KR20170141788A - 암 또는 면역학적 질환의 치료를 위한 세포외 기질 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포를 세포외 기질(ECM) 조성물과 접촉시킴으로써 암세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한 암세포를 화학 요법제를 함유하는 세포외 기질 조성물과 접촉시킴으로써 암세포에 화학 요법제를 전달하는 방법이 제공된다. 또한 ECM 및 화학 요법제를 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

암 또는 면역학적 질환의 치료를 위한 세포외 기질 조성물

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2015년 4월 30일자로 출원된 미국 특허 출원 제 62/155,360 호의 35 U.S.C. §119(e)하의 우선권의 이익을 주장하며, 전체 내용이 모두 본원에 참고로 인용된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 세포외 기질 조성물의 용도, 보다 구체적으로는 세포 증식을 억제하기 위한 세포외 기질 조성물의 용도에 관한 것이다.

세포외 기질(ECM)은 포유 동물 조직의 생체 내에서 발견되는 세포를 둘러싸고 지지하는 복잡한 구조체이다. ECM은 흔히 결합 조직으로 언급된다. ECM은 주로 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 구조 단백질, 피브릴린, 피브로넥틴 및 라미닌과 같은 특화된 단백질 및 프로테오글리칸을 비롯한 3가지 주요 종류의 생체 분자로 구성된다.

시험관 내(in vitro)에서 ECM 조성물의 성장 및 다양한 치료학적 및 의학적 응용에서 그의 용도가 당업계에 서술되어 있다. 이러한 ECM 조성물의 한 치료학적 용도는 연조직 및 주름 및 흉터와 같은 피부 결함의 치료 및 복구를 포함한다.

여드름, 수술 흉터 또는 노화와 같은 결함으로 인한 연조직 결함의 복구 또는 증강(augmentation)은 매우 어렵다고 입증되었다. 다양한 정도의 성공률로 연조직 결함을 교정하기 위해 여러 물질이 사용되었지만 어떠한 물질도 완전히 안전하고 효과적이지 못했다. 예를 들어, 실리콘은 결절, 재발성 봉와직염 및 피부 궤양과 같은 장기 부작용을 포함하는 다양한 생리학적 및 임상적 문제를 유발한다.

또한 콜라겐 조성물은 연조직 증강을 위한 주사용 물질로서 사용되어 왔다. 콜라겐은 결합 조직의 주요 단백질이며 포유 동물에서 가장 풍부한 단백질로 전체 단백질 함량의 약 25 %를 차지한다. 문헌(상세한 목록은 하기 표 1 및 2 참조)에 따르면 현재 28가지 유형의 콜라겐이 존재한다. 그러나 체내 90 % 이상의 콜라겐이 콜라겐 I, II, III 및 IV이다.

상이한 콜라겐 물질은 재구성된 주사용 소 콜라겐, 가교결합된 콜라겐 또는 다른 이종 콜라겐과 같은 연조직 결함의 치료에 사용된다. 그러나, 이러한 콜라겐에는 몇 가지 문제점이 있다. 일반적인 문제는 개체에서 알레르기 반응을 피하기 위해 잠재적으로 면역원성 물질을 제거하기 위해 임플란트 물질을 생산하는 복잡성과 높은 비용을 포함한다. 또한 이러한 콜라겐을 사용하는 치료법은 오래 지속되지 않는다.

수성젤(미국 특허 제 5,204,382 호), 열가소성 및/또는 열경화성 물질(미국 특허 제 5,278,202호), 및 젖산 기반 중합체 블랜드(미국 특허 제 4,235,312 호) 중의 생체적합성 세라믹 입자와 같은 연조직 복구 또는 증강을 위해 사용될 수 있는 다른 재료가 또한 기재되어 있다. 또한 자연적으로 분비되는 세포외 기질 조성물의 용도도 기재되어 있다(미국 특허 제6,284,284호). 그러나 그러한 자료에는 모두 한계가 있음이 입증되었다.

따라서, 이전 물질의 결점을 극복하는 연조직 복구 및 증강을 위한 새로운 물질이 필요하다. 안전하고, 주사 가능하고, 오래 지속되며, 생체 흡수성 연조직 복구 및 증강 물질을 제공할 필요가 있다.

시험관 내 배양된 ECM 조성물은 손상된 심근 및 관련 조직과 같은 손상된 조직을 치료하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 심장 및 관련 조직과 같은 기관에서 혈관 형성을 촉진시키기 위해 스텐트 또는 인조 혈관(vascular prosthesis)과 같은 이식 가능한 장치의 임플란트 또는 생물학적 코팅으로서 유용하다.

관상 동맥 질환(CAD), 허혈성 심장 질환 및 죽상동맥경화성 심장 질환이라고도 하는 관상 동맥성 심장 질환(CHD)은 혈액 및 산소를 심장에 공급하는 작은 혈관이 좁아지는 특징이 있다. 관상 동맥성 심장 질환은 대동맥을 좁히는 동맥 벽에 지방질 물질과 플라크가 쌓일 때 발생하는 죽상동맥경화증 이라고 하는 상태에 의해 발생한다. 관상 동맥이 좁아짐에 따라 심장으로의 혈류가 느려지거나 멈추어 가슴 통증(안정 협심증), 호흡 곤란, 심장 마비 및 기타 증상을 유발할 수 있다.

관상 동맥성 심장 질환(CHD)은 미국에서 남성과 여성의 주요 사망 원인이다. 미국 심장 협회(American Heart Association)에 따르면, 1천 5백만이 넘는 사람들이 어떤 형태의 증상을 가지고 있다. 관상 동맥성 심장 질환의 증상과 징후는 병이 진행된 상태에서 분명하지만, 관상 동맥성 심장 질환을 앓고 있는 대부분 사람들은 갑작스런 심장 마비가 발생하기 전에 질환이 진행됨에 따라 수십년 동안 질환의 증거를 보이지 않는다. 이 질환은 돌연사의 가장 흔한 원인이며, 또한 20 세 이상의 남성과 여성의 가장 흔한 사망 원인이다. 미국의 현재 추세에 따르면 건강한 40 세 남성의 절반뿐만 아니라 건강한 40 세 여성 중 3 명 중 한명에서 CHD가 추후 발병할 것이다.

질환 또는 손상된 심장에서 혈류를 개선하기 위한 현재의 방법은 관상 동맥 우회 수술, 혈관 성형술 및 내막 적출술과 같은 침습적인 수술 기법을 포함한다. 이러한 방법은 수술 중 및 수술 후의 높은 수준의 내재적인 위험을 포함하며 종종 심장 허혈에 대한 일시적인 치료만을 제공한다. 따라서, CHD 및 관련 증상 치료의 현재 이용가능한 기술의 성공을 높이기 위해서는 새로운 치료 선택이 필요하다.

시험관 내 배양된 ECM 조성물은 연골 세포 또는 골연골 세포와 같은 손상된 세포 또는 조직을 복구 및/또는 재생시키는데 추가로 사용될 수 있다. 골연골 조직은 뼈 또는 연골과 관련되거나 이를 포함하는 조직이다. 본 발명의 조성물은 류마티스 및/또는 골관절염과 같은 퇴행성 결합 조직 질환뿐만 아니라 외상으로 인한 연골 결함을 갖는 환자의 결함과 같은 골연골 결함의 치료에 유용하다.

골연골 결함을 복구하기 위한 현재의 시도는 관절 연골 병변을 회복할 가능성을 개선하려는 시도에서 생체적합성 및 생분해성 하이드로젤 이식편에 인간 연골 세포를 이식하는 것을 포함한다. 또한 알지네이트 비드 또는 폴리설페이트화 알지네이트를 포함하는 기질에서 연골 세포 배양 기술은 히알린-유사 연골 조직을 생성하는 것으로 기술되어 있다. 그러나 자가 연골 세포를 이식함으로써 관절 연골의 연골 병변을 치료하려는 시도는 제한된 성공을 거두었다. 따라서 골연골 결손 치료를 위한 현재 이용가능한 기술의 성공을 높이기 위해서는 새로운 치료 선택이 필요하다.

또한, 시험관 내 배양된 ECM 조성물은 인공 조직 임플란트의 생성을 위한 조직 배양 시스템에서 유용하다. 조직 공학 분야는 새로운 생물 조직을 생성하거나 손상된 조직을 복구하기 위해 세포 배양 기술 사용을 포함한다. 부분적으로 줄기 세포 혁명에 의해 촉진된 조직 공학 기술은 외상 후 조직 재생과 대체 또는 퇴행성 질환 치료의 가능성을 제공한다. 그것은 또한 미용 시술과 관련하여 사용될 수 있다.

조직 공학 기술은 다양한 세포 유형 및 배양 기술을 사용하여 자가 및 이종 조직 또는 세포 모두를 생성하는데 사용될 수 있다. 자가 임플란트를 생성함에 있어서, 공여 조직은 체취되어 개별 세포로 분리될 수 있으며, 이어서 작용 조직의 원하는 부위에 이식될 기질에서 부착 및 배양될 수 있다. 많은 격리된 세포 유형은 세포 배양 기술을 사용하여 시험관 내에서 확대될 수 있지만, 부착 증식 세포는 성장을 위한 주형으로 작용하기 위해 종종 3차원 스캐폴드의 존재를 포함하여 특정 환경을 필요로 한다.

현재의 조직 공학 기술은 일반적으로 인공 임플란트를 제공한다. 성공적인 세포 이식 치료는 시험관 내 및 생체 내 조직 배양 모두에서 적합한 기질의 개발에 의존한다. 따라서 천연 물질만을 포함하고 이식에 적합한 세포외 기질의 발달은 내인성 조직의 특성을 더 가질 것이다. 따라서, 천연 세포외 기질 물질의 생성은 조직 공학 분야에서 진행 중인 도전이다.

본 발명은 부분적으로 세포외 매트릭스(ECM) 조성물이 생체 내에서 암세포의 성장을 억제할 수 있다는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명의 일 실시 형태에서, 암세포를 본원에 기재된 바와 같은 세포외 기질 조성물과 접촉시킴으로써 암세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에서, 세포 또는 조직을 화학 요법제를 함유하는 세포외 기질 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, 세포 또는 조직에 화학 요법제를 전달하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에서, ECM 및 화학 요법제를 함유하는 조성물이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 면역 조적출을 추가로 함유한다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 전술한 바와 같이 섬유아세포 조건 배지로부터 한외 여과물 세포외 기질 조성물을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 여과물은 5000 달톤 분자량을 초과하는 분자를 제외하고 CD8+ T 세포 동원 활성을 포함한다. 한 양태에서, 상기 조성물은 PD-1 억제제 또는 화학 요법제 또는 모두와 조합된다.

저분자량 여과물은 개체의 암 또는 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 치료학적 유효량의 저분자량 여과물 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 종양 부위에 CD8+ 세포를 동원하거나 종양 크기를 감소시키는 것을 포함하는, 환자의 종양 부하를 줄이거나 암세포 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 한 양태에서, 종양은 투여하기 전에 종양을 적출된다.

또한 본 발명의 조성물은 면역 시스템 질환을 치료하는데 유용하다. 한 실시 형태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 CD8+ 세포를 동원하고 장애를 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 시스템 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어 상기 장애는 장애는 다발성 경화증(multiple sclerosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신 경화증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 원발성경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 백반증(vitiligo), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 원형 탈모증(alopecia areata), 특발성 확장성 심근증(idiopathic dilated cardiomyopathy), 제1형 당뇨병(type 1 diabetes mellitus), 그레이브스 질환(Graves' disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), IgA 신경병증(IgA nephropathy), 막성 신경병증(membranous nephropathy), EBV 감염(EBV infection) 및 악성 빈혈(pernicious anemia)을 포함한다.

도 1은 CAM 검정에서 ECM의 존재 및 부재하에 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 나타낸다.
도 2는 CAM 검정에서 ECM의 존재 및 부재하에 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 나타낸다.
도 3은 CAM 검정에서 ECM의 부재, ECM과 혼합, 또는 ECM 존재 하에서 성장한 B1 세포의 종양 중량의 플롯을 나타낸다.
도 4는 CAM 검정에서 시스플라틴의 함께 또는 없이 ECM의 존재 및 부재 하의 C6 세포의 종양 중량의 플롯을 나타낸다.
도 5는 CAM 검정에서 시스플라틴을 함께 또는 없이 ECM의 존재 및 부재 하의 C6 세포의 종양 중량의 플롯을 나타낸다.
도 6A 및 6B는 ECM의 존재 또는 부재하에 성장한 C6 신경 교종 종양의 조직학적 분석 사진이다.
도 7은 CAM 검정에서 ECM의 존재 및 부재하에 성장한 MDA 435 세포의 종양 중량의 플롯을 나타낸다.
도 8은 누드 마우스에서 처리하지 않은 C6 세포의 종양 성장 사진이다.
도 9는 누드 마우스에서 hECM을 처리한 C6 세포의 종양 성장 사진이다.
도 10은 누드 마우스에서 ECM + 시스플라틴을 처리한 C6 세포의 종양 성장 사진이다.
도 11은 누드 마우스에서 시스플라틴을 처리한 C6 세포의 종양 성장 사진이다.
도 12는 시스플라틴을 함유하거나 함유하지 않은 ECM의 존재 또는 부재하에 누드 마우스에서 C6 신경 교종 종양 성장의 플롯을 도시한다
도 13 A-D는 처리하지 않은 경우(도 13a), HECM 처리한 경우(도 13B), HECM + 시스플라틴 처리한 경우(도 13C) 및 HECM + 시스플라틴 처리한 경우(도 13C), 및hECM과 시스프라틴의 처리한 경우(도 13D)에서 누드 마우스의 MDA 435 세포의 종양 성장의 사진을 나타낸다.
도 14는 시스플라틴을 함께 또는 없이 ECM의 존재 또는 부재하에 누드 마우스에서 MDA 435 종양 성장의 플롯을 나타낸다.
도 15는 설치류에서 ECM의 존재(우측 표본) 및 ECM의 부재(좌측 표본) 하는 경우 B16 세포의 종양 성장의 사진을 나타낸다.
도 16은 CAM 검정에서 액체 ECM의 존재 및 부재하에 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 나타낸다.
도 17은 CAM 검정에서 액체 ECM의 존재하에 성장한 B16 세포의 종양 중량의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 18은 CAM 검정에서 다양한 분자량 분획의 액체 ECM에서 성장한 B16 세포의 종양 중량의 플롯을 나타낸다.
도 19는 105F 처리가 종양 시딩 및 발달의 현저한 감소를 유발하며, 대부분의 경우 75 % 초과의 감소를 나타낸다.
도 20은 종양 크기 및 수의 차이를 나타내는 H&E 염색 절편에서 조직학적 검사를 나타낸다.
도 21은 항-마우스 CD8+ 항체를 사용한 조직학적 검사를 나타내며, TIL 침윤의 수준을 나타낸다. 105F 처리 마우스는 비히클에 비해 T 세포의 종양 내 주입을 강하게 증가시켰다.
도 22는 항-마우스 PD-1 항체를 사용하여 T-세포가 면역 억제되지 않았음을 나타내는, 침윤 T-세포가 PD-1 음성임을 나타내는 조직학적 검사를 나타낸다. 이 결과는 105F의 종양 내 주입한 피하 모델에서 반복 검증되었다(검정 화살표는 양성 PD-1 염색을 나타냄).
도 23은 마우스 폐 절편을 염색하기 위한 항PDL-1에 의한 조직학적 검사를 나타낸다. PD-1 결과는 반복 검증되었고, 105F에서 음성이었고 대조군에서는 양성이었지만, PDL-1 리간드에 대한 염색은 변하지 않았다.
도 24A 내지 24H는 저분자량 ECM, 105F로 처리한 후 세포에서의 유전자 발현의 분석을 나타낸다. 도 24A-신호 전달; 24B-분자 기능; 24C-단백질 종류; 24D-흑색종 및 췌장암세포주에서 TNF 패밀리 유전자 발현; 24E-인터페론; 24F-Wnt 억제제 유전자 발현의 조절; 24G-표준(canonical) Wnt 유전자 발현; 및 24H-흑색종 및 췌장암 세포주에서 비-기본 Wnt 유전자 발현.
도 25A-25D는 흑색종에서 105F에 의한 카스파제-매개된 세포자살의 유도를 나타낸다. A-세포 역가 Glo 검정; B-상 대조, RFP 및 면역 염색; C-웨스턴 블롯; D-MTT 분석을 위한 그래프.
도 26은 면역 세포가 염증성 사이토카인 및 케모카인을 증가시킴으로써 105에 반응한다는 것을 보여주는 막 배열을 나타낸다.
도 27은 105F가 시험관 내에서 N-Ras 흑색종 IL-6 분비를 증가시키는 것을 보여주는 그래프를 나타낸다. ELISA를 사용하여, 105F로 처리한 후 DO4 흑색종 세포로부터 IL-6의 방출을 나타낸다. 2 개의 C-C 케모카인, MCP-1 및 MCP-5와 함께 전 염증성 사이토카인인 IL-6 및 IL-12p70이 105F 처리 후 상향 조절되었다.
도 28은 C57/B16 마우스에서 B16F10 피부 종양으로부터의 폐 전이의 감소를 나타내는 그래프이다. B16F10의 편평 종양이 형성된 2 주후에 C57/B16 마우스에서 폐를 해부하였다. 105F를 10-14 일 동안 매일 정맥 주사하였다.
도 29는 공동 배양된 MSC1 및 암세포 +/- 105F의 CFU 검정이다.

본 발명은 단독으로 암세포의 성장 또는 증식을 억제하기 위해 또는 화학 요법제의 전달을 위한 생물학적 비히클로서 세포외 기질 조성물의 사용 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물 및 방법이 기술되기 전에, 본 발명은 기술된 특정 조성물, 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 그러한 조성물, 방법 및 조건은 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구범위에 한정되기 때문에 제한하려는 것이 아님을 이해해야한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 인용을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"은 하나 이상의 방법들 및/또는 본 명세서를 읽을 때 당업자에게 명백해질, 본원에 기술된 유형의 단계들을 포함한다.

본 발명의 하나의 실시 형태에서, 상기 방법은 암세포를 세포외 기질 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 암세포 성장 또는 증식을 억제하는 방법이 제공된다. 몇몇 실시 형태에서, ECM은 가용성 분획물일 수 있고, 다른 실시 형태에서 ECM은 비가용성 분획물일 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, ECM은 가용성 및 비가용성 분획물의 조합일 수 있다.

특정 실시 형태에서, 암세포는 종양에서 유래된 것이다. 몇몇 양태에서, 암은 흑색종, 신경아교종 및 선암(adenocarcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 양태에서, 암은 부신, 방광, 뼈, 골수, 뇌, 척추, 유방, 자궁 경부, 담낭, 신경절, 위장관, 위, 결장, 심장, 신장, 간, 폐, 근육, 자궁, 췌장, 부갑상샘, 음경, 전립선, 침샘, 피부, 비장, 고환, 가슴샘, 갑상선, 또는 자궁과 같은 종양을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. 다른 양태에서, 암은 유방암이며, 또 다른 양태에서, 암은 흑색종이다.

특정 실시 형태에서 암은 백혈병을 포함하며, AML, CML, ALL, CLL, 림프종, 다발성 골수종을 포함하나 이에 제한되지 않는, 조혈암이다.

본 발명의 또 다른 실시 형태에서, 암세포에 화학 요법제를 전달하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 암세포를 화학 요법제를 함유하는 세포외 기질 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.

하나의 양태에서, 접촉은 종양이 적출된 영역의 수술 가장자리에서 발생한다. 이러한 실시 형태에서, 종양은 임상의에게 알려진 표준 수술 기법을 사용하여 개체로부터 제거된다. 본 발명의 ECM 조성물은 종양 적출(절제)시 남아있는 공간에 놓여 ECM은 수술 가장자리와 접촉하게 된다. 특정 실시 형태에서, ECM은 종양 가장자리에 있는 암세포의 성장을 억제할 수 있다. ECM 조성물은 면역 조적출와 함께 또는 없이 화학 요법제를 추가로 함유할 수 있다. 외과적 적출수술 후 암 치료에 본 발명의 ECM 조성물을 사용하는 것은 종양 부위에 화학 요법제 및/또는 면역 조적출의 국부적이고 지속적인 방출 전달을 제공하는 이점을 갖는다. 추가적인 이점으로는 수술 상처의 치유 개선과 미용 결과 개선이 포함될 수 있다

본 발명의 또 다른 실시 형태에서는 ECM 및 화학 요법제를 함유하는 조성물이 제공된다. 몇몇 실시 형태에서, 상기 조성물은 면역 조적출을 추가로 함유한다.

몇몇 실시 형태에서, 세포외 기질 조성물은 적절한 성장 배지에서 2차원 또는 3차원 표면상의 저산소 조건하에서 세포를 배양함으로써 생성된다. 배양 방법은 다양한 용도를 갖는 생리학적으로 허용 가능한 조성물을 수득하기 위해 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 가용성 및 비가용성 분획물을 생성한다. 다른 실시 형태에서, 세포는 표준 또는 정상 산소 조건하에서 배양될 수 있다.

본 발명의 조성물은 암세포의 성장 또는 증식 억제, 치료제의 전달, 손상된 세포 또는 조직의 복구 및/또는 재생 촉진, 조직 재생 촉진을 위한 패치, 줄기 세포와 같은 세포 배양을 위한 조직 배양 시스템에서의 용도, 이식 가능한 장치(예, 맥박 조정기, 스텐트, 스텐트 이식편, 인조 혈관, 심장 판막, 분지, 약물 전달 포트 또는 카테터)와 관련하여 사용되는 표면 코팅에 사용, 연 조직 복구 촉진, 증강 및/또는 주름과 같은 피부 표면의 개선, 생물학적 항-부착제로서 또는 전달 부위에서의 세포 전달 또는 유지를 위한 생물학적 비히클로서의 사용을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않은 다양한 용도를 가질 수 있다.

본 발명은 부분적으로, 혈관 신생에 앞서 초기 배아 환경(저산소증 및 감소된 중력)을 자극하는 조건하에 2차원 또는 3차원 표면상에서 배양된 세포가 태아 성질을 갖는 배아 단백질의 생성을 포함하는, 세포외 기질 조성물을 생성한다는 발견에 기초한다. 저산소 조건하에서 세포의 성장은 태아 성질 및 성장인자 발현을 갖는 독특한 ECM을 나타낸다. 전통적인 배양 조건에서 ECM의 배양과는 달리 5000 개 이상의 유전자가 저산소 조건에서 배양된 ECM에서 다르게 발현된다. 배양된 ECM에서의 이러한 결과는 상이한 특성 및 상이한 생물학적 조성을 갖는다. 예를 들어, 저산소 조건에서 생성된 ECM은 콜라겐 유형 III, IV및 V 및 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘(thrombospondin) 및 히알루론산과 같은 당단백질이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 간엽 조직과 유사하다.

또한 저산소증은 wnt 2b, 4, 7a, 10a 및 11을 포함하는 많은 Wnt 인자뿐만 아니라 VEGF, FGF-7 및 TGF-β와 같은 상처 치유 및 기관 형성을 조절하는 인자의 발현을 증가시킨다. 또한 배양된 배아 인간 ECM은 증가된 효소 활성에 의해 측정된 바와 같이, 시험관 내에서 인간 섬유아세포의 대사 활성의 증가를 자극한다. 또한 배양된 배아 ECM에 반응하여 세포 수가 증가한다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명은 하나 이상의 배아 단백질 및 이의 용도를 포함하는 세포외 기질 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 특히, 조성물은 적합한 성장 배지에서 2차원 또는 3차원 표면상의 저산소 조건하에서 세포를 배양함으로써 생성된다. 상기 조성물은 다층 세포 배양 시스템을 초래하는 골격상에 세포를 성장시킴으로써 유도된다. 본 발명에 따라 골격 구조체상에서 성장한 세포는 다층으로 성장하여 세포 기질을 형성한다. 저산소 조건하에서 배양된 세포의 성장은 전통적인 배양과 비교하여 저산소 배양 조건의 결과로서 상이한 유전자 발현을 초래한다.

세포외 기질(ECM)은 실질적으로 세포의 배양에 의해 생성되는 조직을 포함하는 단백질 및 바이오 중합체의 조성물이다. 섬유아세포와 같은 기질 세포는 세포 배양에 적합한 물질 및 표면에 부착되는 동안 성장을 요구하는 부착 의존성 세포 유형이다. 배양된 세포에 의해 생성된 ECM 물질은 조직-유사 구조의 형성을 위한 공간을 제공하는 3차원 배열로 부착된다.

3차원 구조를 제공하는 배양 물질은 스캐폴드로 언급된다. ECM의 부착을 위한 공간은 예를 들어 마이크로 캐리어라고 불리는 구형 비드의 조밀한 형상으로 생성된 직조된 메쉬 또는 간질 공간 내의 개구부 형태이다.

본원에서 사용되는 "세포외 기질 조성물"은 가용성 및 비가용성 분획 또는 이들의 임의의 일부 또는 조합을 포함한다. 비가용성 분획물에는 구조체 또는 스캐폴드에 부착된 분비된 세포외 기질 단백질 및 생물학적 성분이 포함된다. 가용성 분획물은 세포가 배양되고 세포가 활성제를 분비한 배양 배지를 지칭하고, 스캐폴드에 부착되지 않은 단백질 및 생물학적 성분을 포함한다. 모든 분획물을 수집하고 선택적으로 추가로 가공하여 본원에 기재된 바와 같이 다양한 용도로 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. ECM은 사체 조직으로부터 얻을 수도 있다(미국 특허 제 6,284,284 호 및 제 6,372,494 호).

