JPH07501212A - ＴＧＦ−β型受容体ｃＤＮＡおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）は、多くの異なる細胞Ｍ において増殖、分化、形態形成をはじめとする様々な応答を誘導する構造的に近 縁のサイトカイン類のファミリーに属する物質である［ロバーツとスポーフ（Ｒ ｏｂｅｒｔＳ、　Ａ、Ｂ、　ａｎｄ　Ｍ、Ｂ、　５ｐｏｒｎ）、　ｔｎ　：　Ｐ ｅｐｔｉｄｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｃｅ ｐｔｏｒｓ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ。

ｐＨ，４２１−４７２（１９９０）　；　７　ッサーグ（Ｍａｓｓａｇｕｅ、　 Ｊ、）　、　Ａｎｎｕ、　Ｆｌｅｖ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、６：５９７−６ ４１　（１９９０）］　、を椎動物では、ＴＧＦ−β１ないしＴＧＦ−β５と呼 ばれる少なくとも５種類の型のＴＧＦ−βが同定されており、これらはいずれも 高度（６０％〜８０％）のアミノ酸配列相同性を共有している。ＴＧＦ−ａｌは 当初、正常ラット腎臓細胞の足場非依存性増殖を誘導する能力を存することが特 徴であるとされたが、はとんどの細胞型に及ぼすその作用は抗分裂促進的である ［アルドジュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、　Ｓ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｊ、 　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌは、正常なものと形質転換されたものの両者の上皮細胞、 内皮細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ系細胞、および造血細胞をはじめとす る多くの型の細胞に対して強力な増殖阻害性を示す。また、ＴＧＦ−βは、細胞 外マトリックスおよび細胞とマトリックスの接着プロセスの形成の調節において 中心的な役目を果たす。

ＴＧＦ−βは細胞の表現型と生理に対して広範な作用を及ぼすにもかかわらず、 ＴＧＦ−βファミリーに属する物質にこれらの様々な応答を引き起こさせる生化 学的機構についてはほとんど知られていない。放射標識ＴＧＦ−β１とともに細 胞をインキュベートし、結合ＴＧＦ−β１を細胞表面分子に架橋させ、標識化複 合体をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析することによって、■型、 Ｔｌ型、およびＩＩＩ型と呼ばれる３つの異なる高親和性細胞表面ＴＧＦ−β結 合性タンパク質が同定されている［マツサーブとライク（Ｍａｓｓａｇｕｅ、　 Ｊ、　ａｎｄ　Ｂ、　Ｌｉｋｅ）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６０： ２６３６−２６４５　（１９８５）　；チャイフェッツら（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ、 　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６１：９９７２−９９７８　（１９８６）］　、結合 定数は、Ｉ型およびＴＩ型受容体では約５〜５０ｐＭＳ　Ｔｌｌ型受容体では３ ０〜３００ｐＭである［ボイドとマツサーブ（８ｏｙｄ、　Ｆ。

Ｔ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍａｓｓａｇｕｅ）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 ２６４：２２７２−２２７８　（１９８９）コ　。

それぞれ５３キロダルトンと７０〜１００キロダルトンの推定分子量を有するＩ 型およびＩＩ型受容体は、多くの受容体と同じく、Ｎ−グリコジル化された質膜 タンパク質である。これらの受容体はそれぞれ、リガンドのＴＧＦ−βファミリ ーのそれぞれのものに対して異なる親和性を有する［ボイドとマツサーブ（Ｂｏ ｙｄ、　Ｆ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍａｓｓａｇｕｅ）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６４：２２７２−２２７８　（１９８９）］　、一方、Ｔｌｌ型受 容体はすべてのＴＧＦ−βイソタイプに対して同等の親和性を示す。Ｔｌｌ型受 容体は、多くの細胞系において最も豊富な、ＴＧＦ−βのための細胞表面受容体 であり（細胞１個あたり２ｏｏ、ｏｏｏ個以上）、膜内在性プロテオグリカンで ある。

Ｔｌｌ型受容体はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）グループによって高度に修飾 されており、ゲル電気泳動を行なうと２８０ないし３３０キロダルトンのタンパ ク質として不均一に泳動される。ヘパリチナーゼとコンドロイチナーゼ（Ｃｈｏ ｎｄｒｏｎｔｉｎａｓｅ）で脱グリコジル化すると、該タンパク質コアは１００ 〜１１０キロダルトンのタンパク質として泳動される。

ＧＡＧ合成を欠損する細胞変異体中で産生される非グリコジル化皇該受容体は、 天然壓受容体のそれらと同等の親和性をもってリガンド結合する能力を有するの で、ＴＧＦ−β結合部位はこのタンパク質コア内に存在する［チャイフェッツと マツサーブ（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｊ、　Ｍａｓｓａｇｕｅ）　 、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６４：１２０２５−１２０２８　（１９８ ９）］　、Ｉ　Ｉ　Ｉ型受容体の一つの変異型が、膜アンカーを明らかに欠いて いる可溶性分子として、いくつかの型の細胞によって分泌される。この可溶性分 子は血清中および細胞外マトリックス中に少量見られる。

Ｔｌｌ型受容体はベータグリカンとも呼ばれ、■型およびＩＩ型受容体のものと は異なる生物学的機能を有する。ＴＧＦ−β応答性の欠損を対象として選択した 変異体ミンク肺上皮細胞（Ｍｖ　Ｉ　Ｌｕ）のなかには、もはや１盟受容体を発 現しないものがあり、同様に選択したものでも、■型とＩＩ型の両受容体の発現 を欠損しているものもある。しかし、これらの変異体はいずれもＴｌｌ型受容体 を発現し続１プる［ボイドとマツサーブ（Ｂｏｙｄ、　Ｆ、Ｔ、　ａｎｄ　Ｊ、 　Ｍａｓｓａｇｕｅ）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

