－ＮＲＨ－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－、－Ｏ－ＣＯ－ＣＨ２－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－Ｏ－、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲＨ－、－Ｏ－ＣＯ－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－ＣＯ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲＨ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＲＨ－、－ＣＨ＝Ｎ－Ｏ－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－Ｏ－、－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ５を含む）、－ＣＨ２－Ｏ－ＮＲＨ－、－ＣＯ－ＮＲＨ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－Ｏ－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－ＣＯ－、－Ｏ－ＮＲＨ－ＣＨ２－、－Ｏ－ＮＲＨ、－Ｏ－ＣＨ２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ２－Ｏ－、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ＝（後続のモノマーへの結合として使用される場合Ｒ５を含む）、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－、－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＳＯ－ＣＨ２－、－ＣＨ２－ＳＯ２－ＣＨ２－、－Ｏ－ＳＯ－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ２－、－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－ＮＲＨ－、－ＮＲＨ－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ２－；－Ｏ－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ２－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）２－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）２－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ，Ｓ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）２－Ｓ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ”）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＯＣＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｏ ＣＨ２ＣＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｏ ＣＨ２ＣＨ２Ｓ－Ｒ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＢＨ３）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲＮ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－ＮＲＨ Ｈ－、－ＮＲＨ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ、ＮＲＨ）－Ｏ－、－ＣＨ２－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－ＣＨ２－、及び－Ｏ－Ｓｉ（Ｒ”）２－Ｏ－であり、これらの中でとりわけ、－ＣＨ２－ＣＯ－ＮＲＨ－、－ＣＨ２－ＮＲＨ－Ｏ－、－Ｓ－ＣＨ２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－Ｏ－Ｐ（－Ｏ，Ｓ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）２－Ｏ－、－ＮＲＨ Ｐ（Ｏ）２－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ、ＮＲＨ）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（Ｒ”）－Ｏ－、－Ｏ－ＰＯ（ＣＨ３）－Ｏ－、及び－Ｏ－ＰＯ（ＮＨＲＮ）－Ｏ－（式中、ＲＨは、水素及びＣ１～４－アルキルから選択され、 Ｒ”は、Ｃ１～６－アルキル及びフェニルから選択される）が企図される。更なる例示は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９５，５，３４３－３５５及びＳｕｓａｎ Ｍ．Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｌ－Ｈｅｉｎｚ Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，ｖｏｌ ２５，ｐｐ ４４２９－４４４３に提供されている。
オリゴヌクレオチドの更に他の修飾形態は、米国特許出願第２００４／０２１９５６５号に詳細に記載されており、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
修飾オリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の置換糖部分を含んでもよい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、以下のうちの１つを２’位に含み：ＯＨ；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、若しくはＮ－アルキニル；又はＯ－アルキル－Ｏ－アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１～Ｃ１０アルキル又はＣ２～Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。他の実施形態には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が含まれ、式中、ｎ及びｍは、１～約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリル又はＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又はＲＮＡ切断基。一態様では、修飾には、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）又は２’－ＭＯＥとしても知られる、２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基が挙げられる。他の修飾には、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られるＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’－Ｏ－ジメチル－アミノ－エトキシ－エチル又は２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）２が挙げられる。
更に他の修飾には、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－アリル（２’－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｏ－アリル（２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。２’修飾は、アラビノ（上）位又はリボ（下）位にあってもよい。一態様では、２’－アラビノ修飾は２’－Ｆである。同様の修飾はまた、オリゴヌクレオチドの他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位、又は２’－５’結合オリゴヌクレオチド中、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣物を有していてもよい。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、同第５，１１８，８００号、同第５，３１９，０８０号、同第５，３５９，０４４号、同第５，３９３，８７８号、同第５，４４６，１３７号、同第５，４６６，７８６号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５１９，１３４号、同第５，５６７，８１１号、同第５，５７６，４２７号、同第５，５９１，７２２号、同第５，５９７，９０９号、同第５，６１０，３００号、同第５，６２７，０５３号、同第５，６３９，８７３号、同第５，６４６，２６５号、同第５，６５８，８７３号、同第５，６７０，６３３号、同第５，７９２，７４７号、及び同第５，７００，９２０号を参照されたく、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの態様では、糖の修飾には、２’－ヒドロキシル基が糖環の３’又は４’炭素原子に結合し、それにより、二環式糖部分を形成する、ロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。特定の態様では、結合は、２’酸素原子と４’炭素原子とを架橋するメチレン（－ＣＨ２－）ｎであり、式中、ｎは１又は２である。ＬＮＡ及びその調製は、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記載されている。
修飾ヌクレオチドは、ＥＰ１０７２６７９及びＷＯ９７／１２８９６に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。修飾核酸塩基には、５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、６－メチル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－プロピル並びにアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミン、及び２－チオシトシン、５－ハロウラシル及びシトシン、５－プロピニルウラシル及びシトシン、並びにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６－アゾウラシル、シトシン及びチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシル並びに他の８－置換アデニン及びグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチル並びに他の５－置換ウラシル及びシトシン、７－メチルグアニン及び７－メチルアデニン、２－Ｆ－アデニン、２－アミノ－アデニン、８－アザグアニン及び８－アザアデニン、７－デアザグアニン及び７－デアザアデニン、並びに３－デアザグアニン及び３－デアザアデニンが挙げられるが、これらに限定されない。更なる修飾塩基には、三環系のピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾキサジン－２（３Ｈ）－オン）のようなＧ－クランプ（Ｇ－ｃｌａｍｐ）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）が挙げられる。修飾塩基には、プリン又はピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７－デアザ－アデニン、７－デアザグアノシン、２－アミノピリジン、及び２－ピリドンで置き換えられたものも含まれ得る。追加の核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，３０：６１３に開示されているもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものが挙げられる。これらの塩基のいくつかは、結合親和性を高めるのに有用であり、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジン、並びにＮ－２、Ｎ－６、及びＯ－６置換プリンを含み、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシル、及び５－プロピニルシトシンが含まれる。５－メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６～１．２℃上昇させることが示されており、特定の態様では、２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わされる。米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、同第５，１３０，３０２号、同第５，１３４，０６６号、同第５，１７５，２７３号、同第５，３６７，０６６号、同第５，４３２，２７２号、同第５，４５７，１８７号、同第５，４５９，２５５号、同第５，４８４，９０８号、同第５，５０２，１７７号、同第５，５２５，７１１号、同第５，５５２，５４０号、同第５，５８７，４６９号、同第５，５９４，１２１号、同第５，５９６，０９１号、同第５，６１４，６１７号、同第５，６４５，９８５号、同第５，８３０，６５３号、同第５，７６３，５８８号、同第６，００５，０９６号、同第５，７５０，６９２号及び同第５，６８１，９４１号を参照されたく、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
所定の配列のポリヌクレオチドを作製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．１９８９）及びＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，１ｓｔ Ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１）を参照されたい。固相合成法は、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドの両方に適している（ＤＮＡ合成の周知の方法は、ＲＮＡ合成にも有用である）。ポリリボヌクレオチドは酵素的に調製することもできる。天然に存在しない核酸塩基もポリヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、米国特許第７，２２３，８３３号、Ｋａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７４：２２３８（１９５１）、Ｙａｍａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８３：２５９９（１９６１）、Ｋｏｓｔｕｒｋｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３９４９（１９７４）、Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７６：６０３２（１９５４）、Ｚｈａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：７４－７５（２００５）、及びＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１３６８４－１３６８５（２００２）を参照されたい。