상기 가용성 분획물은 최적의 농도를 달성하기 위해 농축되거나 희석될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 농도는 약 1mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5mg/mL, 약 10mg/mL, 약 50mg/mL, 약 100mg/mL, 또는 약 200mg/mL 일 수 있다. 상기 농도는 예를 들어 약 0.1mg/mL 내지 1000mg/mL, 또는 약 1 내지 200mg/mL, 또는 약 10mg/mL 내지 100mg/mL 범위일 수 있다.

가용성 분획은 분자량에 따라(예, 투석, 여과 또는 크로마토그래피에 의해) 분획화되어 분획 내의 용질 분자의 대부분이 특정 분자량 컷오프(cutoff)를 충족한다. 컷오프 값은 절대적인 값이 아니고 주어진 분획에 함유된 용질 분자의 다수(예, 70 %, 80 %, 90 % 또는 95 %)가 분자량 컷오프를 충족하는 것으로 인식될 것이다. 따라서, 본원에서 제공된 방법의 특정 실시 형태에서, ECM 조성물은 그 안에 함유된 용질 분자의 70 % 또는 80 % 또는 90 %가 5,000 달톤 미만, 또는 10,000 달톤 미만, 또는 30,000 달톤 미만, 또는 100,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 가용성 분획을 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, ECM은 그 안에 함유된 용질 분자가 5000 달톤 초과, 또는 10,000 달톤 초과, 또는 30,000 달톤 초과 또는 100,000 달톤 초과의 분자량을 갖는 가용성 분획을 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, ECM은 그 안에 함유된 용질 분자가 10,000 내지 100,000 달톤, 또는 30,000 내지 100,000 달톤, 또는 10,000 내지 30,000 달톤의 분자량을 갖는 가용성 분획을 포함할 수 있다.

기질 세포를 배양하는데 사용되는 2차원 또는 3차원 구조체 또는 스캐폴드는 (a) 세포가 이에 부착되도록 하고(또는 세포가 그것에 부착될 수 있도록 변형될 수 있고); 및 (b) 세포가 하나 초과의 층으로 성장하도록 하는(즉, 3차원 조직을 형성하는) 임의의 물질 및/또는 형태일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 실질적으로 2차원 시트 또는 막이 충분히 3차원 형태인 세포를 배양하는데 사용될 수 있다.

생체적합성 재료는 2차원 또는 3차원 구조체 또는 스캐폴드로 형성되며, 상기 구조체는 세포를 3차원 조직으로 부착 및 성장시키기 위한 간질 공간을 갖는다. 몇몇 실시 형태에서 골격의 개구부 또는 간질 공간은 가로질러 늘어날 수 있도록 하는 적절한 크기의 개구부 및/또는 공간이다. 골격을 가로지르며 늘어나는 성장하는 세포를 유지하는 것은 여기에 기술된 활동을 담당하는 성장인자의 모든 생산을 향상시키는 것으로 보인다. 개구부가 너무 작으면 세포가 빠르게 합류할 수 있지만 쉽게 메쉬에서 빠져 나올 수 없다. 이렇게 갇힌 세포는 접촉 억제를 나타낼 수 있으며 증식을 지원하고 장기간의 배양을 유지하는 데 필요한 적절한 요소의 생산을 중단시킬 수 있다. 개구부가 너무 크면 세포가 개구부를 가로질러 늘어날 수 없으며 이로 인해 기질 세포에서 증식을 지지하고 장기간의 배양을 유지하는데 필요한 적절한 인자의 생산이 감소될 수 있다. 일반적으로, 간질 공간은 적어도 약 100 ㎛, 적어도 140 ㎛, 적어도 약 150 ㎛, 적어도 약 180 ㎛, 적어도 약 200 ㎛ 또는 적어도 약 220 ㎛이다. 본 명세서에 예시된 바와 같이 메쉬 유형의 기질을 사용할 때, 약 100 ㎛ 내지 약 220 ㎛ 범위의 개구부가 만족스럽게 작동한다는 것을 발견했다. 그러나 골격의 3차원 구조와 복잡성에 의존하여 다른 크기도 허용된다. 세포가 신장되고 장기간 동안 계속 복제 및 성장할 수 있게 하는 임의의 모양 또는 구조는 본원의 방법에 따라 세포 인자를 정교하게 기능할 수 있게 한다.

몇몇 양태에서, 3차원 골격은 메쉬 또는 직물과 같은 골격을 형성하도록 편조, 제직, 편직 또는 다른 방식으로 배열된 중합체 또는 실로 형성된다. 또한 물질은 물질 또는 제조물을 폼(foam), 기질 또는 스폰지형 스캐폴드로 주조함으로써 형성될 수 있다. 다른 양태에서, 3차원 골격은 중합체 또는 다른 섬유를 함께 눌러서 간질 공간을 갖는 물질을 생성시킴으로써 제조된 매트형태의 섬유이다. 3차원 골격은 배양중인 세포의 성장을 위한 임의의 형태 또는 기하 구조를 취할 수 있다. 따라서, 후술되는 바와 같이, 골격의 다른 형태는 적절한 조건 배지를 생성하기에 충분할 수 있다.

다수의 상이한 물질이 스캐폴드 또는 골격을 형성하는데 사용될 수 있다. 이러한 물질에는 비중합 및 중합 물질이 포함된다. 중합체는 단독 중합체, 랜덤 중합체, 공중합체, 블록 중합체, 공-블록 중합체(예, 디, 트리 등), 선형 또는 분지형 중합체 및 가교 또는 비-가교 중합체와 같은 임의의 유형의 중합체 일 수 있다. 스캐폴드 또는 골격으로서 사용하기 위한 물질의 비제한적인 예로는 유리 섬유, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아마이드(예, 나일론), 폴리에스테르(예, 다크론), 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐 화합물(예, 폴리비닐 클로라이드, PVC 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE; TEFLON), 썰만녹스(thermanox, TPX), 니트로 셀룰로스, 폴리사카라이드(예, 셀룰로오스, 키토산, 아가로오스), 폴리펩티드(실크, 젤라틴, 콜라겐), 폴리글리콜산(PGA) 및 덱스트란을 포함한다.

몇몇 양태에서, 골격은 사용 조건하에서 시간이 경과함에 따라 분해되는 물질로 이루어질 수 있다. 또한 생분해성은 생체 내 또는 시험관 내 조건하에서 투여될 때 화합물 또는 조성물의 흡수성 또는 분해를 의미한다. 생분해는 직접적으로 또는 간접적으로 생물 제제의 작용을 통해 일어날 수 있다. 생분해성 물질의 비제한적인 예로는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리(트리 메틸렌 카보네이트), 폴리락타이드-코-글리콜라이드(즉, PLGA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리카프로락톤, 창자실 봉합사 물질(catgut suture material), 콜라겐(예, 말 콜라겐 폼), 폴리락트산 또는 히알루론산을 포함한다. 예를 들어, 이러한 물질은 콜라겐 스폰지 또는 콜라겐 젤과 같은 3차원 골격으로 직조될 수 있다.

다른 양태에서, 상기 배양물을 장시간 동안 유지, 동결 보존 및/또는 부가적인 구조적 완전성이 요구되는 경우, 3차원 골격은 비생분해성 물질로 이루어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 비생분해성 물질은 배양 배지의 조건하에서 현저하게 분해되지 않는 물질에 관한 것이다. 예시적인 비분해성 물질은 나일론, 다크론, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 팽창된 PTFE(ePTFE) 및 셀룰로오스를 포함한다. 예시적인 비분해 3차원 골격은 상품명 Nitex^® 하에 입수 가능한 나일론 메쉬인, 140㎛의 평균 공극 크기 및 90㎛의 평균 나일론 섬유 직경(# 3-210/36, Tetko, Inc., NY)을 갖는 나일론 여과 메쉬를 포함한다.

다른 양태에서, 스캐폴드 또는 골격은 생분해성 물질과 비생분해성 물질의 조합이다. 비생분해성 물질은 배양 중 스캐폴드에 안정성을 제공하는 반면, 생분해 성 물질은 치료적 용도에 충분한 세포 인자를 생성하는 세포 네트워크를 생성하기에 충분한 간질 공간의 형성을 허용한다. 생분해성 물질은 비생분해성 물질에 코팅되거나 직조, 편조 또는 메쉬로 형성될 수 있다. 생분해성 물질과 비생분해성 물질의 다양한 조합이 사용될 수 있다. 예시적인 조합은 극성 구조를 얻기 위해 얇은 생분해성 중합체 필름, 폴리[D-L-락틱-코-글리콜산]으로 코팅된 폴리(에틸렌 프탈레이트)(PET) 직물이다.

다양한 양태에서, 스캐폴드 또는 골격 물질은 세포 부착을 향상시키기 위해 세포 접종 전에 전처리될 수 있다. 예를 들어, 세포를 접종하기 전에, 몇몇 실시 형태에서 나일론 스크린을 0.1 M 아세트산과 함께 처리하고, 폴리라이신, 태아 소혈청, 및/또는 콜라겐을 배양하여 나일론을 코팅한다. 폴리스티렌은 황산을 사용하여 유사하게 처리할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 3차원 지지 골격 존재 하에 세포의 성장은 골격에 첨가하거나 세포의 부착을 향상시키기 위해 단백질(예, 콜라겐, 엘라스틴 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코사미노글리칸(예, 콘드로이틴-6-설페이트, 덜마탄 설페이트, 케라틴 설페이트 등), 피브로넥틴 및/또는 글리콜 중합체(폴리[Np-비닐 벤질-D-락토 아미드], PVLA)로 골격을 코팅함으로써 추가적으로 향상될 수 있다. 스캐폴드 또는 골격의 처리는 물질이 세포 부착에 좋지 못한 기질일 때 유용하다.

한 양태에서, 메쉬는 ECM의 생성에 사용된다. 메쉬는 약 100 ㎛의 개구부가 약 125 ㎛의 두께를 갖는 평직 형태의 직조된 나일론 6 물질이다. 배양에서, 섬유아세포는 하전된 단백질 상호 작용을 통해 나일론에 부착하고, ECM 단백질을 생산하고 부착시키면서 메쉬의 공극안으로 성장한다. 과도하게 크거나 작은 메쉬 개구부는 효과적이지 않을 수 있지만, ECM을 생성하거나 부착시키는 능력을 실질적으로 변화시키지 않으면서 상기한 것과 상이할 수 있다. 다른 양태에 있어서, 폴리올레핀과 같은 다른 짜여진 물질은 세포 성장 및 ECM 부착을 위한 적절한 기하학을 제공하는 짜여진 형태에서 ECM 생산에 사용된다.

예를 들면, 원하는 크기로 절단, 0.1~0.5 M 아세트산으로 세정, 고순도 물로 헹구고 증기 멸균함으로써, 본 발명의 임의의 단계에서 배양하기 위해 나일론 메쉬를 제조한다. ECM 생산을 위한 3차원 스캐폴드로 사용하기 위해 그물망은 약 10cm x 10cm의 정사각형으로 크기가 정해진다. 그러나, 메쉬는 목적하는 용도에 적합한 임의의 크기일 수 있으며, 접종, 세포 성장 및 ECM 생산을 위한 배양 방법 및 최종 형태의 제조를 포함하는 본 발명의 방법 중 어느 하나에서 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 배양된 3차원 조직을 생성하기 위한 스캐폴드 또는 골격은 비드 또는 입자인 마이크로 캐리어로 구성된다. 비드는 미세하거나 거시적일 수 있으며, 또한 조직 내로 침투하거나 특정 기하학적 형태를 형성을 위해 압축될 수 있도록 치수가 정해질 수 있다. 몇몇 조직 침투 실시 형태에서, 세포 배양물의 골격은 세포와 결합하여 3차원 조직을 형성하는 입자를 포함한다. 세포는 입자에 서로 부착하여 3차원 조직을 형성한다. 입자 및 세포의 복합체는 주사 또는 카테터와 같이 조직 또는 장기에 투여하기에 충분한 크기이다.

본원에 사용된 바와 같이, "마이크로 캐리어"는 나노미터 내지 마이크로미터의 크기를 갖는 입자를 말하며, 입자는 임의의 형상 또는 기하구조일 수 있으며, 불규칙, 비구형, 구형 또는 타원형일 수 있다. 일반적으로 비즈 또는 마이크로 캐리어에서의 성장은 2차원 시스템 또는 스캐폴드 또는 골격이라고 언급된다.

본원의 목적에 적합한 마이크로 캐리어의 크기는 특정 용도에 적합한 임의의 크기일 수 있다. 몇몇 실시 형태에서, 3차원 조직에 적합한 마이크로 캐리어의 크기는 주사 투여가 가능한 크기일 수 있다. 몇몇 실시 형태에서, 마이크로 캐리어는 적어도 약 1 ㎛, 적어도 약 10 ㎛, 적어도 약 25 ㎛, 적어도 약 50 ㎛, 적어도 약 100 ㎛, 적어도 약 200 ㎛, 적어도 약 300 ㎛, 적어도 약 400 ㎛, 적어도 약 500 ㎛, 적어도 약 600 ㎛, 적어도 약 700 ㎛, 적어도 약 800 ㎛, 적어도 약 900 ㎛, 적어도 약 1000 ㎛의 크기를 갖는다.

몇몇 양태에서 마이크로 캐리어가 생분해성 물질로 제조된다. 몇몇 양태에서, 2 이상의 다른 생분해성 중합체 층을 포함하는 마이크로 캐리어가 사용될 수 있다. 몇몇 실시 형태에서 적어도 외부의 제1 층은 배양 중에 3차원 조직을 형성하기 위한 생분해성을 갖는 반면에, 제1 층과는 다른 성질을 갖는 적어도 생분해성 내부 제2 층은 조직 또는 기관 내로 투여될 때 약화되도록 제조된다.

몇몇 양태에서, 마이크로 캐리어는 다공성 마이크로 캐리어이다. 다공성 마이크로 캐리어는 분자가 미립자 안과 밖으로 확산할 수 있는 작은 틈을 갖는 마이크로 캐리어를 의미한다. 다른 실시 형태에서, 마이크로 캐리어는 비다공성 마이크로 캐리어다. 비다공성 미립자는 선택된 크기의 분자가 미립자 안과 밖으로 확산하지 않는 미립자를 지칭한다.

조성물에 사용하기 위한 마이크로 캐리어는 생체적합성이고 세포에 대한 독성이 적거나 전혀 없다. 적절한 마이크로 캐리어는 치료될 조직, 치료될 손상 유형, 원하는 치료 기간, 생체 내 세포 배양물의 수명 및 3차원 조직을 형성하는데 필요한 시간에 따라 선택될 수 있다. 마이크로 캐리어는 천연 또는 합성, 하전성(즉, 음이온성 또는 양이온성) 또는 비하전성, 생분해성 또는 비생분해성인 다양한 중합체를 포함할 수 있다. 중합체는 단독 중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 이식편 공중합체 및 분지형 중합체일 수 있다.

마이크로 캐리어는 비생분해성 마이크로 캐리어를 포함한다. 비생분해성 마이크로 캡슐 및 마이크로 운반체는 폴리술폰, 폴리(아크릴로니트릴-코-비닐 클로라이드), 에틸렌-비닐 아세테이트, 하이드록시에틸메타크릴레이트-메틸-메타 크릴레이트 공중합체로 제조된 것을 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 이들은 조직 팽창 특성을 제공하거나 또는 마이크로 캐리어가 신체에 의해 제거되는 실시 형태에서 유용하다.

몇몇 양태에서 마이크로 캐리어는 분해성 스캐폴드를 포함한다. 이들은 자연적으로 발생한 중합체로 제조된 마이크로 캐리어를 포함하며, 그 중 비제한적인 예로 피브린, 카제인, 혈청 알부민, 콜라겐, 젤라틴, 레시틴, 키토산, 알긴산 또는 폴리-리신과 같은 폴리-아미노산을 들 수 있다. 다른 양태에서 분해성 마이크로 캐리어는 폴리락티드(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA), 폴리(락티드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리(카프로락톤) 또는 폴리디옥사논 트리메틸렌 카보네이트, 폴리하이드록시 알카노에이트(예, 폴리(하이드록시부티레이트), 폴리(에틸 글루타메이트), 폴리(DTH 이미노카보닐(비스페놀 A 이미노카보네이트), 폴리(오르토 에스테르) 및 폴리시아노아크릴레이트)를 포함한다.

몇몇 양태에서, 마이크로 캐리어는 일반적으로 물로 채워진 친수성 중합체 네트워크인 하이드로젤을 포함한다. 하이드로젤은 폴리머 팽창을 선택적으로 유발할 수 있다는 장점이 있다. 중합체 네트워크의 조성에 따라, 미립자의 팽창은 pH, 이온 강도, 열적, 전기적, 초음파 및 효소 활성을 포함하는 다양한 자극에 의해 유발될 수 있다. 하이드로젤 조성물에 유용한 중합체의 비제한적인 예는 특히, 폴리(락티드-코-글리콜리드)의 중합체; 폴리(N-이소프로필아크릴아미드); 폴리(메타크릴산-g-폴리에틸렌 글리콜); 폴리아크릴산 및 폴리(옥시프로필렌-코-옥시에틸렌) 글리콜; 및 콘드로이틴 설페이트, 키토산, 젤라틴, 피브리노겐 또는 합성 및 천연 중합체의 혼합물, 예를 들어 키토산-폴리(에틸렌 옥사이드)와 같은 천연 화합물을 포함할 수 있다. 중합체는 가역적으로 또는 비가역적으로 가교되어 3차원 조직을 형성하기에 적합한 젤을 형성할 수 있다.

본 발명에 따르면, 배양 방법은 섬유아세포와 같은 기질 세포 및 특히 일차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 포함하는 상이한 유형의 세포의 증식에 사용할 수 있다. 다양한 양태에서, 골격상에 접종된 세포는 후술되는 바와 같이 다른 세포를 함께 또는 없이 섬유아세포를 포함하는 기질 세포일 수 있다. 몇몇 실시 형태에서 세포는 일반적으로 결합 조직에서 유래된 기질 세포이며, 이에 제한되지 않는다:(1) 뼈;(2) 콜라겐 및 엘라스틴 포함하는 느슨한 결합 조직;(3) 인대와 힘줄을 형성하는 섬유질 결합 조직,(4) 연골;(5) 혈액의 세포외 기질;(6) 지방 세포를 포함하는 지방 조직;(7) 섬유아세포.

기질 세포는 생검(적절한 경우) 또는 부검에 의해 얻을 수 있는 피부, 심장, 혈관, 골수, 골격근, 간, 췌장, 뇌, 포피와 같은 다양한 조직 또는 장기로부터 유래될 수 있다. 한 양태에서, 태아 섬유아세포는 신생아 포피와 같은 포피에서 대량으로 얻을 수 있다.

몇몇 양태에서, 세포는 태아, 신생아, 성인 기원 또는 이들의 조합으로부터의 것일 수 있는 섬유아세포를 포함한다. 몇몇 양태에서 기질 세포는 다양한 세포 및/또는 조직의 성장을 지지할 수 있는 태아 섬유아세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 태아 섬유아세포는 태아 근원으로부터 유래된 섬유아세포를 의미한다. 본 명세서에서 신생아 섬유아세포는 신생아 근원에서 유래된 섬유아세포를 의미한다. 적절한 조건하에서, 섬유아세포는 뼈 세포, 지방 세포 및 평활근 세포 및 중배엽 기원의 다른 세포와 같은 다른 세포를 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시 형태에서, 섬유아세포는 피부로부터 유래된 섬유아세포인 피부 섬유아세포를 포함한다. 정상적인 사람의 피부 섬유아세포는 신생아 포피에서 분리될 수 있다. 이러한 세포들은 일반적으로 일차 배양 말기에 냉동 보관된다.

다른 양태에서, 3차원 조직은 단독으로 또는 본원에서 기술된 임의의 세포 유형과 조합하여 줄기 세포 또는 전구 세포를 사용하여 제조될 수 있다. 줄기 세포 및 전구 세포는 배아 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 표피 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포를 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 실시 형태에서, "특정" 3차원 조직은 특정 장기, 즉 피부, 심장 및/또는 나중에 받아들일, 특정 개인으로부터 유래된 세포 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 배양된 세포 및/또는 조직로 스캐폴드를 접종함으로써 제조될 수 있다.

생체 내 특정 용도에 있어서, 환자 고유의 조직으로부터 기질 세포를 수득하는 것이 바람직하다. 기질 지지 골격의 존재하에 세포의 성장은 골격에 추가하거나 골격 구조체를 콜라겐, 라미닌, 탄성 섬유, 망상 섬유, 당단백질과 같은 단백질; 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 덜마탄 설페이트, 케라탄 설페이드; 세포 기질 및/또는 다른 물질로 코팅함으로써 더욱 향상될 수 있다.

따라서, 본원에 기재된 2차원 또는 3차원 배양 시스템은 다양한 세포 유형 및 조직의 성장에 적합하고 배양될 조직 및 원하는 콜라겐 유형에 따라 적절한 기질 세포가 골격에의 접종을 위해 선택될 수 있다.

본 발명의 방법 및 용도는 상이한 세포 유형, 예컨대 조직 특이적 세포 또는 본원에서 논의된 기질 세포의 상이한 유형과 함께 사용하기에 적합하지만, 또한 본 발명에서 사용하기 위한 세포 유래는 종 특이적일 수 있다. 따라서, ECM 조성물이 종 특이적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 세포는 인간 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포는 인간 섬유아세포일 수 있다. 마찬가지로 말은 이퀸(말), 카닌(개) 또는 팰린(고양이) 세포와 같은 동물의 다른 종에서 유래한 것이다. 또한 한 종 또는 종 균주의 세포는 다른 종 또는 관련 균주(예, 동종이계, 동종동계 및 이종)에서 사용하기 위한 ECM 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다. 또한 다양한 종으로부터 기원된 세포가 조합되어 다종 ECM 조성물을 생성할 수 있음을 이해해야 한다.

따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 사람이 아닌 동물을 포함하는 용도에 적합하다. 본 명세서에서 사용되는 "수의학"이란 동물, 특히 가축에 대한 의학적 또는 외과적 치료와 관련된 의료 과학을 의미한다. 일반적인 수의 동물은 포유류, 양서류, 조류, 파충류 및 어류를 포함할 수 있다. 예를 들어, 전형적인 포유 동물은 개, 고양이, 말, 토끼, 영장류, 설치류, 소, 말, 염소, 양 및 돼지와 같은 가축을 포함할 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 추가의 세포가 기질 세포와 함께 배양물에 존재할 수 있다. 이러한 추가 세포는 수많은 유익한 효과를 가질 수 있는데, 그 중에 배양에서 장기 성장을 지지, 성장인자의 합성을 향상 및 스캐폴드에 세포의 부착을 촉진시키는 것을 포함한다. 추가적인 세포 유형은 평활근 세포, 심근 세포, 내피 세포, 골격근 세포, 내피 세포, 주피세포, 대식세포, 단구세포 및 지방세포를 포함한다. 이러한 세포는 섬유아세포가 없는 경우 섬유아세포 또는 몇몇 양태에서 골격에 접종될 수 있다. 이러한 기질 세포는 피부, 심장, 혈관, 골수, 골격근, 간, 췌장 및 뇌를 포함하나, 이에 한정되지 않고 적절한 조직 또는 장기로부터 유래될 수 있다. 다른 양태에서, 하나 또는 그이상의 다른 세포 유형은 섬유아세포를 제외하고 스캐폴드에 접종된다. 다른 양태에서, 상기 스캐폴드는 섬유아세포에만 접종된다.

섬유아세포는 섬유아세포의 공급원으로 작용할 적절한 장기 또는 조직을 분리함으로써 쉽게 격리될 수 있다. 예를 들어, 조직 또는 기관은 기계로 분리 및/또는 상당한 세포 파괴 없이 개별 세포의 현탁액 내로 조직을 분산시키는 것을 가능하게 하는, 이웃 세포 사이의 연결을 약화시키는 소화 효소 및/또는 킬레이트제로 처리될 수 있다. 효소 분리는 조직을 잘게 다지고 다진 조직을 수많은 소화 효소 중 임의의 효소를 단독으로 또는 조합하여 처리함으로써 수행될 수 있다. 이들은 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제, 히알루로니다제, DNase, 프로나제 및/또는 디스페아제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 기계적 파괴는 분쇄기, 블랜더, 체, 균질기, 압력 세포, 또는 초음파 입사를 포함할 수 있다. 적출된 포피 조직은 소화 효소, 일반적으로 콜라게나제 및/또는 트립시나아제를 사용하여 세포를 캡슐화 구조에서 분리한다.

예를 들어, 섬유아세포의 분리는 하기와 같이 수행될 수 있다: 신선한 조직 샘플을 혈청을 제거하기 위해 행크스(Hanks) 균형 염 용액(HBSS)에서 철저하게 세척하고 다진다. 다진 조직은 트립신과 같은 분리 효소의 새롭게 제조된 용액에서 1 내지 12 시간 동안 배양한다. 배양 후, 분리된 세포를 현탁시키고, 원심 분리에 의해 펠렛화하고 배양 접시 상에 배양한다. 모든 섬유아세포는 다른 세포보다 먼저 붙을 것이므로 적절한 기질 세포가 선택적으로 분리되고 자랄 수 있다. 그런 다음 분리된 섬유아세포를 융합되게 성장시키고 융합된 배양물로부터 들어올리고 3차원 골격 위에 접종할 수 있다(참고: Naughton et al., 1987, J. Med. 18(3 & 4): 219-250). 고농도의 기질 세포, 예를 들어 약 10⁶ 내지 5 × 10⁷ 세포/ml와 함께 3차원 골격의 접종은 짧은 시간 내에 3차원 기질 구조체를 확립할 수 있다.

