JP2021183607A - 癌または免疫疾患の治療のための細胞外マトリックス組成物 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞外マトリックス(ECM)組成物と癌細胞を接触させることによって癌細胞の成長または増殖を阻害する方法、また、化学療法剤を含有する細胞外マトリックス組成物と癌細胞を接触させることによって、癌細胞に化学療法剤を送達する方法、また、ECM及び化学療法剤を含有する組成物の提供。【解決手段】線維芽細胞馴化培地からの限外ろ過液細胞外マトリックス組成物を含む組成物であって、前記ろ過液が、分子量5000ダルトンを超える分子を除外しており、かつCD8+T細胞動員活性を含む、前記組成物を提供する。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本出願は、2015年4月30日に出願された米国特許仮出願第62/155,360号に対する優先権の恩典を米国特許法第119条(e)の下で主張するものであり、その全内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2015年4月30日に出願された米国特許仮出願第62/155,360号に対する優先権の恩典を米国特許法第119条(e)の下で主張するものであり、その全内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、一般に細胞外マトリックス組成物の使用に関し、より具体的には、細胞増殖を阻害するための細胞外マトリックス組成物の使用に関する。
本発明は、一般に細胞外マトリックス組成物の使用に関し、より具体的には、細胞増殖を阻害するための細胞外マトリックス組成物の使用に関する。
背景情報
細胞外マトリックス(ECM)は、インビボで哺乳動物組織内にみられる細胞を包囲しかつ支持する複雑な構造体である。ECMは、結合組織と呼ばれることも多い。ECMは、構造タンパク質、例えばコラーゲン及びエラスチン、特殊タンパク質、例えばフィブリリン、フィブロネクチン、及びラミニン、ならびにプロテオグリカンを含む3つの主要なクラスの生体分子から主に構成される。
細胞外マトリックス(ECM)は、インビボで哺乳動物組織内にみられる細胞を包囲しかつ支持する複雑な構造体である。ECMは、結合組織と呼ばれることも多い。ECMは、構造タンパク質、例えばコラーゲン及びエラスチン、特殊タンパク質、例えばフィブリリン、フィブロネクチン、及びラミニン、ならびにプロテオグリカンを含む3つの主要なクラスの生体分子から主に構成される。
インビトロでのECM組成物の成長ならびにさまざまな治療及び医療用途でのその使用が、当該技術分野において報告されている。かかるECM組成物の1つの治療的用途としては、軟組織及び皮膚の欠損、例えばしわ及び瘢痕の治療及び修復が挙げられる。
欠損、例えば、にきび、外科手術の瘢痕、または加齢によって引き起こされる軟組織の欠損の修復または増強は、非常に難しいことがわかっている。軟組織の欠損を治すために多くの材料が用いられているが成功の程度はざまざまであり、完全に安全で効果的な材料はない。例えば、シリコンは、長期の副作用、例えば、小結節、再発性蜂巣炎及び皮膚潰瘍を含むさまざまな生理的及び臨床的問題を生じさせる。
コラーゲン組成物も、軟組織増強のための注射可能な材料として用いられる。コラーゲンは、結合組織の主なタンパク質であり、哺乳動物中の最も豊富なタンパク質であり、総タンパク質含有量の約25%を構成する。現時点で文献に記載されているコラーゲンは28の型がある(例えば、詳細な一覧については、以下の表1及び2を参照)。しかし、身体中のコラーゲンの90%超は、コラーゲンI、II、III、及びIVである。
さまざまなコラーゲン材料、例えば、再構成される注射可能なウシコラーゲン、架橋コラーゲン、または他の異種コラーゲンが軟組織欠損の治療に用いられている。しかし、かかるコラーゲンにはいくつかの問題がある。一般的な問題としては、対象のアレルギー反応を避けるために潜在的に免疫原性な物質を除去するようにインプラント材料を生成する際の複雑度及び高コストが挙げられる。さらに、かかるコラーゲンを用いる治療が長持ちすることは証明されていない。
また、軟組織の修復または増強に用いてよい他の材料、例えば、水性ゲル中の生体適合性セラミック粒子(米国特許第5,204,382号(特許文献1))、熱可塑性及び/または熱硬化性材料(米国特許第5,278,202号(特許文献2))、ならびに乳酸系ポリマーブレンド(米国特許第4,235,312号(特許文献3))も報告されている。さらに、天然分泌型細胞外マトリックス組成物の使用も報告されている(米国特許第6,284,284号(特許文献4))。しかし、かかる材料にはすべて限界があることがわかっている。
したがって、従来の材料の欠陥を克服する軟組織の修復及び増強のための新たな材料が必要である。安全で、注射可能で、長持ちし、生体吸収可能な軟組織の修復及び増強材料を提供する必要がある。
さらに、損傷した組織、例えば、損傷した心筋及び関連組織を治療するのに、インビトロで培養されたECM組成物を用いることができる。当該組成物は、インプラントとして、または臓器、例えば、心臓及び関連組織中の脈管化を促進する埋め込み可能な装置、例えばステントもしくは人工血管上の生物学的コーティングとして有用である。
冠動脈性心疾患(CHD)は、冠動脈疾患(CAD)、虚血性心疾患、及びアテローム心疾患とも呼ばれ、心臓に血液及び酸素を供給する小血管の狭窄を特徴とする。冠動脈性心疾患は、通常、アテローム動脈硬化と呼ばれる状態によって引き起こされ、これは脂肪物質及びプラークが動脈の壁上に蓄積し、動脈を狭くする場合に生じる。冠動脈が狭くなると、心臓への血流が減速または停止する可能性があり、胸痛(安定狭心症)、息切れ、心臓発作、及び他の症状を引き起こす可能性がある。
冠動脈性心疾患(CHD)は、米国の男性及び女性の主な死因である。米国心臓協会によると、1500万人超が当該状態を何らかの形で抱えている。冠動脈性心疾患の症状及び徴候は、当該疾患の進行した状態では明白であるが、冠動脈性心疾患のほとんどの患者では、突然の心臓発作が起きる前に、疾患が進行しても何十年間も疾患が明白にならない。当該疾患は、突然死の最も一般的な原因であり、20歳を超える男性及び女性の最も一般的な死因でもある。米国の現在の傾向によると、健康な40歳の男性の半数ならびに健康な40歳の女性の3人に1人が将来CHDを発症すると考えられる。
疾患のある心臓またはその他の形で損傷を受けた心臓の血流を改善する現在の方法としては、侵襲的外科技術、例えば、冠動脈バイパス手術、血管形成術、及び動脈内膜切除術が挙げられる。かかる方法は、当然、手術中及び手術後の固有リスクの程度が高く、心虚血の一時的な治療を提供するにすぎないことが多い。したがって、CHD及び関連症状を治療するのに現在利用可能な技術の成功を増大させるために新たな治療選択肢が必要である。
さらに、損傷を受けた細胞または組織、例えば、軟骨細胞または骨軟骨細胞を修復及び/または再生するために、インビトロで培養されたECM組成物を用いることができる。骨軟骨組織は、骨または軟骨に関連するまたはこれらを含有する任意の組織である。本発明の組成物は、骨軟骨欠損、例えば変性結合組織疾患、例えばリウマトイド及び/または変形性関節症、ならびに外傷による軟骨欠損を有する患者の欠損の治療に有用である。
骨軟骨欠損を修復する現在の試みとしては、関節軟骨病変を再生する可能性を改善しようとした、生体適合性及び生分解性ハイドロゲルグラフト中のヒト軟骨細胞の埋め込みが挙げられる。さらに、ヒアリン様軟骨性組織を作製するための、アルギン酸ビーズまたはポリ硫酸化アルギン酸を含むマトリックス中での軟骨細胞培養の技術が報告されている。しかし、ヒト自己軟骨細胞の埋め込みによって関節軟骨の軟骨内病変を修復する試みでは、成功が限られてきた。したがって、骨軟骨欠損を治療するのに現在利用可能な技術の成功を増大させるために新たな治療選択肢が必要である。
インビトロで培養されたECM組成物は、工学的組織インプラントの作製のための組織培養システムでも有用である。組織工学の分野は、新たな生物学的組織を作製するためまたは損傷を受けた組織を修復するための細胞培養技術の使用を含む。幹細胞革命によって部分的に刺激され、組織工学技術が、外傷または変性疾患の治療後の組織再生及び置換の見込みをもたらす。それは、また、美容的処置の関連で用いることもできる。
さまざまな細胞型及び培養技術を用いて自己及び異種の両方の組織または細胞を作製するのに組織工学技術を用いることができる。自己インプラントを生成する場合、ドナー組織を採集し、個々の細胞に解離し、その後、基質上に付着させて培養し、機能性組織の所望の部位に埋め込んでよい。細胞培養技術を用いてインビトロで多くの単離された細胞型を増殖させることができるが、足場依存性細胞は、成長のためのテンプレートとして作用する、三次元足場の存在を含むことが多い特定の環境を必要とする。
現在の組織工学技術は、一般に、人工インプラントを提供する。成功している細胞移植治療法は、インビトロ及びインビボでの組織培養に好適な基質の開発に依存している。このため、天然材料だけを含有し、埋め込みに好適である細胞外マトリックスの開発は、内因性組織の特性をより多く有すると考えられる。したがって、天然細胞外マトリックス材料の作製は、組織工学の分野で進行中の課題である。
本発明は、細胞外マトリックス(ECM)組成物がインビボで癌細胞の成長を阻害することができるという発見に部分的に基づいている。したがって、本発明の1つの実施形態では、本明細書に記載される細胞外マトリックス組成物と癌細胞を接触させることによって癌細胞の成長または増殖を阻害する方法が提供される。
本発明の別の実施形態では、化学療法剤を含有する細胞外マトリックス組成物と細胞または組織を接触させることを含む、細胞または組織へ化学療法剤を送達する方法が提供される。
本発明のさらに別の実施形態では、ECM及び化学療法剤を含有する組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本組成物は、免疫調節剤をさらに含有する。
別の実施形態では、本発明は、上記に記載されるとおり、線維芽細胞馴化培地からの限外ろ過液細胞外マトリックス組成物を含む組成物を提供し、当該ろ過液は、分子量5000ダルトンを超える分子を除外しており、かつCD8+T細胞動員活性を含む。1つの態様では、本組成物は、PD−1阻害剤もしくは化学療法剤と、またはこの双方と組み合わせる。
低分子量ろ過液は、対象における癌または腫瘍を治療するために用いることができる。別の態様では、本発明は、対象における腫瘍負荷を減少させるまたは癌細胞の成長を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の低分子量ろ過液組成物を投与し、これにより腫瘍または癌細胞の部位にCD8+細胞を動員し、腫瘍のサイズを減少させるまたは癌細胞の成長を阻害することを含む、方法を提供する。1つの態様では、投与前に腫瘍を切除する。
本発明の組成物は、また、免疫系疾患を治療するのにも有用である。1つの実施形態では、本発明は、対象における免疫系障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載された治療有効量の低分子量ろ過液組成物を投与し、これによりCD8+細胞を動員し、障害を治療することを含む、方法を提供する。例えば、当該障害としては、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、全身性硬化症、皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、IgA腎症、膜性腎症、EBV感染症及び悪性貧血を挙げてよい。
[本発明1001]
線維芽細胞馴化培地からの限外ろ過液細胞外マトリックス組成物を含む組成物であって、前記ろ過液が、分子量5000ダルトンを超える分子を除外しており、かつCD8+T細胞動員活性を含む、前記組成物。
[本発明1002]
薬学的に許容できるキャリア中の、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
化学療法剤と組み合わせた、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
PD−1阻害剤と組み合わせた、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
前記細胞外マトリックス組成物が、好適な成長培地中の二次元または三次元表面上に細胞を培養することから得られる、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
前記細胞が、成体組織由来、胎児組織由来、新生児組織由来または胚組織由来である、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
前記細胞が、低酸素条件下で培養される、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
酸素の前記低酸素条件が、酸素1〜5%である、本発明1001の組成物。
[本発明1009]
可溶性画分である、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
対象における腫瘍負荷を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明1001の組成物を投与し、これにより前記腫瘍の部位にCD8+細胞を動員し、前記腫瘍のサイズを減少させることを含む、前記方法。
[本発明1011]
前記腫瘍が投与前に切除される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
投与が、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内の注射または注入である、本発明1010の方法。
[本発明1013]
対象における免疫系障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明1001の組成物を投与し、これによりCD8+細胞を動員し、前記障害を治療することを含む、前記方法。
[本発明1014]
前記障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、全身性硬化症、皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、IgA腎症、膜性腎症、EBV感染症及び悪性貧血である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明1001の組成物を投与し、これにより前記癌を治療することを含む、前記方法。
[本発明1016]
投与が、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内の注射または注入である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記癌が、急性リンパ芽球性;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;副腎皮質癌、小児;虫垂癌;基底細胞癌;胆管癌、肝外;膀胱癌;骨癌;骨肉腫及び悪性線維性組織球腫;脳幹神経膠腫、小児;脳腫瘍、成人;脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児;脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、小児;中枢神経系胚芽腫;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫;頭蓋咽頭腫;上衣芽腫;上衣腫;髄芽腫;髄様上皮腫;中間型松果体実質腫瘍;テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽腫;視覚路及び視床下部神経膠腫;脳及び脊髄腫瘍;乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;カルチノイド腫瘍;カルチノイド腫瘍、消化管;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;中枢神経系リンパ腫;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児;子宮頚癌;脊索腫、小児;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;眼癌、眼球内黒色腫;眼癌、網膜芽細胞腫;胆嚢癌;胃癌(Gastric(Stomach) Cancer);消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);胚細胞腫瘍、頭蓋外;胚細胞腫瘍、性腺外;胚細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;神経膠腫、小児脳幹;神経膠腫、小児大脳星状細胞腫;神経膠腫、小児視覚路及び視床下部;有毛細胞白血病;頭頚部癌;肝細胞(肝臓)癌;組織球症、ランゲルハンス細胞;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視覚路神経膠腫;眼球内黒色腫;島細胞腫瘍;腎臓(腎細胞)癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;白血病、急性リンパ芽球性;白血病、急性骨髄性;白血病、慢性リンパ球性;白血病、慢性骨髄性;白血病、有毛細胞;口唇及び口腔内癌;肝臓癌;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、AIDS関連;リンパ腫、バーキット;リンパ腫、皮膚T細胞;リンパ腫、ホジキン;リンパ腫、非ホジキン;リンパ腫、原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム;骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫;髄芽腫;黒色腫;黒色腫、眼球内(眼);メルケル細胞癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腺腫症候群、(小児);多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性;骨髄増殖性疾患、慢性;鼻腔及び副鼻腔癌;鼻咽腔癌;神経芽細胞腫;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔内癌;中咽頭癌;骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵癌;膵癌、島細胞腫瘍;乳頭腫;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞(腎臓)癌;腎盂及び尿管、移行細胞癌;第15染色体上のNUT遺伝子に関連する気道癌;網膜芽細胞腫;横絞筋肉腫;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;肉腫、カポジ;肉腫、軟組織;肉腫、子宮;セザリー症候群;皮膚癌(非黒色腫性);皮膚癌(黒色腫);皮膚癌、メルケル細胞;小細胞肺癌;小腸癌;軟組織肉腫;扁平上皮細胞癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;腎盂及び尿管の移行細胞癌;絨毛性腫瘍、妊娠性;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍からなる群から選択される、本発明1015の方法。
[本発明1001]
線維芽細胞馴化培地からの限外ろ過液細胞外マトリックス組成物を含む組成物であって、前記ろ過液が、分子量5000ダルトンを超える分子を除外しており、かつCD8+T細胞動員活性を含む、前記組成物。
[本発明1002]
薬学的に許容できるキャリア中の、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
化学療法剤と組み合わせた、本発明1001の組成物。
[本発明1004]
PD−1阻害剤と組み合わせた、本発明1001の組成物。
[本発明1005]
前記細胞外マトリックス組成物が、好適な成長培地中の二次元または三次元表面上に細胞を培養することから得られる、本発明1001の組成物。
[本発明1006]
前記細胞が、成体組織由来、胎児組織由来、新生児組織由来または胚組織由来である、本発明1001の組成物。
[本発明1007]
前記細胞が、低酸素条件下で培養される、本発明1001の組成物。
[本発明1008]
酸素の前記低酸素条件が、酸素1〜5%である、本発明1001の組成物。
[本発明1009]
可溶性画分である、本発明1001の組成物。
[本発明1010]
対象における腫瘍負荷を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明1001の組成物を投与し、これにより前記腫瘍の部位にCD8+細胞を動員し、前記腫瘍のサイズを減少させることを含む、前記方法。
[本発明1011]
前記腫瘍が投与前に切除される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
投与が、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内の注射または注入である、本発明1010の方法。
[本発明1013]
対象における免疫系障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明1001の組成物を投与し、これによりCD8+細胞を動員し、前記障害を治療することを含む、前記方法。
[本発明1014]
前記障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、全身性硬化症、皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、IgA腎症、膜性腎症、EBV感染症及び悪性貧血である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明1001の組成物を投与し、これにより前記癌を治療することを含む、前記方法。
[本発明1016]