様々な態様では、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチド又は封入されたオリゴヌクレオチド）、又はその修飾形態は、一般に、約１０ヌクレオチド長～約１００ヌクレオチド長である。より具体的には、本開示のオリゴヌクレオチドは、約５～約９０ヌクレオチド長、約５～約８０ヌクレオチド長、約５～約７０ヌクレオチド長、約５～約６０ヌクレオチド長、約５～約５０ヌクレオチド長約５～約４５ヌクレオチド長、約５～約４０ヌクレオチド長、約５～約３５ヌクレオチド長、約５～約３０ヌクレオチド長、約５～約２５ヌクレオチド長、約５～約２０ヌクレオチド長、約５～約１５ヌクレオチド長、約５～約１０ヌクレオチド長、約１０～約９０ヌクレオチド長、約１０～約８０ヌクレオチド長、約１０～約７０ヌクレオチド長、約１０～約６０ヌクレオチド長、約１０～約５０ヌクレオチド長約１０～約４５ヌクレオチド長、約１０～約４０ヌクレオチド長、約１０～約３５ヌクレオチド長、約１０～約３０ヌクレオチド長、約１０～約２５ヌクレオチド長、約１０～約２０ヌクレオチド長、約１０～約１５ヌクレオチド長、約１８～約２８ヌクレオチド長、約１５～約２６ヌクレオチド長、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に、具体的に開示されたサイズの全てのオリゴヌクレオチド中間体長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチド（例えば、封入されたオリゴヌクレオチド）は、約５ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、約５～約４０００ヌクレオチド長、約５～約３５００ヌクレオチド長、約５～約３０００ヌクレオチド長、約５～約２５００ヌクレオチド長、約５～約２０００ヌクレオチド長、約５～約１５００ヌクレオチド長、約５～約１０００ヌクレオチド長、約５～約９００ヌクレオチド長、約５～約８００ヌクレオチド長、約５～約７００ヌクレオチド長、約５～約６００ヌクレオチド長、約５～約５００ヌクレオチド長約５～約４５０ヌクレオチド長、約５～約４００ヌクレオチド長、約５～約３５０ヌクレオチド長、約５～約３００ヌクレオチド長、約５～約２５０ヌクレオチド長、約５～約２００ヌクレオチド長、約５～約１５０ヌクレオチド長、約５～約１００ヌクレオチド長、約５～約９０ヌクレオチド長、約５～約８０ヌクレオチド長、約５～約７０ヌクレオチド長、約５～約６０ヌクレオチド長、約５～約５０ヌクレオチド長、約５～約４０ヌクレオチド長、約５～約３０ヌクレオチド長、約５～約２０ヌクレオチド長、約５～約１０ヌクレオチド長、及びオリゴヌクレオチドが所望の結果を達成できる程度に、具体的に開示されたサイズの全てのオリゴヌクレオチド中間体長である。したがって、様々な実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１５００、１７００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、若しくはそれ以上、又は少なくともそれらのヌクレオチド長である。更なる実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、又はそれ以上未満のヌクレオチド長である。様々な実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、全てが同じ長さ／配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを含み、いくつかの実施形態では、複数のオリゴヌクレオチドは、複数の中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドに対して異なる長さ及び／又は配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、全てが同じ長さ／配列を有するその中に封入された複数のオリゴヌクレオチドを含むが、一方いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、複数の中の少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドに対して異なる長さ及び／又は配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。例えば、限定されないが、いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コアは、遺伝子編集のためにその中に封入された基質ガイドＲＮＡと組み合わせた遺伝子編集エンドヌクレアーゼ（例えば、ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチド及び／又は脂質ナノ粒子に封入されたオリゴヌクレオチド）は、アプタマーである。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドの全ての特徴及び態様（例えば、長さ、タイプ（ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの修飾形態）、スペーサーの任意の存在）は、アプタマーにも適用される。アプタマーは、目的の様々な標的分析物に結合するように進化させることができるオリゴヌクレオチド配列である。アプタマーは、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖であってもよい。
本明細書に記載の検出可能なマーカー（例えば、フルオロフォア、放射性標識）及び治療剤（例えば、抗体）をオリゴヌクレオチドに結合させる方法は、当技術分野において既知である。
様々な態様では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、複数の標的（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質）に結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、本明細書に記載の阻害性オリゴヌクレオチドである１つ以上のオリゴヌクレオチドを更に含む。そのような阻害性オリゴヌクレオチドは、様々な実施形態では、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に存在するか、脂質ナノ粒子コアに封入されているか、又はその両方である。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、使用される条件下でハイブリダイズするために標的ポリヌクレオチドに十分に相補的な配列を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、同一ではない２つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、すなわち、オリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、異なる長さ及び／又は異なる配列を有するという点で、少なくとも１つの他のオリゴヌクレオチドとは異なる。例えば、特定のポリヌクレオチドが標的化されている場合、単一のＬＮＰ－ＳＮＡは、同じ標的の複数のコピーに結合する能力を有する。いくつかの実施形態では、単一のＬＮＰ－ＳＮＡは、異なる標的に結合する能力を有する。したがって、様々な態様では、単一のＬＮＰ－ＳＮＡを、２つ以上の遺伝子産物の発現を阻害する方法で使用してもよい。様々な実施形態では、したがって、オリゴヌクレオチドを使用して、標的ポリヌクレオチドの１つ以上の特異的領域であるかどうかにかかわらず、又は必要に応じて標的ポリヌクレオチドの全長にわたって、特定のポリヌクレオチドを標的にして、遺伝子発現の所望のレベルの阻害をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、本明細書に記載の免疫刺激性オリゴヌクレオチドである１つ以上のオリゴヌクレオチドを更に含む。そのような免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、様々な実施形態では、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に存在するか、脂質ナノ粒子コアに封入されているか、又はその両方である。したがって、本開示の様々な態様及び実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、免疫刺激活性、遺伝子発現活性の阻害、又はその両方を有する。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチドである。様々な実施形態では、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチドは、クラスＡのＣｐＧオリゴヌクレオチド、クラスＢのＣｐＧオリゴヌクレオチド、又はクラスＣのＣｐＧオリゴヌクレオチドである。様々な実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、標的化オリゴヌクレオチド、又はそれらの混合物を含む。
脂質ナノ粒子表面／封入密度。ナノ粒子を安定させるのに十分な表面密度、及びナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの所望の組み合わせに対してそれを得るのに必要な条件は、経験的に決定することができる。一般に、本開示のオリゴヌクレオチドは、少なくとも約２ピコモル／ｃｍ２の表面密度で脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの態様では、表面密度は約１５ピコモル／ｃｍ２又は少なくとも約１５ピコモル／ｃｍ２である。オリゴヌクレオチドが、少なくとも２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも６ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも７ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも８ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１９ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１７５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約２５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約３５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約４５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約５５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約６５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約７５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約８５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９００ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約９５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも約１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上の表面密度で脂質ナノ粒子コアの外部に結合する方法も提供される。あるいは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドの密度を、ＬＮＰ－ＳＮＡに結合したオリゴヌクレオチドの数によって測定する。ＬＮＰ－ＳＮＡに結合したオリゴヌクレオチドの表面密度に関して、本明細書に記載のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した約１～約２，５００個、又は約１～約１，０００個、又は約１～約５００個のオリゴヌクレオチドを含むことが企図される。様々な実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、約１０～約５００個、又は約１０～約４５０個、又は約１０～約４００個、又は約１０～約３００個、又は約１０～約２００個、又は約１０～約１９０個、又は約１０～約１８０個、又は約１０～約１７０個、又は約１０～約１６０個、又は約１０～約１５０個、又は約１０～約１４０個、又は約１０～約１３０個、又は約１０～約１２０個、又は約１０～約１１０個、又は約１０～約１００個、又は１０～約９０個、又は約１０～約８０個、又は約１０～約７０個、又は約１０～約６０個、又は約１０～約５０個、又は約１０～約４０個、又は約１０～約３０個、又は約１０～約２０個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、約８０～約５００個、又は約８０～約４００個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、少なくとも約５、１０、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内に、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１２７、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００個のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。なお更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００個、又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、約４００個のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアに結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、約又は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００個、若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。様々な実施形態では、約２～約１０００個、又は約２～約５００個のオリゴヌクレオチド、又は約１００～約１０００個のオリゴヌクレオチド、又は約５０～約１０００個のオリゴヌクレオチド、又は約１００～約５００個のオリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合している。更なる実施形態では、約１０～約１０００個、又は約１０～約７５０個、又は約１０～約５００個、又は約１０～約４００個、又は約１０～約２５０個、又は約１０～約１００個、又は約５０～約１０００個、又は約５０～約７５０個、又は約５０～約５００個、又は約５０～約２５０個、又は約１００～約１０００個、又は約１００～約５００個、又は約２～約９０個、又は約２～約８０個、又は約２～約７０個、又は約２～約６０個、又は約２～約５０個、又は約２～約４０個、又は約２～約３０個、又は約２～約２０個、又は約２～約１０個、又は約１０～約１００個、又は約１０～約９０個、又は約１０～約８０個、又は約１０～約７０個、又は約１０～約６０個、又は約１０～約５０個、又は約１０～約４０個、又は約１０～約３０個、又は約１０～約２０個、又は約２０～約１００個、又は約２０～約９０個、又は約２０～約８０個、又は約２０～約７０個、又は約２０～約６０個、又は約２０～約５０個、又は約２０～約４０個、又は約２０～約３０個のオリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子コアの外側表面に結合している。なお更なる実施形態では、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個のオリゴヌクレオチドが、脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。脂質ナノ粒子コアに封入されたオリゴヌクレオチドの密度に関して、本明細書に記載されるＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアに封入された約１～約２５０個、約１～約２２０個、約１～約２００個、約１～約１５０個、約１～約１２０個、約１～約１００個、約１～約９０個、約１～約８０個、約１～約７０個、約１～約６０個、約１～約５０個、約１～約４０個、約１～約３０個、約１～約２０個、約１～約１０個、又は約１～約５個のオリゴヌクレオチドを含むことが企図される。更なる実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアに封入された約１０～約２５０個、約１０～約２２０個、約１０～約２００個、約１０～約１５０個、約１０～約１２０個、約１０～約１００個、約１０～約９０個、約１０～約８０個、約１０～約７０個、約１０～約６０個、約１０～約５０個、約１０～約４０個、約１０～約３０個、又は約１０～約２０個のオリゴヌクレオチドを含む。更なる実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアに封入された約又は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２０、１５０、１７０、２００、２２０、２５０個若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる。更なる実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアに封入された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１２０、１５０、１７０、２００、２２０、又は２５０個未満のオリゴヌクレオチドを含む。