일단 조직이 개별 세포의 현탁액으로 환원되면, 현탁액은 섬유아세포 및/또는 다른 기질 세포 및/또는 수득될 수 있는 요소가 부분 집단으로 분획화될 수 있다. 또한 이것은 특정 세포 유형의 클로닝 및 선별, 불필요한 세포의 선택적 파괴(음성 선택), 혼합 집단 내 차별화 세포 응집성(differential cell agglunitability)에 기초한 분리, 동결 융해 공정, 혼합 집단 내 차별화된 세포의 부착 성질, 여과, 통상의 및 띠형 원심 분리, 원심 세정(카운터-스트리밍 원심 분리), 단위 중력 분리, 역류 분배, 전기 영동 및 형광-활성화 세포 분류를 포함하는 세포 분리 표준 기술을 사용함으로써 수행될 수 있다. 클론 선택 및 세포 분리 기술에 대한 검토는 Freshney, Animal Cells의 Culture 및 기본 기술의 설명서, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 및 12, pp.137-168 을 참고한다.

한 양태에서, 분리된 섬유아세포를 성장시켜 세포 은행을 제조할 수 있다. 배양 배치의 다양한 양과 시기선택을 시작하고 오염 물질 및 특정 세포 특성에 대한 세포의 사전 테스트(preemptive testing)를 허용하기 위해 세포 은행이 만들어진다. 세포 은행에서 얻은 섬유아세포는 점진적으로 스캐폴드 시딩을 위한 적절한 수준으로 증가시킨다. 세포 및 세포 접촉 물질의 환경 노출을 포함하는 작업은 이물질 또는 바람직하지 않은 미생물의 오염 가능성을 줄이기 위해 무균 관행에 의해 수행된다.

본 발명의 다른 양태에서, 세포는 수개의 계대(passage)를 통해 마스터 세포 은행을 제조하기에 적합한 양으로 성장될 수 있다. 그런 다음 세포 은행을 수확하고 적절한 용기에 채워 극저온 조건에서 보존할 수 있다. 마스터 세포 은행의 냉동 바이알에 들어있는 세포는 추가 계대(보통 2개 이상)를 통해 해동 및 성장할 수 있다. 세포는 극저온으로 보존된 작동 세포 은행(working cell bank)을 준비하는 데 사용될 수 있다.

세포 팽창 단계는 작동 세포 은행 단계에서 세포 바이알을 사용하여 3차원 스캐폴드 또는 메쉬 또는 마이크로 캐리어와 같은 구조체를 접종하기 위한 세포 수를 추가로 증가시킨다. 각 계대는 세포 성장 표면 접종, 배양, 세포 먹이기 및 채취를 포함하는 일련의 하위 배양 단계이다.

세포 은행 및 세포 팽창을 위한 배양은 배양 플라스크, 롤러 병 또는 마이크로 캐리어와 같은 배양 용기를 접종하여 수행될 수 있다. 섬유아세포와 같은 기질 세포는 의도된 성장 표면에 부착하고 배양 배지의 존재 하에 성장한다. 배양 플라스크, 롤러 병 및 마이크로 캐리어와 같은 배양 용기는 세포 배양을 위해 특별히 구성되며 일반적으로 의도된 용도에 적합한 다양한 플라스틱 물질로 만들어진다. 마이크로 캐리어는 전형적으로 미세하거나 거시적인 비드이며 다양한 플라스틱 물질로 만들어진다. 그러나, 이들은 유리 또는 콜라겐과 같은 고체/반고체 생물학적 기초 물질 또는 전술한 바와 같은 변형 당 복합물인, 덱스트란과 같은 다른 물질로 제조될 수 있다.

배양 중에, 영양분의 적절한 이용성 및 배양 억제 화합물의 제거를 유지하기 위해, 소비된 배지(expended media)를 세포 성장 과정에서 신선한 배지로 주기적으로 교체한다. 배양 플라스크 및 롤러 병은 세포가 성장할 수 있는 표면을 제공하며 부착 의존 세포의 배양에 전형적으로 사용된다.

한 양태에서, 배양은 37 ℃로 가열된 챔버에서 수행한다. 배지의 의사소통 및 챔버 환경을 필요로 하는 배양 위상(topology)은 챔버 가스 공간에서 5 % CO₂ v/v를 사용하여 pH 조절을 돕는다. 대안적으로 배양 온도 및 pH를 유지하는 용기를 세포 확장 및 ECM 생산 작업에 사용할 수 있다. 35 ℃ 이하 또는 38 ℃ 이상의 온도와 3 % 이하 또는 12 % 초과의 CO₂ 농도는 적절하지 않을 수 있다.

부착 표면으로부터 세포를 채취하는 것은 성장 배지를 제거하고 완충된 염 용액으로 세포를 세정하여 효소 경쟁 단백질을 감소시키고, 분리 효소를 적용시킨 다음 세포 분리 후 효소를 중화시킴으로써 수행될 수 있다. 채취된 세포 현탁액을 수집하고 채취액을 원심 분리로 분리한다. 하위 배양 채취물에서 얻은 세포 현탁액을 채취하여 회수된 세포의 양 및 기타 세포의 특성을 평가할 수 있으며 이후에 신선한 배지와 결합하여 접종물에 사용할 수 있다. 허용 가능한 ECM 특성의 달성과 관련하여 세포 은행 및 스캐폴드 접종물을 준비하는 데 사용되는 계대의 수는 중요하다.

적절한 2차원 또는 3차원 스캐폴드를 제조한 후, 준비된 기질 세포를 시딩하여 접종한다. 스캐폴드의 접종은 침전과 같은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 호기성 조건하에서 ECM 배양을 위해 준비된 메쉬는 저산소에서 성장된 메쉬와 동일한 방식으로 준비되며 혐기성 챔버가 저산소 조건을 생성하는데 사용되지 않는다는 점은 예외이다.

예를 들어 호기성 및 저산소 조건 모두에서 ECM 배양을 위해 제조된 메쉬 모두에 대해, 제조되고 멸균된 메쉬를 무균의 150mm 직경 x 15mm 깊이 페트리 접시에 넣고 대략 10 개의 두께로 쌓아 올린다. 메쉬의 더미는 침전되어 접종된다. 세포를 신선한 배지에 첨가하여 접종물을 위한 세포의 적절한 농도를 얻는다. 접종물을 세포가 배양 조건에서 나일론 섬유에 정착 및 부착하는 메쉬의 더미에 첨가한다. 적당한 시간 후, 개별적으로 시딩된 메쉬 시트는 무균적으로 더미에서 분리되어 대략 50 ㎖의 성장 배지를 함유하는 별도의 150 ㎜ × 15 ㎜ 페트리 접시에 개별적으로 놓일 수 있다.

접종된 배양물의 배양은 저산소 조건하에서 수행되며, 이는 정상 배양 조건하에서 생성된 ECM과 비교하여 독특한 특성을 갖는 ECM 및 주위 배지를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 본 명세서에서 사용되는 저산소 조건은 주위 공기의 산소 농도(대략 15-20 % 산소)와 비교하여 더 낮은 산소 농도를 특징으로 한다. 한 양태에서, 저산소 조건은 산소 농도가 약 10 % 미만인 것을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 저산소 조건은 산소 농도가 약 1 % 내지 10 %, 1 % 내지 9 %, 1 % 내지 8 %, 1 % 내지 7 %, 1 % 내지 6 %, 1 % 내지 5 %, 1 내지 4 %, 1 내지 3 %, 또는 1 내지 2 %이다. 특정 양태에서, 시스템은 배양 용기 내에서 약 1-3 %의 산소를 유지한다. 저산소 조건은 예를 들면, 혐기성 챔버와 같은 주변 기체 농도를 조절할 수 있는 배양 장치(예, 혐기성 챔버)를 사용하여 생성되고 유지될 수 있다.

세포 배양물의 배양은 일반적으로 팽창 및 시딩을 위한 15-20 %의 산소 및 5 % CO₂의 정상 대기에서 수행되며, 이 시점에서 저산소 배양물은 95 % 질소/5 % CO₂가 흐르는 기밀 챔버로 나누어져 첨가되어 배양 배지 내에서 저산소 환경이 만들어 진다.

예를 들어, 저산소 조건하에서 ECM을 생산하기 위해 배양된 메쉬가 있는 페트리 접시는 초기에 37 ℃ 및 95 % 공기/5 % CO₂에서 2-3 주간 배양하여 성장된다. 거의 대기 분위기의 배양 기간 후에, 메쉬의 페트리 접시를 대략 95 % 질소 및 5 % CO₂의 기체 혼합물로 퍼징되는(purged) 혐기성 배양을 위해 고안된 챔버에서 배양한다. 소비된 배양 배지는 배양 기간동안 대기 산소 수준의 신선한 배지로 교체되고 배지 교환 후 패트리 접시로 채워진 매쉬는 접시를 혐기성 챔버에 놓여지고 챔버를 95 % 질소/5 % CO₂로 퍼징한 다음 37 ℃에서 배양한다. 배양된 메쉬는 원하는 크기에 도달하거나 원하는 생물학적 구성 요소를 포함할 때 채취된다.

배양 기간 동안, 기질 세포는 골격의 개구부 안에서 성장하기 전에 3차원 골격을 따라 직선적으로 성장하고 이를 둘러쌀 것이다. 성장하는 세포는 무수히 많은 성장인자, 조절 인자 및 단백질을 생성하는데, 그 중 일부는 주변 배지에서 분비되고, 다른 것들은 세포외 기질을 형성하기 위해 구조체 상에 부착된다. 성장 및 규제 요소가 배양물에 추가될 수 있지만 반드시 필요한 것은 아니다. 기질 세포의 배양은 비가용성 및 가용성 분획물을 생산한다. 세포는 적절한 정도까지 성장하여 세포외 기질 단백질의 적절한 침전을 허용한다.

3차원 조직의 배양 중에, 증식하는 세포는 골격으로부터 방출되어 배양 용기의 벽에 달라 붙어 계속 증식하여 융합 단층을 형성할 수 있다. 세포의 성장에 영향을 미칠 수 있는 이러한 발생을 최소화하기 위해, 방출된 세포는 피딩 또는 세포 배양물을 새로운 배양 용기로 옮김으로써 제거될 수 있다. 융합 단층의 제거 또는 배양된 조직의 새로운 용기 내 신선한 배지로의 이동은 배양물의 증식 활성을 유지 또는 회복시킨다. 몇몇 양태에서, 25 % 이상의 융합을 넘는 배양된 세포의 단층을 갖는 배양 용기에서 제거 또는 이동이 행해질 수 있다. 대안적으로, 몇몇 실시 형태에서 배양물은 방출된 세포가 달라 붙지 않도록 교반된다; 대안적으로, 시스템을 통해 새로운 배지가 계속해서 주입된다. 몇몇 양태에서, 두개 또는 그 이상의 세포 유형을 동시에 또는 순차적으로 함께 배양할 수 있다(예, 섬유아세포 및 평활근 세포 또는 내피 세포).

스캐폴드의 접종 후, 세포 배양물을 적절한 영양 배지 및 3차원 조직 내로의 세포 성장을 지원하는 배양 조건에서 배양한다. Dulbecco 's Modified Eagles Medium(DMEM), RPMI 1640, Fisher 's, Iscove 's, McCoy 's 와 같은 상업적으로 이용가능한 많은 배지가 세포 배양물의 성장을 지지하는 데 적합할 수 있다. 배지는 추가 염, 탄소원, 아미노산, 혈청 및 혈청 성분, 비타민, 미네랄, 환원제, 완충제, 지질, 뉴클레오 사이드, 항생제, 부착 인자 및 성장인자로 보충될 수 있다. 상이한 유형의 배양 배지에 대한 제형은 당업자가 이용할 수 있는 다양한 인용문헌에 기재되어 있다(예, Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures, Alan R. Liss, New York(1984); Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester, England(1996); Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques, 4 th Ed., Wiley-Liss(2000)).

본 발명의 임의의 배양 단계에서 호기성 또는 저산소 조건에 관계없이 성장 또는 배양 배지는 혈청을 포함하거나 무혈청일 수 있다. 한 양태에서, 배지는 4.5g/L 글루코스, 알라닐-L-글루타민, Eq 2mM 및 명목상 10 % 소 태아 혈청이 첨가된 Dulbecco 's Modified Eagle Medium이다. 다른 양태에서, 배지는 무혈청 배지이며, 0.5 % 혈청 알부민, 2㎍/ml 헤파린, 1㎍/ml 재조합 염기 FGF, 1㎍/ml 대두 트립신 억제제, 1X ITS 보충제(인슐린-트랜스페린-셀레늄, Sigma Cat. No. I3146), 1:1000 희석된 지방산 보충제(시그마 카탈로그 번호 7050) 및 1:1000 희석된 콜레스테롤이 보충된 Glutamax^®와 함께 4.5g/L 포도당 기초 배지를 갖는 Dulbecco 's Modified Eagle Medium이다. 또한 동일한 배지를 저산소 배양과 호기성 배양 모두에 사용할 수 있다. 한 양태에서 시딩 및 성장의 첫주 후 성장 매체가 혈청 기반 배지에서 무혈청 배지로 바뀐다.

배양 조건은 저산소 성장 조건을 유지하기 위해 적절한 조건의 pH, 온도 및 가스(예, O₂, CO₂ 등)에 있을 것이다. 몇몇 실시 형태에서, 세포 배양은 증식성 활동을 최대화하고 분획물의 원하는 생물학적 활성을 촉진시키는 인자를 생성하기 위해 배양 기간 동안 배지에 현탁될 수 있다. 또한 배양물은 주기적으로 "피딩"하여 사용된 배지를 제거하고, 방출된 세포 수를 줄이고, 새로운 영양소 공급원을 추가할 수 있다. 배양 기간동안, 배양된 세포는 스캐폴드의 개구부 안으로 성장하기 전에 스캐폴드의 필라멘트를 따라 직선형으로 성장하여 이를 둘러싼다.

저산소 조건하에서 배양되는 동안, 약 15-20 %의 정상 대기 산소 농도 하의 배양과 비교하여, 수천개의 유전자가 상이하게 발현된다. 다양한 양태에서, 몇몇 유전자가 대부분 두드러지게 특정 라미닌 종, 콜라겐 종 및 Wnt 인자인 조성물에서 상향 조절되거나 하향 조절된다. 다양한 양태에서, 3차원 세포외 기질은 정상 조건하에서의 성장과 비교하여 저산소 조건에서 성장한 세포에 의해 생성된 세포 생성물의 특징적인 핑커프린트 또는 스위트(suite)에 의해 정의될 수 있다. 본원에서 구체적으로 예시된 세포외 기질 조성물에서, 3차원 조직 및 주위 배지는 다양한 인자의 발현 및/또는 분비를 특징으로 한다.

본원에 기재된 3차원 조직 및 조성물은 스캐폴드 또는 골격 상에 존재하는 세포외 기질을 갖는다. 몇몇 양태에서 세포외 기질은 저산소 조건하에서의 성장 및 구조체상에 성장한 세포의 선택으로 인한 다양한 라미닌 및 콜라겐 유형을 포함한다. 부착된 세포외 기질(ECM) 단백질의 비율은 적절한 콜라겐 유형을 정교하게 하는 섬유아세포를 선택하는 것뿐만 아니라 특정 라미닌 및 콜라겐 종의 발현이 상향 조절되거나 하향 조절되는 저산소 조건하에서 세포를 성장시킴으로써 조절되거나 향상될 수 있다.

섬유아세포의 선택은 특정 콜라겐 유형을 정의하는 적절한 이소유형 또는 하위 분류의 단일클론 항체를 사용하여 몇몇 양태에서 달성될 수 있다. 다른 양태에서 자기 비드와 같은 고체 기질은 항체가 결합된 세포를 선택하거나 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체의 조합은 원하는 콜라겐 유형을 발현하는 섬유아세포(양성적 또는 음성적)를 선택하는데 사용될 수 있다. 또는, 골격에 접종하는데 사용되는 기질은 원하는 콜라겐 유형을 합성하는 세포의 혼합물일 수 있다. 예시적인 유형의 콜라겐의 분포 및 기원을 표 1에 나타냈다.

콜라겐 유형	주요 조직 분포	기원 세포
I	느슨하며 밀집된 보통 결합 조직; 콜라겐 섬유	섬유아세포 및 망상 세포; 평활근 세포
	섬유연골
	뼈	골아세포
	상아질	상아질 모세포
II	히알린 및 탄성 연골	연골 세포
	눈의 유리체	망막 세포
III	소성 결합 조직; 세망 섬유	섬유아세포 및 망상 세포
	진피 유두층	평활근 세포; 내피 세포
	혈관
IV	기저막	상피 세포 및 내피 세포
	눈의 수정체 캡슐	수정체 섬유
V	태막; 태반	섬유아세포
	기저막
	뼈
	평활근	평활근 세포
IV	기저막	상피 세포 및 내피세포
	눈의 수정체 캡슐	수정체 섬유
V	태막; 태반	섬유아세포
	기저막
	뼈
	평활근	평활근세포
VI	결합 조직	섬유아세포
VII	상피 기저막	섬유아세포
	고정원 섬유	각질 세포
VIII	각막	각막 섬유아세포
IX	연골
X	비대 연골
XI	연골
XII	유두 진피	섬유아세포
XIV 운듈린(undulin)	망막 진피	섬유아세포
XVII	P170 수포성 유천포창 항원	각질 세포

추가적인 콜라겐 유형은 표2에 나타난 ECM 조성물에 존재할 수 있다.

콜라겐 유형	유전자
I	COL1A1 , COL1A2
II	COL2A1
III	COL3A1
IV	COL4A1 , COL4A2 , COL4A3 , COL4A4 , COL4A5 , COL4A6
V	COL5A1 , COL5A2 , COL5A3
VI	COL6A1 , COL6A2 , COL6A3
VII	COL7A1
VIII	COL8A1 , COL8A2
IX	COL9A1 , COL9A2 , COL9A3
X	COL10A1
XI	COL11A1 , COL11A2
XII	COL12A1
XIII	COL13A1
XIV	COL14A1
XV	COL15A1
XVI	COL16A1
XVII	COL17A1
XVIII	COL18A1
XIX	COL19A1
XX	COL20A1
XXI	COL21A1
XXII	COL22A1
XXIII	COL23A1
XXIV	COL24A1
XXV	COL25A1
XXVI	EMID2
XXVII	COL27A1
XXVIII	COL28A1

상기한 바와 같이, 본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 콜라겐을 포함한다. 실시예 1의 표 3에 나타난 바와 같이, 몇몇 종의 콜라겐의 발현은 저산소 배양된 ECM 조성물에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 하나 또는 그 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 약 15-20 % 산소의 산소 조건에서 생성된 것과 비교하여 콜라겐 종의 상향 조절을 포함한다. 상향 조절된 콜라겐 종은 V 형 알파 1 형; IX 알파 1; IX 알파 2; VI 알파 2; VIII 알파 1; IV, 알파 5; VII 알파 1; XVIII 알파 1; 및 XII 알파 1이다.

다양한 콜라겐 이외에, 본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 라미닌을 포함한다. 라미닌은 코일된-코일 도메인을 통해 함께 연결된 알파, 베타 및 감마 사슬 서브유닛으로 구성되는 글리코단백질 이형삼량체(heterotrimer)의 계열이다. 현재까지, 5 알파, 4 베타 및 3 감마 라미닌 사슬이 결합하여 15 개의 상이한 아형(isoform)을 형성할 수 있다. 이 구조 내에서 다른 라미닌 및 기질 라미나 분자 및 막 결합 수용체에 대한 결합 활성을 갖는 확인 가능한 도메인이 있다. 도메인 VI, IVb 및 IVa는 구형 구조를 형성하고, 도메인 V, IIIb 및 IIIa(시스테인이 풍부한 EGF 유사 요소를 포함)는 막대형 구조를 형성한다. 3 개의 사슬의 도메인 I 및 II는 3 중 사슬의 코일형 코일 구조(긴 사슬)의 형성에 기여한다.

라미닌 사슬은 공유되고 고유한 기능을 보유하고 특정 시간(발달) 및 공간(조직-부위 특이적) 패턴으로 발현된다. 이들은 조직 특이적인 분포 패턴을 나타내고 주요 세포 상호 작용 부위를 포함하기 때문에 라미닌 알파-사슬은 이형삼량체의 기능적으로 중요한 부분으로 간주된다. 혈관 내피는 발달 단계, 혈관 유형 및 내피의 활성화 상태에 따라 다양한 발현을 갖는 2 개의 라미닌 이소유형을 발현하는 것으로 알려져있다.

따라서 본 발명의 한 양태에서, 하나 또는 그 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 약 15-20 % 산소의 산소 조건에서 생성된 것과 비교하여 다양한 라미닌 종의 상향 조절 또는 하향 조절을 포함한다.

라미닌 8은 알파-4, 베타-1 및 감마-1 라미닌 사슬로 구성된다. 라미닌 알파 4 사슬은 성인 및 발달하는 동안 널리 분포한다. 성인에서는 심장, 골격 및 평활근 섬유를 둘러싸고 있는 기저막과 폐 폐포 중격에서 확인할 수 있다. 또한 그것은 모세 혈관과 큰 혈관 및 말초 신경의 신경초 기저막뿐만 아니라 굴모양 혈관간 공간(intersinusoidal space), 큰 동맥 및 골수의 세동맥에서 모두 내피 기저막에 존재하는 것으로 알려져 있다. 라미닌 8은 혈소판에 의해 발현되고 부착되는 혈관 내피의 주요 라미닌 아형이며 3T3-L1 지방 세포에서 합성되며 세포의 지방 전환에 따라 합성 수준이 증가되는 것으로 보인다. 라미닌 8은 결합 조직에서 미세 혈관을 유도하기 위해 간엽 줄기 세포에서 일반적으로 발현되는 라미닌 아형으로 생각된다. 라미닌 8은 마우스 골수의 일차 배양 세포, 세동맥 벽 및 발달중인 골수의 주요 라미닌 아형인 굴모양 혈관간 공간에서도 확인되었다. 조혈 세포에 인접한 성인 골수에서의 국소화로 인해, 알파-4 사슬을 함유하는 라미닌 아형은 조혈 세포를 발생시키는 생물학적으로 적절한 상호 작용을 하는 경향이 있다.

따라서, 또 다른 양태에서 본 발명의 ECM은 라미닌 8과 같은 라미닌 종의 상향 조절을 포함한다. 또 다른 양태에서 본 발명의 3차원 조직에 의해 생성된 라미닌은 적어도 라미닌 8을 포함하며 이는 조성물에 존재하는 라미닌 단백질의 특징 또는 특성을 정의한다.

본원에 기재된 ECM 조성물은 다양한 Wnt 인자를 포함한다. Wnt 계열 요소는 무수히 많은 세포 경로와 세포-세포 상호 작용 과정에서 역할을 하는 신호 분자이다. Wnt 신호는 종양 형성, 배아의 초기 중배엽 패턴화, 뇌 및 신장의 형태 형성, 유선 증식 조절 및 알츠하이머 질병과 관련되어 있다. 실시예 1의 표 4에 나타난 바와 같이, 몇몇 종의 Wnt 단백질의 발현은 저산소 배양된 ECM 조성물에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 하나 또는 그 이상의 배아 단백질을 포함하는 ECM 조성물은 약 15-20 % 산소의 산소 조건에서 생성된 것과 비교하여 Wnt 종의 상향 조절을 포함한다. 또 다른 양태에서, 상향 조절된 Wnt 종은 wnt7a 및 wnt11이다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 3차원 조직에 의해 생성된 Wnt 인자는 적어도 wnt7a 및 wnt11을 포함하며, 이는 조성물 내에 존재하는 Wnt 단백질의 특징 또는 특성을 정의한다.

전반적으로 논의된 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물은 가용성 및 비가용성 분획물 또는 그의 임의의 부분을 모두 포함한다. 본 발명의 조성물은 분획 중 하나 또는 둘 모두뿐만 아니라 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 개별 성분은 개별적으로 또는 다른 격리물 또는 공지된 조성물과 조합하여 사용되는 분획으로부터 격리될 수 있다.

따라서, 다양한 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 세포외 기질 조성물은 직접적으로 사용되거나 다양한 방법으로 가공될 수 있으며, 그 방법은 비가용성 및 가용성 분획물 모두에 사용될 수 있다. 세포가 없는 상층액 및 배지를 포함하는 가용성 분획물은 요소를 보존 및/또는 농축시키기 위해 동결 건조될 수 있다. 다양한 생체적합성 방부제, 동결 방지제 및 안정제가 필요한 활성을 보존하기 위해 사용될 수 있다. 생체적합성 제제의 예로는 글리세롤, 디메틸 술폭사이드 및 트레 할로오스가 포함된다. 또한 동결 건조물은 완충제, 중량제 및 장성 변형제와 같은 하나 이상의 부형제를 가질 수 있다. 동결 건조된 배지는 후술하는 바와 같이 적합한 용액 또는 약학적 희석제의 첨가에 의해 재구성될 수 있다.

다른 양태에서, 가용성 분획물은 투석된다. 투석은 다공성 막을 가로지르는 선택적 확산에 기초하여 샘플 성분을 분리하는 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나이다. 기공 크기는 용질의 90 %가 막에 의해 유지되는 분자량을 특징으로 하는 막의 분자량 컷오프(MWCO)를 결정한다. 특정 양태에서, 원하는 컷오프에 따라 임의의 공극 크기를 갖는 막이 고려된다. 전형적인 컷오프는 5,000 달톤, 10,000 달톤, 30,000 달톤, 100,000 달톤이 있지만 모든 크기가 고려된다.