投与が、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内の注射または注入である、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記癌が、急性リンパ芽球性;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;副腎皮質癌、小児;虫垂癌;基底細胞癌;胆管癌、肝外;膀胱癌;骨癌;骨肉腫及び悪性線維性組織球腫;脳幹神経膠腫、小児;脳腫瘍、成人;脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児;脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、小児;中枢神経系胚芽腫;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫;頭蓋咽頭腫;上衣芽腫;上衣腫;髄芽腫;髄様上皮腫;中間型松果体実質腫瘍;テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽腫;視覚路及び視床下部神経膠腫;脳及び脊髄腫瘍;乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;カルチノイド腫瘍;カルチノイド腫瘍、消化管;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;中枢神経系リンパ腫;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児;子宮頚癌;脊索腫、小児;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;眼癌、眼球内黒色腫;眼癌、網膜芽細胞腫;胆嚢癌;胃癌(Gastric(Stomach) Cancer);消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);胚細胞腫瘍、頭蓋外;胚細胞腫瘍、性腺外;胚細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;神経膠腫、小児脳幹;神経膠腫、小児大脳星状細胞腫;神経膠腫、小児視覚路及び視床下部;有毛細胞白血病;頭頚部癌;肝細胞(肝臓)癌;組織球症、ランゲルハンス細胞;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視覚路神経膠腫;眼球内黒色腫;島細胞腫瘍;腎臓(腎細胞)癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;白血病、急性リンパ芽球性;白血病、急性骨髄性;白血病、慢性リンパ球性;白血病、慢性骨髄性;白血病、有毛細胞;口唇及び口腔内癌;肝臓癌;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、AIDS関連;リンパ腫、バーキット;リンパ腫、皮膚T細胞;リンパ腫、ホジキン;リンパ腫、非ホジキン;リンパ腫、原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム;骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫;髄芽腫;黒色腫;黒色腫、眼球内(眼);メルケル細胞癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腺腫症候群、(小児);多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性;骨髄増殖性疾患、慢性;鼻腔及び副鼻腔癌;鼻咽腔癌;神経芽細胞腫;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔内癌;中咽頭癌;骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵癌;膵癌、島細胞腫瘍;乳頭腫;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞(腎臓)癌;腎盂及び尿管、移行細胞癌;第15染色体上のNUT遺伝子に関連する気道癌;網膜芽細胞腫;横絞筋肉腫;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;肉腫、カポジ;肉腫、軟組織;肉腫、子宮;セザリー症候群;皮膚癌(非黒色腫性);皮膚癌(黒色腫);皮膚癌、メルケル細胞;小細胞肺癌;小腸癌;軟組織肉腫;扁平上皮細胞癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;腎盂及び尿管の移行細胞癌;絨毛性腫瘍、妊娠性;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍からなる群から選択される、本発明1015の方法。
発明の詳細な説明
本発明は、細胞外マトリックス組成物を、癌細胞の成長もしくは増殖の阻害のために単独で、または化学療法剤の送達のために生物学的ビヒクルとして、用いる方法に関する。
本発明は、細胞外マトリックス組成物を、癌細胞の成長もしくは増殖の阻害のために単独で、または化学療法剤の送達のために生物学的ビヒクルとして、用いる方法に関する。
本組成物及び方法を記載する前に、本発明は、記載された特定の組成物、方法及び実験条件に限定されるものではなく、このため、組成物、方法及び条件を変えてよいと理解しなければならない。さらに、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためのものであって、限定を意図するものではないことも理解しなければならない。
本明細書及び添付の特許請求の範囲に使用される場合、文脈が明確に特に指示をしない限り、単数形「ある(a)」、「ある(an)」および「その(the)」は複数の指示物を含む。このため、例えば、「本方法」への言及は、本開示などを読めば当業者に明らかとなる本明細書に記載された種類の1つ以上の方法、及び/またはステップを含む。
本発明の1つの実施形態では、細胞外マトリックス組成物と癌細胞を接触させることを含む、癌細胞の成長または増殖を阻害する方法が提供される。いくつかの実施形態では、ECMは、可溶性画分であってよく、他の実施形態では、ECMは、非可溶性画分であってよい。さらに他の実施形態では、ECMは、可溶性及び非可溶性画分の組み合わせであってよい。
ある特定の実施形態では、癌細胞は腫瘍由来である。いくつかの態様では、癌は、黒色腫、神経膠腫、及び腺癌からなる群から選択される。他の態様では、癌は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、脊椎、乳房、子宮頸部、胆嚢、神経節、消化管、胃、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、または子宮の癌である。1つの態様では、癌は乳癌であり、別の態様では、癌は黒色腫である。
ある特定の実施形態では、癌は、AML、CML、ALL、CLL、リンパ腫、多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されない白血病を含む造血器癌である。
本発明の別の実施形態では、化学療法剤を含有する細胞外マトリックス組成物と癌細胞を接触させることを含む、癌細胞に化学療法剤を送達する方法が提供される。
1つの態様では、接触は、腫瘍が切除された領域のサージカルマージンにおけるものである。かかる実施形態では、腫瘍が、臨床医に公知の標準外科技術を用いて対象から除去される。腫瘍の切除(摘出)時に残される空間の中に本発明のECM組成物を置いてよく、その結果、ECMがサージカルマージンと接触している。ある特定の実施形態では、ECMが、腫瘍マージンに存在している癌細胞の成長を阻害する可能性がある。いくつかの実施形態では、ECM組成物は、さらに、化学療法剤を免疫調節剤とともにまたは免疫調節剤なしで含有してよい。外科的摘出後の癌の治療に本発明のECM組成物を使用するのは、腫瘍部位への化学療法剤及び/または免疫調節剤の局所放出性及び徐放性の送達を行うという利点がある。さらなる利点としては、手術創の治癒の改善及び美容的結果の改善を挙げることができる。
本発明のさらに別の実施形態では、ECM及び化学療法剤を含有する組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本組成物は、さらに免疫調節剤を含有する。
いくつかの実施形態では細胞外マトリックス組成物は、細胞を、好適な成長培地中の二次元または三次元表面上にて低酸素条件下で培養することによって作製される。この培養方法は可溶性画分及び非可溶性画分の双方を生成し、これらは、さまざまな用途がある生理学に許容できる組成物を得るために別々にまたは組み合わせて用いてよい。他の実施形態では、標準または通常の酸素条件下で細胞を培養してよい。
本発明の組成物は、これらに限定されないが、癌細胞の成長または増殖を阻害すること、治療薬剤の送達、損傷を受けた細胞または組織の修復及び/または再生を促進すること、組織再生を促進するためのパッチでの使用、幹細胞などの細胞を培養するための組織培養システムでの使用、埋め込み可能な装置(例えば、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、ドラッグ送達ポートまたはカテーテル)に関連して用いられる表面コーティングでの使用、軟組織修復を促進すること、しわなどの皮膚表面の増強及び/または改善、生物学的癒着防止剤としてのまたは送達部位での細胞の送達もしくは維持のための生物学的ビヒクルとしての使用を含む、さまざまな用途を有する。
本発明は、血管形成前の初期胚性環境を刺激する条件(低酸素及び重力の減少)下で二次元または三次元表面上で培養された細胞が、胚性タンパク質の産生を含め、胎児性特性を有する細胞外マトリックス組成物を生成するという発見に部分的に基づいている。低酸素条件下での細胞の成長では、胎児性特性及び成長因子発現を有する特有のECMを示す。従来の培養条件下でのECMの培養と異なり、低酸素条件下で培養されたECMでは5000種を超える遺伝子が差次的に発現される。これは、異なる特性及び異なる生物学的組成を有する培養ECMをもたらす。例えば、低酸素条件下で生成されたECMは、III型、IV型、及びV型コラーゲン、ならびに糖タンパク質、例えばフィブロネクチン、SPARC、トロンボスポンジン、ならびにヒアルロン酸が比較的豊富であるという点で胎児間葉組織と類似している。
低酸素は、また、創傷治癒及び器官形成を制御する因子、例えばVEGF、FGF−7、及びTGF−β、ならびにwnt 2b、4、7a、10a、及び11を含む複数のWnt因子の発現を高める。培養胚性ヒトECMは、また、酵素活性の増大によって測定されるとおり、インビトロでヒト線維芽細胞中の代謝活性の増大を刺激する。さらに、培養胚性ECMに反応した細胞数の増大がある。
さまざまな実施形態では、本発明は、1つ以上の胚性タンパク質を含む細胞外マトリックス組成物を作製する方法及びその用途を含む。特に、本組成物は、好適な成長培地中の二次元または三次元表面上にて低酸素条件下で細胞を培養することによって作製される。本組成物は、多層細胞培養システムとなるフレームワーク上に細胞を成長させることによって得られる。本発明に従って、フレームワーク支持体上で成長させた細胞は、複数の層中に成長し、細胞マトリックスを形成する。低酸素条件下での培養細胞の成長は、従来の培養に比べて低酸素の培養条件の結果として、差次的な遺伝子発現をもたらす。
細胞外マトリックス(ECM)は、細胞の培養によって生成される、組織を実質的に含むタンパク質及び生体高分子の組成物である。間質細胞、例えば、線維芽細胞は、細胞培養に好適な材料及び表面に付着させたままでの成長を必要とする足場依存性細胞型である。培養細胞によって生成されるECM材料は、組織様構造の形成のための空間をもたらす三次元配置中に沈着される。
三次元構造をもたらす培養材料は、足場と称される。ECMの沈着のための空間は、例えば織りメッシュ内の開口部の形態、または、マイクロキャリアと呼ばれる球状ビーズのぎっしり詰まった構造中に作られた隙間空間の形態である。
本明細書に用いられる場合、「細胞外マトリックス組成物」は、可溶性画分及び非可溶性画分の双方、またはその任意の割合もしくは組み合わせを含む。非可溶性画分は、支持体または足場上に沈着される分泌細胞外マトリックスタンパク質及び生物学的成分を含む。可溶性画分は、細胞が培養され、細胞が活性作用物質を分泌した培養培地を指し、足場上に沈着されていないタンパク質及び生物学的成分を含む。両画分とも、本明細書に記載されるとおり、収集し、任意でさらに処理し、個々にまたは組み合わせてさまざまな用途に用いてよい。ECMは、また、死体組織から得てよい(米国特許第6,284,284号及び同第6,372,494号)。
可溶性画分は、最適濃度に達するように濃縮または希釈してよい。ある特定の実施形態では、当該濃度は、約lmg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、約l0mg/mL、約50mg/mL、約l00mg/mL、または約200mg/mLとしてよい。当該濃度は、例えば、約0.lmg/mL〜l000mg/mL、または約1〜200mg/mL、または約l0mg/mL〜l00mg/mLの範囲としてよい。
可溶性画分は、画分中の溶質分子の大部分が特定の分子量カットオフを満たすように、分子量にしたがって(例えば、透析、ろ過、またはクロマトグラフィーによって)さらに分画されてよい。カットオフ値は絶対的でないが、所与の画分中に含有される溶質分子の大部分(例えば、70%、80%、90%、または95%)が分子量カットオフを満たすことが理解される。したがって、本明細書に提供される方法のある特定の実施形態では、ECM組成物は、その中に含有される溶質分子の70%、または80%、または90%が、5,000ダルトン未満、または10,000ダルトン未満、または30,000ダルトン未満、または100,000ダルトン未満の分子量を有する可溶性画分を含んでよい。他の実施形態では、ECMは、その中に含有される溶質分子が、5,000ダルトン超、または10,000ダルトン超、または30,000ダルトン超、または100,000ダルトン超の分子量を有する可溶性画分を含んでよい。他の実施形態では、ECMは、その中に含有される溶質分子が、10,000〜100,000ダルトン、または30,000〜100,000ダルトン、または10,000〜30,000ダルトンの分子量を有する可溶性画分を含んでよい。
間質細胞を培養するのに用いられる二次元または三次元の支持体または足場は、(a)細胞をそれに付着させることが可能である(または細胞をそれに付着させるように修飾することができる);かつ(b)細胞を複数の層中に成長させる(すなわち、三次元組織を形成する)ことが可能である、任意の材料及び/または形状のものとしてよい。他の実施形態では、実質的に二次元のシートまたは膜を用いて、形態が十分に三次元である細胞を培養してよい。
生体適合性材料は、構造が細胞の付着及び三次元組織への成長のための隙間空間を有する、二次元または三次元の構造または足場に形成される。フレームワークの開口部及び/または隙間空間は、いくつかの実施形態では、細胞が開口部または空間を横切って広がることを可能にするのに好適なサイズのものである。フレームワークを横切って広がった活発に成長する細胞を維持することで、本明細書に記載された活性を担う成長因子のレパートリーの生成を高められると考えられる。開口部が小さすぎる場合、細胞は、急速にコンフルエンスに至るがメッシュから容易に出ることができない可能性がある。これらの捕捉された細胞は、接触阻止を示し、増殖の支持及び長期培養の維持に必要な好適な因子の生成を止める可能性がある。開口が大きすぎる場合、細胞は開口部を横切って広がることができない可能性があり、増殖の支持及び長期培養の維持に必要な好適な因子の間質細胞による生成を減少させる可能性がある。典型的には、隙間空間は、少なくとも約100um、少なくとも140um、少なくとも約150um、少なくとも約180um、少なくとも約200um、または少なくとも約220umである。メッシュ型のマトリックスを用いる場合、本明細書に例示したとおり、約100μm〜約220μmの範囲の開口部が十分に機能することがわかった。しかし、フレームワークの三次元構造及び複雑さに応じて、他のサイズも許容できる。細胞が広がって長期間にわたり複製かつ成長し続けることを可能にする任意の形状または構造でも、本明細書の方法に従って細胞因子を生産するように機能する可能性がある。
いくつかの態様では、三次元フレームワークは、メッシュまたはファブリックなどのフレームワークを形成するように編まれ、織られ、ニット編みされ、または別の方法で配置されたポリマーまたは糸から形成される。当該材料は、また、材料の鋳込によって、またはフォーム、マトリックス、もしくはスポンジ様の足場への加工によって形成してもよい。他の態様では、三次元フレームワークは、隙間空間を有する材料を作製するようにポリマーまたは他の繊維とともに圧縮することによって生成された、マット状繊維の形態である。三次元フレームワークは、培養細胞の成長のため任意の形態または外形をとってよい。このため、フレームワークの他の形態でも、以下にさらに記載されるとおり、好適な馴化培地を作製するのに十分である可能性がある。
足場またはフレームワークを形成するのに多くのさまざまな材料を用いてよい。これらの材料としては、非ポリマー材料及びポリマー材料が挙げられる。ポリマーは、用いられる場合、任意の型のポリマー、例えば、ホモポリマー、ランダムポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、コブロックポリマー(例えば、ジ、トリ等)、直鎖または分枝ポリマー、及び架橋または非架橋ポリマーであってよい。足場またはフレームワークとして使用するための材料の非限定例としては、特に、グラスファイバー、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド(例えば、ナイロン)、ポリエステル(例えば、ダクロン)、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物(例えば、ポリ塩化ビニル;PVC)、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE;TEFLON)、サーマノクス(TPX)、ニトロセルロース、多糖類(例えば、セルロース、キトサン、アガロース)、ポリペプチド(例えば、シルク、ゼラチン、コラーゲン)、ポリグリコール酸(PGA)、及びデキストランが挙げられる。
いくつかの態様では、使用の条件下で経時的に分解される材料からフレームワークを作製してよい。生分解性とは、インビボで投与される場合のまたはインビトロ条件下での化合物または組成物の吸収性または分解も指す。生分解は、生物学的物質の作用によって直接的または間接的に生じる可能性がある。生分解性材料の非限定例としては、特に、ポリラクチド、ポリグリコライド、ポリ(トリメチレンカーボネート)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(すなわち、PLGA)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリカプロラクトン、腸腺縫合糸材料、コラーゲン(例えば、ウマコラーゲンフォーム)、ポリ乳酸、またはヒアルロン酸が挙げられる。例えば、コラーゲンスポンジまたはコラーゲンゲルなどの三次元フレームワークにこれらの材料を織り込んでよい。
他の態様では、培養物を長期間維持する場合、培養物を凍結保存する場合、及び/または追加の構造的完全性が所望の場合、三次元フレームワークは、非生分解性材料から構成してよい。本明細書に用いられる場合、非生分解性材料とは、培養培地中の条件下で有意に分解または変質しない材料を指す。例示的な非分解性材料としては、非限定的な例として、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、多孔質PTFE(ePTFE)、及びセルロースが挙げられる。例示的な非分解性の三次元フレームワークは、商標名Nitex(登録商標)で市販されているナイロンメッシュを含み、これは平均孔サイズが140μmであり、平均ナイロン繊維直径が90μmであるナイロンろ過メッシュ(#3−210/36、Tetko、Inc.、N.Y.)である。
他の態様では、足場またはフレームワークは、生分解性材料及び非生分解性材料の組み合わせである。非生分解性材料は、培養中に足場への安定性を提供し、一方、生分解性材料は、治療的用途に十分な細胞因子を生成する細胞ネットワークを作製するのに十分な隙間空間を形成するのを可能にする。生分解性材料は、非生分解性材料上にコーティングされてもよく、またはメッシュに織り込まれる、編まれるもしくは形成されてもよい。生分解性材料及び非生分解性材料のさまざまな組み合わせを用いてよい。例示的な組み合わせは、極性構造を得るために薄い生分解性ポリマーフィルムのポリ[D−L−乳酸−コ−グリコール酸)でコーティングされたポリ(エチレンテレフタレート)(PET)ファブリックである。
さまざまな態様では、細胞の付着を向上させるために、細胞接種前に、足場またはフレームワーク材料を前処理してよい。例えば、細胞接種前に、いくつかの実施形態では、ナイロンスクリーンを0.1M酢酸で処理し、ポリリジン、ウシ胎仔血清、及び/またはコラーゲン中でインキュべートし、ナイロンをコーティングする。同様に、硫酸を用いてポリスチレンを処理することができる。他の実施形態では、細胞の付着を改善するために、タンパク質(例えば、コラーゲン、エラスチン線維、細網線維)、糖タンパク質、グルコサミノグリカン(例えば、硫酸ヘパリン、コンドロイチン−4−硫酸、コンドロイチン−6−硫酸、硫酸デルマタン、硫酸ケラタン等)、フィブロネクチン、及び/もしくはグリコポリマー(ポリ[N−p−ビニルベンジル−D−ラクトアミド]、PVLA)をフレームワークに添加することによって、またはこれらでフレームワークをコーティングすることによって、三次元支持体のフレームワークの存在下での細胞の成長をさらに向上させてよい。材料が細胞の付着に劣った基質である場合、足場またはフレームワークの処理が有用である。
1つの態様では、メッシュが、ECMの生成に用いられる。当該メッシュは、およそ100μmの開口部及びおよそ125μmの厚さを有する平織り形態の織られたナイロン6材料である。培養では、線維芽細胞が、荷電タンパク質相互作用によってナイロンに付着し、メッシュの空隙中に成長し、同時に、ECMタンパク質を生成して沈着させる。過剰に大きいまたは小さいメッシュ開口部は、効果的でない可能性があるが、ECMを生成するまたは沈着させる能力を実質的に変えずに、上記のものとは異なってもよい。別の態様では、例えば、細胞成長及びECM沈着に好適な外形を与える織り構造のポリオレフィンのような、他の織られた材料が、ECM生成に用いられる。
例えば、ナイロンメッシュが、所望のサイズへの切断、0.1〜0.5M酢酸での洗浄、続いて高純度水でのすすぎによって、本発明のステップのいずれかで培養のために作られ、その後蒸気滅菌される。ECM生成のための三次元足場として使用するには、メッシュをおよそ10cmx10cmの正方形の大きさに作る。しかし、メッシュは、所定の用途に好適な任意のサイズとすることができ、接種、細胞成長及びECM生成及び最終形態の調製のための培養方法を含む本発明の方法のいずれかで用いてよい。
他の態様では、培養三次元組織を作製するための足場またはフレームワークは、ビーズまたは粒子であるマイクロキャリアから構成される。ビーズは、微視的または巨視的であってよく、さらに、組織中に透過できるような大きさにしても、または特定の外形を形成するように圧縮してもよい。いくつかの組織透過による実施形態では、細胞培養のためのフレームワークは、細胞と組み合わせて、三次元組織を形成する粒子を含む。当該細胞は、粒子に付着し、互いに付着して、三次元組織を形成する。粒子及び細胞の複合体は、例えば注射またはカテーテルによって、組織または臓器中に投与するのに十分なサイズである。
本明細書に用いられる場合、「マイクロキャリア」は、サイズがナノメートル〜マイクロメーターの粒子を指し、当該粒子は、不規則の、非球状の、球状の、または楕円体の、任意の形状または外形としてよい。典型的にはビーズまたはマイクロキャリア上での成長を、二次元システムまたは足場またはフレームワークと称する。
本明細書の目的に好適なマイクロキャリアのサイズは、特定の用途に好適な任意のサイズとすることができる。いくつかの実施形態では、三次元組織に好適なマイクロキャリアのサイズは、注射によって投与可能なサイズとしてよい。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアの粒子サイズの範囲は、少なくとも約1μm、少なくとも約10μm、少なくとも約25μm、少なくとも約50μm、少なくとも約100μm、少なくとも約200μm、少なくとも約300μm、少なくとも約400μm、少なくとも約500μm、少なくとも約600μm、少なくとも約700μm、少なくとも約800μm、少なくとも約900μm、少なくとも約1000μmである。