スペーサー。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、スペーサーを介して（いくつかの実施形態では、更にリンカーを介して）脂質ナノ粒子コアに結合している。本明細書で使用される「スペーサー」は、ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの間の距離を増加させる、又は複数のコピーでナノ粒子に結合したときに個々のオリゴヌクレオチド間の距離を増加させる役割を果たす部分を意味する。したがって、オリゴヌクレオチドが同じ配列を有するか、又は異なる配列を有するかにかかわらず、スペーサーが、タンデムで個々のオリゴヌクレオチド間に位置することが企図される。
いくつかの態様では、スペーサーは、存在する場合、有機部分である。いくつかの態様では、スペーサーは、水溶性ポリマー、核酸、ポリペプチド、オリゴ糖、炭水化物、脂質、エチルグリコール、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されないポリマーである。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、スペーサーは、オリゴ（エチレングリコール）ベースのスペーサーである。様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、又はそれ以上のスペーサー（例えば、スペーサー－１８（ヘキサエチレングリコール））部分を含む。更なる実施形態では、スペーサーはアルカン系スペーサー（例えば、Ｃ１２）である。いくつかの実施形態では、スペーサーはオリゴヌクレオチドスペーサー（例えば、Ｔ５）である。オリゴヌクレオチドスペーサーは、オリゴヌクレオチドが意図する機能を果たす（例えば、免疫応答を刺激する、又は遺伝子発現を阻害する）能力を妨げない任意の配列を有し得る。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドスペーサーの塩基は、全てのアデニル酸、全てのチミジル酸、全てのシチジル酸、全てのグアニル酸、全てのウリジル酸、又は全ての他のいくつかの修飾塩基である。
様々な実施形態では、スペーサーの長さは、少なくとも約２ヌクレオチド、少なくとも約３ヌクレオチド、少なくとも約４ヌクレオチド、少なくとも約５ヌクレオチド、５～１０ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、１０～３０ヌクレオチド、若しくは更には３０ヌクレオチド超であるか、又はそれらに等しい。
脂質ナノ粒子コアへのオリゴヌクレオチドの結合。本開示による使用が企図されるオリゴヌクレオチドには、任意の手段（例えば、共有結合又は非共有結合）を通してナノ粒子コアに結合したものが含まれる。本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートへの共有結合を介して、脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの１０％又は少なくとも１０％は、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％は、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％は、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。なお更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％未満は、脂質ＰＥＧ－コンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドシェル内の１つ以上のオリゴヌクレオチドは、脂質アンカー基を介して脂質ナノ粒子コアの外部に結合している。脂質アンカー基は、様々な実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端に結合している。様々な実施形態では、脂質アンカー基は、コレステロール又はトコフェロールである。
オリゴヌクレオチドが脂質ナノ粒子コアに結合する手段に関係なく、様々な態様での結合は、５’結合、３’結合、ある種の内部結合、又はこれらの結合の任意の組み合わせを通して行われる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に共有結合している。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に非共有結合している。更なる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、共有結合及び非共有結合の組み合わせを介してナノ粒子に結合している。
結合の方法は、当業者に既知であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開第２００９／０２０９６２９号に記載されている。ＲＮＡをナノ粒子に結合させる方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００９／６５８２２に一般的に記載されている。オリゴヌクレオチドをリポソーム粒子と会合させる方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０３１０４２５号に記載されている。
ＬＮＰ－ＳＮＡの合成
本明細書に記載されるように、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、概して、封入されたオリゴヌクレオチドを含む脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルと、を含み、オリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの少なくとも１０％が、脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して脂質ナノ粒子コアの外部に共有結合している。したがって、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、オリゴヌクレオチドが脂質ナノ粒子コアに封入され、オリゴヌクレオチドのシェルが脂質ナノ粒子コアの外部に結合するように合成される。ＬＮＰ－ＳＮＡの合成は、本明細書（例えば、実施例１）に詳細に記載されており、概して図１に示されている。
一般に、かつ一例として、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、脂質及びステロールをエタノール中で希釈することによって製剤化されてもよい。封入される核酸は、低ｐＨ（例えば、ｐＨ４．０）緩衝液中に別々に溶解される。イオン化可能な脂質対封入された核酸の質量比は、所望の範囲内（例えば、２０：１～５：１）に維持される。脂質ナノ粒子コアを形成するために、低ｐＨ緩衝液中の核酸を所望の体積比（例えば、３：１）でエタノール溶液と急速に混合する。このプロセスでは、低ｐＨ緩衝液は、イオン化可能な脂質を正に帯電させ、負に帯電したオリゴヌクレオチドの封入を促進する。混合後、ナノ粒子を１×ＰＢＳに対して透析して、エタノール及び残留緩衝液を除去する。最後に、ＬＮＰからＬＮＰ－ＳＮＡを形成するために、１つ以上のオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドと、コンジュゲーション部位を含む脂質－ＰＥＧコンジュゲートとの所望の比率（例えば、１：１）でＬＮＰとを混合することによって、脂質ナノ粒子コアの外部に結合させる。
本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、脂質ナノ粒子コアの構成成分は、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、封入されたオリゴヌクレオチド、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含む。様々な量の各構成成分を使用して、脂質ナノ粒子コアを生成することができる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約５０％であるイオン化可能な脂質のモル分率を含む。いくつかの実施形態では、イオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の１％～２５％、若しくは２％～５％、若しくは５％～２０％、若しくは１０％～２５％、若しくは１０％～２０％であるか、又は約１％～約２５％、若しくは約２％～約５％、若しくは約５％～約２０％、若しくは約１０％～約２５％、若しくは約１０％～約２０％であるリン脂質のモル分率を含む。更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、若しくは２５％であるか、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、若しくは２５％であるか、又は約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、若しくは２５％未満である、リン脂質のモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の３．５％であるか、又は約３．５％であるリン脂質のモル分率を含む。様々な実施形態では、リン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リン脂質は、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。いくつかの実施形態では、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約２０％～約５０％、又は約２５％～約４５％、又は約２０％～約３５％、又は約２０％～約３０％、又は約２５％～約３５％であるステロールのモル分率を含む。更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、若しくは５０％であるか、少なくとも約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、若しくは５０％であるか、又は約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、若しくは５０％未満である、ステロールのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、４５％であるか、又は少なくとも約４５％であるか、又は約４５％未満であるステロールモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ステロールはコレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の４５％であるか、又は約４５％であるコレステロールのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、２０００ダルトン（Ｄａ）のポリエチレングリコールを含む。更なる実施形態では、脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートは、脂質－ＰＥＧ－マレイミドである。なお更なる実施形態では、脂質－ＰＥＧ－マレイミドは、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジパルミトリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約１％～約５％、又は約１％～約４％、又は約１．５％～約５％、又は約１．５％～約４％、又は約１％～約３．５％、又は約１．５％～約３％、又は約１％～約２％、又は約１％～約２．５％である脂質－ＰＥＧコンジュゲートのモル分率を含む。更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、若しくは５％であるか、少なくとも約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、若しくは５％であるか、又は約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、若しくは５％未満である、脂質－ＰＥＧコンジュゲートのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアは、１．５％であるか、少なくとも約１．５％であるか、又は約１．５％未満である脂質－ＰＥＧコンジュゲートのモル分率を含む。いくつかの実施形態では、脂質－ＰＥＧコンジュゲートは、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡ中のイオン化可能な脂質と封入されたオリゴヌクレオチドとの間の質量比は、約５：１である。更なる実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡ中のイオン化可能な脂質と封入されたオリゴヌクレオチドとの質量比は、約２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、又は１：１である。
遺伝子調節／療法におけるＬＮＰ－ＳＮＡの使用