몇몇 양태에서, 가용성 분획물은 활성 성분(예, 성장인자)을 배지에 침전시킴으로써 가공될 수 있다. 침전은 황산 암모늄으로 염석 또는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과 같은 친수성 고분자를 사용하는 것과 같은 다양한 절차를 사용할 수 있다.

다른 양태에서, 가용성 분획물은 다양한 선택적인 필터를 사용하여 여과된다. 여과에 의해 가용성 분획물을 가공하는 것은 분획에 존재하는 요소를 농축 및 가용성 분획에 사용되는 작은 분자 및 용질을 제거하는데에도 유용하다. 특정 분자량에 대한 선택성을 갖는 필터는 <5000 달톤, <10,000 달톤 및 <15,000 달톤을 포함한다. 다른 필터가 사용될 수 있고, 가공된 배지는 본원에 기재된 치료 활성에 대해 검정된다. 예시적인 필터 및 농축기 시스템은 중공 섬유 필터, 필터 디스크 및 필터 프로브(예, Amicon Stirred Ultrafiltration Cells 참조)에 기초한 시스템을 포함한다.

또 다른 양태에서, 가용성 분획물은 크로마토그래피에 의해 염, 불순물을 제거하거나 배지의 다양한 성분을 분획한다. 분자체, 이온 교환, 역상 및 친화성 크로마토그래피 기술과 같은 다양한 크로마토그래피 기술이 사용될 수 있다. 생체 활성이 현저히 저하되지 않은 조건화된 배지를 가공하기 위해서는 온화한 크로마토그래피 배지를 사용할 수 있다. 비제한적인 예로는 덱스트란, 아가로스, 분리 배지 기반 폴리아크릴아미드(예, Sephadex, Sepharose 및 Sephacryl와 같은 다양한 상표명하에 입수 가능)를 들 수 있다.

또 다른 양태에서, 조건 배지는 리포좀으로 제형화된다. 성장인자는 전달 및 활성 인자의 수명을 연장시키기 위해 리포솜의 내강내로 도입되거나 캡슐화될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 리포솜은 멀티라메라(multilamellar, MLV), 안정형 플루리라멜라(stable plurilamellar, SPLV), 소형 유니라멜라(small unilamellar, SUV) 또는 대형 유니라멜라(larger unilamellar, LUV) 소포로 다양하게 분류될 수 있다. 리포솜은 포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 포스파티딜 이노시톨, 디미리스토일 포스파티딜콜린과 같은 포스파티딜 에테르 및 에스테르; 콜레스테롤과 같은 스테로이드; 세레브로사이드(cerebroside); 스핑고미엘린; 글리세롤 지질; 및 다른 지질(예, 미국 특허 제 5,833,948 호 참조)를 포함하는 합성 또는 자연적으로 발생한 다양한 지질 화합물로부터 제조될 수 있다.

가용성 분획물은 추가의 첨가제 없이 직접 사용되거나, 또는 다양한 약학적으로 허용 가능한 부형제, 비히클 또는 담체와 함께 약학 조성물로 제조될 수 있다. "약학적 조성물"은 가용성 및/또는 비가용성 분획물의 형태 및 하나 이상의 약학 적으로 허용 가능한 비히클, 담체 또는 부형제를 의미한다. 피내, 피하 또는 근육 내 투여를 위해, 조성물은 수성 또는 유성 비히클 중의 세포외 기질 조성물의 무균 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로 제조될 수 있다. 또한 상기 조성물은 현탁제, 안정화제 또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 주사용 제제는 방부제가 포함되거나 포함되지 않은 다회 투여 용기내 앰플, 단위 투약 형태로 제공될 수 있다. 다르게는, 예를 들어 비제한적으로, 멸균된 발열인자가 없는 물, 식염수, 완충액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 적합한 비히클로 재구성하기 위한 조성물을 분말 형태로 존재할 수 있다.

다른 양태에서, 3차원 조직은 사용 전에 해동되는 저온 보존된 제제이다. 약학적으로 허용 가능한 동결 보존제는 글리세롤, 당류, 폴리올, 메틸셀룰로오스 및 디메틸 술폭시드를 포함한다. 당류 제제에는 단당류, 이당류 및 적어도 -60, -50, -40, -30, -20, -10 또는 0 ℃인 최대 동결 농축 용액(Tg)의 유리 전이 온도를 갖는 기타 올리고당이 포함된다. 동결 보존에 사용하기 위한 대표적인 당은 트레할로오스이다.

몇몇 양태에서, 3차원 조직은 사용 전에 세포를 사멸시키도록 처리된다. 몇몇 양태에서, 스캐폴드 상에 부착된 세포외 기질은 투여를 위해 수집 및 가공될 것이다(참조로 본 명세서에 통합된 미국 특허 제 5,830,708 호 및 제 6,280,284 호 참조).

다른 실시 형태에서, 3차원 조직은 농축되어 투여를 위해 약학적으로 허용 가능한 배지로 세척될 수 있다. 조성물을 농축시키기 위한 원심 분리 또는 여과와 같은 다양한 기술이 당업계에서 이용가능하다. 예로는 덱스트란 침전 및 차동 원심 분리가 있다. 또한 3차원 조직의 제형은 현탁액의 이온 강도를 등장성(즉, 약 0.1 내지 0.2) 및 생리학적 pH(즉, pH 6.8 내지 7.5)로 조정하는 것을 포함할 수 있다. 또한 상기 제형은 세포 현탁액의 투여 또는 안정성을 돕기 위해 운활제 또는 다른 부형제를 함유할 수 있다. 이들은 당류(예, 말토스) 및 폴리에틸렌 글리콜 및 히알루론산과 같은 유기 중합체를 포함한다. 다양한 제형의 제조에 대한 추가 세부 사항은 본원에 참고로 인용된 미국 특허 공개 제 2002/0038152 호에 기재되어 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물은 ECM 조성물의 예상되는 용도 및 적절한 전달 또는 투여에 따라 다수의 방법으로 가공될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 3차원 스캐폴드 또는 임플란트로서 전달 될 수 있거나, 상기 조성물은 전술한 바와 같이 주사를 위해 제제화될 수 있다. 용어 "투여"는 치료가 필요한 개체에게 본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물을 제공하는 행위를 포함하는 것으로 정의된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지내, 피하, 표피하, 관절강내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내로 주사 또는 주입하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 "전신 투여" 및 "말초 투여"라는 문구는 예를 들어, 피하 투여와 같이 중추 신경계에 직접적으로 투여되는 것이 아닌, 화합물, 약물 또는 다른 물질의 투여를 의미하며, 대사 및 다른 유사한 과정을 거치게 된다.

본원에 사용된 용어 "개체"는 본 방법이 수행되는 임의의 개체 또는 환자를 지칭한다. 일반적으로 개체는 인간이지만, 당업자라면 알 수 있듯이 피험자는 동물일 수 있다. 따라서 설치류(마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그를 포함), 고양이, 개, 토끼, 소, 말, 염소, 양, 돼지 등의 가축물, 영장류(원숭이, 침팬지, 오랑우탄과 고릴라)가 개체의 정의에 포함된다.

본 발명의 세포외 기질 조성물은 손상된 세포 또는 조직의 복구 및/또는 재생의 촉진, 조직 재생을 촉진시키는 패치의 사용, 줄기 세포와 같은 조직 재생 시스템을 위한 조직 배양 시스템에서의 사용, 이식가능한 장치(예, 맥박 조정기, 스텐트, 스텐트 이식편, 인조 혈관, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터)과 관련하여 사용되는 표면 코팅, 연조직 수복을 촉진, 증강, 및/또는 주름과 같은 피부 표면의 개선, 생물학적 항-부착제로서 또는 전달 부위의 세포 전달 또는 유지를 위한 생물학적 수단으로써 사용된다.

또한, 본원의 임의의 방법에 기재된 세포 배양으로부터 유도된 ECM 조성물은 본 발명의 임의의 다른 적용 또는 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 배양 시스템을 사용하여 세포를 배양함으로써 생성 된 ECM 조성물은 예를 들어 세포의 복구 및/또는 재생, 조직 재생을 촉진시키는 패치에서의 사용, 조직 배양 시스템에서의 사용(예 : 맥박 조정기, 스텐트, 스텐트 이식편, 인공 혈관, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터)과 관련하여 사용되는 표면 코팅에 사용하여 연조직 복구, 증강, 및/또는 주름과 같은 피부 표면의 개선은 생물학적 항-부착 제로서 또는 세포 전달 또는 전달 위치에서의 유지를 위한 생물학적 비히클로서 사용된다.

다양한 실시 형태에서, 본 발명은 세포 또는 조직의 복구 및/또는 재생 및 연조직 복구의 촉진을 위한 방법을 포함한다. 한 실시 형태에서 본 발명의 세포외 기질 조성물과 함께 복구되거나 재생될 세포를 접촉시킴으로써 세포의 복구 및/또는 재생하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 골연골 세포를 포함하여 본원에서 논의된 바와 같은 다양한 세포의 복구 및/또는 재생을 위해 사용될 수 있다.

한 양태에서, 상기 방법은 골연골 결함의 복구으로 고려된다. 본 명세서에서 사용되는 "골연골 세포"는 연골 형성 계통 또는 골 형성 계통에 속하는 세포 또는 환경 신호에 따라 연골 형성 계통 또는 골 형성 계계대 분화될 수 있는 세포를 말한다. 이러한 잠재력은 시험관 내 또는 생체 내에서 공지된 기술로 시험할 수 있다. 따라서, 한 양태에서 본 발명의 ECM 조성물은 연골 세포, 예를 들어 연골을 생성할 수 있는 세포 또는 그들 스스로 연골을 형성하는 연골 형성 세포로 분화할 수 있는 세포(예, 연골 형성 세포 선도물질)를 복구 및/또는 재생하는데 사용되된다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 결합 조직의 복구 및/또는 재생에 유용하다. 본원에 사용된 바와 같이, "결합 조직"은 뼈, 연골, 인대, 힘줄, 매니스커스, 진피, 하이퍼더미스(hyperdermis), 근육, 지방 조직, 관절강을 포함하지만 이에 한정되지 않는 포유 동물의 몸 내의 수많은 구조 조직 중 임의의 것을 의미한다.

본 발명의 ECM 조성물은 무릎, 발목, 팔꿈치, 둔부, 손목, 손가락 관절, 손가락 또는 발가락, 턱 관절의 골연골 결함 치료에 사용될 수 있다. 그러한 골연골 결함은 외상성 손상(예, 스포츠 손상 또는 과도한 마모) 또는 골관절염과 같은 질환의 결과일 수 있다. 특정 양태는 골관절염 연골의 표재성 병변의 치료 또는 예방에서 본 발명의 기질의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 노화 또는 출산으로 인한 골연골 결함의 치료 또는 예방에 사용된다. 본 발명의 문맥에서의 골연골 결함은 연골 및/또는 뼈의 복구가 성형 수술(예, 코, 귀), 그러나 이에 한정되지 않는 외과적 상황에서 요구되는 조건을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 이러한 결함은 연골 또는 뼈 형성이 파괴되거나 연골이나 뼈가 유전적 결함으로 손상되거나 존재하지 않는 신체의 어느 곳에서나 발생할 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, 특정 세포의 성장을 유도하거나 자극하는 성장인자 또는 다른 생물학적 제제가 본 발명의 ECM 조성물에 포함될 수 있다. 성장인자의 유형은 조성물이 의도된 세포 유형 및 용도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 골연골 세포의 경우, 추가적인 생활성 제제는 세포 성장인자(예, TGF-β), 연골 형성을 자극하는 물질(예, BMP-2, BMP-12 및 BMP-13과 같은 연골 형성을 자극하는 BMP), 기질 세포가 스캐폴드로 이동하는 요소, 기질 침착을 자극하는 요소, 항-염증제(예, 비스테로이드성 항염증제), 면역억제제(예, 사이클로스포린)와 같이 존재할 수 있다. 또한 다른 단백질들은 혈소판 유도 성장인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 인간 내피 세포 성장인자(ECGF)와 같은 다른 성장인자, 과립구집락자극인자(GM-CSF), 혈관표피성장인자(VEGF), 연골 유도된 형태 형성 단백질(CDMP), OP-1, OP-2, BMP3, BMP4, BMP9, BMP11, BMP14, DPP, Vg-1,60A 및 Vgr-1, 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유, 당단백질 또는 글리코사민글리칸, 예를 들어 헤파린 설페이트, 콘드로이틴-4-설페이트, 콘드로이틴-6-설페이트, 델마 설페이트, 케라틴 설페이트 등과 같은 다른 골 형성 단백질을 포함한다. 예를 들어, 아스코르브산염과 함께 TGF-β와 같은 성장인자가 연골 세포에 의한 연골 세포 분화 및 연골 형성을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 또한 히알루론산은 연골 세포 및 기타 기질 세포의 부착을 위한 좋은 기질이며 스캐폴드의 일부로 통합되거나 스캐폴드에 코팅될 수 있다.

또한 특정 세포의 성장 및/또는 활성에 영향을 미치는 다른 요소가 사용될 수 있다. 예를 들어, 연골 세포의 경우, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 출원 제2002/0122790 호에 기술된 바와 같이 연골 세포를 비대성 상태로 유지시키기 위해 연골 세포에 의한 연골 생성을 자극하는 콘드로티나제(chondrotinase)와 같은 인자를 상기 기질에 첨가할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 폴리설페이트화 알지네이트 또는 다른 폴리설페이트화 다당류, 예컨대 폴리설페이트화 사이클로 덱스트린 및/또는 폴리설페이트화 이눌린, 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2005/054446에 기재된 바와 같은 결합 조직 세포의 세포외 기질의 생산을 자극할 수 있는 다른 성분들의 존재를 포함할 수 있다.

복구 및/또는 재생될 세포 또는 조직은 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 생체 내 또는 시험관 내에서 접촉될 수 있다. 예를 들어, ECM 조성물을 환자에게 주입하거나 이식(예, ECM 조직, 패치 또는 본 발명의 코팅된 장치를 통해)될 수 있다. 또 다른 양태에서, 복구 및/또는 재생될 조직 또는 세포는 개체로부터 채취하여 시험관 내에서 배양하고, 공지된 수술 기술을 사용하여 개체에 이식되거나 투여될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 ECM 조성물은 다양한 방법으로 가공될 수 있다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 본 발명은 조직 배양 시스템을 포함한다. 다양한 양태에서, 배양 시스템은 본 명세서에 기재된 세포외 기질 조성물로 구성된다. 본 발명의 ECM 조성물은 다양한 방식으로 조직 배양 시스템에 통합될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 코팅물로서, 본원에 기술된 바와 같은 3차원 스캐폴드 물질을 침투시킴으로써 또는 배양용 배지에 첨가제로서 혼입될 수 있다. 따라서, 한 양태에서 배양 시스템은 본원에 기재된 성장인자 또는 배아 단백질과 같은 임의의 세포외 기질 조성물 중 어느 것과 함께 침투시킨 3차원 구조체 물질을 포함할 수 있다.

본원에 기술된 세포외 기질 조성물은 다양한 세포 유형의 성장을 위한 구조체 또는 3차원 구조체로서 작용할 수 있다. 세포 배양이 가능한 모든 세포 유형이 고려된다. 한 양태에서, 배양 시스템은 줄기 세포의 성장을 지원하는 데 사용될 수 있다. 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 또는 신경 줄기 세포이다.

조직 배양 시스템은 이식 가능한 조직과 같은 추가적인 ECM 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 조직 배양 시스템을 사용하는 세포 배양은 생체 내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조직 배양 시스템은 주사 또는 이식을 위한 ECM 조성물을 생성하는데 사용될 수 있다. 조직 배양 시스템에 의해 생성된 ECM 조성물은 본원에 기술된 임의의 방법으로 가공 및 사용될 수 있다.

본 발명의 ECM 조성물은 세포 전달을 위한 생물학적 비히클로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, ECM 조성물은 가용성 및/또는 비가용성 분획물 모두를 포함할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 세포외 기질 성분을 포함하는 전달 부위에서의 세포 전달 또는 유지를 위한 생물학적 비히클이 기술된다. 세포 및 3차원 조직 조성물을 포함하는 본 발명의 ECM 조성물은 생체 내에서 세포의 성장을 촉진 및/또는 지지하는데 사용될 수 있다. 비히클은 예를 들어, 줄기 세포와 같은 세포의 손상된 심장 근육으로의 주입 또는 전술한 바와 같은 힘줄 및 인대 복구를 위해 임의의 적절한 용도로 사용될 수 있다.

적절한 세포 조성물(예, 본 발명의 격리된 ECM 세포 및/또는 추가의 생물학적 작용제)은 ECM 조성물이 이식 또는 투여되기 전, 후 또는 기간동안 투여될 수 있다. 예를 들어, 배양 시스템 또는 생물학적 전달 비히클이 개체에게 이식되기 전에 세포를 투여, 결함 및/또는 이식 부위에 시딩할 수 있다. 또한 적절한 세포 조성물은(예, 부위 내로의 주사에 의해) 후에 투여될 수 있다. 세포는 조직 재생 및/또는 세포 복구를 유도하기 위해 그 내부에서 작용한다. 세포는 결함 부위에 세포를 투여할 수 있는 임의의 수단, 예를 들어 주사에 의해 시딩될 수 있다. 세포 주사는 주사기 또는 관절경에 의해 세포의 생존력을 유지하는 수단일 수 있다.

세포외 기질 조성물은 심장 및 관련 조직에서 내피화 및 혈관 신생을 촉진시키는 이러한 조성물을 투여함으로써 장기 및 조직에서 혈관 신생을 촉진시키는 것으로 기재되어 있다. 따라서, 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 세포외 기질 조성물을 포함하는 개체에서의 장치 이식과 관련하여 사용되는 표면 코팅을 포함한다. 코팅은 심박 조율기, 스텐트, 스텐트 이식편, 인조 혈관, 심장 판막, 션트, 약물 전달 포트 또는 카테터와 같은 개체의 이식 또는 침투에 사용되는 임의의 장치에 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 코팅은 상처 치유, 염증 변형, 섬유 캡슐 형성의 변형, 조직 내 성장의 변형 또는 세포 내 성장의 변형을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 심장, 장, 경색 또는 허혈성 조직과 같은 손상된 조직의 치료를 포함한다. 하기에 제시된 것은 그러한 용도로 고려되는 세포외 기질 조성물의 생성을 논의하는 실시예이다. 정상 산소 조건하에서 성장된 세포외 기질 조성의 제조 및 용도는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 출원 제2004/0219134 호에 기재되어 있다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포외 기질 조성물을 포함하는 조직 재생 패치를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서 본 발명은 본원에 기재된 세포외 기질 조성물을 개체의 주름 부위에 투여하는 것을 포함하는, 개체의 피부 표면 개선 방법을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 세포외 기질 조성물을 주름 부위에서 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자에서의 연조직 복구 또는 증강 방법을 포함한다. 세포의 복구 및/또는 재생, 피부 표면의 개선 및 연조직 복구를 위한 정상적인 산소 배양 조건하에서 생성된 세포외 기질 조성물의 제조 및 용도는 미국 특허 제 5,830,708 호, 미국 특허 제 6,284,284 호, 미국 특허 출원 번호 제2002/0019339 호 및 미국 특허 출원 번호 제2002/0038152 호에 기재되어 있다.

또 다른 실시 형태에서, 본 발명은 본원에 기술된 세포외 기질 조성물을 포함하는 생물학적 항-부착 제제를 포함한다. 상기 제제는 장내 또는 혈관 문합의 생성 후 사용되는 항-부착 패치로서 이러한 용도에 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 조성물 또는 활성 화합물은 일반적으로 치료되는 특정 질환을 치료 또는 예방하는 데 유효한 양으로 사용될 수 있다. 이 조성물은 치료적 이익을 얻기 위해 치료 목적으로 또는 예방적 이익을 얻기 위해 예방 목적으로 투여될 수 있다. 치료적 이익이란 치료 개체의 근본적 병태 또는 질환을 근절시키거나 호전시키는 것을 의미한다. 치료적 이익은 또한 실제로 개선이 일어나는지 여부에 관계없이, 질환의 진행을 중단시키거나 늦추는 것을 포함한다.

조성물의 투여량은, 예를 들어, 조성물의 유형, 치료 개체의 특정 적응증, 투여 방식, 원하는 이익이 예방적 이익인지 또는 치료적 이익인지, 치료 개체 적응증의 중증도 및 환자의 나이와 체중 및 투약 형태의 유효성을 비롯한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 유효 투여량을 결정하는 것은 충분히 당업자의 능력 내에 있다.

초기 투여량은 초기에 시험관 내 분석으로부터 예측할 수 있다. 또한 초기 투여량은 동물 모델과 같은 생체 내 데이터로부터 예측할 수 있다. 모발 성장을 증진하는 조성물의 효능을 테스트하는데 유용한 동물 모델로는 특히 설치류, 영장류 및 기타 다른 포유동물을 포함한다. 당업자는 시험관 내 데이터 및 동물 데이터로부터 외삽법을 통한 추정에 의해 인간 투여에 적합한 투여량을 결정할 수 있다.

투여량은 특히 조건화된 배지의 활성, 투여 방식, 치료 개체의 병태 및 상기에 언급한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량과 투여 간격은 치료적 또는 예방적 효과를 유지하는 데 충분한 수준을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 ECM을 항염증제, 항히스타민, 화학요법제, 면역조절제, 치료용 항체 또는 단백질 키나아제 억제제와 함께 치료가 필요한 조직, 세포 또는 개체에 투여하는 것을 포함한다. 한정을 의도한 것은 아니지만, 화학요법제는 대사길항물질, 예컨대 메토트렉세이트, DNA 가교결합제, 예컨대 시스플라틴/카보플라틴; 알킬화제, 예컨대 칸부실; 토포이소머라제 I 억제제, 예컨대 닥티노마이신; 미세소관 억제제, 예컨대 탁솔(파클리탁솔) 등을 포함한다. 다른 화학요법제로는, 예를 들어 빈카 알칼로이드, 미토마이신 유형 항생제, 블레오마이신 유형 항생제, 항엽산제, 콜히친, 데메콜린, 에토포시드, 탁산, 안트라사이클린 항생제, 독소루비신, 다우노루비신, 카미노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 4-디메톡시-다우노마이신, 11-데옥시다우노루비신, 13-데옥시다우노루비신, 아드리아마이신-14-벤조에이트, 아드리아마이신-14-옥타노에이트, 아드리아마이신-14-나프탈렌아세테이트, 암사크린, 카무스틴, 사이클로포스파미드, 사이타라빈, 에토포시드, 로바스타틴, 멜팔란, 토페테칸, 옥살리플라틴, 클로람부실, 메토트렉세이트, 로무스틴, 티오구아닌, 아스파라기나제, 빈블라스틴, 빈데신, 타목시펜 또는 메클로르에타민을 포함한다. 한정을 의도한 것은 아니지만, 치료용 항체는 HER2 단백질에 대한 항체, 예컨대 트라스투주맙(trastuzumab); 성장인자 또는 성장인자 수용체에 대한 항체,예컨대 내피세포 성장인자를 표적으로 하는 베바시주맙(bevacizumab) 및 표피세포 성장인자를 표적으로 하는 OSI-774; 인테그린 수용체를 표적으로 하는 항체, 예컨대 비탁신(Vitaxin, MEDI-522로도 알려짐) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 항암제 부류로는 1) 알칼로이드, 예를 들어 미세소관 억제제(예, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 빈데신 등), 미세소관 안정화제(예, 파클리탁셀[탁솔] 및 도세탁셀, 탁소테레 등), 및 염색질 기능 억제제, 예를 들어 토포이소머라제 억제제, 예컨대 에피포도필로톡신(예, 에토포시드[VP-16] 및 테니포시드[VM-26] 등), 및 토포이소머라제 I을 표적으로 하는 억제제(예, 캄포테신 및 이시리노테칸[CPT-11] 등); 2) 공유결합성 DNA 결합제[알킬화제], 예를 들어, 질소 머스터드(예, 메클로르에타민, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 이포스파미드 및 부설판[마일레란] 등), 니트로소우레아(예, 카무스틴, 로무스틴 및 세무스틴 등) 및 기타 알킬화제(예, 다카바진, 하이드록시메틸멜라민, 티오테파 및 미토사이신 등); 3) 비공유결합성 DNA 결합제[항종양 항생제], 예를 들어 핵산 결합제(예, 닥티노마이신[액티노마이신 D] 등), 안트라사이클린(예, 다우노루비신[다우노마이신 및 세루비딘], 독소루비신[아드리아마이신] 및 이다루비신[이다마이신] 등), 안트라세네디온(예, 안트라사이클린 유사체, 예컨대 [미톡산트론] 등), 블레오마이신(블레녹산) 등 및 플리카마이신(미트라마이신) 등; 4) 대사길항물질, 예를 들어 항엽산제(예, 메토트렉세이트, 폴렉스 및 멕세이트 등), 퓨린 대사길항물질(예, 6-머캅토퓨린[6-MP, 퓨리네톨], 6-티오구아닌[6-TG], 아자티오프린, 아시클로버, 강시클로버, 클로로데옥시아데노신, 2-클로로데옥시아데노신[CdA] 및 2'-데옥시코포르마이신[페노스타틴] 등), 피리미딘 길항제(예, 플루오로피리미딘[예, 5-플루오로우라실(아드루실), 5-플루오로데옥시우리딘(FdUrd)(플록스우리딘)] 등) 및 사이토신 아라비노시드(예, 사이토사[ara-C] 및 플루다라빈 등); 5) 효소, 예를 들어 L-아스파라기나제; 6) 호르몬, 예를 들어 글루코코티코이드, 예컨대 항에스트로겐(예, 타목시펜 등), 비스테로이드성 항안드로겐(예, 플루타마이드 등) 및 아로마타제 억제제(예, 아나스트로졸[아리미덱스] 등); 7) 백금 화합물(예를 들어, 시스플라틴 및 카보플라틴 등); 8) 항암제, 독소 및/또는 방사성 핵종 등에 접합된 단일클론 항체; 9) 생물학적 반응 조적출(예, 인터페론[예, IFN-알파 등] 및 인터루킨[예, IL-2 등] 등); 10) 입양 면역요법; 11) 조혈 성장인자; 12) 종양 세포 분화를 유도하는 제제(예, 올트랜스 레티노산 등); 13) 유전자 치료 기법; 14) 안티센스 치료 기법; 15) 종양 백신; 16) 종양 전이에 대한 치료법(예, 바티미스타트 등); 및 17) 신생혈관형성 억제제를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물 및 방법은, 상기에 언급된 병리학적 상태의 치료에 일반적으로 사용되는, 본원에 언급된 다른 치료 활성 화합물을 추가로 포함할 수 있다. 다른 치료제의 예로는 사이클로스포린(예, 사이클로스포린 A), CTLA4-Ig, 항체, 예컨대 ICAM-3, 항IL-2 수용체(항Tac), 항CD45RB, 항CD2, 항CD3(OKT-3), 항CD4, 항CD80, 항CD86, CD40과 gp39 사이의 상호작용을 차단하는 제제, 예컨대 CD40 및/또는 gp39(즉, CD154)에 특이적인 항체, CD40 및 gp39(CD40Ig 및 CD8 gp39)으로부터 작제된 융합 단백질, 억제제, 예컨대 핵 전좌 억제제, NF-카파 B 기능의 억제제, 예컨대 데옥시스퍼구알린(DSG), 콜레스테롤 생합성 억제제, 예컨대 HMG CoA 리덕타제 억제제(로바스타틴 및 심바스타틴), 비스테로이드성 항염증제(NSAID), 예컨대 이부프로펜 및 사이클로옥시게나제 억제제, 예컨대 로페콕시브, 스테로이드, 예컨대 프레드니손 또는 덱사메타손, 금 화합물, 항증식제, 예컨대 메토트렉세이트, FK506(타크롤리무스, 프로그라프), 마이코페놀레이트 모페틸, 세포독성제, 예컨대 아자티오프린 및 사이클로포스파미드, TNF-a 억제제, 테니답, 항TNF 항체 또는 가용성 TNF 수용체 및 라파마이신(시롤리무스 또는 라파뮨) 또는 이들의 유도체를 포함한다.