いくつかの態様では、マイクロキャリアは生分解性材料から作製される。いくつかの態様では、異なる生分解性ポリマーの2つ以上の層を含むマイクロキャリアを用いてよい。いくつかの実施形態では、少なくとも外側の第1の層が、培養中に三次元組織を形成するための生分解性特性を有し、一方、少なくとも生分解性の内側の第2の層が、第1の層と異なる特性を有し、組織または臓器中に投与された時に侵食されるように作製される。
いくつかの態様では、マイクロキャリアは多孔性マイクロキャリアである。多孔性マイクロキャリアとは、分子が通り抜けて微粒子中にまたは微粒子外に拡散することができる隙間を有するマイクロキャリアを指す。他の実施形態では、マイクロキャリアは非多孔性マイクロキャリアである。非多孔性微粒子とは、選択サイズの分子が微粒子中にまたは微粒子外に拡散しない微粒子を指す。
組成物に使用されるマイクロキャリアは、生体適合性であり、細胞への毒性が低いかまたは毒性がない。処理される組織、処理される損傷の型、所望の治療の長さ、インビボでの細胞培養物の寿命、及び三次元組織を形成するのに必要な時間に応じて、好適なマイクロキャリアを選択してよい。マイクロキャリアは、天然または合成の、荷電性(すなわち、陰イオン性または陽イオン性)または非荷電性の、生分解性の、または非生分解性の、さまざまなポリマーを含んでよい。ポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー、及び分枝ポリマーとしてよい。
いくつかの態様では、マイクロキャリアは、非生分解性マイクロキャリアを含む。非生分解性マイクロカプセル及びマイクロキャリアとしては、これらに限定されないが、ポリスルホン、ポリ(アクリロニトリル−コ−塩化ビニル)、エチレン酢酸ビニル、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチル−メタクリレートコポリマーから生成されるものが挙げられる。これらは、組織充填特性を提供するために、またはマイクロキャリアが身体によって除去される実施形態において有用である。
いくつかの態様では、マイクロキャリアは分解性足場を含む。これらは、天然ポリマーから生成されるマイクロキャリアを含み、その非限定例としては、特に、フィブリン、カゼイン、血清アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、レシチン、キトサン、アルギン酸またはポリアミノ酸、例えばポリリジンが挙げられる。他の態様では、分解性マイクロキャリアは合成ポリマーから生成され、その非限定例としては、特に、ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド)(PLGA)、ポリ(カプロラクトン)、ポリジオキサノントリメチレンカーボネート、ポリヒドロキシアルコネート(例えば、ポリ(ヒドロキシブチレート)、ポリ(エチルグルタメート)、ポリ(DTHイミノカルボニル(ビスフェノールAイミノカーボネート)、ポリ(オルトエステル)、及びポリシアノアクリレートが挙げられる。
いくつかの態様では、マイクロキャリアは、典型的には、水を充填した親水性ポリマーネットワークであるハイドロゲルを含む。ハイドロゲルには、ポリマー腫脹の選択的トリガーという利点がある。ポリマーネットワークの組成に応じて、微粒子の膨張を、pH、イオン強度、温熱、電気、超音波、及び酵素活性を含むさまざまな刺激によって誘発してよい。ハイドロゲル組成物に有用なポリマーの非限定例としては、特に、ポリ(ラクチド−コ−グリコリド);ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド);ポリ(メタクリル酸−g−ポリエチレングリコール);ポリアクリル酸及びポリ(オキシプロピレン−コ−オキシエチレン)グリコール;ならびにコンドロイチン硫酸、キトサン、ゼラチン、フィブリノーゲンのなどの天然化合物のポリマー、または合成及び天然ポリマーの混合物、例えば、キトサン−ポリ(酸化エチレン)から形成されるものが挙げられる。これらのポリマーを可逆的にまたは非可逆的に架橋して、三次元組織を形成するために適合できるゲルを形成してよい。
本発明に従って、本培養方法は、線維芽細胞、及び特に、初代ヒト新生児包皮線維芽細胞のような間質細胞を含む、異なる種類の細胞の増殖に適用できる。さまざまな態様では、フレームワーク上に接種される細胞は、以下にさらに記載されるとおり、他の細胞を含むかまたは他の細胞を含まない、線維芽細胞を含む間質細胞とすることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、(1)骨;(2)コラーゲン及びエラスチンを含む疎性結合組織;(3)靭帯及び腱を形成する線維性結合組織、(4)軟骨;(5)血液の細胞外マトリックス;(6)脂肪細胞を含む脂肪組織;ならびに(7)線維芽細胞を含むがこれらに限定されない、典型的には結合組織に由来する間質細胞である。
間質細胞は、さまざまな組織または臓器、例えば、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、脳、包皮に由来することができ、これらは組織生検(好適な場合)によってまたは剖検時に得ることができる。1つの態様では、包皮、例えば新生児包皮から多量に胎児線維芽細胞を得ることができる。
いくつかの態様では、細胞は線維芽細胞を含み、これは胎児由来、新生児由来、成体由来、またはこれらの組み合わせであることができる。いくつかの態様では、間質細胞は、さまざまな異なる細胞及び/または組織の成長を支持することができる、胎児線維芽細胞を含む。本明細書に用いられる場合、胎児線維芽細胞とは、胎児供給源に由来する線維芽細胞を指す。本明細書に用いられる場合、新生児線維芽細胞とは、新生児供給源に由来する線維芽細胞を指す。好適な条件下で、線維芽細胞は、他の細胞、例えば、骨細胞、脂肪細胞、及び平滑筋細胞ならびに中胚葉由来の他の細胞をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、皮膚に由来する線維芽細胞である皮膚線維芽細胞を含む。正常ヒト皮膚線維芽細胞は、新生児包皮から単離することができる。これらの細胞は、典型的には初代培養の終わりに凍結保存される。
他の態様では、幹細胞または前駆細胞を単独で用いて、または本明細書に記載された細胞型のいずれかとの組み合わせで用いて、三次元組織を作製することができる。幹細胞及び前駆細胞は、例えば、これらに限定されないが、胚性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮幹細胞、及び間葉幹細胞を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法に従って、特定の臓器、すなわち、皮膚、心臓に由来する細胞、ならびに/または培養で成長させた細胞及び/または組織を後に受ける特定の個体からの細胞を、足場に接種することによって、「特異的な」三次元組織を調製することができる。
インビボでのある特定の使用では、患者自身の組織から間質細胞を得ることが好ましい。さらに、間質支持体のフレームワークの存在下での細胞の成長は、タンパク質、例えば、コラーゲン、ラミニン、弾性線維、細網線維、糖タンパク質;グルコサミノグリカン、例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−4−硫酸、コンドロイチン−6−硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等;細胞マトリックス、及び/または他の物質をフレームワークに添加することによって、またはこれらでフレームワーク支持体をコーティングすることによって、向上させることができる。
このため、本明細書に記載された二次元または三次元培養システムは、種々の細胞型及び組織の成長に好適であるため、培養される組織及び所望のコラーゲン型に応じて、好適な間質細胞を選択して、フレームワークに接種してよい。
本発明の方法及び用途は、本明細書に記載されるとおり、さまざまな細胞型、例えば、組織特異的な細胞またはさまざまな種類の間質細胞で用いるのに好適であるが、本発明で使用するための細胞の由来は、種特異的であってもよい。したがって、種特異的であるECM組成物を作製することができる。例えば、本発明で使用するための細胞は、ヒト細胞を含んでよい。例えば、細胞は、ヒト線維芽細胞としてよい。同様に、細胞は、別の種の動物、例えば、ウマ科(ウマ)、イヌ科(イヌ)またはネコ科(ネコ)細胞由来のものである。さらに、1つの種または種の株からの細胞を用いて、他の種または関連株(例えば、同種、同系及び異種)で使用するためのECM組成物を作製することができる。また、多種ECM組成物を作製するためにさまざまな種に由来する細胞を組み合わせてよいことも理解されるべきである。
したがって、本発明の方法及び組成物は、非ヒト動物を含む用途に好適である。本明細書に用いられる場合、「獣医学」とは、動物、特に家畜の医学的処置または外科的治療と関係するまたは関連する医療科学を指す。通常の獣医学の動物は、哺乳動物、両生類、鳥類、爬虫類及び魚類を含んでよい。例えば、典型的な哺乳動物は、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、霊長動物、げっ歯類、ならびに家畜、例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、及びブタを含んでよい。
上記に記載されるとおり、追加の細胞が、間質細胞とともに培養物中に存在してよい。これらの追加の細胞には、特に、培養で長期成長を支持すること、成長因子の合成を向上させること、及び足場への細胞の付着を促進することを含む、多くの有益な効果がある可能性がある。追加の細胞型は、非限定的な例として、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、及び脂肪細胞を含む。そのような細胞を、線維芽細胞とともに、またはいくつかの態様では線維芽細胞の非存在下で、フレームワーク上に接種してよい。これらの間質細胞は、例えば、これらに限定されないが、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、及び脳を含む、好適な組織または臓器に由来してよい。他の態様では、線維芽細胞を除く、1種以上の他の細胞型が、足場上に接種される。さらに他の態様では、線維芽細胞だけが足場に接種される。
線維芽細胞の供給源として役割を果たす好適な臓器または組織をばらばらにすることによって、線維芽細胞を容易に単離することができる。例えば、組織または臓器は、機械的にばらばらにすることができ、ならびに/または、隣接する細胞間の結合を弱め、相当の細胞破砕なしで個々の細胞の懸濁液へと組織を分散させることができる消化酵素及び/もしくはキレート剤で処理することができる。組織を切り刻み、切り刻んだ組織を、多くの消化酵素のいずれかを単独でまたは組み合わせで用いて処理することによって、酵素的解離を実施することができる。これらには、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、プロナーゼ、及び/またはディスパーゼ等が含まれるが、これらに限定されない。また、これらに限定されないがグラインダー、ブレンダー、ふるい、ホモジナイザー、圧力セル、または超音波破砕機等の使用を含む、多くの方法によって機械的破壊を実施することができる。1つの態様では、切除された包皮組織を、消化酵素、典型的にはコラゲナーゼ及び/またはトリプシナーゼを用いて処理し、封入構造から細胞を解離する。
例えば、以下のとおり、線維芽細胞の単離を実施することができる:血清を除去するために新鮮な組織試料をハンクス平衡塩溶液(HBSS)中で十分に洗浄し、切り刻む。切り刻まれた組織を、解離酵素、例えばトリプシンの新しく調製された溶液中で、1〜12時間インキュべートする。かかるインキュベーション後に、解離した細胞を懸濁し、遠心分離によってペレット化し、培養皿上にプレートする。他の細胞より前に全ての線維芽細胞が付着するので、好適な間質細胞を選択的に単離し、成長させることができる。その後、単離された線維芽細胞を培養密度まで成長させ、集密約培養物から引き上げ、三次元フレームワーク上に接種することができる。Naughton et al.、1987、J.Med.18(3&4):219−250を参照。高濃度の間質細胞、例えば、およそ106〜5x107細胞/mlを三次元フレームワークに接種することによって、より短い時間で三次元間質支持体が確立される。
組織を個々の細胞の懸濁液にしたら、この懸濁液を亜集団に分画することができ、これより線維芽細胞ならびに/または他の間質細胞及び/または要素を得ることができる。これはまた、これらに限定されないが、特定の細胞型のクローニング及び選択、望まない細胞の選択的破壊(負の選択)、混合集団中の細胞凝集性の差に基づく分離、凍結融解法、混合集団中の細胞の接着特性の差、ろ過、従来の遠心分離及びゾーン遠心分離、遠心溶出法(カウンターストリーミング遠心分離)、単位重力分離、向流分配、電気泳動ならびに蛍光活性化細胞選別を含む細胞分離の標準技術を用いて実施してよい。クローン選択及び細胞分離技術の総説については、Freshney、Culture of Animal Cells、A Manual of Basic Techniques、2d Ed.、A.R.Liss、Inc.、NewYork、1987、Ch.11及び12、pp.137−168を参照。
1つの態様では、単離された線維芽細胞を成長させて、細胞バンクを生成することができる。細胞バンクを生成して、さまざまな量での開始及び培養バッチの適時選択を可能にし、ならびに混入物及び特異的細胞特性についての細胞の先行試験を可能にする。細胞バンクからの線維芽細胞はその後成長させて、足場に播種するのに好適なレベルまで細胞数を増大させる。細胞及び細胞接触材料の環境暴露を含む作業を無菌的に実施して、異物または好ましくない微生物の混入の可能性を減少させる。
本発明の別の態様では、単離後に、細胞を数回の継代培養によってマスター細胞バンクを作るのに好適な量まで成長させることができる。その後、細胞バンクを採集し、好適な容器に充填し、低温条件で保存することができる。マスター細胞バンクからの凍結バイアル中の細胞を解凍し、追加の継代培養(通常、2回以上)によって成長させることができる。その後、本細胞を用いて、低温で保存された作業用細胞バンクを調製することができる。
細胞増殖ステップは、作業用細胞バンクのステージにある細胞のバイアルを使用し、三次元の足場または支持体、例えばメッシュまたはマイクロキャリアに接種するために、細胞数をさらに増大させる。各継代培養は、細胞を成長表面に接種すること、インキュベーション、細胞に栄養供給すること及び採集することを含む、一連の植え継ぎ培養ステップである。
細胞バンクのための培養及び細胞増殖は、培養容器、例えば、培養フラスコ、回転びんまたはマイクロキャリアに接種することによって実施することができる。間質細胞、例えば線維芽細胞は、所定の成長表面に付着し、培養培地の存在下で成長する。培養容器、例えば、培養フラスコ、回転びん及びマイクロキャリアは、特に、細胞培養のために構成され、通常、所定の用途に適したさまざまなプラスチック材料から作られる。マイクロキャリアは、典型的には微視的または巨視的ビーズであり、典型的にはさまざまなプラスチック材料から作られる。しかし、これらは、上記に記載されるとおり、他の材料、例えば、ガラスまたは固体/半固体の生物学に基づいた材料、例えば、コラーゲン、もしくは他の材料、例えば、デキストラン、修飾糖複合体から作ることができる。
培養中、消費された培地を細胞成長の経過中に新鮮培地と定期的に取り替えて、栄養分の十分な有効性を維持し、培養の阻害性生成物の除去を維持する。培養フラスコ及び回転びんは、細胞が成長する表面を提供し、典型的には足場依存性細胞の培養のために用いられる。
1つの態様では、37℃で加熱したチェンバー中でインキュベーションを実施する。培地とチェンバー環境とのやりとりを必要とする培養トポロジーでは、チェンバーガス空間に空気とともに5% v/vのCO2を使用して、pHの制御を補助する。代わりに、培養温度及びpHを維持するために備えられた容器を、細胞増殖及びECM生成作業の双方に用いることができる。35℃未満または38℃超の温度及び3%未満または12%超のCO2濃度は、好適でない可能性がある。
付着表面からの細胞の採集は、成長培地を除去し、緩衝塩溶液で細胞をすすいで酵素競合性タンパク質を減らし、解離用酵素を適用し、次いで細胞脱離後に該酵素を中和することによって、実施することができる。採集された細胞懸濁液を収集し、遠心分離によって採集液を分離する。植え継ぎ培養採集物からの細胞懸濁液をサンプリングして、回収した細胞の量及び他の細胞特質を評価することができ、その後、新鮮な培地と混合し、接種材料として適用する。細胞バンク及び足場接種材料を調製するのに用いられる継代数は、許容できるECM特性の実現に関して重要である。
好適な二次元または三次元の足場を調製した後、それに、調製された間質細胞を播種することによって接種を行う。足場への接種は、沈降などのさまざまな方法で行ってよい。好気条件下でのECMの培養のために調製されるメッシュは、低酸素条件を作るための嫌気チェンバーを用いないことを除いて、低酸素成長メッシュと同じ方法で調製する。
例えば、好気条件下及び低酸素条件下でのECMの培養のために調製される両メッシュの場合、調製され滅菌されたメッシュを、無菌の直径150mmx深さ15mmのペトリディッシュ中に入れ、およそ10枚の厚さにスタックする。その後、沈降によってメッシュのスタックに接種を行う。細胞を新鮮培地に添加し、接種に好適な細胞濃度を得る。メッシュのスタックに接種材料を添加すると、インキュべート条件の間中、細胞がナイロン繊維上に定着し付着する。好適な時間の後に、個々に播種されたメッシュシートを前記スタックから無菌的に分離し、およそ50mlの成長培地を含有する別個の150mmx15mmペトリディッシュに個々に入れることができる。
接種培養物のインキュベーションを、通常の培養条件下で作製されるECMと比較して特有の特性を有するECM及び周囲培地を生成することが発見されている低酸素条件の下で実施する。本明細書に用いられる場合、低酸素条件は、周囲空気の酸素濃度(酸素およそ15%〜20%)と比較して、より低い酸素濃度を特徴とする。1つの態様では、低酸素条件は、酸素濃度約10%未満を特徴とする。別の態様では、低酸素条件は、約1%〜10%、1%〜9%、1%〜8%、1%〜7%、1%〜6%、1%〜5%、1%〜4%、1%〜3%、または1%〜2%の酸素濃度を特徴とする。ある特定の態様では、システムは、培養容器内で酸素約1〜3%を維持する。周囲ガス濃度を制御することができる培養装置、例えば、嫌気チェンバーを用いることによって、低酸素条件を作り維持することができる。
細胞培養物のインキュベーションは典型的には、増殖及び播種のために15〜20%の酸素及び5%のCO2を有する通常の大気中で実施されるが、低酸素培養物はその時点で、培養培地内に低酸素環境が作られるように95%窒素/5%CO2で満たされた密閉チェンバーに分割される。
例えば、低酸素条件下でECMを生成するために培養されるメッシュを含むペトリディッシュを、最初は、2〜3週間、37℃及び95%空気/5%CO2でのインキュベーションで成長させる。ほぼ大気での培養の期間ののちに、メッシュのペトリディッシュを、およそ95%の窒素及び5%のCO2のガス混合物でパージされている嫌気培養用に設計されたチェンバー中で、インキュべートする。培養期間の間中、消費された成長培地を大気酸素レベルにある新鮮培地と取り替え、培地を交換した後に、メッシュを入れたペトリディッシュを嫌気チェンバー中に入れ、このチェンバーを95%窒素/5%CO2でパージし、その後、37℃でインキュべートする。培養されたメッシュは、所望のサイズに達したときに、または所望の生物学的成分を含有したときに、採集する。
インキュベーション期間中、間質細胞は、フレームワークの開口部中に成長し始める前に、三次元フレームワークに沿って直線的に成長し、三次元フレームワークを包囲する。成長している細胞は、無数の成長因子、制御因子及びタンパク質を生成し、そのなかには周囲培地中に分泌されるものもあれば、支持体上に沈着されて、以下にさらに十分に記載する細胞外マトリックスを構成するものもある。成長因子及び制御因子を培養物に添加することもできるが、必須ではない。間質細胞の培養物は、非可溶性画分及び可溶性画分の双方を生成する。細胞は、細胞外マトリックスタンパク質の十分な沈着を可能にするように好適な程度まで成長させる。
三次元組織の培養中、増殖している細胞がフレームワークから放出されて、培養容器の壁に固着することがあり、これらの細胞はここで増殖し続け、コンフルエントな単層を形成することがある。細胞の成長に影響を及ぼす可能性があるこの出来事を最小限に抑えるために、栄養供給中にまたは細胞培養物を新たな培養容器に移動させることによって、放出された細胞を除去することができる。コンフルエントな単層の除去または新たな容器中の新鮮培地への培養組織の移動が、培養物の増殖活性を維持または回復する。いくつかの態様では、培養密度が25%を超える培養細胞の単層を有する培養容器において、除去または移動を行ってよい。あるいは、いくつかの実施形態では、培養物を攪拌して、放出された細胞が固着するのを阻止し;他の実施形態では、新鮮培地を本システムを通じて連続的に注入する。いくつかの態様では、2種以上の細胞型を、同時に一緒に培養する、または一方を最初に培養し、続いてもう一方を培養することができる(例えば、線維芽細胞及び平滑筋細胞または内皮細胞)。
足場への接種後に、三次元組織中への細胞の成長を支持する好適な栄養培地及びインキュベーション条件で、細胞培養物をインキュべートする。多くの市販されている培地、例えば、Dulbecco変法イーグル培地(DMEM)、RPMI 1640培地、Fisherの培地、Iscoveの培地、及びMcCoyの培地が、細胞培養物の成長を支持するために好適でありうる。培地に、追加の塩、炭素源、アミノ酸、血清及び血清成分、ビタミン、ミネラル、還元剤、緩衝剤、脂質、ヌクレオシド、抗生物質、付着因子、ならびに成長因子を補充してよい。さまざまなタイプの培養培地のための配合が、当業者が入手できるさまざまな参考文献に記載されている(例えば、Methods for Preparation of Media、Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures、Alan R. Liss、New York(1984);Tissue Culture:Laboratory Procedures、John Wiley & Sons、Chichester、England(1996);Culture of Animal Cells、A Manual of Basic Techniques、4 th Ed.、Wiley−Liss(2000))。
本発明の培養ステップのいずれかに用いられる成長培地または培養培地は、好気条件または低酸素条件下で、血清を含んでもよいし、または無血清であってもよい。1つの態様では、培地は、4.5g/Lのグルコース、アラニル−L−グルタミン、Eq 2mMを含んだ、かつ名目上10%ウシ胎仔血清を補充した、Dulbecco変法イーグル培地である。別の態様では、培地は無血清の培地であり、0.5%血清アルブミン、2μg/mlのヘパリン、1μg/mlの遺伝子組み換え塩基性FGF、1μg/mlの大豆トリプシン阻害剤、1XITSサプリメント(インスリン−トランスフェリン−セレニウム、Sigma Cat.No.I3146)、1:1000希釈の脂肪酸サプリメント(Sigma Cat.No.7050)、及び1:1000希釈のコレステロールを補充した、Glutamax(登録商標)入りグルコース基本培地4.5g/Lを含むDulbecco変法イーグル培地である。さらに、低酸素培養及び好気培養の双方に同じ培地を用いることができる。1つの態様では、播種及び第1週の成長の後に、成長培地を血清に基づく培地から無血清培地に交換する。