本開示の態様又は実施形態のいずれかでは、本明細書に開示されるＬＮＰ－ＳＮＡは、遺伝子発現を調節する能力を有することが企図される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、脂質ナノ粒子コアと、脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルとを含み、オリゴヌクレオチドのシェルは、遺伝子調節活性（例えば、標的遺伝子発現の阻害又は標的細胞認識）を有する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、本明細書に記載の阻害性オリゴヌクレオチドである１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアに封入され、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェルは、阻害性オリゴヌクレオチドである１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子産物の発現を阻害する方法を提供し、そのような方法は、標的遺伝子産物の発現が、ＬＮＰ－ＳＮＡの不在下での遺伝子産物の発現と比較して、約５％若しくは少なくとも約５％、約１０％若しくは少なくとも約１０％、約１５％若しくは少なくとも約１５％、約２０％若しくは少なくとも約２０％、約２５％若しくは少なくとも約２５％、約３０％若しくは少なくとも約３０％、約３５％若しくは少なくとも約３５％、約４０％若しくは少なくとも約４０％、約４５％若しくは少なくとも約４５％、約５０％若しくは少なくとも約５０％、約５５％若しくは少なくとも約５５％、約６０％若しくは少なくとも約６０％、約６５％若しくは少なくとも約６５％、約７０％若しくは少なくとも約７０％、約７５％若しくは少なくとも約７５％、約８０％若しくは少なくとも約８０％、約８５％若しくは少なくとも約８５％、約９０％若しくは少なくとも約９０％、約９５％若しくは少なくとも約９５％、約９６％若しくは少なくとも約９６％、約９７％若しくは少なくとも約９７％、約９８％若しくは少なくとも約９８％、約９９％若しくは少なくとも約９９％、又は１００％阻害される方法を含む。言い換えれば、提供される方法は、本質的に標的遺伝子産物の発現のあらゆる程度の阻害をもたらすものを包含する。
阻害の程度は、体液試料若しくは生検試料から、又は当技術分野において周知の画像化技術により、インビボで決定される。あるいは、阻害の程度は、一般に、特定のタイプのＬＮＰ－ＳＮＡ及び特定のオリゴヌクレオチドの使用から生じるインビボで予想され得る阻害の程度の予測可能な尺度として、細胞培養アッセイにおいて決定される。
したがって、遺伝子調節療法において本開示のＬＮＰ－ＳＮＡを利用する方法が提供される。この方法は、遺伝子産物をコードする標的ポリヌクレオチドを、標的ポリヌクレオチドの全部又は一部に相補的なＬＮＰ－ＳＮＡの１つ以上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップを含み、標的ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズは、遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性で標的ポリヌクレオチドの長さにわたって生じる。遺伝子発現の阻害は、インビボ又はインビトロで生じ得る。
様々な実施形態では、本開示の方法で利用される阻害性オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらの修飾形態である。様々な実施形態では、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである。
免疫調節におけるＬＮＰ－ＳＮＡの使用
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、センチネル細胞で発現されるタンパク質のクラスであり、自然免疫系の調節に重要な役割を果たす。哺乳類の免疫系は、感染症と戦うために２つの一般的な戦略を使用する。病原体への曝露は、免疫刺激性サイトカイン、ケモカイン、及び多反応性ＩｇＭ抗体の産生によって特徴付けられる自然免疫応答を急速に引き起こす。自然免疫系は、多様な感染性微生物群によって発現される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）への曝露によって活性化される。ＰＡＭＰの認識は、受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーによって媒介される。特定のオリゴヌクレオチドに応答するＴＬＲ４、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９などのＴＬＲ受容体は、エンドソームと呼ばれる特別な細胞内区画内に存在する。ＴＬＲ４、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９受容体の調節機構は、例えば、限定されないが、ＤＮＡ－タンパク質相互作用に基づいている。
本明細書に記載されるように、細菌ＤＮＡに見られるものと同様のＣｐＧモチーフを含有する合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ受容体の同様の応答を刺激する。したがって、本開示のＣｐＧオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲアゴニストとして機能する能力を有する。本開示によって企図される他のＴＬＲアゴニストには、一本鎖ＲＮＡ及び小分子（例えば、Ｒ８４８（レシキモド））が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、免疫調節オリゴヌクレオチドには、免疫不全及びがんの治療など、様々な有望な治療用途がある。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性を調節する方法で使用される。
更なる実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、ＴＬＲアンタゴニストであるオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＴＬＲアンタゴニストは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である。
いくつかの実施形態では、免疫系の下方調節は、Ｔｏｌｌ様受容体の発現に関与する遺伝子のノックダウンを伴う。このアンチセンスアプローチは、任意のｔｏｌｌ様タンパク質の発現を阻害するための本開示のＬＮＰ－ＳＮＡの使用を伴う。
したがって、いくつかの実施形態では、ｔｏｌｌ様受容体を調節するために本明細書に記載のＬＮＰ－ＳＮＡを利用する方法が開示される。本方法は、それぞれ、ＴＬＲアゴニスト又はＴＬＲアンタゴニストを使用して、Ｔｏｌｌ様受容体活性を上方調節又は下方調節するかのいずれかである。本方法は、ｔｏｌｌ様受容体を有する細胞を本開示のＬＮＰ－ＳＮＡと接触させ、それによってｔｏｌｌ様受容体の活性及び／又は発現を調節することを含む。調節されるｔｏｌｌ様受容体には、ｔｏｌｌ様受容体１、ｔｏｌｌ様受容体２、ｔｏｌｌ様受容体３、ｔｏｌｌ様受容体４、ｔｏｌｌ様受容体５、ｔｏｌｌ様受容体６、ｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、ｔｏｌｌ様受容体９、ｔｏｌｌ様受容体１０、ｔｏｌｌ様受容体１１、ｔｏｌｌ様受容体１２、及び／又はｔｏｌｌ様受容体１３のうちの１つ以上が含まれる。
障害を治療するためのＬＮＰ－ＳＮＡの使用
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、障害を治療するために使用される。本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、障害又はその１つ以上の症状を排除、軽減、又は改善することを意味する。したがって、いくつかの態様では、本開示は、障害を治療する方法であって、有効量の本開示のＬＮＰ－ＳＮＡを、それを必要とする対象（例えば、ヒト対象）に投与することを含み、投与することにより、障害を治療する、方法を提供する。様々な実施形態では、障害は、がん、感染症、自己免疫疾患、又はそれらの組み合わせである。ＬＮＰ－ＳＮＡの「有効量」は、例えば、遺伝子編集に影響を及ぼし、遺伝子発現を阻害し、かつ／又は自然免疫応答を活性化するのに十分な量である。したがって、先天性免疫応答を活性化する方法も本明細書で企図され、かかる方法は、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡを、対象における先天性免疫応答を活性化するのに有効な量で、それを必要とする対象に投与することを含む。
本開示のＬＮＰ－ＳＮＡは、非経口投与、筋肉内注射、皮下注射、皮内投与、及び／又は経口若しくは鼻腔内などの粘膜投与などの任意の好適な経路を介して投与することができる。追加の投与経路には、静脈内、腹腔内、鼻腔内投与、膣内、直腸内、及び経口投与が挙げられるが、これらに限定されない。異なる投与経路の別々又は同時の組み合わせも、本開示によって企図される。
検出におけるＬＮＰ－ＳＮＡの使用
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡはナノフレア技術に有用である。ナノフレアは、生細胞内の標的分子レベルの蛍光検出のためのポリヌクレオチド官能化ナノ粒子との関連で以前に記載されている（米国特許出願公開第２０１０／０１２９８０８号に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。このシステムでは、「フレア」は検出可能に標識され、いくつかの実施形態では、二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖（又は一本鎖オリゴヌクレオチドの一部）であり、検出可能なマーカーで標識され、入ってくる標的ポリヌクレオチドによってＬＮＰ－ＳＮＡから置換又は放出される。したがって、ナノフレア技術は、本明細書に記載のＬＮＰ－ＳＮＡの関連において有用であることが企図される。
組成物
本開示はまた、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡ、又はその複数を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。「担体」という用語は、本明細書に記載されるＳＮＡが対象に投与されるビヒクルを指す。本開示によるＬＮＰ－ＳＮＡと互換性のある任意の従来の媒体又は薬剤を使用することができる。担体という用語は、希釈剤、賦形剤、補助剤、及びそれらの組み合わせを包含する。
治療剤
本明細書で提供するＬＮＰ－ＳＮＡは、任意選択で、治療剤、又はその複数を更に含む。治療剤は、様々な実施形態では、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドに単純に会合しており、かつ／又は治療剤はＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアに会合しており、かつ／又は治療剤はＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアに封入されている。いくつかの実施形態では、治療剤は、脂質ナノ粒子コアに結合していないオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの末端に会合している（例えば、オリゴヌクレオチドがその３’末端を介して脂質ナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの５’末端に会合している）。あるいは、いくつかの実施形態では、治療剤は、脂質ナノ粒子コアに結合しているオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドの末端に会合している（例えば、オリゴヌクレオチドがその３’末端を介して脂質ナノ粒子コアに結合している場合、治療剤はオリゴヌクレオチドの３’末端に会合している）。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと共有結合的に会合している。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと非共有結合的に会合している。しかしながら、本開示は、１つ以上の治療剤が、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内のオリゴヌクレオチドと共有結合及び非共有結合の両方で会合しているＬＮＰ－ＳＮＡを提供することを理解されたい。また、非共有結合的な会合には、ハイブリダイゼーション、タンパク質結合、及び／又は疎水性相互作用が含まれることも理解されるであろう。いくつかの実施形態では、治療剤は、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡとは別個に投与される。したがって、いくつかの実施形態では、治療剤は、障害を治療するために、本開示のＬＮＰ－ＳＮＡの前、後、又は同時に投与される。
本開示によって企図される治療剤には、タンパク質（例えば、治療用タンパク質）、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗体又は抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「小分子」という用語は、化学化合物若しくは薬物、又は天然若しくは合成のいずれかの任意の他の低分子量有機化合物を指す。「低分子量」とは、１５００ダルトン未満、典型的には１００～７００ダルトンの分子量を有する化合物を意味する。
検出可能なマーカー
本開示の態様又は実施形態のいずれにおいても、オリゴヌクレオチド（例えば、ＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドのシェル内の１つ以上のオリゴヌクレオチド、及び／又はＬＮＰ－ＳＮＡの脂質ナノ粒子コアに封入された１つ以上のオリゴヌクレオチド）は、検出可能なマーカー（例えば、フルオロフォア及び／又は放射性標識）を含む。検出可能なマーカーをオリゴヌクレオチド又はナノ粒子コアに結合させる方法は、当技術分野において既知である。
いくつかの実施形態では、検出可能なマーカーは、脂質ナノ粒子コアと会合される。例えば、限定されないが、本開示の脂質ナノ粒子コアは、フルオロフォアで標識され得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子コア、脂質ナノ粒子コアの外部に結合した１つ以上のオリゴヌクレオチド、及び／又は脂質ナノ粒子コア内に封入された１つ以上のオリゴヌクレオチドの両方は、フルオロフォアを含み、フルオロフォアは全て同じであり得るか、又は１つ以上のフルオロフォアが異なる場合がある。
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６．）Ｂａｎｇａ，Ｒ．Ｊ．；Ｃｈｅｒｎｙａｋ，Ｎ．；Ｎａｒａｙａｎ，Ｓ．Ｐ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｓ．Ｔ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１４，１３６（２８），９８６６－９８６９．
７．）Ｓｐｒａｎｇｅｒｓ，Ａ．Ｊ．；Ｈａｏ，Ｌ．；Ｂａｎｇａ，Ｒ．Ｊ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｆｏｒ Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｓｍａｌｌ ２０１７，１３（１０），１６０２７５３．
８．）Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ．；Ｑｕｅｒｂｅｓ，Ｗ．；Ｔａｍ，Ｙ．Ｋ．；Ａｎｓｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．；Ｋｕｍａｒ，Ｖ．；Ｑｉｎ，Ｊ．；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．；Ｗａｎｇ，Ｑ．；Ｐａｎｅｓａｒ，Ｓ．；Ｈｕｔａｂａｒａｔ，Ｒ．；Ｃａｒｉｏｔｏ，Ｍ．；Ｈｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｊ．；Ｋａｎｄａｓａｍｙ，Ｐ．；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｄ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｐａｎｇ，Ｂ．；Ｃｈａｒｉｓｓｅ，Ｋ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｍｕｉ，Ｂ．Ｌ．；Ｄｕ，Ｘ．；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｐ．；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｄ．；Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄｓ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，２１（８），１５７０－１５７８．