사이토카인, 면역조절제 및 항체 등의 단백질 치료제를 비롯한 다른 제제들도 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 투여될 수 있다. 본원에서 사용될 때, "사이토카인"이란 용어는 케모카인, 인터루킨, 림포카인, 모노카인, 콜로니 자극 인자 및 수용체 관련 단백질 및 이들의 기능성 단편을 포함한다. 본원에서 사용될 때, "기능성 단편"이란 용어는 규정된 기능 분석을 통해 확인되는 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 말한다.

사이토카인은 내피세포 단핵구 활성화 폴리펩티드 II(EMAP-II), 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF), 과립구-CSF(G-CSF), 대식세포-CSF(M-CSF), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12 및 IL-13, 인터페론 등을 포함하며, 이들은 세포 또는 세포 메커니즘에서 특정 생물학적 변경, 형태적 변경, 표현형 변경과 관련되어 있다.

다른 치료제가 본 발명의 조성물 및 방법과 함께 이용될 경우, 이들은 예를 들어 의사 처방전(Physician Desk Referenc: PDR)에 기재된 양으로 또는 당업자가 다른 방식으로 결정한 양으로 사용될 수 있다.

상기 방법 이외에, 하기 실시예 7-9에 기술된 바와 같이, 105F로 명명된 저분자량 여과물은 종양 및 면역 질환을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 면역 치료에서 유용하다.

PD-1 참여는 면역 내성의 유지에 필수적인 SHP-1 및 SHP-2와 같은 포스파타제를 동원함으로써 조직 내에서 T 세포 항원 수용체(TCR)-매개된 이펙터(effector) 기능을 직접 저해할 수 있다. PD-1은 선천적인 면역 세포를 음성적으로 조절하며, 실패로 인해 자가 면역이 활성화될 수 있다. PD-1과 PD-L1 사이의 상호 작용은 췌장섬에서에 TCR-유도 정지 신호를 차단함으로써 내성을 촉진시키고, PD-1 또는 PD-L1의 차단은 T 세포 운동성을 억제하고 주변 내성을 제거한다. 생체 내에서 PD-1 결핍은 마우스의 유전적 배경에 따라 다양한 자가 면역 질환에서 자가 면역을 유도했다. PD-1이 유전적으로 결핍된 이 마우스들은 BALB/c 배경에서 트로포닌 I에 고-역가 순환하는 IgG 자가 항체가 나타남을 통해 확장된 심근 병증을 일으켰다. PD-1 결핍은 당업계에 공지된 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스에서 I 형 당뇨병의 발병 및 빈도를 가속화시켰다. DC에서 PD-1의 과발현은 BALB/c 마우스에서 동종 림프구 활성화를 억제했다. PD-1은 자가 면역을 막기 위해 선천적인 반응 및 림프구 반응 모두를 조절할 수 있음을 시사한다.

PD-1이 TCR 신호 전달을 약화시킬 뿐만 아니라 T 세포 기능을 손상시키는 유전자의 발현을 강화시킴으로써 T 세포 활성화를 제한하는 기능을 한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. PD-1은 T 세포 증식 및 사이토카인 분비를 손상시키기에 충분한 전사 인자 ATF 유사(BATF)의 발현을 대등하게 상향조절하였다. T 세포에서 BATF를 억제하면 PD-1 억제를 감소시키고HIV 특이적 T 세포 기능이 회복됐다. PD-1은 해당 과정을 억제하고 지방 분해 및 지방산 산화를 촉진함으로써 T 세포 대사를 재프로그래밍하며 이를 통해 PD-1-매개 T 세포 효과기 기능 차단에 관여하는 대사 메커니즘을 밝혀냈다. PD-1의 유도는 IL-10 생산을 상향 조절함으로써 T 세포 확대 및 기능을 억제하였다. PD-1의 봉쇄는 포스파티딜 이노시톨-3-키나아제(PI3K) 및 그것의 하류 표적인 AKT 및 항바이러스성의 세포 독성 T 림프구(CTL)에서 손상된 라파마이신(mTOR)의 표유류 표적의 활성화를 증가시켰다. 추가 연구에서 전사 인자 FoxO1은 고갈된 CTL에서 PD-1의 발현과 기능을 지탱하는 역할을 하는 것으로 입증되었다. 몇몇 다른 전사 인자도 PD-1 발현 조절에 관여한다. 활성화된 T 세포 c1(NFATc1)의 핵 인자의 돌연변이로 인해 T 세포에서 PD-1 발현이 완전히 손실되었다. 인터페론(IFN)에 민감한 반응성 요소(ISRE)는 IFN-알파에 의해 유도된 대 식세포에서 PD-1의 상향 조절에 필수적인 것으로 나타났다. NF-κB는 보존 구역 C에서 유전자의 상류에 위치한 부위의 결합을 통해 대식세포에서 PD-1 발현을 조절하였다. PD-1은 말초 내성 및 자가 면역에 기여하는 톨-유사 수용체 9의 연결에 의해 선택적으로 유도될 수 있다. 또한 PD-1은 PI3K-Akt 및 Ras-미토젠-활성화 및 세포외 신호 조절 키나아제 키나아제(MEK)-세포외 신호 조절 키나아제(EPK) 신호 경로를 억제를 통해 유비퀴틴 리가제 SCF(Skp2)를 억제함으로써 세포의 진전 및 T 림프구의 증식에 영향을 주었다(참조: [Sui et al., Oncotarget. 2015 Aug 14; 6(23): 19393-19404], 참조로 포함됨).

실시예 7에 기재된 바와 같이, 여과물 처리 마우스 폐에서 B16의 전이성 부하는 75 % 이상 감소되었다. 또한 이러한 데이터는 여과물에서 활성 성분이 종양 안에 CD8+ T 세포의 침윤에 영향을 미쳤음을 나타낸다. 침윤 T 세포(TIL)의 활성화 상태는 PD-1 음성이었고, 이는 TIL이 105F 저분자량 여과물로 인해 면역 억제 성보다는 세포 독성을 나타냈음을 시사한다. 특정 이론에 구속되기를 원하지 않지만 PD-1 + 억제 T 세포(CD8+)는 105F 여과물에 의해 사망하고 PD-1 음성 CD8+ 세포는 종양 부위로 동원되고 있는 것으로 보인다.

또한 105F 저분자량 여과물은 PD-1 억제제 또는 다른 화학 요법제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어 니볼루맙(Nivolumab, ONO-4538, BMS-936558 또는 MDX-1106라고도 알려짐)은 인간 PD-1을 특이적으로 표적하는 유전적으로 조작된, 완전 인간 면역 글로불린(Ig) G4 면역 체크포인트 억제제이다. 항체는 PD-1에 고친화도로 결합하여 억제 신호를 약화시키고 숙주 항종양 면역 반응을 강화시킨다. 니볼루맙은 흑색종, 비소세포성 폐암, 전립선 암, 신세포 암(RCC), 호치킨 림프종 및 대장암(CRC)을 포함하는 다양한 종양 유형에서 항암 잠재성을 가지고 있다. 최근 니볼루맙은 적출 불가능하거나 전이성 흑색종 환자의 치료를 위해 2014년 12월 미국 FDA의 승인을 받았다. 또한 니볼루맙은 2015년 3월에 백금 기반 화학 요법으로 치료하는 동안 또는 후에 치료하는 전이성 편평 상피 NSCLC 환자 치료를 위해 미국 FDA의 승인을 받았다. 따라서 니볼루맙과 105F의 조합은 본 발명에 포함된다.

흑색종은 "면역원성" 종양으로 간주되며 PD-L1의 높은 수준에 이은 흑색종에서 빈번하게 발현되며 PD-1의 활성화 및 T 세포와 같은 항암 면역의 하향 조절을 유도한다. 따라서 면역 체크포인트 항체는 흑색종 환자에게 항종양 잠재성을 가질 수 있다.

흑색종과 유사하게, 비소세포성 폐암은 PD-1 또는 PD-L1의 높은 발현을 나타내고, 치료 전략으로서 최근 PD-1/PD-L1 경로 차단은 비소세포성 폐암 환자에서 평가되었다.

T 세포상의 PD-1과 그의 리간드와의 상호 작용을 차단하는 인간화 IgG4 단일클론 항체인 펨브롤리주맙(Pembrolizumab, MK-3475)은 항종양 면역을 재 활성화하는 것으로 여겨진다. 임상 1 상 시험에서 이필티무맙(imilimumab) 내성 진행 흑색종 환자에서 펨브롤리주맙의 효능 및 안전성을 평가했다.

NSCLC에서, 펨브롤리주맙의 효능 및 안전성은 현재 임상 1 상 시험에서 조사되고 있다. 진행된 비소세포성 폐암 환자에서 펨브롤리주맙이 항종양 활성을 보였고, 종양 세포의 50 % 이상에서 PD-L1 발현이 펨브롤리주맙의 개선된 효과와 관련이 있는 것으로 나타났다. 또한 펨브롤리주맙은 현재 유방암, 방광암 및 혈액학 악성 종양을 비롯한 몇몇 다른 암 유형의 환자에서 임상 1상/2 상 시험 중에 있다.

피딜리주맙(Pidilizumab, CT-011)은 PD-1에 대한 인간화 IgG1 카파 재조합 단일클론 항체이다. 전임상 연구에서 피딜리주맙은 암세포 생존을 억제하는 것으로 입증되었다. 피딜리주맙은 여포성 림프종에 대한 추가 연구할 가치가 있었다.

인공 인간 항-PD-L1 단일클론 IgG1 항체인 MPDL3280A는 전이성 요로 상피 방광암(UBC)에서 주목할만한 항종양 활성을 갖는다. MPDL3280A는 현재 BRAF 돌연변이와 함께 또는 없이 진행된 흑색종에서 다브라페닙(dabrafenib), 베무라페닙(vemurafenib) 또는 트라메티닙(trametinib)과 함께 조사 중이다. 진행된 NSCLC, 전이성 RCC 및 유방암에서 MPDL3280A의 임상 2 상/3 상 시험도 진행 중이다.

인공 완전-인간 항PD-L1 항체인 MEDI4736은 폐암 환자에서 ORR이 13 %이지만, PD-L1+ 환자에서 39 %까지, PD-L1 음성 환자에서 5 %까지인 것으로 보고되었다. 폐암에서 이러한 결과에 근거하여, MEDI4736의 단일 요법뿐만 아니라 다른 제제와 함께 조합하는 경우 여러 임상 시험이 다양한 종양 유형에 걸쳐 진행되고 있다.

"화학요법제" 는 암 치료에 유용한 화학물 화합물이다. ECM 또는 저분자량 여과물, 105F와 같이 본원에 개시된 것과 조합하여 사용될 수 있는 화학치료 암 약제에는, 이에 제한되지 않으나, 유사분열 억제제(mitotic inhibitors)(빈카알칼로이드(vinca alkaloid)) 가 포함된다. 여기에는, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈데신(vindesine) 및 나벨빈™(비노렐빈-5'-노르안히드로블라스틴) 이 포함된다. 또 다른 실시 형태에서, 화학치료 암 약제에는 토포이소머라아제 I 억제제, 예컨대 캄토테신(camptothecin) 화합물이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, "캄토테신 화합물" 에는 캄토사™(이리노테칸 HCL), 하이캄틴™(토포테칸 HCL) 및 캄토테신 및 그의 유사체로부터 유도된 여타 화합물이 포함된다. 본 개시내용의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 화학요법 암 약제의 또 다른 카테고리는 포도필로톡신(podophyllotoxin) 유도체, 예컨대 에토포시드(etoposide), 테니포시드(teniposide) 및 미토포도지드(mitopodozide) 이다. 본 개시내용은 추가로 알킬화제로 공지된 여타 화학요법 암 약제가 포함되며, 이는 종양 세포 내 유전자 물질을 알킬화시킨다. 여기에는, 이에 제한됨없이, 시스플라틴(cisplatin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 질소 머스타드(nitrogen mustard), 트리메틸렌 티오포스포르아미드, 카르무스틴(carmustine), 부술판(busulfan), 클로람부실(chlorambucil), 벨루스틴(belustine), 우라실 머스타드(uracil mustard), 클로마파진(chlomaphazin) 및 다카르바진(dacarbazine) 이 포함된다. 본 개시내용은 화학요법제로서의 항대사약물을 포함한다. 그러한 유형의 약제의 예시에는, 싸이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside), 플루오로우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 아자티오프림(azathioprime), 및 프로카르바진(procarbazine) 이 포함된다. 본 개시내용의 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 화학치료 암 약제의 추가적인 카테고리에는 항생제가 포함된다. 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미토마이신 C(mytomycin C) 및 다우노마이신(daunomycin) 이 포함된다. 상기 화합물에 대해 시판되어 입수가능한 수많은 리포좀 제형물이 있다. 본 개시내용은 추가로, 이에 제한되지 않으나, 항종양 항체, 다카르바진(dacarbazine), 아자싸이티딘(azacytidine), 암사크린(amsacrine), 멜팔란(melphalan), 이포스파미드(ifosfamide) 및 미톡사트론(mitoxantrone) 을 포함하는 여타 화학치료 암 약제를 포함한다.

본원에 개시된 화합물들은 단독으로, 또는 ECM 또는 105F 여과물에 더하여 세포독성/항신생물제 및 항혈관형성제를 포함하는 여타 항종양 약제와 조합되어 투여될 수 있다. 세포독성/항신생물 약제는 암세포를 공격 및 사멸시키는 약제로서 정의된다. 일부 세포독성/항신생물제는 알킬화제이며, 이는 종양 세포 내 유전자 물질을 알킬화시키며, 예를 들어 시스플라틴(cis-platin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 질소 머스타드(nitrogen mustard), 트리메틸렌 티오포스포르아미드, 카르무스틴(carmustine), 부술판(busulfan), 클로르암부실(chlorambucil), 벨루스틴(belustine), 우라실 머스타드(uracil mustard), 클로마파진(chlomaphazin) 및 다카바진(dacabazine) 이 있다. 여타 세포독성/항신생물제는 종양 세포에 대한 항대사약물이며, 예를 들어 싸이토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 플루오로우라실(fluorouracil), 메토트렉세이트(methotrexate), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 아자티오프림(azathioprime), 및 프로카르바진(procarbazine) 이 있다. 여타 세포독성/항신생물제는 항생제이며, 예를 들어 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 미트라마이신(mithramycin), 미토마이신(mitomycin), 미토마이신 C(mytomycin C) 및 다우노마이신(daunomycin) 이 있다. 상기 화합물들에 대해 시판되어 입수가능한 수많은 리포좀 제형물이 있다. 또 다른 세포독성/항신생물제는 유사분열 억제제(빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)) 이다. 여기에는, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine) 및 에토포사이드(etoposide) 가 포함된다. 다양한 세포독성/항신생물제에는 택솔(taxol) 및 그의 유도체, L-아스파라기나아제, 항종양 항체, 다카르바진(dacarbazine), 아자싸이티딘(azacytidine), 암사크린(amsacrine), 멜팔란(melphalan), VM-26, 이포스파미드(ifosfamide), 미톡산트론(mitoxantrone) 및 빈데신(vindesine) 이 포함된다.

항혈관형성제는 당업계에 널리 공지되어 있다. 본 개시내용의 방법 및 조성물에 사용하기에 적합한 항혈관형성제에는 항-VEGF 항체가 포함되며, 여기에는 인간화 및 키메라성 항체, 항-VEGF 아프타머(aptamer) 및 안티센스 올리고뉴클레오티드가 포함된다. 또한 여타 공지된 혈관형성 억제제에는 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 인터페론, 인터류킨 1(α 및 β 포함), 인터류킨 12, 레티노산, 및 메탈로프로테이나제-1 및 -2 의 조직 억제제가 포함된다.(TIMP-I 및 -2). 토포이소머라아제, 예컨대 라족산(razoxane), 항혈관형성 활성이 있는 토포이소머라아제 II 억제제를 포함하는 소형 분자들이 이용될 수 있다.