インキュベーション条件は、低酸素成長条件を維持するために、pH、温度、及びガス(例えば、O2、CO2等)の好適な条件の下にある。いくつかの実施形態では、増殖活性を最大化し、画分の所望の生物学的活性を促進する因子を産生するために、インキュベーション期間中に培地中に細胞培養物を懸濁させることができる。さらに、培養物に定期的に「栄養供給」し、消費された培地を除去し、放出された細胞を減らし、新たな栄養源を添加してもよい。インキュベーション期間中、培養細胞は、足場の開口部中に成長し始める前に、足場のフィラメントに沿って直線的に成長し、足場のフィラメントを包囲する。
低酸素条件下でのインキュベーション中、約15〜20%の通常の大気酸素濃度下でのインキュベーションと比較して、何千という遺伝子が差次的に発現される。かかる組成物中では、いくつかの遺伝子、最も注目すべきは、ある特定のラミニン種、コラーゲン種及びWnt因子が、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされることがわかった。さまざまな態様では、三次元細胞外マトリックスは、通常の条件下での成長と比較して低酸素条件での成長に起因して細胞により生成される細胞生成物の特徴的なフィンガープリントまたは組によって定義することができる。特に本明細書に例示される細胞外マトリックス組成物では、三次元組織及び周囲培地は、さまざまな因子の発現及び/または分泌を特徴とする。
本明細書に記載される三次元組織及び組成物は、足場またはフレームワーク上に存在する細胞外マトリックスを有する。いくつかの態様では、細胞外マトリックスは、低酸素条件下での成長及び支持体上で成長させる細胞の選択により、さまざまなラミニン及びコラーゲン型を含む。沈着される細胞外マトリックス(ECM)タンパク質の割合は、好適なコラーゲン型を生産する線維芽細胞を選択することによって、ならびに、特定のラミニン及びコラーゲン種の発現がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる低酸素条件下で細胞を成長させることによって、操作または向上させることができる。
いくつかの態様では、特定のコラーゲン型を決める好適なアイソタイプまたはサブクラスのモノクローナル抗体を用いて、線維芽細胞の選択を実施することができる。他の態様では、固体基材、例えば磁気ビーズを用いて、抗体に結合した細胞を選択または除去してよい。これらの抗体の組み合わせを用いて、所望のコラーゲン型を発現する線維芽細胞を選択(陽性にまたは陰性に)することができる。あるいは、フレームワークに接種するのに用いられる間質は、所望のコラーゲン型を合成する細胞の混合物とすることができる。例示的なコラーゲン型の分布及び起源を表Iに示す。
ECM組成物中に存在しうる追加のコラーゲン型を表2に示す。
上記に記載されるとおり、本明細書に記載されるECM組成物は、さまざまなコラーゲンを含む。実施例1の表3に示されるとおり、いくつかのコラーゲン種の発現が、低酸素培養されたECM組成物においてアップレギュレートされることがわかっている。したがって、本発明の1つの態様では、1種以上の胚性タンパク質を含むECM組成物は、酸素約15〜20%の酸素条件で生成されるものと比較して、コラーゲン種のアップレギュレーションを含む。別の態様では、アップレギュレートされるコラーゲン種は、V型α1;IX型α1;IX型α2;VI型α2;VIII型α1;IV型α5;VII型α1;XVIII型α1;及びXII型α1である。
さまざまなコラーゲンに加えて、本明細書に記載されるECM組成物は、さまざまなラミニンを含む。ラミニンは、コイルド・コイルドメインによってともに連結されたα、β、及びγ鎖サブユニットから構成される糖タンパク質ヘテロ三量体のファミリーである。現在まで、組み合わさって15種の異なるアイソフォームを形成することができる5種のα、4種のβ、及び3種のγラミニン鎖が同定されている。この構造内には、他のラミニン及び基底膜分子、ならびに膜結合受容体に対する結合活性を保持するドメインが特定可能である。ドメインVI、IVb、及びIVaが球状構造を形成し、ドメインV、IIIb、及びIIIa(システインリッチEGF様要素を含有する)が、棒状構造を形成する。3つの鎖のうちのドメインI及びIIが、三本鎖コイルド・コイル構造(長腕)の形成に関与する。
ラミニン鎖は、共通及び特有の機能を保持し、特異的な時間的(発生的)及び空間的(組織部位特異的)パターンで発現される。ラミニンα鎖は、組織特異的分布パターンを示し、主要な細胞相互作用部位を含有するため、ヘテロ三量体の機能的に重要な部分と考えられる。血管内皮細胞は、2種のラミニンアイソフォームを発現することが知られ、これは、発生段階、血管型、及び内皮細胞の活性化状態に応じて発現が異なる。
したがって、本発明1つの態様では、1種以上の胚性タンパク質を含むECM組成物は、酸素約15〜20%の酸素条件で生成されるものと比較して、さまざまなラミニン種のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを含む。
ラミニン8は、α−4、β−1、及びγ−1ラミニン鎖から構成される。ラミニンα−4鎖は、成体において及び発生中に、広く分布される。成体では、それは、心筋、骨格筋、及び平滑筋線維の周囲の基底膜において、ならびに肺胞中隔において同定することができる。それは、また、毛細血管及びより大きな血管中の内皮基底膜に、ならびに末梢神経の神経周囲基底膜に、ならびに類洞内空間、骨髄のより大きな動脈及びより小さな小動脈に存在することが知られている。ラミニン8は、血管内皮細胞における主要なラミニンアイソフォームであり、これは、血小板によって発現され血小板に接着され、3T3−L1脂肪細胞において合成され、その合成レベルは、細胞の脂肪変換時に増大することが示される。ラミニン8は、一般に間葉細胞系統において発現され、結合組織において微小血管を誘導するラミニンアイソフォームであると考えられている。ラミニン8は、また、マウス骨髄初代細胞培養物、細動脈壁、及び類洞内空間中で同定され、それは、発生中の骨髄において主要なラミニンアイソフォームである。α−4鎖を含有するラミニンアイソフォームは、造血細胞に隣接した成体骨髄中に局在するため、発生中の造血細胞と生物学的に関連した相互作用を有する可能性が高い。
したがって、本発明の別の態様では、ECMは、ラミニン種、例えばラミニン8のアップレギュレーションを含む。別の態様では、本発明の三次元組織によって生成されるラミニンは、少なくともラミニン8を含み、これは、組成物中に存在しているラミニンタンパク質の特性または特色を定義する。
本明細書に記載されるECM組成物は、さまざまなWnt因子を含む。Wntファミリー因子は、無数の細胞経路及び細胞−細胞相互作用プロセスでの役割を有するシグナリング分子である。Wntシグナリングは、腫瘍発生、胚の初期中胚葉パターン形成、脳及び腎臓の形態形成、乳腺組織増殖の制御、ならびにアルツハイマー病に関与している。実施例1の表4に示されるとおり、いくつかの種のWntタンパク質の発現が、低酸素培養されたECM組成物においてアップレギュレートされることがわかっている。したがって、本発明の1つの態様では、1種以上の胚性タンパク質を含むECM組成物は、酸素約15〜20%の酸素条件で生成されるものと比較して、Wnt種のアップレギュレーションを含む。別の態様では、アップレギュレートされるWnt種は、wnt7a及びwnt11である。別の態様では、本発明の三次元組織によって生成されるWnt因子は、少なくともwnt7a及びwntllを含み、これは、組成物中に存在しているWntタンパク質の特性または特色を定義する。
全体にわたって記載されるとおり、本発明のECM組成物は、可溶性画分及び非可溶性画分の双方またはこれらの任意の部分を含む。本発明の組成物は、いずれかまたは双方の画分、ならびにこれらの任意の組み合わせを含んでよいと理解されるべきである。さらに、画分から個々の成分を単離して、個々にまたは他の単離物もしくは公知の組成物と組み合わせて用いてよい。
したがって、さまざまな態様では、本発明の方法を用いて生成される細胞外マトリックス組成物は、直接使用されても、またはさまざまな方法で処理してもよく、その方法は、非可溶性画分及び可溶性画分の双方に適用可能でありうる。無細胞上清及び培地を含む可溶性画分は、因子を保存及び/または濃縮するために凍結乾燥してよい。必要な場合には活性を維持するために、さまざまな生体適合性防腐剤、凍結保護剤、及び安定剤を用いてよい。生体適合性薬剤の例としては、特に、グリセロール、ジメチルスルホキシド、及びトレハロースが挙げられる。凍結乾燥物は、また、1種以上の賦形剤、例えば、緩衝剤、充填剤、及び等張性調節剤を有してよい。凍結乾燥された培地は、以下にさらに記載されるとおり、好適な溶液または薬学的希釈剤の添加によって再構成してよい。
他の態様では、可溶性画分は透析される。透析は、多孔性膜を通じた選択的拡散に基づいて試料成分を分離するための最も一般に用いられる技術の1つである。孔サイズは、溶質の90%が膜によって保持される分子量によって特徴づけられる膜の分子量カットオフ(MWCO)を決定する。ある特定の態様では、任意の孔サイズを有する膜が、所望のカットオフに応じて企図される。典型的なカットオフは、5,000ダルトン、10,000ダルトン、30,000ダルトン、及び100,000ダルトンであるが、全サイズが企図される。
いくつかの態様では、培地中の活性成分(例えば、成長因子)を沈殿させることによって可溶性画分を処理してよい。沈殿では、さまざまな方法、例えば、硫酸アンモニウムによる塩析、または親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコールの使用を用いてよい。
他の態様では、可溶性画分は、さまざまな選択的フィルターを用いてろ過される。ろ過によって可溶性画分を処理することは、画分中に存在している因子を濃縮すること、また、可溶性画分中の使用された小分子及び溶質を除去することに有用である。特定の分子量の選択性を有するフィルターは、<5000ダルトン、<10,000ダルトン、及び<15,000ダルトンを含む。本明細書に記載されるとおり、他のフィルターを用いてもよく、処理された培地を治療的活性についてアッセイしてもよい。例示的なフィルター及び濃縮装置システムとしては、特に、中空繊維フィルター、フィルターディスク、及びフィルタープローブに基づいたものが挙げられる(例えば、Amicon Stirred Ultrafiltration Cellsを参照)。
さらに他の態様では、塩、不純物を除去する、または培地のさまざまな成分を分画するために、可溶性画分をクロマトグラフィーに供する。さまざまなクロマトグラフィー技術、例えば、分子ふるい、イオン交換、逆相、及び親和性クロマトグラフィー技術を用いてよい。生物活性を著しく損失することなしに馴化培地を処理するために、穏やかなクロマトグラフィー媒体を用いてよい。非限定的な例としては、特に、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド系分離媒体(例えば、さまざまな商品名、例えば、Sephadex、Sepharose、及びSephacrylで市販されている)が挙げられる。
さらに他の態様では、馴化培地は、リポソームとして製剤化される。送達のため及び活性因子の寿命を伸ばすため、リポソームの内腔中に成長因子を導入またはカプセル化してよい。当該技術分野で知られるとおり、リポソームをさまざまなタイプ:多重膜(MLV)、安定多層(SPLV)、小型単層(SUV)または大型単層(LUV)ベジクルに分類することができる。リポソームは、ホスファチジルエーテル及びエステル、例えば、ホスホチジルセリン、ホスホチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルコリン;ステロイド、例えば、コレステロール;セレブロシド;スフィンゴミエリン;グリセロ脂質;ならびに他の脂質(例えば、米国特許第5,833,948号を参照)を含み、合成されてもまたは天然に存在してもよい、さまざまな脂質化合物から調製することができる。
可溶性画分は、追加の添加剤なしで直接使用されても、またはさまざまな薬学的に許容できる賦形剤、ビヒクルもしくはキャリアとともに薬学的組成物として調製してもよい。「薬学的組成物」とは、可溶性及び/または非可溶性画分ならびに少なくとも1つの薬学的に許容できるビヒクル、キャリア、または賦形剤の形態を指す。皮内、皮下または筋肉内投与では、本組成物は、水性または油性ビヒクル中の細胞外マトリックス組成物の無菌懸濁液、溶液またはエマルジョンに調製してよい。本組成物は、また、配合剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤または分散剤を含有してもよい。注射のための製剤は、防腐剤とともにまたは防腐剤なしで、複数用量容器中の単位剤形のアンプルで提供されてよい。あるいは、本組成物は、例えば、これらに限定されないが、無菌の発熱物質非含有水、生理食塩水、緩衝液、またはブドウ糖溶液を含む好適なビヒクルで再構成される粉末形態で提供されてよい。
他の態様では、三次元組織は、使用前に解凍される、凍結保存された調整物である。薬学的に許容できる凍結保護剤としては、特に、グリセロール、糖、ポリオール、メチルセルロース、及びジメチルスルホキシドが挙げられる。糖剤としては、単糖、二糖、及び、少なくとも−60、−50、−40、−30、−20、−10、または0℃である最大凍結濃縮溶液のガラス転移温度(Tg)を有する他のオリゴ糖が挙げられる。凍結保存に使用される例示的な糖は、トレハロースである。
いくつかの態様では、三次元組織を処理して、使用前に細胞を殺処理する。いくつかの態様では、足場上に沈着された細胞外マトリックスを収集し、投与のために処理してよい(米国特許第5,830,708号及び6,280,284号を参照、参照により本明細書に組み込まれる)。D
他の実施形態では、三次元組織を濃縮して、投与のために薬学的に許容できる媒体で洗浄してよい。組成物を濃縮するためのさまざまな技術、例えば、遠心分離またはろ過を本技術分野で利用できる。その例としては、デキストラン沈降法及び分画遠心法が挙げられる。三次元組織の製剤化は、懸濁液のイオン強度を等張性(すなわち、約0.1〜0.2)及び生理的pH(すなわち、pH6.8〜7.5)に調節することを含んでもよい。本製剤は、また、細胞懸濁液の投与または安定性を補助するために潤滑剤または他の賦形剤を含有してよい。これらとしては、特に、糖(例えば、マルトース)及び有機ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール及びヒアルロン酸が挙げられる。さまざまな製剤の調製のための追加の詳細が、米国特許公開第2002/0038152号に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
上記に記載されるとおり、本発明のECM組成物は、ECM組成物の予定される用途及び好適な送達または投与に応じて、多くの方法で処理してよい。例えば、本組成物は、上記に記載されるとおり、三次元足場もしくはインプラントとして送達されてもよく、または注射のために本組成物を製剤化してもよい。用語「投与」または「投与すること」は、治療が必要な対象に本発明の化合物または薬学的組成物を提供する行為を含むものと定義される。語句「非経口投与」及び「非経口的に投与される」は、本明細書に用いられる場合、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与方法を意味し、これには、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内の注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。語句「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」及び「末梢に投与される」は、本明細書に用いられる場合、化合物、薬剤または他の物質が対象の系に入り、かくして代謝及び他の同様のプロセスに供されるような、中枢神経系への直接投与以外の投与、例えば、皮下投与を意味する。
用語「対象」は、本明細書に用いられる場合、本方法が実施される任意の個体または患者を指す。一般に、対象はヒトであるが、当業者によって理解されるとおり、対象は動物としてよい。このため、哺乳動物、例えば、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター及びモルモットを含む)、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む家畜、ならびに霊長動物(サル、チンパンジー、オランウータン及びゴリラを含む)を含む他の動物が、対象の定義内に含まれる。
本発明の細胞外マトリックス組成物は、これらに限定されないが、損傷を受けた細胞または組織の修復及び/または再生の促進、組織再生を促進するためのパッチでの使用、幹細胞などの細胞を培養するための組織培養システムでの使用、埋め込み可能な装置(例えば、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、ドラッグ送達ポートまたはカテーテル)に関連して用いられる表面コーティングでの使用、軟組織修復の促進、しわなどの皮膚表面の増強及び/または改善、生物学的癒着防止剤としてのまたは送達部位での細胞の送達もしくは維持のための生物学的ビヒクルとしての使用を含む、さまざまな用途を有する。
さらに、本明細書のいずれかの方法に記載されるとおりに細胞を培養することから得られるECM組成物は、本発明の任意の他の用途または方法において用いてよい。例えば、本発明の組織培養システムを用いて細胞を培養することによって作製されるECM組成物は、例えば、細胞の修復及び/または再生、組織再生を促進するためのパッチでの使用、幹細胞などの細胞を培養するための組織培養システムでの使用、埋め込み可能な装置(例えば、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、ドラッグ送達ポートまたはカテーテル)に関連して用いられる表面コーティングでの使用、軟組織修復の促進、しわなどの皮膚表面の増強及び/または改善、生物学的癒着防止剤としてのまたは送達部位での細胞の送達もしくは維持のための生物学的ビヒクルとしての使用において用いてよい。
さまざまな実施形態では、本発明は、細胞または組織の修復及び/または再生ならびに軟組織修復の促進のための方法を含む。1つの実施形態は、本発明の細胞外マトリックス組成物と修復または再生される細胞を接触させることによる細胞の修復及び/または再生の方法を含む。骨軟骨細胞を含む本明細書に記載されるさまざまな細胞の修復及び/または再生のために、本方法を用いてよい。
1つの態様では、本方法は骨軟骨欠損の修復を企図する。本明細書に用いられる場合、「骨軟骨細胞」とは、軟骨形成もしくは骨形成の系統のいずれかに属する細胞、または、環境シグナルに応じて軟骨形成もしくは骨形成の系統のいずれかに分化させることができる細胞を指す。この潜在能力は、公知の技術によってインビトロまたはインビボで試験することができる。このため、1つの態様では、本発明のECM組成物を用いて、軟骨形成細胞、例えば、軟骨を生成することができる細胞またはそれ自体が軟骨を生成する細胞に分化する細胞、例えば軟骨細胞及びそれ自体が軟骨細胞に分化する細胞(例えば、軟骨細胞前駆細胞)を、修復及び/または再生する。このため、別の態様では、本発明の組成物は、結合組織の修復及び/または再生に有用である。本明細書に用いられる場合、「結合組織」とは、これらに限定されないが、骨、軟骨、靱帯、腱、半月板、真皮、皮下組織(hyperdermis)、筋肉、脂肪組織、関節包を含む、哺乳動物の身体中のいくつかの構造組織のいずれかを指す。
本発明のECM組成物は、膝、足首、肘、臀部、手首、手指もしくは足指の指関節、または顎関節などの、可動関節の骨軟骨欠損を治療するために用いてよい。かかる骨軟骨欠損は、外傷性損傷(例えば、スポーツ損傷もしくは過度の摩耗)または変形性関節症などの疾患の結果でありうる。1つの特定の態様は、変形性関節症軟骨の表面病変の治療または予防での本発明のマトリックスの使用に関する。さらに本発明は、加齢または出産に起因する骨軟骨欠損の治療または予防において有用である。本発明の文脈での骨軟骨欠損は、また、これらに限定されないが、美容整形(例えば、鼻、耳)などの外科手術の文脈で軟骨及び/または骨の修復が必要とされる状態を含むと理解されるべきである。このため、かかる欠損は、軟骨もしくは骨形成が破壊されている身体のどこかで、または軟骨もしくは骨が損傷を受けているもしくは遺伝的欠損のために存在しない身体のどこかで生じる可能性がある。
上記に記載されるとおり、本発明のECM組成物中に、成長因子または特定の細胞の成長を誘発もしくは刺激する他の生物学的作用物質を含めてもよい。成長因子の種類は、細胞型、及び組成物が意図される用途に依存する。例えば、骨軟骨細胞の場合では、追加の生物活性剤、例えば、細胞成長因子(例えば、TGF−β)、軟骨形成を刺激する物質(例えば、BMP−2、BMP−12及びBMP−13などの軟骨形成を刺激するBMP)、間質細胞の足場への遊走を刺激する因子、マトリックス沈着を刺激する因子、抗炎症剤(例えば、非ステロイド性抗炎症剤)、免疫抑制剤(例えば、シクロスポリン)が、存在してもよい。また、他の成長因子、例えば、血小板由来成長因子(PDGF)、インスリン様成長因子(IGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、上皮成長因子(EGF)、ヒト内皮細胞成長因子(ECGF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、血管内皮成長因子(VEGF)、軟骨由来形態形成タンパク質(CDMP)、他の骨形成タンパク質、例えば、OP−1、OP−2、BMP3、BMP4、BMP9、BMP11、BMP14、DPP、Vg−1、60A、及びVgr−1、コラーゲン、弾性線維、細網線維、糖タンパク質またはグルコサミノグリカン、例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−4−硫酸、コンドロイチン−6−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸等のような、他のタンパク質を含めてもよい。例えば、TGF−βなどの成長因子は、アスコルビン酸とともに、軟骨細胞分化及び軟骨細胞による軟骨形成をトリガーすることがわかっている。さらに、ヒアルロン酸は、軟骨細胞及び他の間質細胞の付着のための良好な基質であり、足場の一部として組み込む、または足場上にコーティングすることができる。
さらに、特定の細胞の成長及び/または活性に影響を及ぼす他の因子を用いてもよい。例えば、軟骨細胞の場合では、肥大状態の軟骨細胞を維持するために、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第2002/0122790号に記載のとおり、軟骨細胞による軟骨生成を刺激するコンドロイチナーゼなどの因子をマトリックスに添加することができる。別の態様では、本発明の方法は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公報WO2005/054446に記載のとおり、ポリ硫酸化アルギン酸または他のポリ硫酸化多糖、例えば、ポリ硫酸化シクロデキストリン及び/またはポリ硫酸化イヌリン、または結合組織細胞の細胞外マトリックスの生成を刺激することができる他の成分の存在を含む。