９．）Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｃｈｅｎ，Ｊ．；Ｓａｎｄｈｕ，Ａ．Ｐ．；Ｍｕｉ，Ｂ．Ｌ．；Ｃｈｏ，Ｃ．Ｋ．；Ｓａｈ，Ｄ．Ｗ．Ｙ．；Ｓｔｅｂｂｉｎｇ，Ｄ．；Ｃｒｏｓｌｅｙ，Ｅ．Ｊ．；Ｙａｗｏｒｓｋｉ，Ｅ．；Ｈａｆｅｚ，Ｉ．Ｍ．；Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｑｉｎ，Ｊ．；Ｌａｍ，Ｋ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｆ．；Ｊｅｆｆｓ，Ｌ．Ｂ．；Ｎｅｃｈｅｖ，Ｌ．；Ｅｉｓｅｎｈａｒｄｔ，Ｍ．Ｌ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｋａｚｅｍ，Ｍ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌｕ，Ｍ．；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｊ．；Ｃｈｅｎ，Ｑ．；Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．；Ｂａｒｒｏｓ，Ｓ．Ａ．；Ｄｅ，Ｓ．；Ｋｌｉｍｕｋ，Ｓ．Ｋ．；Ｂｏｒｌａｎｄ，Ｔ．；Ｋｏｓｏｖｒａｓｔｉ，Ｖ．；Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｗ．Ｌ．；Ｔａｍ，Ｙ．Ｋ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｃｉｕｆｏｌｉｎｉ，Ｍ．Ａ．；Ｔｒａｃｙ，Ｍ．Ａ．；Ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｄ．；Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ＳｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１０，２８（２），１７２－１７６．
１０．）Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ａｎｓｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．；Ｍｕｉ，Ｂ．Ｌ．；Ｔａｍ，Ｙ．Ｋ．；Ｃｈｅｎ，Ｊ．；Ｄｕ，Ｘ．；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｄ．；Ｅｌｔｅｐｕ，Ｌ．；Ｍａｔｓｕｄａ，Ｓ．；Ｎａｒａｙａｎａｎｎａｉｒ，Ｊ．Ｋ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｈａｆｅｚ，Ｉ．Ｍ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｔｒａｃｙ，Ｍ．Ａ．；Ｃｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｄ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ＳｉＲＮＡ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１（３４），８５２９－８５３３．
１１．）Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．；Ｍａｈｏｎ，Ｋ．Ｐ．；Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．Ｇ．；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ，Ｋ．Ａ．；Ｑｕｅｒｂｅｓ，Ｗ．；Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｑｉｎ，Ｊ．；Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｗ．；Ｑｉｎ，Ｌ．Ｌ．；Ｒａｃｉｅ，Ｔ．；Ｆｒａｎｋ－Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｍ．；Ｙｉｐ，Ｋ．Ｎ．；Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．；Ｓａｈ，Ｄ．Ｗ．Ｙ．；Ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ，Ｖ．；Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｌｏｗ－Ｄｏｓｅ，ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１０，１０７（５），１８６４－１８６９．
１２．）Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｚｕｍｂｕｅｈｌ，Ａ．；Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．；Ｌｅｓｈｃｈｉｎｅｒ，Ｅ．Ｓ．；Ｂｕｓｉｎｉ，Ｖ．；Ｈｏｓｓａｉｎ，Ｎ．；Ｂａｃａｌｌａｄｏ，Ｓ．Ａ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｎ．；Ｆｕｌｌｅｒ，Ｊ．；Ａｌｖａｒｅｚ，Ｒ．；Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙ，Ａ．；Ｂｏｒｌａｎｄ，Ｔ．；Ｃｏｎｓｔｉｅｎ，Ｒ．；Ｄｅ Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．；Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｎａｒａｙａｎａｎｎａｉｒ Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈ，Ｋ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｊｏｈｎ，Ｍ．；Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ，Ｖ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｎｅｃｈｅｖ，Ｌ．；Ｑｉｎ，Ｊ．；Ｒａｃｉｅ，Ｔ．；Ｒａｉｔｃｈｅｖａ，Ｄ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｓａｈ，Ｄ．Ｗ．Ｙ．；Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．；Ｔｏｕｄｊａｒｓｋａ，Ｉ．；Ｖｏｒｎｌｏｃｈｅｒ，Ｈ．Ｐ．；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ．Ｓ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．Ａ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８，２６（５），５６１－５６９．
１３．）Ｓａｇｏ，Ｃ．Ｄ．；Ｌｏｋｕｇａｍａｇｅ，Ｍ．Ｐ．；Ｉｓｌａｍ，Ｆ．Ｚ．；Ｋｒｕｐｃｚａｋ，Ｂ．Ｒ．；Ｓａｔｏ，Ｍ．；Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｔｈａｔ Ｄｅｌｉｖｅｒ ＲＮＡ ｔｏ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１８，１４０（４９），１７０９５－１７１０５．
１４．）Ｃｈｅｎｇ，Ｑ．；Ｗｅｉ，Ｔ．；Ｆａｒｂｉａｋ，Ｌ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｔ．；Ｄｉｌｌｉａｒｄ，Ｓ．Ａ．；Ｓｉｅｇｗａｒｔ，Ｄ．Ｊ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｏｒｇａｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＳＯＲＴ）Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｔｉｓｓｕｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２０，１－８．
１５．）Ｃｈｉｎｅｎ，Ａ．Ｂ．；Ｇｕａｎ，Ｃ．Ｍ．；Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍｉｅ－Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１５，５４（２），５２７－５３１．
１６．）Ａｋｉｎｃ，Ａ．；Ｑｕｅｒｂｅｓ，Ｗ．；Ｄｅ，Ｓ．；Ｑｉｎ，Ｊ．；Ｆｒａｎｋ－Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，Ｍ．；Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈ，Ｋ．Ｎ．；Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ｍ．；Ｒａｊｅｅｖ，Ｋ．Ｇ．；Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｗ．Ｌ．；Ｄｏｒｋｉｎ，Ｊ．Ｒ．；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｑｉｎ，Ｌ．；Ｒａｃｉｅ，Ｔ．；Ｓｐｒａｇｕｅ，Ａ．；Ｆａｖａ，Ｅ．；Ｚｅｉｇｅｒｅｒ，Ａ．；Ｈｏｐｅ，Ｍ．Ｊ．；Ｚｅｒｉａｌ，Ｍ．；Ｓａｈ，Ｄ．Ｗ．；Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．；Ｔｒａｃｙ，Ｍ．Ａ．；Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．；Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ，Ｖ．；Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，Ａ．Ｄｅ；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｗｉｔｈ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｄ Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｉｇａｎｄ－Ｂａｓｅｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１０，１８（７），１３５７－１３６４．
１７．）Ｌｏｋｕｇａｍａｇｅ，Ｍ．Ｐ．；Ｓａｇｏ，Ｃ．Ｄ．；Ｇａｎ，Ｚ．；Ｋｒｕｐｃｚａｋ，Ｂ．Ｒ．；Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｄｅｌｉｖｅｒ ＳｉＲＮＡ ａｎｄ ＳｇＲＮＡ ｔｏ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２０１９，３１（４１），１９０２２５１．
１８．）Ｐａｔｅｌ，Ｓ．；Ａｓｈｗａｎｉｋｕｍａｒ，Ｎ．；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．；Ｘｉａ，Ｙ．；Ｍｉｈａｉ，Ｃ．；Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ＩＩＩ，Ｊ．Ｐ．；Ｈｏｕ，Ｓ．；Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ａ．Ａ．；Ｋｅｔｏｖａ，Ｔ．；Ｗｅｌｓｈｅｒ，Ｋ．；Ｊｏｙａｌ，Ｊ．Ｌ．；Ａｌｍａｒｓｓｏｎ，Ｏ．；Ｓａｈａｙ，Ｇ．Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ｓｈａｐｅ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍＲＮＡ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．２０２０，１１．
１９．）Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８７：６８－８０（２０１５）
２０．）Ａｌｆａｇｉｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ ｎａｎｏｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １３：４５（１－２７）（２０２１）．
２１．）Ｖｅｉｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ＲＮＡ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １５９：３６４－３７６（２０２０）．
２２．）Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｒｇａｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＳＯＲＴ）ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：３１３－３２０（２０２０）
２３．）Ｌｏｋｕｇａｍａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｄｅｌｉｖｅｒ ｓｉＲＮＡ ａｎｄ ｓｇＲＮＡ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｌｉｇａｎｄｓ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ３１（４１）：ｅ１９０２２５１
以下の実施例は、単に本開示を例示するために与えられたものであり、その範囲を限定するために与えられたものではない。
実施例１
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成するために、構造の成分を２０～８０ｍＭの総濃度でエタノールに溶解した。これらの成分は、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ＰＥＧ－マレイミドの４つの異なるクラスに分類される。各ナノ粒子構造は、各クラスから１つの成分から構成された。各成分のモル分率は、イオン化可能な脂質、５０％；リン脂質、１．４～２３．５％；ステロール、２５～４５％；脂質－ＰＥＧ－マレイミド、１．５～３．５％であった。使用したイオン化可能な脂質は、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）であった。使用したリン脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、及び１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）であった。使用したステロールはコレステロールであった。使用した脂質－ＰＥＧ－マレイミドは、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジパルミトリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）であった。封入される核酸は、ｐＨ４．０で１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に溶解した。イオン化可能な脂質と使用された核酸との間で使用された質量比は、５：１であった。核酸を封入するために、核酸を、ピペット先端を使用して、３：１の体積比でエタノール中のＬＮＰ成分と混合した（図１）。混合後、ＬＮＰを、３０００Ｄａの分子量カットオフ膜中のリン酸緩衝生理食塩水に対して２時間透析した。
脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）は、透析ＬＮＰの表面上の脂質－ＰＥＧ－マレイミドにスルフヒドリル末端ＤＮＡ配列をコンジュゲートすることから形成された。１－Ｏ－ジメトキシトリチル－プロピル－ジスルフィド上で合成されたＤＮＡを、ｐＨ８．３～８．５で１００ｍＭの１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用して、１’－スクシニル－ｌｃａａ－ＣＰＧを還元して３’スルフヒドリル基を形成した。