개시된 화합물과 조합하여 사용될 수 있는 다른 항암제에는, 이에 제한되지 않으나 하기의 것이 포함된다: 아시비신(acivicin); 아클라루비신(aclarubicin), 아코다졸 히드로클로라이드(acodazole hydrochloride; 아크로닌(acronine), 아도젤레신(adozelesin); 알데스류킨(aldesleukin); 알트레타민(altretamine), 암보마이신(ambomycin); 아메탄트론 아세테이트(ametantrone acetate); 아미노글루테티마이드(aminoglutethimide); 암사크린(amsacrine); 아나스트로졸(anastrozole); 안트라마이신(anthramycin); 아스파라기나아제(asparaginase); 아스페름(asperlim); 아자싸이티딘(azacitidine); 아제테파(azetepa); 아조토마이신(azotomycin); 바티마스타트(batimastat); 벤조데파(benzodepa); 비칼루타마이드(bicalutamide); 비산트렌 히드로클로라이드(bisantrene hydrochloride); 비스나파이드 디메실레이트(bisnafide dimesylate); 비젤레신(bizelesin); 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate); 브레퀴나르 소듐(brequinar sodium); 브로피리민(bropirimine); 부술판(busulfan); 칵티노마이신(cactinomycin); 칼루스테론(calusterone); 카라세마이드(caracemide); 카르베티메르(carbetimer), 카르보플라틴(carboplatin); 카르무스틴(carmustine); 카루비신 히드로클로라이드(carubicin hydrochloride); 카르젤레신(carzelesin); 세데핀골(cedefingol); 클로람부실(chlorambucil); 시롤레마이신(cirolemycin); 시스플라틴(cisplatin); 클라드리빈(cladribine); 크리스나톨 메실레이트(crisnatol mesylate); 시클로포스파마이드(cyclophosphamide); 시타라빈(cytarabine), 다카르바진(dacarbazine); 닥티노마이신(dactinomycin); 다우노루비신 히드로클로라이드(daunorubicin hydrochloride); 데시타빈(decitabine); 덱소르마플라틴(dexormaplatin); 데자구아닌(dezaguanine); 데자구아닌 메실레이트(dezaguanine mesylate); 디아지쿠온(diaziquone); 도세탁셀(docetaxel); 독소루비신(doxorubicin); 독소루비신 히드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride); 드롤록시펜(droloxifene); 드롤록시펜 시트레이트(droloxifene citrate); 드로모스타놀론 프로피오네이트(dromostanolone propionate); 두아조마이신(duazomycin); 에다트렉세이트(edatrexate); 에플로르니틴 히드로클로라이드(eflornithine hydrochloride); 엘라사미트루신(elsamitrucin); 엔로플라틴(enloplatin); 엔프로메이트(enpromate); 에피프로피딘(epipropidine); 에피루비신 히드로클로라이드(epirubicin hydrochloride); 에르불로졸(erbulozole); 에소루비신 히드로클로라이드(esorubicin hydrochloride); 에스트라무스틴(estramustine); 에스트라부스틴 포스페이트 소듐(estramustine phosphate sodium); 에타니다졸(etanidazole); 에토포사이드(etoposide); 에토포사이드 포스페이트(etoposide phosphate); 에토프린(etoprine); 파드로졸 히드로클로라이드(fadrozole hydrochloride); 파자라빈(fazarabine); 펜레티나이드(fenretinide); 플록복구딘(floxuridine); 플루다라빈 포스페이트(fludarabine phosphate); 플루오로우라실(fluorouracil); 플루오로시타빈(flurocitabine); 포스퀴돈(fosquidone); 포스트리에신 소듐(fostriecin sodium); 겜시타빈(gemcitabine), 겜시타빈 히드로클로라이드; 히드록시우레아; 이다루비신 히드로클로라이드(idarubicin hydrochloride); 이포스파미드(ifosfamide); 일모포신(ilmofosine); 인터류킨 II(재조합 인터류킨 II 또는 rIL2 포함), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1, 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-1a; 인터페론 감마-1b; 이프로플라틴(iproplatin); 이리노테칸 히드로클로라이드(irinotecan hydrochloride); 란레오타이드 아세테이트(lanreotide acetate); 레트로졸(letrozole); 류프롤라이드 아세테이트(leuprolide acetate); 리아로졸 히드로클로라이드(liarozole hydrochloride); 로메트렉솔 소듐(lometrexol sodium); 로무스틴(lomustine); 록속산트론 히드로클로라이드(losoxantrone hydrochloride); 마소프로콜(masoprocol); 메이탄신(maytansine); 메클로레타민 히드로클로라이드(mechlorethamine hydrochloride); 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate); 멜렌게스트롤 아세테이트(melengestrol acetate); 멜팔란(melphalan); 메노가릴(menogaril); 메르캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 메토트렉세이트 소듐(methotrexate sodium); 메토프린(metoprine); 메투레데파(meturedepa); 미틴도마이드(mitindomide); 미토카르신(mitocarcin); 미토크로민(mitocromin); 미토길린(mitogillin); 미토말신(mitomalcin); 미토마이신(mitomycin), 미토스페르(mitosper); 미토탄(mitotane), 미톡산트론 히드로클로라이드(mitoxantrone hydrochloride); 미코페놀산(mycophenolic acid); 노코다졸(nocodazole); 노갈라마이신(nogalamycin), 오르마플라틴(ormaplatin); 옥시수란(oxisuran); 파클리탁셀(paclitaxel); 페가스파르가아제(pegaspargase); 펠리오마이신(peliomycin); 펜타무스틴(pentamustine); 페플레오마이신 설페이트(peplomycin sulfate); 페르포스파미드(perfosfamide), 피포브로만(pipobroman), 피포술판(piposulfan), 피록산트론 히드로클로라이드(piroxantrone hydrochloride); 플리카마이신(plicamycin); 플로메스탄(plomestane); 포르피메르 소듐(porfimer sodium); 포르피로마이신(porfiromycin); 프레드니무스틴(prednimustine); 프로카르바진 히드로클로라이드(procarbazine hydrochloride); 푸로마이신(puromycin); 푸로마이신 히드로클로라이드; 피라조푸린(pyrazofurin); 리보프린(riboprine); 로글리티마이드(rogletimide); 사핀골(safingol); 사핀골 히드로클로라이드; 세무스틴(semustine); 심트라젠(simtrazene); 스파르포세이트 소듐(sparfosate sodium); 스파르소마이신(sparsomycin); 스피로게르마늄 히드로클로라이드(spirogermanium hydrochloride); 스피로무스틴(spiromustine); 스피로플라틴(spiroplatin); 스트렙토니그린(streptonigrin); 스트렙토조신(streptozocin); 술포레누르(sulofenur); 탈리소마이신(talisomycin); 테코갈란 소듐(tecogalan sodium), 테가푸르(tegafur); 텔록산트론 히드로클로라이드(teloxantrone hydrochloride); 테모포르핀(temoporfin); 테니포사이드(teniposide); 테록시론(teroxirone); 테스톨락톤(testolactone); 티아미프린(thiamiprine); 티오구아닌(thioguanine); 티오테파(thiotepa); 티아조푸린(tiazofurin); 티라파자민(tirapazamine); 토레미펜 시트레이트(toremifene citrate); 트레스톨론 아세테이트(trestolone acetate); 트리시리빈 포스페이트(triciribine phosphate); 트리메트렉세이트(trimetrexate); 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트리프토렐린(triptorelin), 투불로졸 히드로클로라이드(tubulozole hydrochloride), 우라실 머스타드(uracil mustard), 우레데파(uredepa), 바프레오타이드(vapreotide), 베르테포르핀(verteporfin), 빈블라스틴 설페이트(vinblastine sulfate), 빈크리스틴 설페이트(vincristine sulfate); 빈데신(vindesine); 빈데신 설페이트(vindesine sulfate), 빈네피딘 설페이트(vinepidine sulfate); 빈글리시네이트 설페이트(vinglycinate sulfate); 빈류로신 설페이트(vinleurosine sulfate); 비노렐빈 타르트레이트(vinorelbine tartrate); 빈로시딘 설페이트(vinrosidine sulfate), 빈졸리딘 설페이트(vinzolidine sulfate), 보로졸(vorozole); 제니플라틴(zeniplatin); 지노스타틴(zinostatin); 조루비신 히드로클로라이드(zorubicin hydrochloride). 다른 항암제로 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 20-epi-1,25 디히드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실, 아비라테론(abiraterone); 아클라루비신(aclarubicin), 아실풀벤(acylfulvene), 아데시페놀(adecypenol); 아도젤레신(adozelesin); 알데슬류킨(aldesleukin), ALLTK 안타고니스트; 알트레타민(altretamine); 암바무스틴(ambamustine); 아미독스(amidox); 아미포스틴(amifostine); 아미노레불린산(aminolevulinic acid); 암루비신(amrubicin); 암사크린(amsacrine); 아나그렐라이드(anagrelide); 아나스트로졸(anastrozole); 안드로그라폴라이드(andrographolide); 혈관형성 억제제; 안타고니스트 D; 안타고니스트 G; 안타렐릭스(antarelix); 항-등쪽 형태형성 단백질-1(anti-dorsalizing morphogenetic protein-1); 안티안드로겐(antiandrogen), 전립선 암종(prostatic carcinoma), 안티에스트로겐(antiestrogen); 안티네오플라스톤(antineoplaston), 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotides), 아피디콜린 글리시네이트(aphidicolin glycinate); 아폽토시스 유전자 조절제, 아폽토시스 조절제, 아푸린산(apurinic acid); ara-CDP-DL-PTBA, 아르기닌 디아미나아제(arginine deaminase); 아술라크린(asulacrine); 아타메스탄(atamestane), 아트리무스틴(atrimustine); 악시나스타틴 1(axinastatin 1); 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3, 아자세트론(azasetron), 아자톡신(azatoxin), 아자타이로신(azatyrosine), 바카틴 III 유도체(baccatin III derivatives), 발라놀(balanol), 바티마스타트(batimastat), BCR/ABL 안타고니스트; 벤조클로린(benzochlorin), 벤조일스타우로스포린(benzoylstaurosporine), 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴(beta-alethine); 베타클라마이신 B(betaclamycin B); 베툴린산(betulinic acid); bFGF 억제제; 비칼루타마이드(bicalutamide); 비산트렌(bisantrene), 비스아지리디닐스페르민(bisaziridinylspermine); 비스나파이드(bisnafide), 비스트라텐 A(bistratene A); 비젤레신(bizelesin), 브레플레이트(breflate); 브로피리민(bropiromine); 부도티탄(budotitane); 부티오닌 술폭시민(buthionine sulfoximine); 칼시포트리오(calcipotriol); 칼포스틴 C(calphostin C); 캄토테신 유도체(camptothecin derivatives), 카나르폭스(canarypox) IL-2; 카페시타빈(capecitabine); 카르복사마이드-아미드-트리아졸(carboxamide-amino-triazol); 카르복시아미도트리아졸(carboxyamidotriazol); CaRest M3; CARN 700, 연골 유도성 억제제, 카르젤레신(carzelesin), 카제인 키아나제 억제제(ICOS), 카스타노스페르민(castanospermine); 세크로핀 B(cecropin B), 세트로렐릭스(cetrorelix); 클로르린(chlorlns); 클로로퀴녹살린 술폰아미드(chloroquinoxaline sulfonamide), 시카프로스트(cicaprost); 시스-포르피린(cis-porphyrin), 클라드리빈(cladribine); 클로미펜 유사체(clomifene analogues), 클로트리마졸(clotrimazole), 콜리스마이신 A(collismycin A), 콜리스마이신 B(collismycin B), 콤브레타스타틴 A4(combretastatin A4); 콤브레타스타틴 유사체; 코나게닌(conagenin); 크람베시딘(crambescidin) 816, 크리스나톨(crisnatol); 크립토피신 8(cryptophycin 8), 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A(curacin A); 시클로펜타트라퀴논(cyclopentanthraquinones), 시클로플라탐(cycloplatam), 시페마이신(cypemycin), 시타라빈 옥포스페이트(cytarabine ocfosfate), 세포가수분해 인자(cytolytic factor), 싸이토스타틴(cytostatin), 클릭시마브(dacliximab), 데시타빈(decitabine), 디히드로디데민 B(dehydrodidemnin B); 데슬로렐린(deslorelin); 덱사메타손(dexamethasone), 덱시포스파마이드(dexifosfamide), 덱스라족산(dexrazoxane); 덱스베라파밀(dexverapamil); 디아지쿠온(diaziquone); 디뎀닌 B(didemnin B); 디독스(didox), 디에틸노르스페르민(diethylnorspermine), 디히드로-5-아자싸이티딘; 디히드로택솔(dihydrotaxol), 9-; 디옥사마이신(dioxamycin), 디페닐스피로무스틴(diphenyl spiromustine); 도세탁셀(docetaxel), 도코사놀(docosanol); 돌라세트론(dolasetron); 독시플루리딘(doxifluridine), 드롤록시펜(droloxifene); 드로나비놀(dronabinol), 두오카르마이신 SA(duocarmycin SA); 에브셀렌(ebselen); 에코무스틴(ecomustine); 에델포신(edelfosine), 에드레콜로마브(edrecolomab), 에플로르니틴(eflornithine), 엘레멘(elemene); 에미테푸르(emitefur); 에피루비신(epirubicin), 에피리스테라이드(epristeride), 에스트라무스틴 유사체(estramustine analogue), 에스트로겐 아고니스트(estrogen agonist), 에스트로겐 안타고니스트(estrogen antagonist); 에타니다졸(etanidazole); 에토포사이드 포스페이트(etoposide phosphate); 엑세메스탄(exemestane); 파드로졸(fadrozole); 파자라빈(fazarabine), 펜레티나이드(fenretnide), 필그라스팀(filgrastim), 피나스테라이드(finasteride); 플라보피리돌(flavopiridol); 플레젤라스틴(flezelastine); 플루아스테론(fluasterone); 플루다라빈(fludarabine), 플루오로다우노루니신 히드로클로라이드(fluorodaunorunicin hydrochloride), 포르페니멕스(forfenimex), 포르메스탄(formestane), 포스트리에신(fostriecin), 포테무스틴(fotemustine); 가돌리늄 텍사피린(gadolinium texaphyrin); 갈륨 니트레이트(gallium nitrate); 갈로시타빈(galocitabine); 가니렐릭스(ganirelix), 젤라티나아제 억제제(gelatinase inhibitors); 겜시타빈(gemcitabine); 글루타티온 억제제; 헵술팜(hepsulfam); 헤레굴린(heregulin); 헥사메틸렌 비스아세트아미드(hexamethylene bisacetamide); 히페리신(hypericin), 이바드론산(ibandronic acid); 이다루비신(idarubicin), 이독시펜(idoxifene); 이드라만톤(idramantone); 일모포신(ilmofosine), 일로마스타트(ilomastat), 이미다졸크리돈(imidazoacridone); 이미퀴모드(imiquimod); 면역자극 펩티드; 인슐린 유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 아고니스트; 인터페론; 인터류킨; 요벤구안(iobenguane); 요오독소루비신(iododoxorubicin); 이포메아놀(ipomeanol), 4-; 이로플락트(iroplact); 이르소글라딘(irsogladine); 이소벤가졸(isobengazole); 이소호모할리콘드린 B(isohomohalicondrin B); 이타세트론(itasetron); 자스플라키놀라이드(jasplakinolide); 카할랄라이드 F(kahalalide F); 라멜라린-N 트리아세테이트(lamellarin-N triacetate), 란레오타이드(lanreotide); 레이나마이신(leinamycin); 레노그라스틴(lenograstine), 렌티난 설페이트(lentinan sulfate), 렙톨스타틴(leptolstatin); 레트로졸(letrozole); 백혈병 억제 인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤라이드 + 에스트로겐 + 프로게스테론; 류프로렐린(leuprorelin); 레바미솔(levamisole); 리아로졸(liarozole), 선형 폴리아민 유사체; 친유성 이당류 펩티드; 친유성 백금 화합물; 리소클린아미드 7(lissoclinamide 7); 로바플라틴(lobaplatin), 롬브리신(lombricine), 로메트렉솔(lometrexol); 로니다민(lonidamine); 로속산트론(losoxantrone), 로바스타틴(lovastatin), 록소리빈(loxoribine), 루르토테칸(lurtotecan), 루테튬 텍사피린(lutetium texaphyrin), 리소필린(lysofylline), 분해 펩티드(lytic peptides); 마이탄신(maitansine); 만노스타틴 A(mannostatin A), 마리마스타트(marimastat); 마소프로콜(masoprocol); 마스핀(maspin), 마트릴리신 억제제(matrilysin inhibitors); 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제(matrix metalloproteinase inhibitors), 메노가릴(menogaril); 메르바론(merbarone); 메테렐린(meterelin); 메티오니나아제(methioninase), 메토클로프라마이드(metoclopramide) 및 미토구아존(mitoguazone); 미토락톨(mitolactol); 미토마이신 유사체(mitomycin analogues); 미토나파이드(mitonafide); 미토톡신 섬유아세포 성장 인자-사포린(mitotoxin fibroblast growth factor-saporin); 미톡산트론(mitoxantrone); 모파로텐(mofarotene); 몰그라모스팀(molgramostim); 모노클로날 항체, 인간 코리오닉 고나도트로핀(human chorionic gonadotrophin); 모노포스포릴 지질 A(monophosphoryl lipid A) + 미요박테리움 세포벽 sk(myobacterium cell wall sk), 모피다몰(mopidamol), 다중 약물 내성 유전자 억제제, 다중 종양 억제자 1-기반 요법; 머스타드 항암제(mustard anticancer agent); 미카페록시드 B(mycaperoxide B), 미코박테리아 세포벽 추출물; 미리아포론(myriaporone); N-아세틸디날란(Nacetyldinaline), N-치환 벤즈아미드, 나파렐린(nafarelin), 나그레스팁(nagrestip), 날록손(naloxone) + 펜타조신(pentazocine), 나파빈(napavin), 나프테르핀(naphterpin), 나르토그라스팀(nartograstim); 네다플라틴(nedaplatin); 네모루비신(nemorubicin); 네리드론산(neridronic acid); 중성 엔도펩티다아제(neutral endopeptidase), 니룰타마이드(nilutamide), 니사마이신(nisamycin); 산화질소 조절제, 니트록시드 산화방지제, 니트룰린(nitrullyn), 06-벤질구아닌, 옥트레오타이드(octreotide), 오키세논(okicenone); 올리고뉴클레오티드; 오나프리스톤(onapristone); 온단세트론(ondansetron), 온단세트론; 오라신(oracin); 경구용 사이토카인 유도체(oral cytokine inducer), 오르마플라틴(ormaplatin); 오사테론(osaterone); 옥살리플라틴(oxaliplatin); 옥사우로마이신(oxaunomycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민(palauamine), 팔미토일리족신(palmitoylrhizoxin); 파미드론산(pamidronic acid); 파낙실트리올(panaxytriol); 파노미펜(panomifene); 바라박틴(parabactin); 파젤리프틴(pazelliptine); 페가스파르가아제(pegaspargase); 펠데신(peldesine); 펜토산 폴리설페이트 소듐(pentosan polysulfate sodium), 펜토스타틴(pentostatin), 펜트로졸(pentrozole), 퍼플루브론(perflubron), 퍼포스파미드(perfosfamide), 페릴릴 알콜(perillyl alcohol), 페나즈모마이신(phenazmomycin), 페닐아세테이트, 포스파타아제 억제제; 피시바닐(picibanil); 필로카르핀 히드로클로라이드(pilocarpine hydrochloride); 피라루비신(pirarubicin), 피리트렉심(piritrexim); 플라세틴 A(placetin A), 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화제 억제제(plasminogen activator inhibitor); 백금 착물, 백금 화합물; 백금-트리아민 착물, 포르피메르 소듐(porfimer sodium); 포르피로마아신(porfiromycin); 프레드니손(prednisone), 프로필 비스-아크리돈(propyl bis-acridone); 프로스타글란딘 12(prostaglandin 12); 프로테아좀 억제제; 단백질 A-기반 면역 조적출; 단백질 키나아제 C 억제제; 단백질 키나아제 C 억제제, 미크로알칼(microalgal); 단백질 타이로신 포스파타아제 억제제; 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라아제 억제제; 푸르푸린(purpurin); 피라졸로아크리딘(pyrazoloacridine); 피리독실화 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 콘쥬게이트(pyridoxylated hemoglobin polyoxyethylene conjugate); raf 안타고니스트; 랄티트렉스드(raltitrexed); 라모세트론(ramosetron); ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라아제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 디메틸화된 레텔리프틴(retelliptine demethylated); 레늄 Re 186 에티드로네이트(etidronate); 리족신(rhizoxin); 리보자임; RII 레틴아미드(retinamide); 로글레티마이드(rogletimide); 로히투킨(rohitukine); 로무르타이드(romurtide); 로퀴니멕스(roquinimex); 루비기논 B1(rubiginone B1); 루복실(ruboxyl); 사핀골(safingol); 삼토핀(samtopin); SarCNU; 사르코피톨 A(sarcophytol A); 사르그라모스팀(sargramostim); Sdi 1 모방체; 세무스틴(semustine); 세네센스 유도성 억제제1(senescence derived inhibitor 1); 센스 올리고뉴클레오티드; 신호 전달 억제제; 신호 전달 조적출; 단일 사슬 항원 결합 단백질; 시조피란(sizofiran); 소보족산(sobuzoxane); 소듐 보로카프테이트(sodium borocaptate); 소듐 페닐 아세테이트; 솔베롤(solverol); 소마토메딘(somatomedin) 결합 단백질, 소네르민(sonermin); 스파르포스산(sparfosic acid); 스피카마이신 D(spicamycin D); 스피로무스틴(spiromustine); 스플레노펜틴(splenopentin); 스포기스타틴 1(spongistatin 1); 스쿠알라민(squalamine); 줄기 세포 억제제; 줄기 세포 분열 억제제; 스티피아미드(stipiamide); 스토멜리신(stromelysin) 억제제; 술피노신(sulfinosine); 수퍼액티브 혈관작용성 소장 펩티드 안타고니스트(superactive vasoactive intestinal peptide antagonist); 수라디스타(suradista); 수라민(suramin); 스와인소닌(swainsonine), 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴(tallimustine); 타목시펜 메티오다이드(tamoxifen methiodide); 타우로무스틴(tauromustine); 타자로텐(tazarotene); 테코갈란 소듐(tecogalan sodium); 테가푸르(tegafur); 텔루라피릴륨(tellurapyrylium); 텔로머라아제 억제제; 테모포르핀(temoporfin); 테모졸로마이드(temozolomide); 템포사이드(temposide); 테트라클로로데카옥시드; 테트라조민(tetrazomine), 탈리블라스틴(thaliblastine); 티오코랄린(thiocoraline); 트롬보포이에틴(thrombopoietin); 트롬보포이에틴 모방체; 티말파신(thymalfasin); 티모포이에틴 수용체 아고니스트; 티모트리난(thymotrinan); 흉선 자극 호르몬; 주석 에틸 에티오푸르푸린(tin ethyl etiopurpurin); 티라파자민(tirapazamine), 티타노오센 비클로라이드(titanocene bichloride); 탑센틴(topsentin), 토레미펜(toremifene); 토티포텐트 줄기 세포 인자(totipotent stem cell factor); 번역 억제제(translation inhibitors); 트레티노인(tretinoin); 트리아세틸우리딘(triacetyluridine); 트리시리빈(triciribine); 트리메트렉세이트(trimetrexate); 트리프토렐린(triptorelin); 트로피세트론(tropisetron); 투로스테라이드(turosteride); 타이로신 키나아제 억제제; 티르포스틴(tyrphostin); UBC 억제제, 우베니멕스(ubenimex), 우로제니탈 사이너스-유도성 성장 저해 인자(urogenital sinus-derived growth inhibitory factor), 우로키나아제 수용체 안타고니스트(urokinase receptor antagonists); 바프레타이드(vapreotide); 바리올린 B(variolin B); 벡터 시스템, 적혈구 유전자 요법(erythrocyte gene therapy); 벨라레솔(velaresol); 베라민(veramine), 베르딘스(verdins); 베르테포핀(verteporfin); 비노렐빈(vinorelbine); 빈잘틴(vinxaltine); 비탁신(vitaxin); 보로졸(vorozole); 자노테론(zanoterone); 제니플라틴(zeniplatin); 질라스코르브(zilascorb); 및 지노스타틴 스티말머(zinostatin stimalamer).

본원에 사용된 용어 "유효량"은 "원하는 또는 치료 결과를 달성하기 위해 투여량 및 필요한 기간 동안 유효한 하나 이상의 제제 및/또는 105F 및/또는 ECM의 양" 을 의미한다. 유효량은 당업계에 공지된 인자들, 예컨대 치료한 인간 또는 동물의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중에 따라 가변적일 수 있다. 비록 특정 투여 계획이 본원에서 실시예에서 기재될 수 있지만, 당업자라면 투여 계획이 최적의 치료 응답성 제공을 위해 변경될 수 있다는 점을 감안할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량" 을 설명하는 것을 가능하지 않다. 예를 들어, 몇몇 나눈 투여량을 매일 투여할 수 있거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 의해 표시된 것에서 비율에 맞게 투여량을 감소시킬 수 있다. 추가로, 본 개시내용의 조성물은 치료량 달성에 필요한 만큼 빈번하게 투여될 수 있다.

본원에 기재된 방법 및 조성물은 상기 암이 하기로 이루어진 군에서 선택될 때 유용하다: 급성 림프구성 백혈병(Acute Lymphoblastic); 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia); 부신피질암(Adrenocortical Carcinoma); 소아 부신피질암(Adrenocortical Carcinoma, Childhood); 충수암(Appendix Cancer); 기저세포 암종(Basal Cell arcinoma); 간외 담도암(Bile Duct Cancer, Extrahepatic); 방광암(Bladder Cancer); 골암(Bone Cancer); 골육종(Osteosarcoma) 및 악성 섬유성 조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma); 소아 뇌간교종(Brain Stem Glioma, Childhood); 성인 뇌종양(Brain Tumor, Adult); 뇌종양(Brain Tumor), 소아 뇌간교종(Brain Stem Glioma, Childhood); 뇌종양, 소아 중추신경계 비정형 기형/횡문근양 종양(Central Nervous System Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor, Childhood); 중추 신경계 배아종(Central Nervous System Embryonal Tumors); 소뇌별아교세포종(Cerebellar Astrocytoma); 소뇌별아교세포종(Cerebral Astrocytoma)/악성 교종(Malignant Glioma); 두개인두종(Craniopharyngioma); 뇌실막모세포종(Ependymoblastoma); 뇌실막종(Ependymoma); 속질모세포종(Medulloblastoma); 속질상피종(Medulloepithelioma); 중등도분화의 송과 실질세포 종양(Pineal Parenchymal Tumors of Intermediate Differentiation); 천막위 원시 신경외배엽종양(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumors) 및 송과체모세포종(Pineoblastoma); 시각경로 및 시상하부 신경아교종(Visual Pathway and Hypothalamic Glioma); 뇌 및 척추 종양(Brain and Spinal Cord Tumors); 유방암(Breast Cancer); 기관지내 종양(Bronchial Tumors); 버킷 림프종(Burkitt Lymphoma); 유암종(Carcinoid Tumor); 위장관 유암종(Carcinoid Tumor, Gastrointestinal); 중추신경계 비정형 기형/횡문근양 종양(Central Nervous System Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor); 중추 신경계 배아종(Central Nervous System Embryonal Tumors); 중추신경계 림프종(Central Nervous System Lymphoma); 소뇌별아교세포종(Cerebellar Astrocytoma); 소아 소뇌별아교세포종/악성 교종(Cerebral Astrocytoma/Malignant Glioma, Childhood); 자궁경부암(Cervical Cancer); 소아 척삭종(Chordoma, Childhood); 만성 림프성 백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia); 만성 골수성 백혈병(Chronic Myelogenous Leukemia); 만성 골수 증식 질환(Chronic Myeloproliferative Disorders); 대장암(Colon Cancer); 직장암(Colorectal Cancer); 두개인두종(Craniopharyngioma); 피부 T-세포 림프종(Cutaneous T-Cell Lymphoma); 식도암(Esophageal Cancer); 종양의 유잉 패밀리(Ewing Family of Tumors); 고환외 배세포종(Extragonadal Germ Cell Tumor); 간외 담도암(Extrahepatic Bile Duct Cancer); 안암으로서, 안구내 흑색종(Eye Cancer, Intraocular Melanoma); 안암으로서, 망막모세포종(Eye Cancer, Retinoblastoma); 담낭암(Gallbladder Cancer); 위암(Gastric(Stomach) Cancer); 위장관 악성 종양(Gastrointestinal Carcinoid Tumor); 위장관 기질종양(Gastrointestinal Stromal Tumor(GIST)); 두개외 생식세포 종양(Germ Cell Tumor, Extracranial); 고환외 생식 세포 종양(Germ Cell Tumor, Extragonadal); 난소 생식 세포 종양(Germ Cell Tumor, Ovarian); 임신성 융모성 종양(Gestational Trophoblastic Tumor); 신경아교종(Glioma); 소아 뇌간 신경아교종(Glioma, Childhood Brain Stem); 신경아교종으로서의, 소아 뇌 별아교세포종(Glioma, Childhood Cerebral Astrocytoma), 신경아교종으로서의, 소아 시각경로 및 시상하부 신경아교종(Glioma, Childhood Visual Pathway and Hypothalamic), 털세포 백혈병(Hairy Cell Leukemia); 두경부암(Head and Neck Cancer); 간암(hepatocellular(Liver) Cancer); 랑게르한스 세포의 조직구증(Histiocytosis, Langerhans Cell); 호지킨 림프종(Hodgkin Lymphoma); 피열후두개 암(Hypopharyngeal Cancer); 시상하부 및 시각경로 신경아교종(Hypothalamic and Visual Pathway Glioma); 안구 내 흑색종(Intraocular Melanoma); 췌도 세포종(Islet Cell Tumors); 신장암(Kidney(Renal Cell) Cancer); 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans Cell Histiocytosis); 후두암(Laryngeal Cancer); 급성 림프모구 백혈병(Leukemia, Acute Lymphoblastic); 급성 골수성 백혈병(Leukemia, Acute Myeloid); 만성 림프구성 백혈병(Leukemia, Chronic Lymphocytic); 만성 골수성 백혈병(Leukemia, Chronic Myelogenous); 털세포 백혈병(Leukemia, Hairy Cell); 구순 및 구강암(Lip and Oral Cavity Cancer); 간암(Liver Cancer); 비소세포 폐암(Lung Cancer, Non-Small Cell); 소세포 폐암(Lung Cancer, Small Cell); AIDS 관련 림프종(Lymphoma, AIDS-Related); 버킷 림프종(Lymphoma, Burkitt); 피부 T-세포 림프종(Lymphoma, Cutaneous T-Cell); 호지킨 림프종(Lymphoma, Hodgkin); 비-호지킨 림프종(Lymphoma, Non-Hodgkin); 원발성 중추 신경계 림프종(Lymphoma, Primary Central Nervous System); 왈덴스트롬 마크로불린혈증(Macroglobulinemia, Waldenstrom); 뼈의 악성 섬유조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone) 및 골육종(Osteosarcoma); 수모세포종(Medulloblastoma); 흑색종(Melanoma); 안내 흑색종(Melanoma, Intraocular(눈)); 메르켈 세포 암(Merkel Cell Carcinoma); 중피종(Mesothelioma); 잠복 원발성의 전이성 편평상피 경부암(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary); 구강암(Mouth Cancer); 소아의 다발성 내분비 샘종증 증후군(Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome,(Childhood)); 다발 골수종(Multiple Myeloma)/형질 세포 종양(Plasma Cell Neoplasm); 균상 식육종(Mycosis Fungoides); 골수형성이상 증후군(Myelodysplastic Syndromes); 골수형성이상/골수증식 질환(Myelodysplastic/Myeloproliferative Diseases); 만성 골수성 백혈병(Myelogenous Leukemia, Chronic); 성인 급성 골수성 백혈병(Myeloid Leukemia, Adult Acute); 소아 급성 골수성 백혈병(Myeloid Leukemia, Childhood Acute); 다발성 골수종(Myeloma, Multiple); 만성 골수증식 질환(Myeloproliferative Disorders, Chronic); 비강 및 부비동 암(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer); 비인두암(Nasopharyngeal Cancer); 신경모세포종(Neuroblastoma); 비소세포폐암(Non-Small Cell Lung Cancer); 구강암(Oral Cancer); 구강암(Oral Cavity Cancer); 입인두암(Oropharyngeal Cancer); 뼈육종(Osteosarcoma) 및 뼈의 악성 섬유 조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone); 난소암(Ovarian Cancer); 상피성 난소암(Ovarian Epithelial Cancer); 난소 생식 세포 종양(Ovarian Germ Cell Tumor); 난소 저악성 잠재성 종양(Ovarian Low Malignant Potential Tumor); 췌장암(Pancreatic Cancer); 췌장암으로서, 췌도 세포 종양(Pancreatic Cancer, Islet Cell Tumors); 유두종증(Papillomatosis); 부갑상선암(Parathyroid Cancer); 음경암(Penile Cancer); 인두암(Pharyngeal Cancer); 크롬친화세포종(Pheochromocytoma); 중등도분화의 송과 실질세포 종양(Pineal Parenchymal Tumors of Intermediate Differentiation); 송과체모세포종(Pineoblastoma) 및 천막위 원시 신경외배엽종양(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumors); 하수체 종양(Pituitary Tumor); 형질 세포 종양(Plasma Cell Neoplasm)/다발 골수종(Multiple Myeloma); 흉막폐아세포종(Pleuropulmonary Blastoma); 원발성 중추신경계 림프종(Primary Central Nervous System Lymphoma); 전립선암(Prostate Cancer); 직장암(Rectal Cancer); 신장암(Renal Cell(Kidney) Cancer); 신우 및 요관 이행세포암(Renal Pelvis and Ureter, Transitional Cell Cancer); 15 번 염색체 상의 NUT 유전자와 관련된 기 도 암종(Respiratory Tract Carcinoma Involving the NUT Gene on Chromosome 15); 망막모세포종(Retinoblastoma); 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma); 침샘암(Salivary Gland Cancer); 종양의 유잉 패밀리의 육종(Sarcoma, Ewing Family of Tumors); 카포시 육종(Sarcoma, Kaposi); 연조직 육종(Sarcoma, Soft Tissue); 요관 육종(Sarcoma, Uterine); 세자리 증후군(Sezary Syndrome); 피부암(비흑색종)(Skin Cancer(Nonmelanoma)); 피부암(흑색종)(Skin Cancer(Melanoma)); 메르켈 세포 피부 암종(Skin Carcinoma, Merkel Cell); 소세포 폐암(Small Cell Lung Cancer); 소장암(Small Intestine Cancer); 연조직 육종(Soft Tissue Sarcoma), 편평세포 암종(Squamous Cell Carcinoma), 잠복 원발성의 전이성 편평상피 경부암(Squamous Neck Cancer with Occult Primary, Metastatic); 위암(Stomach(Gastric) Cancer); 천막위 원시 신경외배엽종양(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumors); 피부 T-세포 림프종(T-Cell Lymphoma, Cutaneous); 고환암(Testicular Cancer); 인후두암(Throat Cancer); 가슴샘종(Thymoma) 및 흉선 암종(Thymic Carcinoma); 갑상선암(Thyroid Cancer); 신우 및 요관 이행세포암(Transitional Cell Cancer of the Renal Pelvis and Ureter); 임신성 융모 종양(Trophoblastic Tumor, Gestational); 요도암(Urethral Cancer); 자궁내막 자궁암(Uterine Cancer, Endometrial); 자궁 육종(Uterine Sarcoma); 질암(Vaginal Cancer); 외음부암(Vulvar Cancer); 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom Macroglobulinemia) 또는 윌름 종양(Wilms Tumor).