修復及び/または再生される細胞または組織は、本明細書に記載された方法のいずれかによって、インビボでまたはインビトロで接触させてよい。例えば、ECM組成物を対象に(例えば、本発明のECM組織、パッチまたはコーティングを施した装置によって)注射または埋め込んでよい。別の態様では、修復及び/または再生される組織または細胞は、公知の外科的技術を用いて対象から採集され、インビトロで培養され、その後、対象に埋め込むまたは投与されてよい。
上記に記載されるとおり、本発明のECM組成物はさまざまな方法で処理してよい。したがって、1つの実施形態では、本発明は組織培養システムを含む。さまざまな態様では、本培養システムは、本明細書に記載される細胞外マトリックス組成物から構成される。本発明のECM組成物は、さまざまな方法で組織培養システムに組み込んでよい。例えば、本明細書に記載されるとおり、三次元足場材料を含浸させることによってコーティングとして、または細胞を培養するための培地への添加剤として、組成物を組み込んでよい。したがって、1つの態様では、本培養システムは、成長因子または胚性タンパク質などの、本明細書に記載された細胞外マトリックス組成物のいずれかを含浸させた三次元支持体材料を含むことができる。
本明細書に記載される細胞外マトリックス組成物は、さまざまな細胞型の成長のための支持体または三次元支持体として役割を果たしてよい。細胞培養可能な任意の細胞型が企図される。1つの態様では、幹細胞の成長を支持するために本培養システムを用いることができる。別の態様では、幹細胞は、胚性幹細胞、間葉幹細胞または神経幹細胞である。
埋め込み可能な組織などのさらなるECM組成物を作製するために、組織培養システムを用いてよい。したがって、本発明の組織培養システムを用いる細胞の培養をインビボでまたはインビトロで実施してよい。例えば、対象への注射または埋め込みのためのECM組成物を作製するために本発明の組織培養システムを用いてよい。本組織培養システムによって作製されたECM組成物は、本明細書に記載されるいずれかの方法で処理して用いてもよい。
本発明のECM組成物は、細胞送達のための生物学的ビヒクルとして用いてよい。本明細書に記載されるとおり、ECM組成物は、可溶性画分及び/または非可溶性画分の双方を含んでよい。したがって、本発明の別の実施形態では、本発明の細胞外マトリックス組成物を含む送達部位での細胞の送達または維持のための生物学的ビヒクルが記載されている。インビボでの細胞の成長を促進及び/または支持するために、細胞及び三次元組織組成物を含む本発明のECM組成物を用いてよい。任意の好適な用途で、例えば、損傷を受けた心筋中への幹細胞などの細胞の注射を支持するために、または上記に記載されるとおりに腱及び靱帯修復のために、本ビヒクルを用いることができる。
ECM組成物が埋め込まれるまたは投与される前、その後、またはその最中に、好適な細胞組成物(例えば、本発明の単離されたECM細胞及び/または追加の生物学的作用物質)を投与することができる。例えば、培養システムまたは生物学的送達ビヒクルが対象に埋め込まれる前に、投与、欠損、及び/または埋め込みの部位に、細胞を播種することができる。あるいは、好適な細胞組成物を後で(例えば、部位への注射によって)投与することができる。細胞は、その場所で作用して、組織再生及び/または細胞修復を誘発する。例えば、注射によって欠損部位へ細胞を投与することができる任意の手段によって、細胞を播種することができる。細胞の注射は、細胞の生存可能性を維持する任意の手段によって、例えば、シリンジまたは関節鏡によって行うことができる。
細胞外マトリックス組成物は、かかる組成物を投与して、心臓及び関連組織での内皮化及び脈管化を促進することによって、臓器及び組織での血管新生を促進することが報告されている。したがって、さらに別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される細胞外マトリックス組成物を含む対象における装置の埋め込みに関連して用いられる表面コーティングを含む。コーティングは、対象への埋め込みまたは侵入に用いられる任意の装置、例えば、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、ドラッグ送達ポートまたはカテーテルに、適用してよい。ある特定の態様では、コーティングは、創傷治癒を変えるため、炎症を変えるため、線維性被膜形成を変えるため、組織内殖を変えるため、または細胞内殖を変えるために、用いることができる。別の実施形態では、本発明は、損傷を受けた組織、例えば、心臓、腸、梗塞または虚血組織の治療のためのものを含む。かかる用途のために企図された細胞外マトリックス組成物の作製を記載している実施例を、以下に示す。通常の酸素条件下で成長させる細胞外マトリックス組成物の調製及び使用は、米国特許出願第2004/0219134号に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される細胞外マトリックス組成物を含む組織再生パッチを含む。別の実施形態では、本発明は、対象のしわの部位に本明細書に記載される細胞外マトリックス組成物を投与することを含む、対象における皮膚表面の改善のための方法を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、対象のしわの部位に本明細書に記載される細胞外マトリックス組成物を投与することを含む、対象における軟組織の修復または増強のための方法を含む。細胞の修復及び/または再生、皮膚表面の改善、ならびに軟組織修復のための通常の酸素培養条件下で生成された細胞外マトリックス組成物の調製及び使用は、米国特許第5,830,708号、米国特許第6,284,284号、米国特許出願第2002/0019339号及び米国特許出願第2002/0038152号に記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される細胞外マトリックス組成物を含む生物学的癒着防止剤を含む。本薬剤は、腸または血管吻合の形成後に用いられる癒着防止パッチ等の用途に用いることができる。
本明細書に用いられる組成物または活性成分は、一般に、治療される特定の疾患を治療または予防するのに有効な量で用いられる。本組成物は、治療的利益を得るために治療的に投与されても、または予防的利益を得るために予防的に投与されてもよい。治療的利益は、治療される基礎状態または障害の根絶または改善を意味する。治療的利益は、また、改善が実現するかどうかにかかわらず、疾患の進行を停止させること、または遅くすることも含む。
投与される組成物の量は、例えば、組成物の種類、治療される特定の適応症、投与の方法、所望の利益が予防的であるか治療的であるか、治療される適応症の重症度及び患者の年齢と体重、ならびに剤形の有効性を含む、さまざまな要因に依存する。効果的な用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
初期の投与量は、最初にインビトロでのアッセイから推定してよい。初期の投与量は、また、インビボデータ、例えば、動物モデルから推定することもできる。育毛を向上させるための組成物の有効性を試験するのに有用な動物モデルとしては、特に、げっ歯類、霊長動物及び他の哺乳動物が挙げられる。当業者は、インビトロ及び動物でのデータからの外挿によって、ヒトでの投与に好適な投与量を決定することができる。
投与量は、特に、馴化培地の活性、投与の方法、治療される状態、及び上記に記載されるさまざまな要因に依存する。投与量及び間隔は、治療的または予防的効果を維持するのに十分なレベルをもたらすように個々に調節してよい。
1つの実施形態では、本発明の方法は、ECMを、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、化学療法剤、免疫調節剤、治療用抗体またはタンパク質キナーゼ阻害剤と組み合わせて、かかる治療を必要とする組織、細胞または対象に投与することを含む。限定するものではないが、化学療法剤としては、代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセート、DNA架橋剤、例えば、シスプラチン/カルボプラチン;アルキル化剤、例えば、カンブシル;トポイソメラーゼI阻害剤、例えば、ダクチノマイシン;微小管阻害剤、例えば、タキソール(パクリタキソール)等が挙げられる。他の化学療法剤としては、例えば、ビンカアルカロイド、マイトマイシン型抗生物質、ブレオマイシン型抗生物質、葉酸拮抗剤、コルヒチン、デメコリン、エトポシド、タキサン、アントラサイクリン抗生物質、ドキソルビシン、ダウノルビシン、カルミノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、4−ジメトキシ−ダウノマイシン、11−デオキシダウノルビシン、13−デオキシダウノルビシン、アドリアマイシン−14−ベンゾエート、アドリアマイシン−14−オクタノエート、アドリアマイシン−14−ナフタレンアセテート、アムサクリン、カルムスチン、シクロホスファミド、シタラビン、エトポシド、ロバスタチン、メルファラン、トポテカン、オキサラプラチン、クロラムブシル、メトトレキサート、ロムスチン、チオグアニン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンデシン、タモキシフェン、またはメクロレタミンが挙げられる。限定するものではないが、治療用抗体としては、HER2タンパク質に対する抗体、例えば、トラスツズマブ;成長因子または成長因子受容体に対する抗体、例えば、血管内皮成長因子を標的にするベバシズマブ、及び、上皮成長因子を標的にするOSI−774;インテグリン受容体を標的にする抗体、例えば、ビタキシン(MEDI−522としても知られる)等が挙げられる。本発明の組成物及び方法で使用するのに好適な抗癌剤のクラスとしては、1)微小管阻害剤(例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビンデシン等)、微小管安定化剤(例えば、パクリタキセル[タキソール]、及びドセタキセル、タキソテレ等)、及び、トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、エピポドフィロトキシン(例えば、エトポシド[VP−16]、及びテニポシド[VM−26]等)、及びトポイソメラーゼIを標的にする薬剤(例えば、カンプトテシン及びイシリノテカン[CPT−11]等)を含むクロマチン機能阻害剤を含む、アルカロイド;2)ナイトロジェンマスタード(例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、及びブスルファン[ミレラン]等)、ニトロソウレア(例えば、カルムスチン、ロムスチン、及びセムスチン等)、及び他のアルキル化剤(例えば、ダカルバジン、ヒドロキシメチルメラミン、チオテパ、及びマイトサイシン等)を含む、共有結合性DNA結合剤[アルキル化剤];3)核酸阻害剤(例えば、ダクチノマイシン[アクチノマイシンD]等)、アントラサイクリン(例えば、ダウノルビシン[ダウノマイシン、及びセルビジン]、ドキソルビシン[アドリアマイシン]、及びイダルビシン[イダマイシン]等)、アントラセンジオン(例えば、アントラサイクリン類似体、例えば、[ミトキサントロン]等)、ブレオマイシン(ブレノキサン)等、及びプリカマイシン(ミトラマイシン)等を含む、非共有結合性DNA結合剤[抗腫瘍抗生物質];4)葉酸拮抗剤(例えば、メトトレキセート、ホレックス、及びメキセート等)、プリン代謝拮抗剤(例えば、6−メルカプトプリン[6−MP、プリントール]、6−チオグアニン[6−TG]、アザチオプリン、アシクロビル、ガンシクロビル、クロロデオキシアデノシン、2−クロロデオキシアデノシン[CdA]、及び2’−デオキシコホルマイシン[ペントスタチン]等)、ピリミジンアンタゴニスト(例えば、フルオロピリミジン[例えば、5−フルオロウラシル(アドルシル)、5−フルオロデオキシウリジン(FdUrd)(フロクスウリジン)]等)、及びシトシンアラビノシド(例えば、シトサール[ara−C]及びフルダラビン等)を含む、代謝拮抗剤;5)L−アスパラギナーゼを含む酵素;6)グルココルチコイド、例えば、抗エストロゲン(例えば、タモキシフェン等)、非ステロイド系抗アンドロゲン(例えば、フルタミド等)、及びアロマターゼ阻害剤(例えば、アナストロゾール[アリミデックス]等)を含む、ホルモン;7)白金化合物(例えば、シスプラチン及びカルボプラチン等);8)抗癌剤、毒素、及び/または放射線核種等とコンジュゲートされた、モノクローナル抗体;9)生物学的応答調節物質(例えば、インターフェロン[例えば、IFN−α等]及びインターロイキン[例えば、IL−2等]等);10)養子免疫療法;11)造血成長因子;12)腫瘍細胞分化を誘発する薬剤(例えば、全トランス型レチノイン酸等);13)遺伝子療法技術;14)アンチセンス療法技術;15)腫瘍ワクチン;16)腫瘍転移に向けられた療法(例えば、バチミスタット等);ならびに17)血管新生の阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の薬学的組成物及び方法は、さらに、上記に示された病的状態の治療に通常適用される、本明細書に記載の他の治療用活性化合物を含んでよい。他の治療剤の例としては、以下のものが挙げられる:シクロスポリン(例えば、シクロスポリンA)、CTLA4−Ig、抗体、例えば、ICAM−3、抗IL−2受容体(抗Tac)、抗CD45RB、抗CD2、抗CD3(OKT−3)、抗CD4、抗CD80、抗CD86、CD40とgp39の間の相互作用を遮断する薬剤、例えば、CD40及び/またはgp39(すなわち、CD154)に特異的な抗体、CD40及びgp39から構築される融合タンパク質(CD40Ig及びCD8gp39)、阻害剤、例えば、NF−カッパB機能の核移行阻害剤、例えば、デオキシスパガリン(DSG)、コレステロール生合成阻害剤、例えば、HMG CoA レダクターゼ阻害剤(ロバスタチン及びシンバスタチン)、非ステロイド系抗炎症薬(NSAID)、例えば、イブプロフェン及びシクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えば、ロフェコキシブ、ステロイド、例えば、プレドニゾンまたはデキサメタゾン、金化合物、細胞増殖阻害薬、例えば、メトトレキセート、FK506(タクロリムス、プログラフ)、ミコフェノール酸モフェチル、細胞毒性薬、例えば、アザチオプリン及びシクロホスファミド、TNF−a阻害剤、例えば、テニダップ、抗TNF抗体または可溶性TNF受容体、ならびにラパマイシン(シロリムスまたはラパミューン)またはこれらの誘導体。
本発明の組成物及び方法と組み合わせて投与してよい他の薬剤としては、タンパク質治療剤、例えば、サイトカイン、免疫調節剤及び抗体が挙げられる。本明細書に用いられる場合、用語「サイトカイン」は、ケモカイン、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、及び受容体関連タンパク質、ならびにこれらの機能的フラグメントを包含する。本明細書に用いられる場合、用語「機能的フラグメント」は、規定の機能アッセイによって同定される生物学的機能または活性を保持するポリペプチドまたはペプチドを指す。
サイトカインとしては、内皮単球活性化ポリペプチドII(EMAP−II)、顆粒球−マクロファージ−CSF(GM−CSF)、顆粒球−CSF(G−CSF)、マクロファージ−CSF(M−CSF)、IL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−12、及びIL−13、インターフェロン等が挙げられ、これは、細胞または細胞機序における特定の生物学的変化、形態学的変化、または表現型の変化と関連している。
他の治療剤が、本発明の組成物または方法と組み合わせて用いられる場合、これらは、例えば、米国医薬品便覧(Physician Desk Reference(PDR))に示されるとおりの量で、またはそうでなければ当業者によって決定される量で、用いてよい。
上記に記載された方法に加えて、105Fという名称の低分子量ろ過液が、以下の実施例7〜9に記載のとおり、腫瘍及び免疫疾患を含む癌の治療での使用を含むがこれらに限定されない免疫療法として、有用である。
PD−1の会合は、SHP−1及びSHP−2などのホスファターゼを動員することによって組織内のT細胞抗原受容体(TCR)媒介エフェクター機能を直接的に阻害する可能性があり、これは、免疫寛容の維持のために不可欠である。PD−1は、自然免疫細胞を負に制御し、その不良は、自己免疫の活性化を引き起こす可能性がある。PD−1とPD−L1の間の相互作用は、膵島中でTCR誘発性停止シグナルを遮断することによって寛容を促進するものであり、PD−1またはPD−L1の遮断は、T細胞運動性を抑制し、末梢性寛容を阻害した。インビボでは、PD−1欠損は、マウスの遺伝的背景に応じて、さまざまな自然発症の自己免疫疾患で自己免疫を誘発した。遺伝的にPD−1を欠いているこれらのマウスは、BALB/c背景で、トロポニンIに対する高力価の循環IgG自己抗体の呈示を通じて、拡張型心筋症を発症した。PD−1の欠損は、当該技術分野に示されるとおり、非肥満性糖尿病(NOD)マウスにおいてI型糖尿病の発症及び頻度を特に促進した。DCにおけるPD−1の過剰発現は、BALB/cマウスにおいて同種リンパ球の活性化を阻害した。これらの観察は、PD−1が、生得的反応及びリンパ球反応の双方を制御し、自己免疫を阻害する可能性があることを示唆する。
当該技術分野では、PD−1が、TCRシグナリングを弱めることによってだけでなく、T細胞の機能を弱める遺伝子の発現を増強することによっても、T細胞の活性化を制限するように機能することが知られている。PD−1は、T細胞増殖及びサイトカイン分泌を弱めるのに十分な転写因子ATF−like(BATF)の発現を協調的にアップレギュレートした。T細胞においてBATFを発現停止させると、PD−1による阻害が減少し、HIV特異的T細胞の機能を回復した。PD−1は、解糖を阻害することならびに脂肪分解及び脂肪酸酸化を促進することによって、T細胞代謝の再プログラミングを変えた。これは、T細胞エフェクター機能のPD−1により媒介される遮断を担う代謝機序を示している。PD−1をトリガーすることは、IL−10生成をアップレギュレートすることによってT細胞の増殖及び機能を阻害した。PD−1の遮断は、ホスファチジルイノシトール−3−キナーゼ(PI3K)及びその下流標的AKTならびに哺乳動物ラパマイシン標的タンパク質(mTOR)の活性化を増大させた。これらは、抗ウイルス性細胞毒性Tリンパ球(CTL)では弱められている。さらなる研究では、転写因子FoxO1が、疲弊したCTL中のPD−1の発現及び機能の持続を担うことが示された。いくつかの他の転写因子もまた、PD−1発現の制御に関与している。活性化T細胞核内因子c1(NFATc1)の突然変異が、T細胞中のPD−1発現の完全損失をもたらした。インターフェロン(IFN)感受性応答要素(ISRE)は、マクロファージ中のPD−1のIFN−α誘発アップレギュレーションに不可欠であることが示された。NF−κBは、保存領域C中の遺伝子上流に位置する部位に結合することによってマクロファージ中のPD−1発現を制御した。さらに、PD−1は、Toll様受容体9の連結によって選択的にトリガーされることができ、これは、末梢性寛容及び自己免疫に寄与する。PD−1は、また、PI3K−Akt及びRas−分裂促進因子活性化及び細胞外シグナル制御キナーゼキナーゼ(MEK)−細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)シグナリング経路を阻害することにより、ユビキチンリガーゼSCF(Skp2)を抑制することによって、細胞周期の進行及びTリンパ球の増殖に影響を及ぼした(参照によって組み込まれるSui et al.、Oncotarget.2015 Aug 14;6(23):19393−19404から)。
実施例7に示されるとおり、ろ過液で処理したマウス肺におけるB16の転移性負荷が、75%超減少した。これらのデータは、また、ろ過液中の活性成分が、腫瘍におけるCD8+T細胞の侵入に効果があったことを示す。侵入しているT細胞(TIL)の活性化状態は、PD−1陰性であった。これは、TILが、105F低分子量ろ過液によって免疫抑制性ではなく細胞毒性であったことを示唆している。特定の理論によって拘束されることを望まないが、PD−1+サプレッサーT細胞(CD8+)が105Fろ過液によって殺され、PD−1陰性CD8+細胞が、腫瘍の領域に動員されると考えられる。
さらに、105F低分子量ろ過液は、PD−1阻害剤または他の化学療法剤と組み合わせて用いることができる。例えば、ニボルマブ(ONO−4538、BMS−936558またはMDX−1106としても知られる)は、ヒトPD−1を特異的に標的にする、遺伝子組み換えした完全ヒト免疫グロブリン(Ig)G4免疫チェックポイント阻害剤である。本抗体は、高親和性でPD−1に結合し、これにより阻害性シグナルを弱め、宿主の抗腫瘍免疫反応を高める。ニボルマブは、黒色腫、NSCLC、前立腺癌、腎細胞癌(RCC)、ホジキンリンパ腫及び結腸直腸癌(CRC)を含むさまざまな腫瘍型で抗癌能力を有する。最近、ニボルマブは、切除不能なまたは転移性の黒色腫の患者の治療のために、2014年12月に米国FDAによって承認された。ニボルマブはまた、プラチナ系化学療法による治療中または治療後に再発した転移性扁平上皮NSCLCの患者の治療のために、2015年3月に米国FDAによって承認された。したがって、ニボルマブと組み合わせた105Fが、本発明に含まれる。
黒色腫は、「免疫原性」腫瘍と考えられ、高レベルのPD−L1が黒色腫中に頻繁に発現されており、これが、PD−1の活性化、及び抗癌免疫、例えばT細胞のダウンレギュレーションを導く。このため、免疫チェックポイント抗体は、黒色腫の患者に対して抗腫瘍能力を有する可能性がある。
黒色腫と同様に、NSCLCはPD−1またはPD−L1の高発現を示し、治療戦略としてPD−1/PD−L1経路を遮断することが、最近、NSCLCの患者で評価された。
ペムブロリズマブ(MK−3475)、すなわちT細胞上のPD−1とそのリガンドとの相互作用を遮断するヒト化IgG4モノクローナル抗体が、抗腫瘍免疫を再活性化すると考えられている。第I相試験が、イピリムマブ不応性進行黒色腫の患者でのペムブロリズマブの有効性及び安全性を評価した。
NSCLCでは、ペムブロリズマブの有効性及び安全性が、現在、第I相試験で検討されている。ペムブロリズマブは、進行NSCLCの患者での抗腫瘍活性を有することが示され、さらに、少なくとも50%の腫瘍細胞におけるPD−L1発現が、ペムブロリズマブの有効性の改善と相関することが示された。さらに、ペムブロリズマブは、現在、乳癌、膀胱癌、及び血液学的悪性腫瘍を含むいくつかの他の癌型の患者において第I/II相試験で検討されている。
ピディリズマブ(CT−011)は、PD−1に対するヒト化IgG1カッパ遺伝子組み換えモノクローナル抗体である。前臨床試験では、ピディリズマブが癌細胞の生存を阻害することが示された。ピディリズマブは、濾胞性リンパ腫でのさらなる試験の価値があった。
MPDL3280A、すなわち遺伝子組み換えしたヒト抗PD−L1モノクローナルIgG1抗体は、転移性尿路上皮性膀胱癌(UBC)において顕著な抗腫瘍活性を有する。MPDL3280Aは、現在、BRAF突然変異を有するまたは有しない進行黒色腫で、ダブラフェニブ、ベムラフェニブまたはトラメチニブと組み合わせて検討されている。また、進行NSCLC、転移性RCC、及び乳癌でのMPDL3280AのII/III相試験が進行中である。
MEDI4736、すなわち遺伝子組み換えした完全ヒト抗PD−L1抗体は、肺癌の全患者で13%のORRを有するが、PD−L1+患者では最大39%であり、PD−L1陰性患者では5%であると報告されている。肺癌でのこれらの結果に基づいて、MEDI4736のいくつかの臨床試験が、単剤療法としてならびに他の薬剤との組み合わせで、さまざまな腫瘍型にわたって進行中である。