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５カラムを使用してＤＴＴを除去した後、１当量のＤＮＡをＬＮＰと混合し、室温で２時間振盪して、ｐＨ７．２～７．６のリン酸緩衝生理食塩水中にＬＮＰ－ＳＮＡを形成した。ＬＮＰ－ＳＮＡの直径及び構造は、ナノ粒子追跡分析及び低温電子顕微鏡を用いて確認した（図２）。
ＬＮＰとの反応後、アガロースゲル上でＤＮＡ移動度を低下させ、コンジュゲーションを確認し（図３）、細胞アッセイにおけるｄｓＤＮＡ及びｓｉＲＮＡ送達に関連して、ＬＮＰ－ＳＮＡ活性を評価した。ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路の活性化に応答するように設計されたＲａｗ２６４．７細胞株では、ＬＮＰ－ＳＮＡは、２’３’－ｃＧＡＭＰ（４．７５μＭ）及び遊離ＤＮＡと比較して、２８．１ｎＭの臨界濃度を示し、活性化を示さなかった（図４Ａ）。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）を発現するＵ８７細胞株において、ｓｉＬｕｃ２送達を、ＬＮＰ－ＳＮＡ媒介遺伝子サイレンシングのための概念実証として使用した。ｓｉＬｕｃ２を含有するＬＮＰ－ＳＮＡは、ｓｉＧＦＰ対照ＬＮＰ－ＳＮＡと比較して、２５～５０ｎＭの濃度でＬｕｃ２発現を約９０％サイレント化した（図４Ｂ）。同等のＬＮＰ構造と比較して、ＬＮＰ－ＳＮＡは、Ｕ８７－Ｌｕｃ２細胞株において、５０ｎＭ及び１００ｎＭの濃度で約５％多くＬｕｃ２をサイレント化する（図４Ｃ）。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＬＮＰ－ＳＮＡの機能及び標的化を評価した。ＬＮＰ－ＳＮＡ及び同等のＬＮＰを、ルシフェラーゼｍＲＮＡを用いて製剤化した。尾静脈を介したｍＲＮＡの０．１ｍｇｋｇ－１注射後、６時間後に発光を評価した。ＬＮＰ－ＳＮＡは、脾臓特異的なｍＲＮＡ発現を示し、肝臓では検出可能な発現を示さなかった（図５）。対照的に、ＬＮＰは、肝臓において高い程度のｍＲＮＡ発現、及び脾臓においてＬＮＰ－ＳＮＡと同様のレベルの発現を示し、オフターゲット肝毒性のより大きな可能性を示した。図５は、ＳＮＡの表面上のＤＮＡ配列の存在が、ｍＲＮＡの発現が観察されるところで変化することを示す。同等のＬＮＰの送達を変更することに加えて、送達は、表面ＤＮＡの配列組成を変更することによって調整することができる。図６は、表面ＧリッチＤＮＡ配列を有するＬＮＰ－ＳＮＡとＴリッチＤＮＡ配列を有するＬＮＰ－ＳＮＡとの間で、ｍＲＮＡの発現が達成される場所に有意差があることを示す。
材料及び方法
自動化された固体支持体ホスホルアミダイト合成（モデル：ＭＭ１２，ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用して、ＤＮＡを合成した。配列を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴｏＦ、Ｂｒｕｋｅｒ Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ）を使用して特性評価した。実験に使用されるＤＮＡ配列及び脂質ナノ粒子組成物を、以下の表１に列挙する。ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓから購入した。ＤＭＰＥ－ＰＥＧ（２０００）マレイミド、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ（２０００）マレイミド、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ（２０００）マレイミドは、Ｎａｎｏｃｓ，Ｉｎｃから購入した。コレステロール及びＴｒｉｔｏｎ（商標）－Ｘ－１００は、Ｓｉｇｍａから購入した。ＤＯＰＣ、ＤＳＰＣ、１８：１ＤＡＰ、及びＤＯＰＥは、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ｌｉｐｉｄｄｓ，Ｉｎｃ．から購入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）ｄｓＤＮＡ試薬、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）試薬、並びに２０倍ＴＥ緩衝液は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。Ｄ－ルシフェリンは、Ｇｏｌｄ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、Ｌｕｃ ｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
ＬＮＰ－ＳＮＡ製剤。ＬＮＰを、エタノール希釈法を使用して製剤化した［Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｄｅｌｉｖｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ＦＡＨ ｍＲＮＡ ｔｏ Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ Ｌｉｖｅｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｒｅｎａｌ Ｔｙｒｏｓｉｎｅｍｉａ Ｔｙｐｅ Ｉ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ３０（５２）：ｅ１８０５３０８（２０１８）］。手短に言えば、脂質及びコレステロールを１００％エタノール中に溶解した。ｄｓＤＮＡを、５．０のイオン化可能な脂質：ｄｓＤＮＡの質量比で、ｐＨ４．０で１０ｍＭのクエン酸塩中に溶解した。両方の溶液を作製した後、ＤＮＡを、３：１の体積比でエタノール溶液と急速にピペット混合した。混合後、ＮＰを、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）３Ｋ ＭＷＣＯ微小透析プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）内で、１×ＰＢＳに対して６０分間、２回透析した。続いて、１当量の凍結乾燥チオール末端のＤＮＡ配列を含有する微量遠心管にＮＰを添加し、７００ｒｐｍ、室温で一晩振盪して、マレイミド官能性ＰＥＧ脂質とスルフヒドリル末端のＤＮＡとの反応を容易にした。
ＬＮＰ－ＳＮＡの特性評価。ＬＮＰ－ＳＮＡサイズ及びナノ粒子濃度は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ試料アシスタントを装着したＭａｌｖｅｒｎ ＮａｎｏＳｉｇｈｔ ＮＳ３００を使用して、ナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）によって決定した。ナノ粒子を水で１：１０００に希釈し、５０μＬ／分でマイクロ流体を通過させた。サイズは、バックグラウンドを回避するために、手動で設定された検出閾値を有するＮＴＡソフトウェアを使用して決定した。ｄｓＤＮＡ及びＲＮＡの封入効率は、それぞれ、修正されたＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）及びＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）アッセイによって決定した。簡潔に述べると、封入された核酸を用いて２つの別個の標準曲線を作製した。１つは、１×ＴＥ緩衝液中にあり、他方は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）－Ｘ－１００を補充した１×ＴＥに含まれた。各ナノ粒子から２つの試料を作製し、１つをＴＥで希釈し、１つを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）－Ｘ－１００でＴＥで希釈した。続いて、１×ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）（ｄｓＤＮＡ）又はＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）１００μＬを標準品及び試料の上に添加し、各試料の蛍光をプレートリーダーを使用して測定した。遊離核酸の濃度は、ＴＥ標準曲線から決定され、総核酸の濃度は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）－Ｘ－１００で溶解された粒子によって決定された。このことから、封入効率は、以下の式から計算された。（［Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ］－［ＴＥ］）／（［Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ］）又は（［合計］－［遊離］）／（［合計］）。
ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路活性化を測定するための細胞アッセイ。Ｒａｗ Ｌｕｃｉａ（商標）ＩＳＧ（Ｒａｗ２６４．７）細胞株は、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。インビトロ実験のために、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、Ｎｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、及びＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）もＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。全ての細胞株を、製造業者の仕様に従って培養した。細胞認証は実施されなかった。全ての細胞株をマイコプラズマ汚染について試験し、３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気で増殖させた。
特定のナノ粒子製剤及び対照をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈し、９６ウェルプレート中に三通りでプレーティングした。続いて、細胞を、ウェルあたり１００，０００個の細胞で、ナノ粒子処置物の上部にプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、２０μＬの培地を除去し、ＩＲＦ３誘導を、メーカーのプロトコルに従って、Ｑｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用して定量した。生存細胞の数を、達成したＩＲＦ３誘導量に正規化するために、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）ＨＳ細胞透過性生存試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した。Ｑｕａｎｔｉ－Ｌｕｃ（商標）測定のために２０μＬの培地を除去した後、プレート内の体積が９０μＬであるように追加の培地を除去した。１ウェル当たり１０μＬのＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）を添加し、プレートを１５分間インキュベートし、その時点で、製造業者のプロトコルに従って蛍光を読み取った。次いで、ＩＲＦ３誘導（発光）を生存細胞（ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）蛍光）に対してウェルごとに基づいて正規化した。
細胞アッセイでｓｉＲＮＡを送達するＬＮＰ－ＳＮＡ。Ｂ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ２及びＵ８７－Ｌｕｃ２細胞株をＡＴＣＣから入手し、製造元の仕様に従って培養した。ｓｉＲＮＡ媒介遺伝子サイレンシングを評価するために、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ経路スクリーニングからの上位５つのＬＮＰ－ＳＮＡ候補を、ｓｉＬｕｃ２とともに、ｓｉＧＦＰで製剤化された対照ＬＮＰ－ＳＮＡと組み合わせて製剤化した。したがって、遺伝子サイレンシングは、Ｌｕｃ２のサイレンシングによる発光の減少として読み出すことができる。
特定のナノ粒子製剤及びトランスフェクトされたｓｉＲＮＡ対照をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で希釈し、９６ウェルプレート中に三通りでプレーティングした。続いて、細胞を、ウェルあたり５０，０００個の細胞で、ナノ粒子処置物の上部にプレーティングした。２４時間のインキュベーションの後、１２０μＬの培地を除去し、２０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して、各ウェル内の生存細胞の数を測定した。３７℃で３０分間インキュベーションした後、製造業者のプロトコルに従って蛍光を読み取った。その後、ウェルを１００ｕＬのＰＢＳで３回洗浄した。Ｌｕｃ２発光は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して読み取った。Ｌｕｃ２遺伝子サイレンシングを、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｆｌｕｏｒ（商標）生存能に正規化された任意の単位で評価した。
動物の取り扱い。８～１２週の年齢範囲の雌マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、従来の飼育施設で維持した。使用された全ての動物は、プロトコルＩＳ０００１０９７０の下でノースウェスタン大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された方法及び手順に従って取り扱った。
ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２）ｍＲＮＡ発現。Ｃｌｅａｎｃａｐ（登録商標）ルシフェラーゼｍＲＮＡは、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。マウスに、０．１ｍｇｋｇ－１のｍＲＮＡ含有製剤の単回ボーラス注射を与えた。６時間後、マウスに１５０ｍｇｋｇ－１のＤ－ルシフェリンを腹腔内注射した。続いて、動物を安楽死処分し、主要な臓器を採取し、３００μｇ／ｍＬのＤ－ルシフェリン溶液に浸した。次いで、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ機器（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して個々の臓器を撮像した。
表１に列挙されるパーセンテージは、最終的なＬＮＰ－ＳＮＡにおける様々な成分の量（モルパーセント）を表す。
Ｃ１４、Ｃ１６及びＣ１８は、脂質アルキル鎖の長さである。脂質は、以下のように命名される。ＤＭＰＥ－ＰＥＧ－マレイミド（Ｃ１４）、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ－マレイミド（Ｃ１６）、及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ－マレイミド（Ｃ１８）。
「Ｔ２１」とは、配列５’－ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ Ｔ－３’（配列番号１）を指す。
「ＧＧＴ７」とは、配列５’－ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ Ｔ－３’（配列番号２）を指す。
「ＥＥ％」は、封入効率を指す。
実施例２
Ａｉ１４マウス実験
特定の細胞型の一般的な動物の取り扱い及び単離のためのプロトコル