또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 저분자량 여과물(105F)은 개체의 T 세포 반응 자극에 유용하다. T 세포의 활성화는 면역계의 중요한 양태이다. 예를 들어T 세포 활성화는 감염성 병원체에 대한 특정 면역반응에 필요하다. 또한 T 세포 활성화는 종양 면역 및 자가 면역 및 염증 장애에서 중요한 역할을 한다. T 세포 활성화는 T 세포의 T 세포 항원 수용체(TCR)가 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자의 맥락에서 그들의 특정 항원(Ag)을 인식할 때 개시된다. 저분자량 여과물 또는 이의 조성물은 면역 세포 기능(예, 림프구 증식, 사이토카인 생산 또는 항체 생산)을 조절하기 위해 생체 외(ex vivo) 세포 배양에 사용될 수 있다. 특히, 세포는 본 발명의 조성물과 접촉하여 하나 이상의 면역 세포 기능을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 암, 전염병, 자가 면역 질환, 염증성 질환 및 이식 거부와 같은 특정 질환을 예방, 치료 또는 관리하기 위해 환자에게 투여될 수 있다.

한 양태에서, 상기 면역 시스템 장애는 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 전신 홍반성 루프스, 쇼그렌 증후군, 전신 경화증, 피부근염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성경화성 담관염, 궤양성 대장염, 크론병, 건선, 백반증, 수포성 유천포창, 원형 탈모증, 특발성 확장성 심근증, 제1형 당뇨병, 그레이브스 질환, 하시모토 갑상선염, 중증 근무력증, IgA 신경병증, 막성 신경병증, EBV 감염 및 악성 빈혈이다.

논의된 용도를 고려한 세포외 기질 조성물 및 저분자량 여과물(105F)의 생성을 기재하는 예가 하기에 제시된다. 하기의 실시예는 본 발명의 실시 형태를 추가로 예시하기 위해 제공되나, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 그들은 사용될 수 있는 것들의 전형이지만, 당업자에게 알려진 다른 절차, 방법론 또는 기술이 대안적으로 사용될 수 있다.

실시예 1

저산소 조건하에서 증식된 ECM 조성물 중에서의 유전자의 차등적인 발현

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 조직 배양 플라스크에서 표준 단일층으로서 배양하고, 자연적으로 축적된(deposited) 태아-유사 ECM 내에서의 3차원 섬유아세포 배양물과 비교하였다. 이 배양물을 본원에 개시된 바와 같이 증식시켰다. 유전자의 차등적인 발현을 평가하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 글로벌 유전자 발현(40,000개 미만의 유전자를 포함함)을 위한 Agilent Whole human Genome Oligo Microarrays^®를 사용하여 전체 RNA 샘플을 완성하였다.

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 조건에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 콜라겐 및 ECM 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 콜라겐 및 ECM 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 3에 명백히 제시되어 있다.

저산소 조건하의 3차원 섬유아세포 배양물 중 콜라겐 및 ECM의 차등적인 발현

유전자	증가 배수	감소 배수
COL4A1	17.2
COL20A1	6.88
COL19A1	5.22
COL9A1	4.81
COL10A1	4.45
COL6A3	3.48
COL9A2	2.48
COL14A1	2
SPARC	2.74
COL1A2		3.45
COL13A1		4
COL18A1		4.76
COL1A2		7.14

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 조건에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 Wnt 경로 유전자의 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 Wnt 경로 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 4에 명백히 제시되어 있다.

저산소 조건하의 3차원 섬유아세포 배양물 중 Wnt의 차등적인 발현

유전자	증가 배수	감소 배수
WNT4	5.94
WNT7a	5.43
WNT 7b	4.05
WNT 2b	3.95
WNT 10a	3.86
WNT 8b	3.48
WNT 6	3.36
WNT 3a	3.19
WNT 9b	3.06
WNT 9a	3.02
WNT 11	2.89
WNT 5a		8.33
WNT 2		7.14
WNT 5b		5.26
LRP6	3.43
LRP3	2.27
LRP11		10
LRP12		7.69
DKK1		50
DKK3		5.88
FSZD5	4.48
FRZ9	3.85
FRZB	3.36
FRZD1	2.94
SFRP2	2.95
FRZD1	2.92
FRZD3	2.84
AXIN2	4.4
KREMEN2	4.24
KREMEN1	3.45
b-CATENIN		4.76
GSK3b		11.1
GSK3a		6.67
bFGF		50

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 조건에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 골 형성 단 백질(BMP: bone morphogenetic protein) 경로 유전자의 유전자 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 다양한 BMP 경로 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 5에 명백히 제시되어 있다.

저산소 조건하의 3차원 섬유아세포 배양물 중 BMP의 차등적인 발현

유전자	증가 배수	감소 배수
BMP7/OP1	4.88
BMP2	4.19
BMP5	3.49
BMP3	3.44
BMPrecIb	3.37
BMP8b	3.36
BMP 8a	3.15
BMP 10	2.86
BMP1	2.12
BMPrecIa		2.5
Osteocalcin		2.5
Osteopontin		6.25
BMPrecII		6.25

비교 결과, 섬유아세포는 저산소 조건에서 배양된 자연적으로 분비된 ECM 내의 3차원 배양물 중에서 추가적인 유전자의 발현을 조절하는 것으로 확인되었다. 추가적인 유전자 발현의 상향 조절 및 하향 조절이 표 6에 명백히 제시되어 있다.

저산소 조건하의 생체 내 섬유아세포 ECM의 배양으로부터 일어나는 추가 유전자의 발현 변화

유전자	증가 배수	감소 배수
콜라겐
COL5A1	6.21
COL9A2	3.96
COL6A2	3.78
COL6A2	3.21
COL11A1	3.07
COL8A1	2.78
COL4A5	2.45
COL7A1	2.45
COL18A1	2.41
COL12A1	2.04
COL1A2		0.5
COL14A1		0.45
COL4A1		0.45
COL5A2		0.23
COL6A1		0.16
기질 단백분해효소(Matrix Metalloproteinases, MMPs))
MMP23B	2.75
MMP27		0.24
MMP28		0.17
MMP10		0.16
MMP1		0.16
MMP7		0.1
MMP14		0.08
MMP3		0.06
MMP12		0.05
다른ECM
HAPLN3	8.11
ACAN L12234	6.48
AGC1	3.32
LAMA3	2.92
LAMA1	2.14
LAMA5	2.14

실시예 2

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 사용한 저산소 조건하에서의 ECM생산

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 사용한 저산소 조건하에서의 ECM 배양에 관한 2가지 실시예를 제공한다.

1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 조직 배양 플라스크에서 10% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민이 보충된 90% DMEM(10% FBS/DMEM)의 존재 하에 증식시켰다. 세포를 0.05% 트립신/EDTA를 사용하여 3대까지 계대배양하고, 그 시점에 세포를 배지 1 ml당 0.04 mg의 무드 비드로 사이토덱스-1(Cytodex-1) 덱스트란 비드(100∼120 ml가 충전된 125 ml의 스피너 플라스크 중 5e⁶ 세포/10 mg 비드), 또는 나일론 메쉬(25e⁶ 세포/6×100 ㎠ 나일론)에 시딩하였다. 모든 배양물은 증식 및 시딩을 위해 표준 대기 및 5% CO₂ 중에서 유지하였고, 그 시점에 저산소 배양물을 배양 배지 내에 저산소 환경이 형성될 수 있도록 95% 질소/5% CO₂로 퍼지된 밀폐 챔버로 분할해 넣었다. 이 시스템은 배양 용기 내 산소 농도를 약 1∼5%로 유지한다. 시딩을 위해 나일론 또는 비드를 덮는 데 필요한 최소 부피로 세포를 잘 혼합해 넣고, 그 후, 약 30분이 지나 1회 혼합한 후, 가습된 37℃ 인큐베이터에서 밤새 방치하였다. 세포가 증식하여 ECM을 축적시키기 시작하는 동안 2∼3일마다 50∼70% 배지를 교환해 주면서 2∼4주 동안 10% FBS/DMEM을 배양물에 공급하였다. 추가로 4∼6주 동안, FBS 대신, 철 보충제, 및 20 ㎍/ml 아스코르브산을 함유하는 10% 송아지 혈청을 배양물에 공급하였다. 스피너 플라스크를 처음에는 15∼25 rpm으로 약 2∼4주 동안 혼합하였으며, 그 후 45 rpm으로 증가시켜 이후로는 이 속도를 유지하였다. 비드 배양물은 4주 후에 폭 및 직경이 약 0.5∼1.0 cm인 ECM 함유의 거대 무정형 구조체를 형성하였으며, 따라서 기체 확산과 높은 대사 요구량으로 인해 상기 배양물은 저산소 조건이 되었다.

또 다른 실시예에서는, 1차 인간 신생아 포피 섬유아세포를 단일층 플라스크에서 증식시킨 후, 시험관 내에서 ECM 발달을 지지하도록 나일론 메쉬 스캐폴드 상에서 배양하였다. 고글루코스, 2 mM L-글루타민 및 10%(v/v) 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 중에서 섬유아세포를 증식시켰다. 또한 배양물에 20 ㎍/ml 아스코르브산을 보충하였다. 주변 산소(대략 16∼20%의 산소) 중에서 3주 후, 이중의 ECM 함유 배양물을 95% 질소/5% 이산화탄소(카탈로그 번호 MC-101, 캘리포니아주 델마 소재의 Billups-Rothenberg, Inc.)로 광범위하게 플러싱한 밀폐 챔버의 저산소 배양 조건(1∼5%의 산소)으로 전환하였다. 배양 배지로부터 대기 산소를 확실하게 고갈시키기 위해, 2∼3시간 후, 배지가 약 1∼3%의 산소를 포함하도록 공기를 바꾸었다. 두 세트의 ECM 함유 배양물 모두 추가의 4주 동안 매주 2회씩 영양분을 공급하면서 배양하고, 그 후 RNA 단리를 위해 배양물을 조제하였다. 제조사의 설명서에 따라 상업적으로 입수 가능한 키트(카탈로그 번호 Z3100, Promega, Inc.)를 사용하여 전체 세포 RNA를 단리하였다. 정제된 RNA 샘플을, Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays^®를 이용하는 유전자 발현의 마이크로어레이 분석 전, -80 ℃에 보관하였다.

Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays^® 를 이용하여 결과를 분석한 바, 저산소 배양물로부터 제조된 프로브와 비교하여 주변 산소로부터 제조된 프로브로부터 차등적으로 발현된 전사체 약 5,500종이 검출되었다. 이 중 대략 절반(2,500종)은 저산소에 의해 2.0배 넘게 증가하였고, 대략 절반(2,500종)은 저산소에 의해 2.0배 넘게 감소하였다. 이는 저산소가 시험관 내 유전자 발현에 상당한 변화를 유발한다는 것을 시사한다. 특히 중요한 것은, ECM 단백질, 특히 다수의 콜라겐 유전자에 대한 전사체는 상향 조절된 반면, 다수의 기질 분해 효소 유전자는 하향 조절되었다는 점이다.

실시예 3

치료 적용을 위한 조직 공학적으로 처리된 인간 배아 세포외 기질

배아 세포외 기질(ECM)은 흉터 형성 또는 유착을 유발하지 않고 신속한 세포 증식과 치유에 도움이 되는 환경을 형성한다. 신생혈관형성 전의 초기 배아 환경을 모의하는 조건(저산소 조건 및 감소된 중력) 하에 인간 신생아 섬유아세포가 3차원으로 증식시키면 태아의 특성을 갖는 ECM 조성물이 생성될 것이라고 가정하였다. 유전자 칩 어레이 분석에 의하면, 종래의 조직 배양 조건과 비교하여 저산소 조건하에서 5,000종이 넘는 유전자가 차등적으로 발현되는 것으로 나타났다. 생성된 ECM은 콜라겐 III형, IV형 및 V형, 및 당단백질, 예컨대 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘 및 하이알루론산이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 중간엽 조직과 유사하였다. 또한 ECM은, 주요 성장인자를 갖는 재생성 줄기 세포 집단을 지지하는 추정 영역에서 성장인자에 결합하여 이를 제시하는 데 있어서 중요한 조절 기능을 하기 때문에, 본 발명자들은 배양 상태에서 태아 유사 ECM이 발생하는 동안 저산소 조건이 성장인자 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 또한 저산소 조건은 상처 치유 및 기관형성을 조절하는 인자, 예컨대 VEGF, FGF-7 및 TGF-β와, Wnt 2b, 4, 7a, 10a 및 11을 비롯한 다수의 wnt의 발현을 증진시킬 수 있다. MTT 분석법을 이용할 때 효소 활성의 증가로 측정되는 바와 같이, 또한 배아 인간 ECM은 시험 관내 인간 섬유아세포의 대사 활성의 증가를 촉진하였다. 또한 본 발명자들은 인간 ECM에 대한 반응으로 세포 수가 증가한 것을 검출하였다. 이러한 인간 ECM은 흉터 형성 또는 유착의 발생없이 새 조직의 증식 및 치유가 필요한 다양한 치료 용도에 있어서 생물학적 표면 코팅으로서, 또 조직 필러 치료에 사용될 수 있다.

실시예 4

재생 의학 적용을 위한 천연적으로 가용성인 WNT 활성의 생성

피부 또는 혈액과 같은 성체 조직을 재생시킬 수 있는 줄기 세포 또는 전구 세포는 이러한 재생을 실현하기 위해 어느 정도까지는 배아 발생을 반복한다. 증가하고 있는 많은 연구를 통해, 배아발생 중에 활성을 띠는, 줄기 세포 다능성 및 계통 특이적 분화의 주요 조절인자가 특정 환경 하에서는 성체에서도 재발현된다는 것이 밝혀졌다. 분비된 형태발생 성장인자 및 발생 인자의 WNT 패밀리는 잠재적으로 가치있는 연구 도구가 되고 결국 임상에서의 치료 수단이 될 수 있는 성장인자 중 하나이다. 그러나, 현재까지 상업적 규모로는 Wnt가 표준 재조합 발현 및 정제 기법에 대하여 적합하지 않은 것으로 입증되었고, WNT 베이스의 제품을 임상적으로 개발할 수 있는 대규모 WNT 단백질 생산에 관한 보고도 없었다. 배양액 중의 다양한 스캐폴드 상의 신생아 인간 진피 섬유아세포를 사용하여 태아 유사 ECM을 배양 증식시킴으로써 3차원 조직 등가물을 생성할 수 있는 기법이 개발되었다. 이 과정에서, 상기 배양물이, ECM 생산에 사용되는 무혈청 조건화 배지 중에 함유되어 있는 생물학적 활성 WNT의 상업적 규모의 공급원을 제공할 수 있다는 것이 발견되었다. 여기에서, 본 발명자들은 상기 WNT 생성물 후보물질에 대한 데이터를 제공한다.

세포의 유전자 발현 분석은, 적어도 3종의 WNT 유전자(wnt 5a, wnt 7a, 및 wnt 11)가 발현되었고, wnt 신호전달과 관련이 있는 소수의 유전자도 발현되었다는 것을 입증하였다; 그러나, 그 기능은 완전히 이해되고 있지 않다. 유전자 발현 데이터를 wnt 신호전달(1차 인간 표피 각질세포에서 β-카테닌의 핵 전좌)에 대한 시험관 내 생물학적 분석으로 확장시켜, 혈액 줄기 세포에 대한 wnt 활성을 평가하였다. 두 분석 모두를 통해 정규(canonical) wnt 활성과 일치하는 활성이 입증되었다. 또한 이들 배양물로부터 얻은 조건화된 배지는, 마우스의 피부 내로 주사되었을 때 모낭 줄기 세포가 성장기에 진입할 수 있도록 유도하여 모발 성장이 이루어질 수 있도록 하는 wnt 활성을 보였다. 이는 규정 배지 및 무혈청 조건 배지 중의 안정화된 WNT 활성은 정제를 필요로 하지 않는다는 것을 시사한다. 이러한 생성물을 모낭 재생용으로, 또 다양한 인간 줄기 세포의 배양을 위한 유용한 연구 수단으로써 사용할 수 있다.

실시예 5

저산소 조건하의 섬유아세포는 독특한 ECM 생산과 성장인자 발현을 나타낸다

인간 신생아 진피 섬유아세포는 시험관 내에서 배양될 때 ECM을 생산하는데, 이는 진피와 매우 유사하고, 상처 치유와 같은 재생 의학 분야에서 손상된 진피를 대체할 수 있다. 또한 상처 치유 과정은 배아 환경을 모의함으로써 배아 발생을 반복하기 때문에, 본 발명자들은 생산된 ECM이 조직 재생 용도를 위한 증대된 ECM을 제공할 것이라고 가정하였다. 따라서, 신생혈관형성 전의 초기 배아에 존재하는 저산소 조건을 모의하기 위해, 인간 신생아 섬유아세포 유래의 ECM을 저산소 조건의 배양 조건으로 증식시켰다. 이 목적은 배양 상태에서의 조직 발생중에 저산소 조건을 사용함으로써 태아 특성을 갖는 ECM을 생성하는 것이었다.

이러한 저산소 배양 상태에서 생산된 ECM은 콜라겐 III형 및 V형, 및 당단백질, 예컨대 피브로넥틴, SPARC, 트롬보스폰딘 및 하이알루론산이 비교적 풍부하다는 점에서 태아 중간엽 조직과 유사하였다. 또한 ECM은, 주요 성장인자를 갖는 재생성 줄기 세포 집단을 지지하는 추정 영역에서 성장인자에 결합하고 이를 제시하는 데 있어서 중요한 조절 기능을 하기 때문에, 본 발명자들은 배양 상태에서의 태아 유사 ECM의 발생 중에 저산소 조건이 성장인자 발현에 미치는 영향을 평가하였다. 또한 저산소 조건은 상처 치유 및 기관형성을 조절하는 인자, 예컨대 VEGF, FGF-7 및 TGF-β의 발현을 증대시킬 수 있는 것으로 확인되었다.

MTT 분석법을 이용할 때 효소 활성의 증가로 측정되는 바와 같이, 또한 인간 ECM은 시험관 내 인간 섬유아세포의 대사 활성 증가를 촉진하였다. 또한 인간 ECM에 대한 반응으로 세포수가 증가한 것도 검출되었다. 이러한 결과는 배아 세포 배양에서 코팅/스캐폴드로서, 또 다양한 치료 용도 또는 의료용 디바이스에서 생물학적 표면 코팅/필러로서의 상기 인간 ECM의 용도를 뒷받침한다.

실시예 6

골수종, 신경교종 및 유방암에서의 세포외 기질 조성물

시스플라틴 존재 또는 부재 하, ECM 존재 또는 부재 하에서의 B16(흑색종 세포주), C6(신경교종 세포주) 및 MDA 435(유방암세포주) 세포의 종양 성장을 수정된 계란의 장뇨막 분석(CAM)으로 조사하였다. 요약하면, 계란의 생존성을 촛불에 비추어 확인하였다. 계란의 적도판에서 껍질과 장뇨막 사이에 기포가 형성되도록 공기 주머니를 이동시켰다. CAM으로의 접근로를 확보하기 위해 껍질에 창을 만들었다. CAM에 다음과 같이 세포를 첨가하였다: B16 세포, 계란당 5백만개; C6 세포, 계란당 5백만개; 및 MD435 세포, 계란당 5백만개. ECM 처리 계란의 경우, ECM(약 100 ㎍/처리) 및 세포를 동시에 계란에 첨가하였다. 시스플라틴으로 처리된 계란의 경우, 시스플라틴(1 mg/mL의 시스플라틴 용액 250 ㎕)을 다음날 국소적으로 첨가하였다. 계란을 10일 동안 인큐베이션하였고, 그 후 종양을 적출하여 칭량하였다.

종양 매스는 ECM 존재 하에 유의적으로 감소하였다. 도 1 및 2는 B16 세포에 의해 생성된 종양의 중량이 ECM 부재에 비해 ECM 존재 하에 감소하였음을 보여준다. 또한 종양의 중량은 ECM과 혼합하거나 ECM 상에서 배양한 경우에도 감소되었다(도 3). 도 4 및 5는 C6 세포에 의해 생성된 종양의 중량이 미처리에 비해 ECM 존재 하에 감소되었음을 보여준다. 또한 ECM+시스플라틴 존재 하에 종양 중량이 추가로 감소되었다. 도 7은 MDA 435 유방암세포에 의해 생성된 종양의 중량이 미처리에 비해 ECM 존재 하에 감소되었으며 ECM + 시스플라틴 존재 하에 추가로 감소되었음을 보여준다.

또 다른 CAM 검정에서는, B16 세포를 바이오뉴시스(BioNeusis)(10 mg/ml) 100 ㎕와 함께 계란(계란당 2∼3백만개 세포)에 주사하였다. 바이오뉴시스는 ECM을 생성하는 데 사용되는 바이오리액터에서 섬유아세포에 의해 조건화된 배지로서 액체 형태에서만 ECM과 매우 유사하다. 도 16은 CAM 검정에서의 종양 증식이 미처리에 비해 바이오뉴시스(BioNeusis) 존재 하에 감소되었음을 보여준다. 추가 연구에서, B16 세포를 액체 ECM의 농도를 증가시키면서 배양하였으며, 이때 모든 ECM 농도에서 증식이 감소되었다(도 17). 또 다른 연구에서는, B16 세포를, CAM 검정에서의 비분획화 액체 ECM 중에서 증식시킨 B16 세포와 비교하여 다양한 분자량 분획의 액체 ECM 중에서 증식시켰다. 100,000 달톤 초과를 제외하고 모든 분자량 분획이 비분획화 ECM과 비교하여 종양 매스 감소율(%)에 있어서 의 증가를 보였다(도 18).