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。本明細書に開示されるECMまたは低分子量ろ過液、すなわち105Fと組み合わせて用いることができる化学療法癌薬剤は、有糸分裂阻害剤(ビンカアルカロイド)を含むがこれらに限定されない。これらとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン及びNavelbine(商標)(ビノレルビン−5’−ノルアンヒドロブラスチン)が挙げられる。さらに他の実施形態では、化学療法癌薬剤は、トポイソメラーゼI阻害剤、例えば、カンプトテシン化合物を含む。本明細書に用いられる場合、「カンプトテシン化合物」は、Camptosar(商標)(イリノテカンHCL)、Hycamtin(商標)(トポテカンHCL)及びカンプトテシンに由来する他の化合物ならびにその類似体を含む。本開示の方法及び組成物に用いてよい別のカテゴリーの化学療法癌薬剤は、ポドフィロトキシン誘導体、例えば、エトポシド、テニポシド及びミトポドジドである。本開示は、さらに、腫瘍細胞中の遺伝子物質をアルキル化するアルキル化剤として知られる他の化学療法癌薬剤を包含する。これらとしては、限定するものではないが、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、及びダカルバジンが挙げられる。本開示は、化学療法剤としての代謝拮抗剤を包含する。これらの型の薬剤の例としては、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン、アザチオプリン、及びプロカルバジンが挙げられる。本開示の方法及び組成物に用いてよい追加のカテゴリーの化学療法癌薬剤は、抗生物質を含む。例としては、限定するものではないが、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンC、及びダウノマイシンが挙げられる。これらの化合物のために市販されている多くのリポソーム製剤がある。本開示は、限定するものではないが、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、イホスファミド及びミトキサントロンを含む他の化学療法癌薬剤をさらに包含する。
本明細書に開示される化合物は、単独で、または本明細書に記載されるECMまたは105Fろ過液に加えて細胞毒性/抗新生物薬剤及び抗血管新生薬剤を含む他の抗腫瘍薬剤と組み合わせて、投与することができる。細胞毒性/抗新生物薬剤は、癌細胞を攻撃し殺す薬剤と定義される。いくつかの細胞毒性/抗新生物薬剤は、腫瘍細胞中の遺伝子物質をアルキル化するアルキル化剤であり、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、及びダカルバジンである。他の細胞毒性/抗新生物薬剤は、腫瘍細胞の代謝拮抗剤であり、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン、アザチオプリン、及びプロカルバジンである。他の細胞毒性/抗新生物薬剤は、抗生物質であり、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンC、及びダウノマイシンである。これらの化合物のために市販されている多くのリポソーム製剤がある。さらに他の細胞毒性/抗新生物薬剤は、有糸分裂阻害剤(ビンカアルカロイド)である。これらとしては、ビンクリスチン、ビンブラスチン及びエトポシドが挙げられる。種々の細胞毒性/抗新生物薬剤としては、タキソール及びその誘導体、L−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、VM−26、イホスファミド、ミトキサントロン、ならびにビンデシンが挙げられる。
抗血管新生薬剤は、当業者によく知られている。本開示の方法及び組成物に使用される好適な抗血管新生薬剤としては、ヒト化抗体及びキメラ抗体を含む抗VEGF抗体、抗VEGFアプタマーならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。他の公知の血管新生阻害剤としては、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン1(α及びβを含む)、インターロイキン12、レチノイン酸、ならびに組織メタロプロテイナーゼ阻害物質1及び2(TIMP−1及び−2)が挙げられる。また、トポイソメラーゼ、例えば、ラゾキサン、抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼII阻害物質を含む小分子も用いることができる。
開示される組成物と組み合わせて用いることができる他の抗癌剤としては、アシビシン;アクラルビシン;アコダゾール塩酸塩;アクロニン;アドゼレシン;アルデスロイキン;アルトレタミン;アンボマイシン;アメタントロン酢酸塩;アミノグルテチミド;アムサクリン;アナストロゾール;アントラマイシン;アスパラギナーゼ;アスペルリン;アザシチジン;アゼテパ;アゾトマイシン;バチマスタット;ベンゾデパ;ビカルタミド;ビサントレン塩酸塩;ビスナフィドメシル酸塩;ビゼレシン;ブレオマイシン硫酸塩;ブレキナルナトリウム;ブロピリミン;ブスルファン;カクチノマイシン;カルステロン;カラセミド;カルベチマー;カルボプラチン;カルムスチン;カルビシン塩酸塩;カルゼルシン;セデフィンゴール;クロラムブシル;シロレマイシン;シスプラチン;クラドリビン;クリスナトールメシル酸塩;シクロホスファミド;シタラビン;ダカルバジン;ダクチノマイシン;ダウノルビシン塩酸塩;デシタビン;デキソルマプラチン;デザグアニン;デザグアニンメシル酸塩;ジアジコン;ドセタキセル;ドキソルビシン;ドキソルビシン塩酸塩;ドロロキシフェン;ドロロキシフェンクエン酸塩;ドロモスタノロンプロピオン酸塩;ズアゾマイシン;エダトレキセート;エフロルニチン塩酸塩;エルサミトルシン;エンロプラチン;エンプロメート;エピプロピジン;エピルビシン塩酸塩;エルブロゾール;エソルビシン塩酸塩;エストラムスチン;エストラムスチンリン酸ナトリウム;エタニダゾール;エトポシド;エトポシドリン酸塩;エトプリン;ファドロゾール塩酸塩;ファザラビン;フェンレチニド;フロクスウリジン;フルダラビンリン酸塩;フルオロウラシル;フルオロシタビン;ホスキドン;フォストリエシンナトリウム;ゲムシタビン;ゲムシタビン塩酸塩;ヒドロキシ尿素;イダルビシン塩酸塩;イホスファミド;イルモホシン;インターロイキンII(遺伝子組み換えインターロイキンII、すなわちrIL2を含む)、インターフェロンα−2a;インターフェロンα−2b;インターフェロンα−n1;インターフェロンα−n3;インターフェロンβ−Ia;インターフェロンγ−Ib;イプロプラチン;イリノテカン塩酸塩;ランレオチド酢酸塩;レトロゾール;リュープロリド酢酸塩;リアロゾール塩酸塩;ロメテレキソールナトリウム;ロムスチン;ロソキサントロン塩酸塩;マソプロコール;マイタンシン;メクロレタミン塩酸塩;メゲストロール酢酸塩;メレンゲストロール酢酸塩;メルファラン;メノガリル;メルカプトプリン;メトトレキセート;メトトレキセートナトリウム;メトプリン;メツレデパ;ミチンドミド;ミトカルシン;ミトクロミン;ミトギリン;ミトマルシン;マイトマイシン;ミトスパー、ミトタン;ミトキサントロン塩酸塩;ミコフェノール酸;ノコダゾール;ノガラマイシン;オルマプラチン;オキシスラン;パクリタキセル;ペガスパルガーゼ;ペリオマイシン;ペンタムスチン;ペプロマイシン硫酸塩;ペルホスファミド;ピポプロマン;ピポスルファン;ピロキサントロン塩酸塩;プリカマイシン;プロメスタン;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニムスチン;プロカルバジン塩酸塩;ピュロマイシン;ピュロマイシン塩酸塩;ピラゾフリン;リボプリン;ログレチミド;サフィンゴール;サフィンゴール塩酸塩;セムスチン;シムトラゼン;スパルホセートナトリウム;スパルソマイシン;スピロゲルマニウム塩酸塩;スピロムスチン;スピロプラチン;ストレプトニグリン;ストレプトゾシン;スロフェヌル;タリソマイシン;テコガランナトリウム;テガフール;テロキサントロン塩酸塩;テモポルフィン;テニポシド;テロキシロン;テストラクトン;チアミプリン;チオグアニン;チオテパ;チアゾフリン;チラパザミン;トレミフェンクエン酸塩;トレストロン酢酸塩;トリシリビンリン酸塩;トリメトレキセート;トリメトレキセートグルクロン酸塩;トリプトレリン;ツブロゾール塩酸塩;ウラシルマスタード;ウレデパ;バプレオチド;ベルテポルフィン;ビンブラスチン硫酸塩;ビンクリスチン硫酸塩;ビンデシン;ビンデシン硫酸塩;ビネピジン硫酸塩;ビングリシネート硫酸塩;ビンレウロシン硫酸塩;ビノレルビン酒石酸塩;ビンロシジン硫酸塩;ビンゾリジン硫酸塩;ボロゾール;ゼニプラチン;ジノスタチン;ゾルビシン塩酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗癌薬としては、20−epi−1,25ジヒドロキシビタミンD3;5−エチニルウラシル;アビラテロン;アクラルビシン;アシルフルベン;アデシペノール;アドゼレシン;アルデスロイキン;ALL−TKアンタゴニスト;アルトレタミン;アンバムスチン;アミドックス(amidox);アミホスチン;アミノレブリン酸;アムルビシン;アムサクリン;アナグレリド;アナストロゾール;アンドログラホリド;血管新生阻害剤;アンタゴニストD;アンタゴニストG;アンタレリクス(antarelix);抗背側形態形成タンパク質−1(anti−dorsalizing morphogenetic protein−1);前立腺癌抗アンドロゲン剤;抗エストロゲン剤;アンチネオプラストン;アンチセンスオリゴヌクレオチド;アフィディコリングリシネート;アポトーシス遺伝子モジュレーター;アポトーシス制御因子;アプリン酸;ara−CDP−DL−PTBA;アルギニンデアミナーゼ;アスラクリン;アタメスタン;アトリムスチン;アキシナスタチン1;アキシナスタチン2;アキシナスタチン3;アザセトロン;アザトキシン;アザチロシン;バッカチンIII誘導体;バラノール;バチマスタット;BCR/ABLアンタゴニスト;ベンゾクロリン;ベンゾイルスタウロスポリン;ベータラクタム誘導体;β−アレチン;ベタクラマイシンB;ベツリン酸;bFGF阻害剤;ビカルタミド;ビサントレン;ビスアジリジニルスペルミン;ビスナフィド;ビストラテンA;ビゼレシン;ブレフレート;ブロピリミン;ブドチタン;ブチオニンスルホキシイミン;カルシポトリオール;カルホスチンC;カンプトテシン誘導体;カナリアポックスIL−2;カペシタビン;カルボキサミド−アミノ−トリアゾール;カルボキシアミドトリアゾール;CaRest M3;CARN 700;軟骨由来阻害物質;カルゼルシン;カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS);カスタノスペルミン;セクロピンB;セトロレリクス;クロリン(chlorln);クロロキノキサリンスルホンアミド;シカプロスト;cis−ポルフィリン;クラドリビン;クロミフェン類似体;クロトリマゾール;コリスマイシンA;コリスマイシンB;コンブレタスタチンA4;コンブレタスタチン類似体;コナゲニン;クランベシジン816(crambescidin 816);クリスナトール;クリプトフィシン8;クリプトフィシンA誘導体;クラシンA;シクロペンタンセラキノン(cyclopentanthraquinone);シクロプラタム;シペマイシン;シタラビンオクホスフェート;細胞溶解因子;シトスタチン;ダクリキシマブ;デシタビン;デヒドロジデムニンB;デスロレリン;デキサメタゾン;デキシホスファミド;デクスラゾキサン;デクスベラパミル;ジアジコン;ジデムニンB;ジドックス;ジエチルノルスペルミン;ジヒドロ−5−アザシチジン;ジヒドロタキソール、9−;ジオキサマイシン;ジフェニルスピロムスチン;ドセタキセル;ドコサノール;ドラセトロン;ドキシフルリジン;ドロロキシフェン;ドロナビノール;デュオカルマイシンSA;エブセレン;エコムスチン;エデルホシン;エドレコロマブ;エフロミチン;エレメン;エミテフール;エピルビシン;エプリステリド;エストラムスチン類似体;エストロゲンアゴニスト;エストロゲンアンタゴニスト;エタニダゾール;エトポシドリン酸;エキセメスタン;ファドロゾール;ファザラビン;フェンレチニド;フィルグラスチム;フィナステリド;フラボピリドール;フレゼラスチン;フルアステロン;フルダラビン;フルオロダウノルニシン塩酸塩;ホルフェニメクス;フォルメスタン;ホストリエシン;ホテムスチン;ガドリニウムテキサフィリン;ガリウム硝酸塩;ガロシタビン;ガニレリクス;ゼラチナーゼ阻害剤;ゲムシタビン;グルタチオン阻害剤;ヘプスルファム;ヘレグリン;ヘキサメチレンビスアセトアミド;ヒペリシン;イバンドロン酸;イダルビシン;イドキシフェン;イドラマントン;イルモホシン;イロマスタット;イミダゾアクリドン;イミキモド;免疫刺激ペプチド;インスリン様成長因子−1受容体阻害剤;インターフェロンアゴニスト;インターフェロン;インターロイキン;イオベングアン;ヨードドキソルビシン;イポメアノール,4−;イロプラクト;イルソグラジン;イソベンガゾール;イソホモハリコンドリンB;イタセトロン;ジャスプラキノリド;カハラリドF;ラメラリン−Nトリアセテート;ランレオチド;レイナマイシン;レノグラスチム;レンチナン硫酸塩;レプトルスタチン;レトロゾール;白血病阻害因子;白血球アルファインターフェロン;リュープロリド+エストロゲン+プロゲステロン;リュープロレリン;レバミゾール;リアロゾール;直鎖ポリアミン類似体;親油性二糖ペプチド;親油性白金化合物;リッソクリナミド7(lissoclinamide 7);ロバプラチン;ロンブリシン(lombricine);ロメテレキソール;ロニダミン;ロソキサントロン;ロバスタチン;ロキソリビン;ルルトテカン(lurtotecan);ルテチウムテキサフィリン;リソフィリン;溶解性ペプチド;メイタンシン(maitansine);マンノスタチンA;マリマスタット;マソプロコール;マスピン;マトリライシン阻害剤;マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤;メノガリル;メルバロン;メテレリン;メチオニナーゼ;メトクロプラミド;MIF阻害剤;ミフェプリストン;ミルテホシン;ミリモスチム;ミスマッチ二本鎖RNA;ミトグアゾン;ミトラクトール;マイトマイシン類似体;ミトナフィド;マイトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン;ミトキサントロン;モファロテン;モルグラモスチム;モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン;モノホスホリル脂質A+ミオバクテリウム細胞壁sk;モピダモール;多剤耐性遺伝子阻害剤、多発性腫瘍サプレッサー1に基づく療法;マスタード抗癌剤;ミカペルオキシドB;マイコバクテリア細胞壁抽出物;ミリアポロン;N−アセチルジナリン;N−置換ベンズアミド;ナファレリン;ナグレスチプ;ナロキソン+ペンタゾシン;ナパビン;ナフテルピン;ナルトグラスチム;ネダプラチン;ネモルビシン;ネリドロン酸;中性エンドペプチダーゼ;ニルタミド;ニサマイシン;一酸化窒素モジュレーター;ニトロキシド抗酸化剤;ニトルリン;O6−ベンジルグアニン;オクトレオチド;オキセノン;オリゴヌクレオチド;オナプリストン;オンダンセトロン;オンダンセトロン;オラシン;経口サイトカイン誘導物質、オルマプラチン;オサテロン;オキサリプラチン;オキサウノマイシン;パクリタキセル;パクリタキセル類似体;パクリタキセル誘導体;パラウアミン;パルミトイルリゾキシン;パミドロン酸;パナキシトリオール;パノミフェン;パラバクチン;パゼリプチン;ペガスパルガーゼ;ペルデシン;ペントサンポリサルフェートナトリウム;ペントスタチン;ペントロゾール;ペルフルブロン;ペルホスファミド;ペリリルアルコール;フェナジノマイシン;フェニルアセテート;ホスファターゼ阻害剤;ピシバニール;ピロカルピン塩酸;ピラルビシン;ピリトレキシム;プラセチンA;プラセチンB;プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、白金錯体;白金化合物;白金トリアミン錯体;ポルフィマーナトリウム;ポルフィロマイシン;プレドニゾン;プロピルビス−アクリドン;プロスタグランジンJ2;プロテアソーム阻害剤;タンパク質A系免疫モジュレーター;タンパク質キナーゼC阻害剤;タンパク質キナーゼC阻害剤、ミクロアルガール(microalgal);タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤;プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤;プルプリン;
ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート;rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras−GAP阻害剤;脱メチル化レテリプチン;レニウムRe186エチドロネート;リゾキシン;リボザイム;RIIレチナミド;ログレチミド;ロヒツキン;ロムルチド;ロキニメクス;ルビギノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サイントピン;SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム;Sdi 1模倣体;セムスチン;老化由来阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達モジュレーター;単鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン(sizofuran);ソブゾキサン;ホウクエン酸ナトリウム;フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール;ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン;スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンギスタチン1;スクアラミン;幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド;ストロメライシン阻害剤;スルフモシン;超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト;スラジスタ;スラミン;スワインソニン;合成グルコサミノグリカン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール、テルラピリリウム;テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;チオコラリン;トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣体;チマルファシン;サイモポエチン受容体アゴニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン;チラパザミン;二塩化チタノセン;トプセンチン;トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チロホスチン(tyrphostins);UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリンB;ベクターシステム、赤血球遺伝子療法;ベラレソール;ベラミン;ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン;バイタクシン;ボロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;及びジノスタチンスチマラマーが挙げられるが、これらに限定されない。
ピラゾロアクリジン;ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート;rafアンタゴニスト;ラルチトレキセド;ラモセトロン;rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤;ras阻害剤;ras−GAP阻害剤;脱メチル化レテリプチン;レニウムRe186エチドロネート;リゾキシン;リボザイム;RIIレチナミド;ログレチミド;ロヒツキン;ロムルチド;ロキニメクス;ルビギノンB1;ルボキシル;サフィンゴール;サイントピン;SarCNU;サルコフィトールA;サルグラモスチム;Sdi 1模倣体;セムスチン;老化由来阻害剤1;センスオリゴヌクレオチド;シグナル伝達阻害剤;シグナル伝達モジュレーター;単鎖抗原結合タンパク質;シゾフィラン(sizofuran);ソブゾキサン;ホウクエン酸ナトリウム;フェニル酢酸ナトリウム;ソルベロール;ソマトメジン結合タンパク質;ソネルミン;スパルホス酸;スピカマイシンD;スピロムスチン;スプレノペンチン;スポンギスタチン1;スクアラミン;幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤;スチピアミド;ストロメライシン阻害剤;スルフモシン;超活性血管作用性腸管ペプチドアンタゴニスト;スラジスタ;スラミン;スワインソニン;合成グルコサミノグリカン;タリムスチン;タモキシフェンメチオジド;タウロムスチン;タザロテン;テコガランナトリウム;テガフール、テルラピリリウム;テロメラーゼ阻害剤;テモポルフィン;テモゾロミド;テニポシド;テトラクロロデカオキシド;テトラゾミン;タリブラスチン;チオコラリン;トロンボポエチン;トロンボポエチン模倣体;チマルファシン;サイモポエチン受容体アゴニスト;チモトリナン;甲状腺刺激ホルモン;スズエチルエチオプルプリン;チラパザミン;二塩化チタノセン;トプセンチン;トレミフェン;全能性幹細胞因子;翻訳阻害剤;トレチノイン;トリアセチルウリジン;トリシリビン;トリメトレキセート;トリプトレリン;トロピセトロン;ツロステリド;チロシンキナーゼ阻害剤;チロホスチン(tyrphostins);UBC阻害剤;ウベニメクス;尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト;バプレオチド;バリオリンB;ベクターシステム、赤血球遺伝子療法;ベラレソール;ベラミン;ベルジン;ベルテポルフィン;ビノレルビン;ビンキサルチン;バイタクシン;ボロゾール;ザノテロン;ゼニプラチン;ジラスコルブ;及びジノスタチンスチマラマーが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「有効量」は、本明細書に用いられる場合、「所望のまたは治療の結果を実現するために必要な投与及び期間で有効な、1種以上の薬剤及び/または105F及び/またはECMの量」を意味する。有効量は、当該技術分野で知られる要因、例えば、治療されるヒトまたは動物の疾患状態、年齢、性別、及び体重に応じて変えてよい。特定の投薬計画が本明細書の実施例に記載されているが、当業者であれば、投薬計画を最適な治療反応をもたらすように変えてよいことを理解するであろう。このため、正確な「有効量」を明示することはできない。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよいし、あるいは、治療状況の緊急性によって示されるとおり、用量を比例的に減少させてもよい。さらに、本開示の組成物を、治療量を実現するのに必要なくらい頻繁に投与することができる。