動物の取り扱い。８～１２週の年齢範囲の雌マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ（＃０００６６４）及びＬＳＬ－Ｔｏｍａｔｏ／Ａｉ１４（＃００７９１４））をＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手し、従来の飼育施設で維持した。使用された全ての動物は、ノースウェスタン大学の動物実験委員会によって承認された方法及び手順に従って取り扱った。
細胞の単離。臓器を採取し、３７℃で３０分間、５０００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩの消化混合物中でインキュベートした。続いて、臓器を約３ｍｍの厚さの小さなスライスに切り刻み、７０μｍのフィルターを通した。続いて、赤血球を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して５分間溶解し、細胞をカウントし、２．５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ中に再懸濁した。
各臓器に由来する目的の細胞型を、磁気分離を使用して単離した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、脾臓マクロファージ及びＢ細胞を単離した。肝臓Ｂ細胞を、同一のＥａｓｙＳｅｐ（商標）キットを使用して単離した。２００×ｇでの遠心分離によって肝細胞を単離した。
Ａｉ１４マウスについて：Ａｉ１４マウスに、Ｃｒｅ ｍＲＮＡによって０．３ｍｇｋｇ－１の用量でＬＮＰ及びＬＮＰ－ＳＮＡを静脈内に注射した（図７）。図７は、Ａｉ１４マウスを使用した細胞集団レベルのゲノム編集のためのアッセイを示す。Ａｉ１４マウスは、ｌｏｘＰが導入された（ｆｌｏｘｅｄ）ストップカセットの下流にｔｄＴｏｍを発現する（図７Ａ）。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現は、ストップカセットを除去し、ｔｄＴｏｍ発現をオンにする。これは、フローサイトメトリーを介して検出することができ、ここではバックグラウンドを上回るｔｄＴｏｍを発現する標的細胞集団の割合が定量化される。これは、ｔｄＴｏｍ＋細胞％として表示される。
注射の２日後、動物を安楽死処分し、目的の細胞型を、上記の細胞単離プロトコルを使用して単離した。個々の細胞集団を調製したら、細胞をフローサイトメーターで実行した。ＰＢＳ処置マウス上でゲートされ、各細胞型におけるゲノム編集を、検出可能なｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を有する細胞パーセントの観点から定量化した（図８）。図９は、ＧＧＴ配列で官能化されたＬＮＰ－ＳＮＡが、脾臓単球におけるＣｒｅ ｍＲＮＡによるゲノム編集を引き起こすことを示す。
ＤＮＡバーコード化実験について、
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＬＮＰ－ＳＮＡの合成及び投与。ＬＮＰ－ＳＮＡ及び裸のＬＮＰの小さなライブラリーを、以下の表２に示す組成物で作製した。各ＬＮＰ又はＬＮＰ－ＳＮＡは、各粒子を識別する固有の５６塩基ＤＮＡバーコードを封入した。各粒子内のバーコードの量を定量化した後、等量のバーコードを０．１ｍｇｋｇ－１の総用量にプールし、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注射した。２日間の循環期間の後、上記のプロトコルによって目的の細胞型を磁気分離によって単離し、ＤＮＡ単離及びシーケンシング（以下に記載）に進んだ。
ＤＮＡ単離、及び次世代シーケンシング。目的の細胞タイプでは、Ｃｌａｒｉｔｙ ＯＴＸ（商標）カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を使用してＤＮＡを単離した。試料を凍結乾燥し、ＰＣＲ－Ｃｌｅａｎｕｐキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を使用して洗浄した。続いて、ネステッドＰＣＲを以前のプロトコル［Ｐａｕｎｏｖｓｋａ，Ｋ．；Ｓａｇｏ，Ｃ．Ｄ．；Ｍｏｎａｃｏ，Ｃ．Ｍ．；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｗ．Ｈ．；Ｃａｓｔｒｏ，Ｍ．Ｇ．；Ｒｕｄｏｌｔｚ，Ｔ．Ｇ．；Ｋａｌａｔｈｏｏｒ，Ｓ．；Ｖａｎｏｖｅｒ，Ｄ．Ａ．；Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ，Ｐ．Ｊ．；Ａｈｍｅｄ，Ｒ．；Ｂｒｙｋｓｉｎ，Ａ．Ｖ．；Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．Ａ Ｄｉｒｅｃｔ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｈｕｎｄｒｅｄｓ ｏｆ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｗｅａｋ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１８，１８（３），２１４８－２１５７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．８ｂ００４３２］に従って実施した。ユニバーサルプライマーを使用してバーコード配列を増幅し、続いてアダプター配列を使用して試料をインデックス付けし、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ化学物質を添加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（商標）を使用して、試料を配列決定した。
ＮＧＳデータの分析。シーケンスファイルは、カスタムＲスクリプトを使用して分析した。最初に、読み取りを前処理して、アダプタープライマー配列だけでなく、４０塩基未満の読み取りも除外した。次に、２０未満の品質スコアを含む読み取りがないように読み取りを処理した。最後に、バーコード配列の逆相補体を検索することによって、各バーコードを各試料内でカウントした。各試料中の各バーコードの読み取り回数を用いて、数値を入力に正規化した。これを使用して、各バーコードからの読み取り回数を最初に注入された回数に正規化した。続いて、送達を「正規化送達」又は試料中の読み取りの総数のパーセンテージとしての各バーコードからの正規化読み取りのパーセンテージとして定量化した。
図１０は、（ＧＧＴ）７外側配列及びＤＯＰＥヘルパー脂質が、主要な脾細胞型へのＬＮＰ－ＳＮＡの増強された送達を可能にしたことを示す。脾臓への送達を、ＤＮＡバーコード化技術を使用して評価した。ＬＮＰ－ＳＮＡを５６ヌクレオチド長のバーコードでインデックス付けし、図１０の左パネルに示される戦略を使用して増幅及びインデックス付けした。ＬＮＰ及びＬＮＰ－ＳＮＡ構造の送達を、目的の各細胞型に由来する全バーコードリードのパーセントとして評価した。ここで、脾臓におけるＬＮＰ－ＳＮＡの濃縮は、（ＧＧＴ）７外側配列を提示し、ヘルパー脂質ＤＯＰＥを含有することによって達成されたことが見出された。

Claims (75)

  1. 脂質ナノ粒子コアと、前記脂質ナノ粒子コアの外部に結合したオリゴヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドのシェルと、を含む脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）であって、
    前記脂質ナノ粒子コアが、封入されたオリゴヌクレオチド、イオン化可能な脂質、リン脂質、ステロール、及び脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートを含み、
    前記オリゴヌクレオチドのシェル内の前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１０％が、前記脂質－ＰＥＧコンジュゲートを介して前記脂質ナノ粒子コアの前記外部に共有結合している、ＬＮＰ－ＳＮＡ。
  2. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約５～約１０００個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  3. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約１００～約１０００個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１又は２に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  4. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、約４００個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  5. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約５～約１００ヌクレオチド長である、請求項１～４のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  6. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約１０～約５０ヌクレオチド長である、請求項１～５のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  7. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、約２５ヌクレオチド長である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  8. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、同じヌクレオチド配列を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  9. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  10. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、一本鎖、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される、請求項１～９のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  11. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、一本鎖、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される、請求項１～９のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  12. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、又はそれらの組み合わせから構成される、請求項１～９のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  13. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、標的化オリゴヌクレオチドである、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  14. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、標的化オリゴヌクレオチドである、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  15. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  16. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の各オリゴヌクレオチドが、（ＧＧＴ）ｎヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなり、式中、ｎが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はそれ以上である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  17. ｎが７である、請求項１５又は１６に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  18. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、アプタマーである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  19. 前記オリゴヌクレオチドのシェル内の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、検出可能なマーカーを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  20. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、阻害性オリゴヌクレオチド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子基質ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  21. 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである、請求項２０に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  22. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド、又は一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドである、請求項２０又は２１に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  23. 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの組み合わせから構成される、請求項１～２２のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  24. 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、阻害性オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子タンパク質をコードするｍＲＮＡ、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ遺伝子編集因子基質である、請求項１～２３のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  25. 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである、請求項２４に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  26. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチドである、請求項２４又は２５に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  27. 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、約５～約５０００ヌクレオチド長である、請求項１～２６のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  28. 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、約１０～約４５００ヌクレオチド長である、請求項１～２７のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  29. 