ECM 존재 또는 부재 하 및 시스플라틴 존재 및 부재 하에서의 B16 세포, C6 세포 또는 MDA435 세포의 종양 증식을 누드 마우스에서 조사하였다. 세포, ECM 및 시스플라틴을 누드 마우스의 아랫쪽 둔부에 동시에 피하 주사하였다. 사진 촬영, 길이 및 폭 측정, 마지막으로 중량 측정을 통해 종양 증식을 경시적으로 추적하였다. 도 8 및 9는, 주사 후 14일째의, ECM 존재 하(도 9) 및 부재 하(도 8)에서의 누드 마우스에서의 C6 세포로부터의 종양 증식을 보여준다. 도 10 및 11은, 주사 후 14일째의, ECM + 시스플라틴 존재 하(도 10) 및 ECM 없이 시스플라틴 존재 하(도 11)에서의 누드 마우스에서의 C6 세포로부터의 종양 증식을 보여준다. ECM 존재 하에서 증식시킨 세포는, 촉진할 수 있는 종양을 형성한 대조군(미처리)과 비교하여 종양 증식을 보이지 않거나 감소된 증식을 보였다. 도 12는, ECM으로 처리된 마우스는 미처리 대조군과 비교하여 감소된 종양 증식을 나타내었으며, ECM 존재 또는 부재 하에 시스플라틴으로 처리된 마우스는 종양 증식을 나타내지 않았음을 보여주는 18일 동안의 종양 증식 플롯을 도시한다. 유사한 연구에서, ECM 존재 하에 증식시킨 MDA435 세포(도 13b), ECM 및 시스플라틴 존재 하에 증식시킨 MDA435 세포(도 13c) 또는 시스플라틴 단독 존재 하에 증식시킨 MDA435 세포(도 13d)는 촉진할 수 있는 종양을 형성한 미처리 대조군(도 13a)과 비교해서 종양 증식의 감소 또는 부재를 나타내었다. 도 14는 25일 동안의 종양 증식 플롯을 도시하며, 여기에서는 ECM으로 처리된 마우스가 미처리 대조군과 비교해서 감소된 종양 증식을 나타내었다. ECM 존재 또는 부재 하에 시스플라틴으로 처리된 마우스는 종양 매스가 0까지 감소됨을 나타내었다. 도 15는 ECM 존재(오른쪽) 또는 ECM 부재(왼쪽) 하에 누드 마우스에서 증식시킨 B16 세포의 결과를 보여주며, 여기에서는 종양 증식이 ECM 존재 하에 억제되었다.

실시예 7

ECM으로부터 저분자량 여과물의 제조

ECM에서 활성 성분을 추가로 정의하기 위해, 신생아 피부 섬유아세포( "105F"라고도 함)의 교반된 생물 효과기로부터의 조건화된 배지로부터 5K 이하의 분자량의 한외 여과물을 제조하였다. 정제 프로토콜은 다음과 같다:

헤파린 세파로즈 6(Sepharose 6) 고속 유동(GE Healthcare): 20 ml 컬럼

결합 완충액: 50 mM Tris/HCl, 0.2 M NaCl, pH 7.4

세정 완충액: 50 mM Tris/HCl, 0.2 M NaCl, pH 7.4

용출 완충액: 50 mM Tris/HCl, 1.0 M NaCl, pH 7.4

유동 속도: ~ 30 ml/hr(gravity flow)

분획 크기: 5 ml

C57bl6 마우스에서 B16 폐 모델을 사용하여 CD8+ 인 현저한 종양 침윤 림프구(TIL)가 관찰되었다. 또한 TIL은 PD-1 음성이였으며 이는 면역 억제성이 아니지만 세포 독성을 나타냄을 나타낸다. 또한 이 데이터는 피하 B16 마우스 모델에서 반복하였다. PD-1 발현에 대한 여과물의 효과는 항원 제시 세포에서 PD-1에 대한 리간드인 PDL-1의 발현에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 이러한 데이터는 여과물이 범 면역 조절 효과와는 반대로 특정 T 세포 효과가 있음을 나타낸다.

방법

B16 폐 모델

B16 마우스 흑색종 세포(5 x 10⁵)를 C57bl6 마우스에 정맥 주사하였다. 매일 100ul I.V. 처리(100ul, i.v.)는 다음날 시작되었고 연구 기간 내내 계속되었다. 연구 기간은 마우스의 상태와 질환의 진행에 따라 2.5-3 주였다. 부검에서, 폐엽을 정상적인 나눈 후 반은 완충 포르말린에서 고정되었고, 반은 OCT에서는 동결하였다. 종양을 밝은 영역 현미경을 사용하여 표면에서 계수하였다.

B16 피하 모델

B16 마우스 흑색종 세포(1 × 10⁶)를 C57bl6 마우스에 피하 주사하였다. 일단 종양이 감지할 수 있는 크기에 도달하면, 일주일에 두 번 여과물을 종양 내 주사(0.5mL)하였다. 마우스는 병적 상태가 되기 전에 희생되었다. 종양의 반은 보통 완충된 포르말린에서 고정되었고, 반은 OCT에서 동결하였다.

조직학

파라핀 함몰 저온-절편에 대해 표준 H&E 염색뿐만 아니라 면역 조직화학(IHC)을 수행하였다.

결과

B16 세포의 i.v. 주사는 공격적이고 전이성인 질환 상태를 초래하였다. 폐에는 각각 100 종양이 넘었다. 여과물 처리는 대부분 종양의 시딩 및 발달을 현저히 감소시켜 대부분 경우 75 % 이상이었다(도 19).

H&E 염색 절편에서의 조직학적 검사는 종양 크기 및 수의 차이를 입증한다(도 20)

항-마우스 CD8+ 항체를 사용하여 TIL 침윤의 수준을 증명하였다. 여과물 처리된 마우스는 비히클에 비해 종양 내 T- 세포의 투입을 강하게 증가시켰다(도 21).

증가된 TIL 활성을 입증함으로써, T- 세포의 활성화 상태를 조사하였다. 항마우스 PD-1 항체를 사용하여 침윤하는 T 세포가 PD-1 음성이었으며, 이는 T 세포가 면역 억제되지 않았음을 나타낸다. 이 결과는 여과물의 종양 내 주사하여 피하 모델에서 반복되었다(도 22, 검은 화살표는 PD-1 염색에서 양성임을 나타낸다).

결과가 여과물의 특정 로트 또는 제조에 제한되지 않는다는 것을 입증하기 위해, 상이한 로트의 출발 물질 및 상이한 농축기를 사용하는 상이한 제제를 시험 하였다. 이 로트를 사용하면 B16 폐 전이 모델에서와 동일한 TIL 및 PD-1 프로파일이 원래의 여과물처럼 관찰되었다. 이 데이터는 여과물의 활성 성분이 다양한 생산 방법을 사용하여 일관성이 있음을 나타낸다.

여과물이 모든 변형된 면역 세포에 영향을 주는지 여부를 결정하기 위해 항-PDL-1을 사용하여 마우스 폐 절편을 염색하였다. PD-1 결과는 반복되었고, 치료군에서는 음성 및 대조군에서는 양성이었으나 리간드 PDL-1에 대한 염색은 변하지 않았다(도 23). 이러한 데이터는 여과물의 활성이 T 세포에 초점을 맞추고 종양의 면역 억제 상태에 크게 기여하는 항원 제시 세포에는 영향을 미치지 않을 수 있음을 나타낸다.

토론

이전의 연구들은 세포 사멸을 유도하는 여과물의 효과를 입증하였다. 이러한 연구에서 여과물 처리 마우스 폐에서 B16의 전이성 부하는 75 % 이상 감소되었다. 또한 이 데이터는 여과물에서 활성 성분이 종양에서 CD8+ T 세포의 침범에 영향을 미쳤음을 나타낸다. 침윤 T 세포의 활성화 상태는 PD-1 음성이었고, 이는 TIL이 여과물로 인해 면역 억제보다는 세포 독성을 나타냈음을 시사한다.

실시예 8

췌장암, 난소암, 위암 및 간암으로 시작하여 제한된 치료 성공율 및 높은 사망률을 갖는 105F 표적 암으로 시험관 내 및 생체 내에서 연구를 수행하였다. 복수의 감소(복부 체액 축적) 및 종양 크기 감소의 효능 측정 결과, 삶의 질과 수명이 향상되었다. 105F는 현저히 종양 부하를 줄이고 생존을 연장시켜 동물 모델뿐만 아니라 시험관 내에서 21 종의 인간 암세포주를 억제하는 것으로 나타났다.

105F를 시험관 내 또는 생체 내 또는 이들 둘 모두에서 하기 세포주에서 시험 하였다:

4 mg/ml 의 MTT 분석에서 MDA435 인간 유방 증식의 50 % 감소

3mg/ml의 MDA 231 인간 유방 60 %

HT29 인간 결장 선암종 마우스 모델에서 65 % 감소

4 mg/ml의 HCT116 인간 결장 선암종 20 %

4 mg/ml 의 OVCAR 인간 난소 암 20 %

4 ㎎/㎖의 C33a 인간 자궁 경부암 20 %

4 mg/ml의 PC3 인간 전립선 암 55 %; METCAM 50 % 감소(Ig-형 유전자 슈퍼 패밀리의 세포 부착 분자인 전이 세포 부착 분자/MUC18(METCAM)은 전립선 암세포 진행의 주요 결정 인자이다.)

PC3-CTC 순환 종양 세포 METCAM 80 % 감소

3 mg/ml 의 Panc 1 췌장 연성 암종 20 %

3 mg/ml 의 MiaPaca 췌장암 60 %,

3 mg/ml 의 OST1 골육종 40 %

C6 마우스 신경 교종 CAM 58 +/1.5 %; SQ 마우스 61 +/2.9 %(SQ- 피하)

4mg/ml의 SCC 편평 상피 암종 90 %

8 mg/ml의 B16 마우스 흑생종 50 %; 60 +/ 3.2 % SQ 마우스; 67 +/0.7 % CAM

8mg/ml의 MESO 인간 중피종 50 %

4mg/ml의 NUGC 인간 위암 50 %

0.5mg/ml의 C918, D04, MM485, MEL202 50 %

실시예 9

흑색종 및 췌장 세포주에서 분획 105F로 처리된 세포에서 유전자 발현을 조사 하였다. 경로 분석은 wnt 신호, 세포 자멸사, 혈관 신생, 인터루킨 및 사이토카인 신호, 염증 및 TLR 신호를 나타낸다(도 24A 참조). 분자 기능 경로 분석은 105F가 결합 모티프 및 수용체 활성뿐만 아니라 암과 관련된 촉매 및 효소적 조절 기능과 관련된 "활성"에 풍부하다는 것을 확인했다. 또한 이는 단일 경로에만 영향을 미치는 단일 작은 분자보다는 105F 분획 모이어티의 생물학적 기능과도 일치한다(도 24B 참조).

단백질 분류의 분석은 이전의 분자 기능 결과와 유사하다. 활성 모이어티의 대부분은 분비되며, 따라서 세포외 영역과 관련된 이러한 활동의 거의 50 %를 발견하는 것이 가능하다. 또한 우리는 세포내 세포 부분과 세포 소기관을 확인하였지만 고밀도 세포 배양에서 활성 수송과는 반대로 일정 수준의 방출이 있기 때문에 조건화된 배지에서 일어난다는 것이 알려져 있다(도 24C 참조).

도 24D에서, 빨간 화살표는 유전자 발현의 변화 조절의 방향을 나타낸다; 예를 들어, TNFα 유전자는 SkMel에서 감소하지만 DO4에서 증가된다; 녹색선은 췌장 세포주 대비 흑색종에서 변화없이 비교적 많은 수의 유전자를 보여준다. TNF 신호는 FAS 리간드와 CD27과 함께 명확하게 조절된다. TNFS10(일명 TRAIL) 및 TNFRSF10A(TRAILRec1)가 새로 확인되었다. 도 24E-24H는 인터페론, WNT 억제제, 표준 WNT 유전자 발현 및 비표준 WNT 유전자 발현을 각각 나타낸다.

흑색종 세포주는 췌장 암세포주보다 105F 에 더 반응하였다. WNT 경로는 105F-(표준 >> 비표준), 아마도 카드헤린과 억제제(WIF1, sFRPs)를 통해 조절된다. 프로-염증성 유전자는 암세포 및 면역 세포에서 시험관 내(TNFα, 인터페론-감마)에서 유도된다. 105F의 항종양 활성은 분화 조절 및 종양 세포에 대한 면역 반응의 증가를 포함하는 것으로 보인다.

본 발명은 2015년 4월 30일자로 출원된 관련된 미국 가출원 제 62/155,360 호의 상기 실시예 및 첨부 1을 참조하여 설명되었지만, 그 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함되어 있지만, 수정 및 변형이 본 발명의 사상 및 범위 내에 포함되는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 다음의 청구 범위에 의해서만 제한된다.

Claims (17)

1. 섬유아세포 조건조절된 배지로부터의 한외 여과물인 세포외 기질 조성물을 포함하는 조성물로서, 상기 여과물은 5000 달톤 분자량을 초과하는 분자를 배제시키며 CD8+ T 세포 동원 활성을 포함하는 것인, 조성물.
2. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체에 있는 것인, 조성물.
3. 제1항에 있어서, 화학요법제와 병용하는 것인, 조성물.
4. 제1항에 있어서, PD-1 저해제와 병용하는 것인, 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 세포외 기질 조성물은 세포를 적절한 성장 배지 중의 2차원 또는 3차원 표면 하/상에서 배양하여 얻어지는 것인, 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 성인, 태아, 신생아, 배아 조직으로부터의 것인, 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 세포는 저산소 조건 하에서 배양되는 것인, 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 저산소 조건은 1-5% 산소인 것인, 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 가용성 분획인 것인, 조성물.
10. 치료학적으로 유효한 양의 제1항의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 종양 부위에 CD8+ 세포를 동원하고 종양 크기를 감소시키는 것을 포함하는, 개체에서 종양 부하(tumor burden)를 감소시키는 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 종양은 투여 전에 적출되는 것인, 방법.
12. 제10항에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지내, 피하, 표피하, 관절강내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내로 주사 또는 주입하는 것인, 방법.
13. 치료학적으로 유효한 양의 제1항의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 CD8+ 세포를 동원하고 장애를 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 면역 체계 장애를 치료하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 장애는 다발성 경화증(multiple sclerosis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 전신 경화증(systemic sclerosis), 피부근염(dermatomyositis), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 원발성경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's disease), 건선(psoriasis), 백반증(vitiligo), 수포성 유천포창(bullous pemphigoid), 원형 탈모증(alopecia areata), 특발성 확장성 심근증(idiopathic dilated cardiomyopathy), 제1형 당뇨병(type 1 diabetes mellitus), 그레이브스 질병(Graves' disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), IgA 신경병증(IgA nephropathy), 막성 신경병증(membranous nephropathy), EBV 감염(EBV infection) 및 악성 빈혈(pernicious anemia)인 것인, 방법.
15. 치료학적으로 유효한 양의 제1항의 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 암을 치료하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지내, 피하, 표피하, 관절강내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내로 주사 또는 주입하는 것인, 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 암은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법:
    급성 림프구성 백혈병(Acute Lymphoblastic); 급성 골수성 백혈병(Acute Myeloid Leukemia); 부신피질암(Adrenocortical Carcinoma); 소아 부신피질암(Adrenocortical Carcinoma, Childhood); 충수암(Appendix Cancer); 기저세포 암종(Basal Cell arcinoma); 간외 담도암(Bile Duct Cancer, Extrahepatic); 방광암(Bladder Cancer); 골암(Bone Cancer); 골육종(Osteosarcoma) 및 악성 섬유성 조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma); 소아 뇌간교종(Brain Stem Glioma, Childhood); 성인 뇌종양(Brain Tumor, Adult); 뇌종양(Brain Tumor), 소아 뇌간교종(Brain Stem Glioma, Childhood); 뇌종양, 소아 중추신경계 비정형 기형/횡문근양 종양(Central Nervous System Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor, Childhood); 중추 신경계 배아종(Central Nervous System Embryonal Tumors); 소뇌별아교세포종(Cerebellar Astrocytoma); 소뇌별아교세포종(Cerebral Astrocytoma)/악성 교종(Malignant Glioma); 두개인두종(Craniopharyngioma); 뇌실막모세포종(Ependymoblastoma); 뇌실막종(Ependymoma); 속질모세포종(Medulloblastoma); 속질상피종(Medulloepithelioma); 중등도분화의 송과 실질세포 종양(Pineal Parenchymal Tumors of Intermediate Differentiation); 천막위 원시 신경외배엽종양(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumors) 및 송과체모세포종(Pineoblastoma); 시각경로 및 시상하부 신경아교종(Visual Pathway and Hypothalamic Glioma); 뇌 및 척추 종양(Brain and Spinal Cord Tumors); 유방암(Breast Cancer); 기관지내 종양(Bronchial Tumors); 버킷 림프종(Burkitt Lymphoma); 유암종(Carcinoid Tumor); 위장관 유암종(Carcinoid Tumor, Gastrointestinal); 중추신경계 비정형 기형/횡문근양 종양(Central Nervous System Atypical Teratoid/Rhabdoid Tumor); 중추 신경계 배아종(Central Nervous System Embryonal Tumors); 중추신경계 림프종(Central Nervous System Lymphoma); 소뇌별아교세포종(Cerebellar Astrocytoma); 소아 소뇌별아교세포종/악성 교종(Cerebral Astrocytoma/Malignant Glioma, Childhood); 자궁경부암(Cervical Cancer); 소아 척삭종(Chordoma, Childhood); 만성 림프성 백혈병(Chronic Lymphocytic Leukemia); 만성 골수성 백혈병(Chronic Myelogenous Leukemia); 만성 골수 증식 질환(Chronic Myeloproliferative Disorders); 대장암(Colon Cancer); 직장암(Colorectal Cancer); 두개인두종(Craniopharyngioma); 피부 T-세포 림프종(Cutaneous T-Cell Lymphoma); 식도암(Esophageal Cancer); 종양의 유잉 패밀리(Ewing Family of Tumors); 고환외 배세포종(Extragonadal Germ Cell Tumor); 간외 담도암(Extrahepatic Bile Duct Cancer); 안암으로서, 안구내 흑색종(Eye Cancer, Intraocular Melanoma); 안암으로서, 망막모세포종(Eye Cancer, Retinoblastoma); 담낭암(Gallbladder Cancer); 위암(Gastric(Stomach) Cancer); 위장관 악성 종양(Gastrointestinal Carcinoid Tumor), 위장관 기질종양(Gastrointestinal Stromal Tumor(GIST)); 두개외 생식세포 종양(Germ Cell Tumor, Extracranial); 고환외 생식 세포 종양(Germ Cell Tumor, Extragonadal); 난소 생식 세포 종양(Germ Cell Tumor, Ovarian); 임신성 융모성 종양(Gestational Trophoblastic Tumor); 신경아교종(Glioma); 소아 뇌간 신경아교종(Glioma, Childhood Brain Stem); 신경아교종으로서의, 소아 뇌 별아교세포종(Glioma, Childhood Cerebral Astrocytoma), 신경아교종으로서의, 소아 시각경로 및 시상하부 신경아교종(Glioma, Childhood Visual Pathway and Hypothalamic), 털세포 백혈병(Hairy Cell Leukemia); 두경부암(Head and Neck Cancer); 간암(hepatocellular(Liver) Cancer); 랑게르한스 세포의 조직구증(Histiocytosis, Langerhans Cell); 호지킨 림프종(Hodgkin Lymphoma); 피열후두개 암(Hypopharyngeal Cancer); 시상하부 및 시각경로 신경아교종(Hypothalamic and Visual Pathway Glioma); 안구 내 흑색종(Intraocular Melanoma); 췌도 세포종(Islet Cell Tumors); 신장암(Kidney(Renal Cell) Cancer); 랑게르한스 세포 조직구증(Langerhans Cell Histiocytosis); 후두암(Laryngeal Cancer); 급성 림프모구 백혈병(Leukemia, Acute Lymphoblastic); 급성 골수성 백혈병(Leukemia, Acute Myeloid); 만성 림프구성 백혈병(Leukemia, Chronic Lymphocytic); 만성 골수성 백혈병(Leukemia, Chronic Myelogenous); 털세포 백혈병(Leukemia, Hairy Cell); 구순 및 구강암(Lip and Oral Cavity Cancer); 간암(Liver Cancer); 비소세포 폐암(Lung Cancer, Non-Small Cell); 소세포 폐암(Lung Cancer, Small Cell); AIDS 관련 림프종(Lymphoma, AIDS-Related); 버킷 림프종(Lymphoma, Burkitt); 피부 T-세포 림프종(Lymphoma, Cutaneous T-Cell); 호지킨 림프종(Lymphoma, Hodgkin); 비-호지킨 림프종(Lymphoma, Non-Hodgkin); 원발성 중추 신경계 림프종(Lymphoma, Primary Central Nervous System); 왈덴스트롬 마크로불린혈증(Macroglobulinemia, Waldenstrom); 뼈의 악성 섬유조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone) 및 골육종(Osteosarcoma); 수모세포종(Medulloblastoma); 흑색종(Melanoma); 안내 흑색종(Melanoma, Intraocular(눈)); 메르켈 세포 암(Merkel Cell Carcinoma); 중피종(Mesothelioma); 잠복 원발성의 전이성 편평상피 경부암(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary); 구강암(Mouth Cancer); 소아의 다발성 내분비 샘종증 증후군(Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome,(Childhood)); 다발 골수종(Multiple Myeloma)/형질 세포 종양(Plasma Cell Neoplasm); 균상 식육종(Mycosis Fungoides); 골수형성이상 증후군(Myelodysplastic Syndromes); 골수형성이상/골수증식 질환(Myelodysplastic/Myeloproliferative Diseases); 만성 골수성 백혈병(Myelogenous Leukemia, Chronic); 성인 급성 골수성 백혈병(Myeloid Leukemia, Adult Acute); 소아 급성 골수성 백혈병(Myeloid Leukemia, Childhood Acute); 다발성 골수종(Myeloma, Multiple); 만성 골수증식 질환(Myeloproliferative Disorders, Chronic); 비강 및 부비동 암(Nasal Cavity and Paranasal Sinus Cancer); 비인두암(Nasopharyngeal Cancer); 신경모세포종(Neuroblastoma); 비소세포폐암(Non-Small Cell Lung Cancer); 구강암(Oral Cancer); 구강암(Oral Cavity Cancer); 입인두암(Oropharyngeal Cancer); 뼈육종(Osteosarcoma) 및 뼈의 악성 섬유 조직구종(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone); 난소암(Ovarian Cancer); 상피성 난소암(Ovarian Epithelial Cancer); 난소 생식 세포 종양(Ovarian Germ Cell Tumor); 난소 저악성 잠재성 종양(Ovarian Low Malignant Potential Tumor); 췌장암(Pancreatic Cancer); 췌장암으로서, 췌도 세포 종양(Pancreatic Cancer, Islet Cell Tumors); 유두종증(Papillomatosis); 부갑상선암(Parathyroid Cancer); 음경암(Penile Cancer); 인두암(Pharyngeal Cancer); 크롬친화세포종(Pheochromocytoma); 중등도분화의 송과 실질세포 종양(Pineal Parenchymal Tumors of Intermediate Differentiation); 송과체모세포종(Pineoblastoma) 및 천막위 원시 신경외배엽종양(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumors); 하수체 종양(Pituitary Tumor); 형질 세포 종양(Plasma Cell Neoplasm)/다발 골수종(Multiple Myeloma); 흉막폐아세포종(Pleuropulmonary Blastoma); 원발성 중추신경계 림프종(Primary Central Nervous System Lymphoma); 전립선암(Prostate Cancer); 직장암(Rectal Cancer); 신장암(Renal Cell(Kidney) Cancer); 신우 및 요관 이행세포암(Renal Pelvis and Ureter, Transitional Cell Cancer); 15 번 염색체 상의 NUT 유전자와 관련된 기 도 암종(Respiratory Tract Carcinoma Involving the NUT Gene on Chromosome 15); 망막모세포종(Retinoblastoma); 횡문근육종(Rhabdomyosarcoma); 침샘암(Salivary Gland Cancer); 종양의 유잉 패밀리의 육종(Sarcoma, Ewing Family of Tumors); 카포시 육종(Sarcoma, Kaposi); 연조직 육종(Sarcoma, Soft Tissue); 요관 육종(Sarcoma, Uterine); 세자리 증후군(Sezary Syndrome); 피부암(비흑색종)(Skin Cancer(Nonmelanoma)); 피부암(흑색종)(Skin Cancer(Melanoma)); 메르켈 세포 피부 암종(Skin Carcinoma, Merkel Cell); 소세포 폐암(Small Cell Lung Cancer); 소장암(Small Intestine Cancer); 연조직 육종(Soft Tissue Sarcoma), 편평세포 암종(Squamous Cell Carcinoma), 잠복 원발성의 전이성 편평상피 경부암(Squamous Neck Cancer with Occult Primary, Metastatic); 위암(Stomach(Gastric) Cancer); 천막위 원시 신경외배엽종양(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumors); 피부 T-세포 림프종(T-Cell Lymphoma, Cutaneous); 고환암(Testicular Cancer); 인후두암(Throat Cancer); 가슴샘종(Thymoma) 및 흉선 암종(Thymic Carcinoma); 갑상선암(Thyroid Cancer); 신우 및 요관 이행세포암(Transitional Cell Cancer of the Renal Pelvis and Ureter); 임신성 융모 종양(Trophoblastic Tumor, Gestational); 요도암(Urethral Cancer); 자궁내막 자궁암(Uterine Cancer, Endometrial); 자궁 육종(Uterine Sarcoma); 질암(Vaginal Cancer); 외음부암(Vulvar Cancer); 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증(Waldenstrom Macroglobulinemia) 또는 윌름 종양(Wilms Tumor).
    
    

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