本明細書に記載される方法及び組成物は、急性リンパ芽球性;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;副腎皮質癌、小児;虫垂癌;基底細胞癌;胆管癌、肝外;膀胱癌;骨癌;骨肉腫及び悪性線維性組織球腫;脳幹神経膠腫、小児;脳腫瘍、成人;脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児;脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、小児;中枢神経系胚芽腫;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫;頭蓋咽頭腫;上衣芽腫;上衣腫;髄芽腫;髄様上皮腫;中間型松果体実質腫瘍;テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽腫;視覚路及び視床下部神経膠腫;脳及び脊髄腫瘍;乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;カルチノイド腫瘍;カルチノイド腫瘍、消化管;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;中枢神経系リンパ腫;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児;子宮頚癌;脊索腫、小児;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;眼癌、眼球内黒色腫;眼癌、網膜芽細胞腫;胆嚢癌;胃癌(Gastric(Stomach) Cancer);消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);胚細胞腫瘍、頭蓋外;胚細胞腫瘍、性腺外;胚細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;神経膠腫、小児脳幹;神経膠腫、小児大脳星状細胞腫;神経膠腫、小児視覚路及び視床下部;有毛細胞白血病;頭頚部癌;肝細胞(肝臓)癌;組織球症、ランゲルハンス細胞;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視覚路神経膠腫;眼球内黒色腫;島細胞腫瘍;腎臓(腎細胞)癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;白血病、急性リンパ芽球性;白血病、急性骨髄性;白血病、慢性リンパ球性;白血病、慢性骨髄性;白血病、有毛細胞;口唇及び口腔内癌;肝臓癌;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、AIDS関連;リンパ腫、バーキット;リンパ腫、皮膚T細胞;リンパ腫、ホジキン;リンパ腫、非ホジキン;リンパ腫、原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム;骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫;髄芽腫;黒色腫;黒色腫、眼球内(眼);メルケル細胞癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腺腫症候群、(小児);多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性;骨髄増殖性疾患、慢性;鼻腔及び副鼻腔癌;鼻咽腔癌;神経芽細胞腫;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔内癌;中咽頭癌;骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵癌;膵癌、島細胞腫瘍;乳頭腫;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞(腎臓)癌;腎盂及び尿管、移行細胞癌;第15染色体上のNUT遺伝子に関連する気道癌;網膜芽細胞腫;横絞筋肉腫;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;肉腫、カポジ;肉腫、軟組織;肉腫、子宮;セザリー症候群;皮膚癌(非黒色腫性);皮膚癌(黒色腫);皮膚癌、メルケル細胞;小細胞肺癌;小腸癌;軟組織肉腫;扁平上皮細胞癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;腎盂及び尿管の移行細胞癌;絨毛性腫瘍、妊娠性;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍から選択される癌に有用である。
別の実施形態では、本発明の低分子量ろ過液105Fが、対象におけるT細胞反応の刺激に有用である。T細胞の活性化は、免疫系の重要な側面である。T細胞活性化は、例えば、感染性物質に対する特異的免疫反応のために必要とされる。T細胞活性化は、また、腫瘍免疫ならびに自己免疫障害及び炎症性障害で重要な役割を果たす。T細胞活性化は、T細胞のT細胞抗原受容体(TCR)が、主要組織適合複合体(MHC)分子でその特異的抗原(Ag)を認識したときに開始する。免疫細胞機能(例えば、リンパ球増殖、サイトカイン生成、または抗体生成)を調節するために、インビトロ(エクスビボ)での細胞培養で低分子量ろ過液またはその組成物を用いることができる。特に、1つ以上の免疫細胞機能を調節するために、本発明の組成物と細胞を接触させてよい。さらに、ある特定の疾患、例えば、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び移殖片拒絶を予防する、治療するまたは管理するために本発明の組成物を対象に投与することができる。
1つの態様では、免疫系障害は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、全身性硬化症、皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、IgA腎症、膜性腎症、EBV感染症または悪性貧血である。
記載される用途のために企図された細胞外マトリックス組成物及び低分子量ろ過液(105F)の作製を記載している実施例を以下に示す。以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに示すために提供されており、本発明の範囲を限定することを意図しない。これらは、用いてよいものの典型であるが、当業者に知られる他の方法、方法論、または技術を代わりに用いてもよい。
実施例1
低酸素条件下で成長させたECM組成物中の差次的な遺伝子発現
組織培養フラスコ中で標準的な単層として初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を培養し、自然に沈着した胎児様ECM内の三次元線維芽細胞培養物と比較した。本明細書に開示されるとおりに培養物を成長させた。遺伝子の差次的発現を評価するために、製造者のプロトコールに従って、全般的遺伝子発現(40,000未満の遺伝子を含む)のためのAgilent Whole Human Genome Oligo Microarrays(登録商標)を用いて、全RNAの試料をそろえた。
低酸素条件下で成長させたECM組成物中の差次的な遺伝子発現
組織培養フラスコ中で標準的な単層として初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を培養し、自然に沈着した胎児様ECM内の三次元線維芽細胞培養物と比較した。本明細書に開示されるとおりに培養物を成長させた。遺伝子の差次的発現を評価するために、製造者のプロトコールに従って、全般的遺伝子発現(40,000未満の遺伝子を含む)のためのAgilent Whole Human Genome Oligo Microarrays(登録商標)を用いて、全RNAの試料をそろえた。
比較すると、線維芽細胞が、低酸素培養され自然分泌されたECM内の三次元培養物中でコラーゲン及びECMの遺伝子発現を制御することがわかった。さまざまなコラーゲン及びECM遺伝子の発現のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションが、表3において明白である。
比較すると、線維芽細胞が、低酸素培養され自然分泌されたECM内の三次元培養物中でWnt経路遺伝子の遺伝子発現を制御することがわかった。さまざまなWnt経路遺伝子の発現のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションが、表4において明白である。
比較すると、線維芽細胞が、低酸素培養され自然分泌されたECM内の三次元培養物中で骨形成タンパク質(BMP)経路遺伝子の遺伝子発現を制御することがわかった。さまざまなBMP経路遺伝子の発現のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションが、表5において明白である。
比較すると、線維芽細胞が、低酸素培養され自然分泌されたECM内の三次元培養物中でさらなる遺伝子の発現を制御することがわかった。さらなる遺伝子の発現のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションが、表6において明白である。
実施例2
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いる低酸素ECMの生成
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いるECMの低酸素培養について2つの実施例を提供する。
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いる低酸素ECMの生成
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いるECMの低酸素培養について2つの実施例を提供する。
2mM L−グルタミンを含む10%ウシ胎仔血清、90%高グルコースDMEM(10%FBS/DMEM)の存在下で、組織培養フラスコ中で初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を増殖させた。0.05%トリプシン/EDTA溶液を用いて細胞を3回目の継代まで植え継ぎ培養し、その時点で、それらをCytodex−1デキストランビーズに0.04mg乾燥ビーズ/ml培地(100〜120mlを充填した125mlスピナーフラスコ中5e6細胞/l0mgビーズ)で、またはナイロンメッシュ(25e6細胞/6x100cm2ナイロン)に播種した。全培養物は、増殖及び播種のために通常の大気及び5%CO2中に維持したが、低酸素培養物はその時点で、培養培地内に低酸素環境が作られ得るように95%窒素/5%CO2で満たされた密閉チェンバーに分割した。このシステムを、培養容器内の酸素約1〜5%で維持する。播種のためにナイロンまたはビーズを覆うのに必要な最小の容積中で細胞をよく混合し、続いて、これを30分後に一回混合し、その後、一晩、加湿した37℃のインキュベーター中に静置させた。2〜3日ごとに50〜70%の培地を交換しながら、培養物に2〜4週間、10%FBS/DMEMを栄養供給すると、その間に細胞が増殖し、その後、ECMの沈着が開始した。さらに4〜6週間、FBSの代わりに鉄サプリメントを含む10%仔ウシ血清及び20ug/mlアスコルビン酸を用いて培養物に栄養供給を行った。スピナーフラスコを最初に及び約2〜4週間、15〜25rpmで混合し、その時点で45rpmに増大させ、その後、この速度を維持した。ビーズ培養物は、4週間後に、幅及び直径が0.5〜1.0cmほどのECMを含有する大きな不定形構造を形成し、それゆえこれらの培養物は、ガス拡散及び高い代謝性要求のために低酸素状態であった。
さらなる実施例では、単層フラスコ中で初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を増殖させ、その後、インビトロでの細胞外マトリックス(ECM)の成長を支持するためのナイロンメッシュ足場上で培養した。高グルコース、2mM L−グルタミン、及び10%(v/v)ウシ胎仔血清を含むDMEM中で線維芽細胞を増殖させた。また、培養物に、20μg/mlアスコルビン酸を補充した。周囲酸素(酸素およそ16%〜20%)中で3週間後に、2つ組のECM含有培養物を、95%窒素/5%二酸化炭素で十分に流した密封チェンバー(Cat.#MC−101、Billups−Rothenberg、Inc.、Del Mar、CA)において低酸素培養条件(酸素1%〜5%)に切り替えた。培養培地からの大気酸素の枯渇を確実にするために、2〜3時間後に、大気を交換し、培地におよそ1〜3%の酸素が含まれることを確実にした。ECM含有培養物の両セットをさらに4週間、1週間に2回の栄養供給を行いながら成長させ、その後、培養物をRNA単離のために調製した。市販されているキットを製造者指示書に従って用いて(Cat.#Z3100、Promega、Inc.)、全細胞RNAを単離した。Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays(登録商標)を用いる遺伝子発現のマイクロアレイ分析のために処理する前に、精製したRNA試料を−80℃で保存した。
結果の分析では、Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays(登録商標)を用いて、低酸素培養物からのプローブと比較して周囲酸素から調製されたプローブから検出され、差次的に発現された転写物が、およそ5,500種存在した。これらのうち、約半分(2,500種)は、低酸素により2.0倍超増大しており、約半分(2,500種)は、低酸素で2.0倍超減少していた。これは、低酸素が、インビトロでの遺伝子発現に顕著な変化をもたらしたことを示す。特に興味深いのは、ECMタンパク質の転写物、特にいくつかのコラーゲン遺伝子がアップレギュレートされ、一方、マトリックス分解酵素のいくつかの遺伝子がダウンレギュレートされた。
実施例3
治療的用途のための組織工学的ヒト胚性細胞外マトリックス
胚性細胞外マトリックス(ECM)は、瘢痕または癒着の形成なしで急速な細胞増殖及び治癒を促す環境を作る。3次元でのヒト新生児線維芽細胞の成長が、血管形成前の初期胚性環境をシミュレートする条件(低酸素及び重力の減少)下で、胎児性特性を有するECMを作製すると仮定した。遺伝子チップアレイ分析が、従来の組織培養条件に比べて低酸素の組織培養条件の下での、5000種を超える遺伝子の差次的発現を示した。生成されたECMは、III型、IV型、及びV型コラーゲン、ならびに糖タンパク質、例えばフィブロネクチン、SPARC、トロンボスポンジン、ならびにヒアルロン酸が比較的豊富であるという点で胎児間葉組織と類似していた。ECMはまた、鍵となる成長因子によって再生幹細胞集団を支持する推定上のニッチにおける成長因子の結合及び提示に重要な制御的役割を果たすため、本発明者らは、培養下の胎児様ECMの成長中の成長因子発現に及ぼす低酸素の効果を評価した。低酸素は、また、創傷治癒及び器官形成を制御する因子、例えばVEGF、FGF−7、及びTGF−β、ならびにwnt 2b、4、7a、10a、及び11を含む複数のwntの発現を高めることができる。胚性ヒトECMは、また、MTTアッセイを用いて酵素活性の増大によって測定されるとおり、インビトロでヒト線維芽細胞中の代謝活性の増大を刺激した。さらに、本発明者らは、ヒトECMに反応した細胞数の増大を検出した。このヒトECMは、瘢痕または癒着なしに新たな組織を成長させ治癒するというさまざまな治療的用途での、生物学的な表面コーティング及び組織フィラー処置剤として用いることができる。
治療的用途のための組織工学的ヒト胚性細胞外マトリックス
胚性細胞外マトリックス(ECM)は、瘢痕または癒着の形成なしで急速な細胞増殖及び治癒を促す環境を作る。3次元でのヒト新生児線維芽細胞の成長が、血管形成前の初期胚性環境をシミュレートする条件(低酸素及び重力の減少)下で、胎児性特性を有するECMを作製すると仮定した。遺伝子チップアレイ分析が、従来の組織培養条件に比べて低酸素の組織培養条件の下での、5000種を超える遺伝子の差次的発現を示した。生成されたECMは、III型、IV型、及びV型コラーゲン、ならびに糖タンパク質、例えばフィブロネクチン、SPARC、トロンボスポンジン、ならびにヒアルロン酸が比較的豊富であるという点で胎児間葉組織と類似していた。ECMはまた、鍵となる成長因子によって再生幹細胞集団を支持する推定上のニッチにおける成長因子の結合及び提示に重要な制御的役割を果たすため、本発明者らは、培養下の胎児様ECMの成長中の成長因子発現に及ぼす低酸素の効果を評価した。低酸素は、また、創傷治癒及び器官形成を制御する因子、例えばVEGF、FGF−7、及びTGF−β、ならびにwnt 2b、4、7a、10a、及び11を含む複数のwntの発現を高めることができる。胚性ヒトECMは、また、MTTアッセイを用いて酵素活性の増大によって測定されるとおり、インビトロでヒト線維芽細胞中の代謝活性の増大を刺激した。さらに、本発明者らは、ヒトECMに反応した細胞数の増大を検出した。このヒトECMは、瘢痕または癒着なしに新たな組織を成長させ治癒するというさまざまな治療的用途での、生物学的な表面コーティング及び組織フィラー処置剤として用いることができる。
実施例4
再生医療用途のための天然可溶性Wnt活性の生成
成体組織、例えば、皮膚または血液を再生することができる幹細胞または前駆細胞は、胚発生をある程度繰り返し、この再生を実現する。さらに多くの研究により、胚発生中の幹細胞多能性及び系統特異的分化活性の鍵となる制御因子は、ある特定の環境下で成体において再発現されることが示されている。分泌型の形態形成成長及び発生因子のWNTファミリーは、有益な研究ツール、及び最終的に診療所での治療的処置を提供する可能性のある成長因子の1つである。しかし、Wntは、現在までに、商業規模での標準的な遺伝子組み換え発現及び精製技術で処理しにくいことが判明しており、WNTに基づく製品の臨床開発を可能にする大規模なWNTタンパク質の生成の報告はない。三次元の組織等価物を作製するために培養下でさまざまな足場に新生児ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、培養下で胎児様ECMを成長させるための技術が開発されている。本プロセスでは、これらの培養物が、ECM生成に用いられる無血清馴化培地中に含有される生物活性WNTの商業規模の供給源をもたらすことができることが発見された。本発明者らは、このWNT製品候補のデータをここに示す。
再生医療用途のための天然可溶性Wnt活性の生成
成体組織、例えば、皮膚または血液を再生することができる幹細胞または前駆細胞は、胚発生をある程度繰り返し、この再生を実現する。さらに多くの研究により、胚発生中の幹細胞多能性及び系統特異的分化活性の鍵となる制御因子は、ある特定の環境下で成体において再発現されることが示されている。分泌型の形態形成成長及び発生因子のWNTファミリーは、有益な研究ツール、及び最終的に診療所での治療的処置を提供する可能性のある成長因子の1つである。しかし、Wntは、現在までに、商業規模での標準的な遺伝子組み換え発現及び精製技術で処理しにくいことが判明しており、WNTに基づく製品の臨床開発を可能にする大規模なWNTタンパク質の生成の報告はない。三次元の組織等価物を作製するために培養下でさまざまな足場に新生児ヒト皮膚線維芽細胞を用いて、培養下で胎児様ECMを成長させるための技術が開発されている。本プロセスでは、これらの培養物が、ECM生成に用いられる無血清馴化培地中に含有される生物活性WNTの商業規模の供給源をもたらすことができることが発見された。本発明者らは、このWNT製品候補のデータをここに示す。
細胞の遺伝子発現分析では、少なくとも3つのWNT遺伝子が発現され(wnt5a、wnt7a、及びwnt11)、かつwntシグナリングに関連する少数の遺伝子が同様に発現されたことを示した;しかし、それらの機能は完全には理解されていない。遺伝子発現データをwntシグナリングのインビトロバイオアッセイ(初代ヒト表皮ケラチノサイトにおけるβ−カテニンの核移行)に拡張し、血液幹細胞に及ぼすwnt活性を評価した。両アッセイとも古典的wnt活性と一致した活性を示した。さらに、これらの培養物からの馴化培地が、マウスの皮膚中に注射された場合にwnt活性を示し、毛包幹細胞が成長期に入るのを誘発し、この結果、髪を成長させた。これは、規定の無血清条件培地内の安定化されたWNT活性には精製は必要でなかったことを示す。この生成物を、毛包再生のために、及びさまざまなヒト幹細胞の培養のための有益な研究ツールとして、用いることができる。
実施例5
低酸素線維芽細胞は特有のECM生成及び成長因子発現を示す
ヒト新生児皮膚線維芽細胞が、インビトロで培養される場合、真皮に非常に似ており、創傷治癒などの再生医療用途で損傷を受けた真皮に取って代わることができるECMを生成する。創傷治癒のプロセスは、また、胚発生を繰り返すため、本発明者らは、胚性環境をシミュレートすることによって、生成されるECMが組織再生用途のためのECMの向上をもたらすと仮定する。したがって、ヒト新生児線維芽細胞由来ECMを、培養液中、低酸素条件下で成長させ、血管形成前の初期胚中に存在する低酸素をシミュレートした。目標は、培養下の組織成長中に低酸素条件を用いて、胎児性特性を有するECMを作製することであった。
低酸素線維芽細胞は特有のECM生成及び成長因子発現を示す
ヒト新生児皮膚線維芽細胞が、インビトロで培養される場合、真皮に非常に似ており、創傷治癒などの再生医療用途で損傷を受けた真皮に取って代わることができるECMを生成する。創傷治癒のプロセスは、また、胚発生を繰り返すため、本発明者らは、胚性環境をシミュレートすることによって、生成されるECMが組織再生用途のためのECMの向上をもたらすと仮定する。したがって、ヒト新生児線維芽細胞由来ECMを、培養液中、低酸素条件下で成長させ、血管形成前の初期胚中に存在する低酸素をシミュレートした。目標は、培養下の組織成長中に低酸素条件を用いて、胎児性特性を有するECMを作製することであった。
これらの低酸素培養物中で生成されたECMは、III型及びV型コラーゲン、ならびに糖タンパク質、例えばフィブロネクチン、SPARC、トロンボスポンジン、ならびにヒアルロン酸が比較的豊富であるという点で胎児間葉組織と類似していた。ECMはまた、鍵となる成長因子によって再生幹細胞集団を支持する推定上のニッチにおける成長因子の結合及び提示に重要な制御的役割を果たすため、本発明者らは、培養下の胎児様ECMの成長中の成長因子発現に及ぼす低酸素の効果を評価した。低酸素が、また、創傷治癒及び器官形成を制御する因子、例えばVEGF、FGF−7、及びTGF−βの発現を高めることができることを示した。
ヒトECMは、また、MTTアッセイを用いて酵素活性の増大によって測定されるとおり、インビトロでヒト線維芽細胞中の代謝活性の増大を刺激した。さらに、ヒトECMに反応した細胞数の増大を検出した。これらの結果はこのヒトECMの、胚細胞培養におけるコーティング/足場としての使用、及びさまざまな治療的用途または医療用装置での生物学的な表面コーティング/フィラーとしての使用を支持する。
実施例6
黒色腫、神経膠腫、及び乳癌における細胞外マトリックス組成物
受精鶏卵絨毛尿膜アッセイ(CAM)において、ECMの存在下または非存在下での、かつシスプラチンありまたはなしでの、B16(黒色腫細胞株)、C6(神経膠腫細胞株)、及びMDA435(乳癌細胞株)細胞の腫瘍成長を調べた。簡潔にいうと、生存可能性について卵を明りに透かして調べた。気室をずらして、卵の赤道で卵殻と絨毛尿膜との間に気泡(blister)作った。卵殻を切って窓を開け、CAMへのアクセスを得た。以下のとおりCAMに細胞を添加した:B16細胞、1つの卵当たり500万個;C6細胞、1つの卵当たり500万個;及びMD435細胞、1つの卵当たり500万個。ECMで処理する卵では、ECM(およそ100μg/処理)及び細胞を卵に同時に添加した。シスプラチンで処理する卵では、シスプラチン(250μLの1mg/mLシスプラチン溶液)を翌日に局所的に添加した。10日間、卵をインキュべートし、その時点で腫瘍を切除し、重量を計測した。