前記封入されたオリゴヌクレオチドが、約１５００ヌクレオチド長である、請求項１～２８のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  30. 前記脂質ナノ粒子コアが、複数の封入されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  31. 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドが、検出可能なマーカーを含む、請求項３０に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  32. 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチドが、阻害性オリゴヌクレオチド、ｍＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、遺伝子編集因子タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ遺伝子編集因子基質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３０又は３１に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  33. 前記阻害性オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、ＤＮＡザイム、又はアプタザイムである、請求項３２に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  34. 前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ、又は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である、請求項３２又は３３に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  35. 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、約１０～約５０ヌクレオチド長である、請求項３０～３２のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  36. 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、約５０ヌクレオチド長である、請求項３０～３５のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  37. 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチド中の各オリゴヌクレオチドが、同じヌクレオチド配列を有する、請求項３０～３６のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  38. 前記複数の封入されたオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含む、請求項３０～３６のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  39. 前記イオン化可能な脂質が、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、Ｃ１２－２００、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、又はそれらの組み合わせである、請求項１～３８のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  40. 前記イオン化可能な脂質が、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）である、請求項１～３９のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  41. 前記ＬＮＰ－ＳＮＡが、前記ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約５０％である前記イオン化可能な脂質のモル分率を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  42. 前記リン脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジヘキサデカノイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、又はそれらの組み合わせである、請求項１～４１のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  43. 前記リン脂質が、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１～４２のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  44. 前記ＬＮＰ－ＳＮＡが、前記ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約１％～約２５％である前記リン脂質のモル分率を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  45. 前記ＬＮＰ－ＳＮＡが、前記ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の３．５％であるか、又は約３．５％である前記リン脂質のモル分率を含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  46. 前記ステロールが、３β－ヒドロキシコレスト－５－エン（コレステロール）、９，１０－セココレスタ－５，７，１０（１９）－トリエン－３β－オール（ビタミンＤ３）、９，１０－セコエルゴスタ－５，７，１０（１９），２２－テトラエン－３β－オール（ビタミンＤ２）、カルシポトリオール、２４－エチル－５，２２－コレスタジエン－３β－オール（スチグマステロール）、２２，２３－ジヒドロスチグマステロール（β－シトステロール）、３，２８－ジヒドロキシ－ルペオール（ベツリン）、ルペオール、ウルゾール酸、オレアノール酸、２４α－メチルコレステロール（カンペステロール）、２４－エチルコレスタ－５，２４（２８）Ｅ－ジエン－３β－オール（フコステロール）、２４－メチルコレスタ－５，２２－ジエン－３β－オール（ブラシカステロール）、２４－メチルコレスタ－５，７，２２－トリエン－３β－オール（エルゴステロール）、９，１１－デヒドロエルゴステロール、ダウコステロール、又は１つ以上のアミノ酸で修飾された前述のステロールのうちのいずれかである、請求項１～４５のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  47. 前記ＬＮＰ－ＳＮＡが、前記ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約２５％～約４５％である前記ステロールのモル分率を含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  48. 前記ＬＮＰ－ＳＮＡが、前記ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の４５％であるか、又は約４５％である前記ステロールのモル分率を含む、請求項１～４７のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  49. 前記ステロールが、コレステロールである、請求項１～４８のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  50. 前記ＬＮＰ－ＳＮＡが、前記ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の４５％であるか、又は約４５％であるコレステロールのモル分率を含む、請求項４９に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  51. 前記脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートが、２０００ダルトン（Ｄａ）のポリエチレングリコールを含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  52. 前記脂質－ポリエチレングリコール（脂質－ＰＥＧ）コンジュゲートが、脂質－ＰＥＧ－マレイミドである、請求項１～５１のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  53. 前記脂質－ＰＥＧ－マレイミドが、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジパルミトリル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、２０００Ｄａのポリエチレングリコールマレイミドにコンジュゲートされた１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、又はそれらの組み合わせである、請求項５２に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  54. 前記ＬＮＰ－ＳＮＡが、前記ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の約１．５％～約３．５％である前記脂質－ＰＥＧコンジュゲートのモル分率を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  55. 前記ＬＮＰ－ＳＮＡが、前記ＬＮＰ－ＳＮＡ中の総脂質の１．５％であるか、又は約１．５％である前記脂質－ＰＥＧコンジュゲートのモル分率を含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  56. 前記イオン化可能な脂質と前記封入されたオリゴヌクレオチドとの間の質量比が、約２０：１～約５：１である、請求項１～５５のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  57. 前記脂質ナノ粒子コアに封入された治療剤を更に含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  58. 前記脂質ナノ粒子コアの前記外部に結合した治療剤を更に含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  59. 前記治療剤が、抗体若しくは抗体断片、小分子、ペプチド、抗生物質、成長因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、抗真菌剤、抗ウイルス剤、化学療法剤、又はそれらの組み合わせである、請求項５７又は５８に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  60. 前記脂質ナノ粒子コアの前記外部に結合した標的化ペプチド、標的化抗体、又はそれらの組み合わせを更に含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載のＬＮＰ－ＳＮＡ。
  61. 請求項１～６０のいずれか一項に記載の複数の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）を含む、組成物。
  62. 治療剤を更に含む、請求項６１に記載の組成物。
  63. 遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを、請求項１～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）、又は請求項６１若しくは６２に記載の組成物とハイブリダイズさせるステップを含む、遺伝子の発現を阻害する方法であって、前記ポリヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドのシェル内の１つ以上のオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイズが、前記遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な程度の相補性で前記ポリヌクレオチドの長さにわたって生じる、方法。
  64. 前記遺伝子産物の発現が、インビボで阻害される、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記遺伝子産物の発現が、インビトロで阻害される、請求項６３に記載の方法。
  66. ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性を上方調節するための方法であって、前記ｔｏｌｌ様受容体を有する細胞を、請求項１～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）、又は請求項６１若しくは６２に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
  67. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、ＴＬＲアゴニストである１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記ｔｏｌｌ様受容体が、ｔｏｌｌ様受容体１、ｔｏｌｌ様受容体２、ｔｏｌｌ様受容体３、ｔｏｌｌ様受容体４、ｔｏｌｌ様受容体５、ｔｏｌｌ様受容体６、ｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、ｔｏｌｌ様受容体９、ｔｏｌｌ様受容体１０、ｔｏｌｌ様受容体１１、ｔｏｌｌ様受容体１２、ｔｏｌｌ様受容体１３、又はそれらの組み合わせである、請求項６６又は６７に記載の方法。
  69. ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の活性を下方調節するための方法であって、前記ｔｏｌｌ様受容体を有する細胞を、請求項１～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）、又は請求項６１若しくは６２に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
  70. 前記オリゴヌクレオチドのシェルが、ＴＬＲアンタゴニストである１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ｔｏｌｌ様受容体が、ｔｏｌｌ様受容体１、ｔｏｌｌ様受容体２、ｔｏｌｌ様受容体３、ｔｏｌｌ様受容体４、ｔｏｌｌ様受容体５、ｔｏｌｌ様受容体６、ｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、ｔｏｌｌ様受容体９、ｔｏｌｌ様受容体１０、ｔｏｌｌ様受容体１１、ｔｏｌｌ様受容体１２、ｔｏｌｌ様受容体１３、又はそれらの組み合わせである、請求項６９又は７０に記載の方法。
  72. インビトロで実施される、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. インビボで実施される、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の方法。
  74. 障害を治療する方法であって、有効量の、請求項１～６０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子球状核酸（ＬＮＰ－ＳＮＡ）、又は請求項６１若しくは６２に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記投与することが、前記障害を治療する、方法。
  75. 前記障害が、がん、感染症、自己免疫疾患、又はそれらの組み合わせである、請求項７４に記載の方法。
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