黒色腫、神経膠腫、及び乳癌における細胞外マトリックス組成物
受精鶏卵絨毛尿膜アッセイ(CAM)において、ECMの存在下または非存在下での、かつシスプラチンありまたはなしでの、B16(黒色腫細胞株)、C6(神経膠腫細胞株)、及びMDA435(乳癌細胞株)細胞の腫瘍成長を調べた。簡潔にいうと、生存可能性について卵を明りに透かして調べた。気室をずらして、卵の赤道で卵殻と絨毛尿膜との間に気泡(blister)作った。卵殻を切って窓を開け、CAMへのアクセスを得た。以下のとおりCAMに細胞を添加した:B16細胞、1つの卵当たり500万個;C6細胞、1つの卵当たり500万個;及びMD435細胞、1つの卵当たり500万個。ECMで処理する卵では、ECM(およそ100μg/処理)及び細胞を卵に同時に添加した。シスプラチンで処理する卵では、シスプラチン(250μLの1mg/mLシスプラチン溶液)を翌日に局所的に添加した。10日間、卵をインキュべートし、その時点で腫瘍を切除し、重量を計測した。
ECMの存在によって腫瘍塊が有意に減少した。図1及び2は、B16細胞によって生成される腫瘍の重量が、ECMの非存在下と比べてECMの存在下で減少したことを示す。また、腫瘍の重量は、腫瘍細胞をECMと混合したかまたはECM上で成長させたかに関わらず減少した(図3)。図4及び5は、C6細胞によって生成される腫瘍の重量が、処理なしと比べてECMの存在下で減少したことを示す。さらに、シスプラチンとECMの存在下で、腫瘍重量がさらに減少した。図7は、MDA435乳癌細胞によって生成される腫瘍の重量が、処理なしと比べてECMの存在下で減少し、シスプラチンとECMによってさらに減少したことを示す。
別のCAMアッセイでは、B16細胞を用量100μLのBioNeusis(10mg/mL)とともに卵(細胞200〜300万個/卵)に注入した。BioNuesisは、ECMを作製するために用いられるバイオリアクター中の線維芽細胞によって馴化された培地であり、液体形態のみでECMに非常に類似している。図16は、CAMアッセイにおける腫瘍成長が、処理なしと比較してBioNeusisの存在下で減少したことを示す。さらなる試験では、漸増濃度の液体ECMの存在下でB16細胞を成長させ、全濃度のECMで成長が減少した(図17)。別の試験では、B16細胞をCAMアッセイにおいて、未分画液体ECM中で成長させたB16細胞と比較して、さまざまな分子量画分の液体ECM中で成長させた。100,000超ダルトンの画分を除く全分子量画分が、未分画ECMと比較して、腫瘍塊のパーセント減少の増大を示した(図18)。
ヌードマウスにおいて、ECMの存在下または非存在下での、かつシスプラチンありまたはなしでの、B16細胞、C6細胞、またはMDA435細胞の腫瘍成長を調べた。細胞、ECM及びシスプラチンを、ヌードマウスの臀部下側に同時に皮下注射した。写真、長さ及び幅の測定値を用いて、その後最終的に重量によって、経時的に腫瘍成長を追跡した。図8及び9は、注射後第14日のECMの存在下(図9)及び非存在下(図8)でのヌードマウスにおけるC6細胞からの腫瘍の成長を示す。図10及び11は、注射後第14日のシスプラチンありのECMの存在下(図10)及びECMなしのシスプラチンの存在下(図11)でのヌードマウスにおけるC6細胞からの腫瘍の成長を示す。触診できる腫瘍を形成した対照(処理なし)と比較して、ECMとともに成長させた細胞は、腫瘍成長の減少または腫瘍成長のないことを示した。図12は、18日間にわたる腫瘍成長のグラフを示し、ECMで処理したマウスが、処理なしの対照と比較して、腫瘍成長の減少を示し、シスプラチンで処理したマウスが、ECMの有無にかかわらず、成長のないことを示した。類似の試験で、ECMとともに(図13B)、ECMに加えてシスプラチンとともに(図13C)、またはシスプラチン単独で(図13D)成長させたMDA435細胞が、触診できる腫瘍を形成した処理なしの対照(図13A)と比較して、腫瘍成長の減少または腫瘍成長のないことを示した。図14は、25日間にわたる腫瘍成長のグラフを示し、ECMで処理したマウスが、処理なしの対照と比較して、腫瘍成長の減少を示した。シスプラチンで処理したマウスが、ECMの有無にかかわらず、腫瘍塊の減少から何もないことまでを示した。図15は、ECMあり(右側)またはECMなし(左側)でヌードマウスにおいて成長したB16細胞の結果を示し、腫瘍成長はECMの存在下で阻害された。
実施例7
ECMからの低分子量ろ過液の調製
ECM中の活性成分をさらに限定するために、新生児皮膚線維芽細胞の攪拌バイオリアクターからの馴化培地から、分子量5K未満の限外ろ過液を生成した(「105F」とも称される)。精製プロトコールは、以下のとおりであった。
ECMからの低分子量ろ過液の調製
ECM中の活性成分をさらに限定するために、新生児皮膚線維芽細胞の攪拌バイオリアクターからの馴化培地から、分子量5K未満の限外ろ過液を生成した(「105F」とも称される)。精製プロトコールは、以下のとおりであった。
Heparin Sepharose 6 fast flow(GE Healthcare):20mlカラム
結合緩衝剤:50mM トリス/HCl、0.2M NaCl、pH7.4
洗浄緩衝剤:50mM トリス/HCl、0.2M NaCl、pH7.4
溶離緩衝剤:50mM トリス/HCl、1.0M NaCl、pH7.4
流速:およそ30ml/時間(自然流下)
画分サイズ:5ml
C57bl6マウスにおいてB16肺モデルを用いて、CD8+である腫瘍浸潤リンパ球(TIL)が顕著に存在することを観察した。さらに、TILが、免疫抑制性でないが細胞毒性であることを示すPD−1陰性であった。これらのデータは、皮下B16マウスモデルでも再現された。ろ過液のPD−1発現に対する効果は、PD−1のリガンドであるPDL−1の抗原提示細胞上での発現に影響を及ぼさないと思われる。これらのデータは、当該ろ過液が、汎免疫調節効果とは対照的に、特異的なT細胞効果を有する可能性があることを示す。
方法
B16肺モデル
C57bl6マウスに、B16マウス黒色腫細胞(5x105個)を静脈注射した。100ulの毎日の静脈内の処理(100ul、静脈内)を翌日開始し、試験の間継続した。試験期間は、マウスの状態及び疾患の進行に応じて、2.5〜3週間であった。剖検では、肺葉を分割し、半分を通常の緩衝ホルマリンに固定し、半分をOCTに凍結した。明視野顕微鏡を用いて、表面上の腫瘍の数をカウントした。
B16肺モデル
C57bl6マウスに、B16マウス黒色腫細胞(5x105個)を静脈注射した。100ulの毎日の静脈内の処理(100ul、静脈内)を翌日開始し、試験の間継続した。試験期間は、マウスの状態及び疾患の進行に応じて、2.5〜3週間であった。剖検では、肺葉を分割し、半分を通常の緩衝ホルマリンに固定し、半分をOCTに凍結した。明視野顕微鏡を用いて、表面上の腫瘍の数をカウントした。
B16皮下モデル
C57bl6マウスに、B16マウス黒色腫細胞(1x106個)を皮下注射した。一旦、腫瘍が触診できるサイズに達したら、試験の間、1週間に2回のろ過液の腫瘍内注射を開始した(0.5mL)。病的状態になる前に、マウスを殺処分した。腫瘍を処理し、半分を通常の緩衝ホルマリンに固定し、半分をOCTに凍結した。
C57bl6マウスに、B16マウス黒色腫細胞(1x106個)を皮下注射した。一旦、腫瘍が触診できるサイズに達したら、試験の間、1週間に2回のろ過液の腫瘍内注射を開始した(0.5mL)。病的状態になる前に、マウスを殺処分した。腫瘍を処理し、半分を通常の緩衝ホルマリンに固定し、半分をOCTに凍結した。
組織学
パラフィン包埋切片及び凍結切片上で、標準H&E染色ならびに免疫組織化学(IHC)を実施した。
パラフィン包埋切片及び凍結切片上で、標準H&E染色ならびに免疫組織化学(IHC)を実施した。
結果
B16細胞の静脈内注射は、浸襲性転移性疾患状態をもたらした。各肺には、100を超える腫瘍があった。ろ過液処理により、腫瘍の播種及び成長が、ほとんどの場合75%超、有意に減少する(図19)。
B16細胞の静脈内注射は、浸襲性転移性疾患状態をもたらした。各肺には、100を超える腫瘍があった。ろ過液処理により、腫瘍の播種及び成長が、ほとんどの場合75%超、有意に減少する(図19)。
H&E染色した切片の組織学的試験では、腫瘍のサイズ及び数の差を示す(図20)。
抗マウスCD8+抗体を用いて、TIL侵入のレベルを示す。ろ過液で処理されたマウスでは、ビヒクルと比較して、T細胞の腫瘍内注入が非常に増大した(図21)。
TIL活性の増大が示されたため、T細胞の活性化状態を調べた。抗マウスPD−1抗体を用いて、侵入T細胞がPD−1陰性であったことが示された。これは、T細胞が免疫抑制されていなかったことを示す。この結果は、ろ過液を腫瘍内注射した皮下モデルで再現された(図22、黒い矢が陽性PD−1染色を示す)。
この結果が、ろ過液の特定のロットまたは調製に限定されないことを示すために、異なるロットの出発物質及び異なる濃縮装置を用いて、異なる調製を試験した。このロットでは、オリジナルのろ過液と同様に、B16肺−転移モデルにおいて同じTIL及びPD−1プロフィールが観察された。これらのデータは、さまざまな生成方法を用いてもろ過液中の活性成分が一致していることを示す。
ろ過液が、修飾免疫細胞すべてに影響を及ぼすかどうかを決定するために、抗PDL−1を用いて、マウス肺切片を染色した。PD−1の結果が再現され、処理したものでは陰性であり対照では陽性であったが、リガンドであるPDL−1の染色は変わらなかった(図23)。これらのデータは、ろ過液活性がT細胞に集中し、抗原提示細胞へは作用しない可能性があることを示しており、これも、腫瘍の免疫抑制された状態に有意に寄与する。
考察
これまでの試験は、ろ過液がアポトーシスを誘発する効果を示している。これらの試験では、ろ過液で処理したマウス肺中のB16の転移性負荷が、75%超減少した。これらのデータは、また、ろ過液中の活性成分が、腫瘍におけるCD8+T細胞の侵入に効果があったことを示す。侵入しているT細胞の活性化状態は、PD−1陰性であった。これは、TILが、ろ過液によって免疫抑制性ではなく細胞毒性であったことを示唆している。
これまでの試験は、ろ過液がアポトーシスを誘発する効果を示している。これらの試験では、ろ過液で処理したマウス肺中のB16の転移性負荷が、75%超減少した。これらのデータは、また、ろ過液中の活性成分が、腫瘍におけるCD8+T細胞の侵入に効果があったことを示す。侵入しているT細胞の活性化状態は、PD−1陰性であった。これは、TILが、ろ過液によって免疫抑制性ではなく細胞毒性であったことを示唆している。
実施例8
膵癌、卵巣癌、胃癌及び肝臓癌をはじめとする、限定された治療の成功及び高死亡率を有する癌を標的として、105Fを用いたインビトロ及びインビボの試験を実施した。生活の質及び寿命の改善をもたらす、腹水(腹部液体蓄積)の減少及び腫瘍サイズの減少という有効性尺度を観察した。105Fは、有意に腫瘍負荷を減少させ、生存を延長し、インビトロならびに動物モデルの双方で21超のヒト癌細胞株を阻害することを示した。
膵癌、卵巣癌、胃癌及び肝臓癌をはじめとする、限定された治療の成功及び高死亡率を有する癌を標的として、105Fを用いたインビトロ及びインビボの試験を実施した。生活の質及び寿命の改善をもたらす、腹水(腹部液体蓄積)の減少及び腫瘍サイズの減少という有効性尺度を観察した。105Fは、有意に腫瘍負荷を減少させ、生存を延長し、インビトロならびに動物モデルの双方で21超のヒト癌細胞株を阻害することを示した。
インビトロもしくはインビボで、または双方で、以下の細胞株で105Fを試験した。
MTTアッセイにおいて4mg/mlでMDA435ヒト乳房の増殖の50%減少
3mg/mlでMDA231ヒト乳房60%
マウスモデルにおいてHT29ヒト結腸腺癌65%減少
4mg/mlでHCT116ヒト結腸腺癌20%
4mg/mlでOVCARヒト卵巣癌20%
4mg/mlでC33aヒト子宮頚癌20%
4mg/mlでPC3ヒト前立腺癌55%;METCAMの50%減少(転移細胞接着分子/MUC18(METCAM)、すなわちIg様遺伝子スーパーファミリー中の細胞接着分子は、前立腺癌細胞進行の鍵となる決定因子である)。
PC3−CTC循環腫瘍細胞のMETCAM80%減少
3mg/mlでPanc1膵管癌20%
3mg/mlでMiaPaca膵癌60%
3mg/mlでOST1骨肉腫40%
C6マウス神経膠腫CAM58+/1.5%;SQマウス61+/2.9%(SQ−皮下)
4mg/mlでSCC扁平細胞癌90%
8mg/mlでB16マウス黒色腫50%;60+/3.2%SQマウス;67+/0.7%CAM
8mg/mlでMESOヒト中皮腫50%
4mg/mlでNUGCヒト胃癌50%
0.5mg/mlでC918、D04、MM485、MEL202 50%
実施例9
黒色腫及び膵細胞株において画分105Fで処理した細胞の遺伝子発現を試験した。経路分析では、wntシグナリング、アポトーシス、血管新生、インターロイキン及びサイトカインシグナリング、炎症及びTLRシグナリングを示す(図24Aを参照)。分子機能経路分析では、105Fが、結合モチーフ及び受容体活性、ならびに癌に関連がある触媒及び酵素制御機能に関係する「活性」において強化されていることを確認した。これは、また、単一経路だけに影響を及ぼす単一小分子でなく、105F画分成分の生物学的機能であることと一致している(図24Bを参照)。
黒色腫及び膵細胞株において画分105Fで処理した細胞の遺伝子発現を試験した。経路分析では、wntシグナリング、アポトーシス、血管新生、インターロイキン及びサイトカインシグナリング、炎症及びTLRシグナリングを示す(図24Aを参照)。分子機能経路分析では、105Fが、結合モチーフ及び受容体活性、ならびに癌に関連がある触媒及び酵素制御機能に関係する「活性」において強化されていることを確認した。これは、また、単一経路だけに影響を及ぼす単一小分子でなく、105F画分成分の生物学的機能であることと一致している(図24Bを参照)。
タンパク質クラスの分析は、これまでの分子機能の結果と類似している。活性成分の大半が分泌されるものであり、したがって、これらの活性のおよそ50%が細胞外領域と関連するという知見が理解できる。また、本発明者らは、細胞内細胞部分及び細胞小器官を同定したが、高密度細胞培養物中の能動輸送とは対照的に常にいくらかのレベルの放出があるため、馴化培地中に存在することがわかる(図24Cを参照)。
図24Dでは、赤色の矢が、遺伝子発現における変化の制御の方向を示す;例えば、TNFa遺伝子は、SkMelでは減少するが、DO4では増大する;緑色の線が、黒色腫に比べて膵細胞株で変化のない比較的多くの遺伝子を示す。TNFシグナリングが明白に制御され、FASリガンド及びCD27とともに、TNFS10(別称TRAIL)及びTNFRSF10A(TRAILRec1)が新たに同定されている。図24E〜24Hは、それぞれ、インターフェロン、WNT阻害物質、古典的WNTの遺伝子発現及び非古典的WNTの遺伝子発現を示す。
黒色腫細胞株が、膵癌株より多く105Fに反応した。105FによってWNT経路が、おそらくカドヘリン及び阻害物質(WIF1、sFRP)を介して、制御される(古典的≫非古典的)。炎症促進性遺伝子が、癌株及び免疫細胞中でインビトロで誘発される(TNFa、インターフェロン−γ)。105Fの抗腫瘍活性は、分化の調節及び腫瘍細胞への免疫反応の増大を含むと考えられる。
本発明は、上記実施例及びその全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年4月30日に出願された関連米国特許仮出願第62/155,360号の添付書類1を参照して記載されているが、修正及び変更は、本発明の趣旨および範囲内に包含されることが理解される。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (17)
- 線維芽細胞馴化培地からの限外ろ過液細胞外マトリックス組成物を含む組成物であって、前記ろ過液が、分子量5000ダルトンを超える分子を除外しており、かつCD8+T細胞動員活性を含む、前記組成物。
- 薬学的に許容できるキャリア中の、請求項1に記載の組成物。
- 化学療法剤と組み合わせた、請求項1に記載の組成物。
- PD−1阻害剤と組み合わせた、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞外マトリックス組成物が、好適な成長培地中の二次元または三次元表面上に細胞を培養することから得られる、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞が、成体組織由来、胎児組織由来、新生児組織由来または胚組織由来である、請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞が、低酸素条件下で培養される、請求項1に記載の組成物。
- 酸素の前記低酸素条件が、酸素1〜5%である、請求項1に記載の組成物。
- 可溶性画分である、請求項1に記載の組成物。
- 対象における腫瘍負荷を減少させる方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項1に記載の組成物を投与し、これにより前記腫瘍の部位にCD8+細胞を動員し、前記腫瘍のサイズを減少させることを含む、前記方法。
- 前記腫瘍が投与前に切除される、請求項10に記載の方法。
- 投与が、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内の注射または注入である、請求項10に記載の方法。
- 対象における免疫系障害を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項1に記載の組成物を投与し、これによりCD8+細胞を動員し、前記障害を治療することを含む、前記方法。
- 前記障害が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、全身性硬化症、皮膚筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、乾癬、白斑、水疱性類天疱瘡、円形脱毛症、特発性拡張型心筋症、1型糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、IgA腎症、膜性腎症、EBV感染症及び悪性貧血である、請求項13に記載の方法。
- 対象における癌を治療する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の請求項1に記載の組成物を投与し、これにより前記癌を治療することを含む、前記方法。
- 投与が、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内の注射または注入である、請求項15に記載の方法。
- 前記癌が、急性リンパ芽球性;急性骨髄性白血病;副腎皮質癌;副腎皮質癌、小児;虫垂癌;基底細胞癌;胆管癌、肝外;膀胱癌;骨癌;骨肉腫及び悪性線維性組織球腫;脳幹神経膠腫、小児;脳腫瘍、成人;脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児;脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍、小児;中枢神経系胚芽腫;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫;頭蓋咽頭腫;上衣芽腫;上衣腫;髄芽腫;髄様上皮腫;中間型松果体実質腫瘍;テント上原始神経外胚葉性腫瘍及び松果体芽腫;視覚路及び視床下部神経膠腫;脳及び脊髄腫瘍;乳癌;気管支腫瘍;バーキットリンパ腫;カルチノイド腫瘍;カルチノイド腫瘍、消化管;中枢神経系非定型奇形腫様/ラブドイド腫瘍;中枢神経系胚芽腫;中枢神経系リンパ腫;小脳星状細胞腫;大脳星状細胞腫/悪性神経膠腫、小児;子宮頚癌;脊索腫、小児;慢性リンパ球性白血病;慢性骨髄性白血病;慢性骨髄増殖性疾患;結腸癌;結腸直腸癌;頭蓋咽頭腫;皮膚T細胞リンパ腫;食道癌;ユーイングファミリー腫瘍;性腺外胚細胞腫瘍;肝外胆管癌;眼癌、眼球内黒色腫;眼癌、網膜芽細胞腫;胆嚢癌;胃癌(Gastric(Stomach) Cancer);消化管カルチノイド腫瘍;消化管間質腫瘍(GIST);胚細胞腫瘍、頭蓋外;胚細胞腫瘍、性腺外;胚細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛性腫瘍;神経膠腫;神経膠腫、小児脳幹;神経膠腫、小児大脳星状細胞腫;神経膠腫、小児視覚路及び視床下部;有毛細胞白血病;頭頚部癌;肝細胞(肝臓)癌;組織球症、ランゲルハンス細胞;ホジキンリンパ腫;下咽頭癌;視床下部及び視覚路神経膠腫;眼球内黒色腫;島細胞腫瘍;腎臓(腎細胞)癌;ランゲルハンス細胞組織球症;喉頭癌;白血病、急性リンパ芽球性;白血病、急性骨髄性;白血病、慢性リンパ球性;白血病、慢性骨髄性;白血病、有毛細胞;口唇及び口腔内癌;肝臓癌;肺癌、非小細胞;肺癌、小細胞;リンパ腫、AIDS関連;リンパ腫、バーキット;リンパ腫、皮膚T細胞;リンパ腫、ホジキン;リンパ腫、非ホジキン;リンパ腫、原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム;骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫;髄芽腫;黒色腫;黒色腫、眼球内(眼);メルケル細胞癌;中皮腫;原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;口腔癌;多発性内分泌腺腫症候群、(小児);多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;菌状息肉腫;骨髄異形成症候群;骨髄異形成/骨髄増殖性疾患;骨髄性白血病、慢性;骨髄性白血病、成人急性;骨髄性白血病、小児急性;骨髄腫、多発性;骨髄増殖性疾患、慢性;鼻腔及び副鼻腔癌;鼻咽腔癌;神経芽細胞腫;非小細胞肺癌;口腔癌;口腔内癌;中咽頭癌;骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫;卵巣癌;卵巣上皮癌;卵巣胚細胞腫瘍;卵巣低悪性度腫瘍;膵癌;膵癌、島細胞腫瘍;乳頭腫;副甲状腺癌;陰茎癌;咽頭癌;褐色細胞腫;中間型松果体実質腫瘍;松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍;脳下垂体腫瘍;形質細胞腫瘍/多発性骨髄腫;胸膜肺芽腫;原発性中枢神経系リンパ腫;前立腺癌;直腸癌;腎細胞(腎臓)癌;腎盂及び尿管、移行細胞癌;第15染色体上のNUT遺伝子に関連する気道癌;網膜芽細胞腫;横絞筋肉腫;唾液腺癌;肉腫、ユーイングファミリー腫瘍;肉腫、カポジ;肉腫、軟組織;肉腫、子宮;セザリー症候群;皮膚癌(非黒色腫性);皮膚癌(黒色腫);皮膚癌、メルケル細胞;小細胞肺癌;小腸癌;軟組織肉腫;扁平上皮細胞癌、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌;胃癌;テント上原始神経外胚葉性腫瘍;T細胞リンパ腫、皮膚;精巣癌;咽喉癌;胸腺腫及び胸腺癌;甲状腺癌;腎盂及び尿管の移行細胞癌;絨毛性腫瘍、妊娠性;尿道癌;子宮癌、子宮内膜;子宮肉腫;膣癌;外陰癌;ワルデンシュトレームマクログロブリン血症;またはウィルムス腫瘍からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
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