、Ｉ型および＋１型受容体はシグナル導入性分子であり、一方、Ｔｌｌ型受容体 は、真性の（Ｊｏｎａ　ｒｉｄｅ）シグナル導入性受容体に提示される前のリガ ンド濃縮におけるものなど何か他の機能を担っているかもしれないとする説を導 いた。一方、Ｔｌｌ型受容体の分泌量は生物活性ＴＧＦ−βの貯蔵系またはクリ アランス系として作用するのかもしれない。

これらのＴＧＦ−β受容体型のそれぞれについてのこれ以上のｔＲ報があれば、 それらの役目についての理解が深まり、所望すればそれらの機能を変化させるこ とができるようになる。

発明の要旨 本発明は、哺乳類由来のＴＧＦ−βＴＴＩＴｌｌ型受容体ドするＤＮＡおよび哺 乳類由来のＴＧＦ−βＩＩ型受客受容体−ドするＤＮＡ０単離、配列決定、およ びキャラクタライゼーションに関する。本発明はさらに、上記コードされたＴＧ Ｆ−βＩＩＩ型およびＩＴ型受容体、ならびにそれぞれの可溶性壓、上記受容体 をコードする遺伝子と受容体そのものの用途、ＴＧＦ−βＩ　Ｉ　ＴＬ！受容体 特異的抗体およびＴＧＦ−βＩＩ型受客受容体特異性抗体する。とりわけ、本発 明は、ラットおよびヒト由来のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡお よびヒト由来のＴＧＦ−βｌ１ｆｆｉ受容体をコードするＤＮＡ、ならびにそれ ぞれの類似体に関する。

本発明のＴＧＦ−β受容体をコードするＤＮＡは、たとえば公知のハイブリダイ ゼーションに基づく方法やポリメラーゼ連鎖反応を用いて、その他の起源由来の 同等のＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型およびＩＩ型遺伝子を同定するために使うこと ができる。ＩＩＩ型受客受容体遺伝子Ｉ型受容体遺伝子またはそれらのそれぞれ のコード化物は、細胞増殖や生長、細胞接着および細胞表現型に及ぼす作用など のＴＧＦ−βの作用を変えるために使うことができる（たとえばＴＧＦ−βに対 する細胞の受容性を変えたり、受容体へのＴＧＦ−βの結合を阻害することによ り）。たとえば、ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ型遺伝子、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ型遺 伝子、または受容体全体をコードしてはいない切断遺伝子（たとえば可溶性ＴＧ Ｆ−βＩＩＴ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βｌ１ｆｆｉ受容体またはＴＧＦ−βＩ ＩＩ型またはＩＩ壓結合部位）は、ＴＧＦ−β作用を変えようとする者に投与す ることができる。あるいは、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受客 受容体れらの可溶性型（すなわち膜アンカーを欠損する型）またはＴＧＦ−βＩ ＩＩ型またはＩＩ型受容体の活性結合部位は、ＴＧＦ−βの作用を変えるために 、人に投与することができる。

ＴＧＦ−βは体内で多くの役目があるので、本明細書で説明するＴＧＦ−β受容 体が入手可能であれば、イン・ビボおよびイン・ビトロの方法を利用してさらに ＴＧＦ−β機能を評価すること、およびその作用を変える（強化または抑制する ）ことができる。

図面の簡単な説明 図１は、ＩＩＩ型ＴＧＦ−βｌ受容体ｃＤＮＡクローンＲ３−ＯＦ　Ｆ　（完全 挿入断片サイズ６ｋｂ）のＤＮＡ配列（ｓＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１）と翻訳アミノ 酸配列（ｓＥＱ　ＩＤＮｏ、２）であり、該クローンのフランキング配列を有す るオーブンリーディングフレームを示しである。質膜領域は１重下線で示す。本 文中で述べる、誘導配列に対応する精製ＩＩＩ型受客受容体由来ペプチド配列タ リック表記で下線を付けである。潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位は＃で示し、 細胞外システィンは＆で示す。コンセンサスタンパク質キナーゼＣリン酸化部位 は＄で示す。クローンＲ３−０Ｆ　（２゜９ｋｂ）の最後の非ベクターコード化 アミノ酸は＠で示す。

コンセンサスプロテオグリカン付着部位は＋十＋で示す。その他の潜在的グリコ サミノグリカン付着部位は十で示す。上流イン・フレーム終止コドン（−４２な いし−４４）は波線で示す。フォノへイネのアルゴリズム［フォンヘイネ（ｖｏ ｎＨｅｉｊｎｅ、　Ｇ、）　、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、１４：４６ ８３−４６９０　（１９８６）　］によって予想されるシグナルペプチド切断部 位は矢印で示す図２は、ヒトＨｅｐＧ２細胞ｃＤＮＡライブラリーから単離した 全長ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体ｃＤＮＡクローン３ＦＦ（完全挿入断片サイズ５ｋ ｂ）のヌクレオチド配列（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ、３）である。該ｃＤＮＡは５７２ 個のアミノ酸残基から成るタンパク質をコードするオーブンリーディングフレー ムを有する。

図３は、全長ＩＩ壓ＴＧＦ−β受容体のアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４ ）である。

発明の詳細な説明 本発明は、ＴＧＦ−βＴＩＥ型受容型金容体ドするを推動物とくに哺乳類由来の ＤＮＡおよびＴＧＦ−βＩＩ型受客受容体−ドする哺乳類由来ＤＮＡの単離およ び配列決定、上記コード化物の発現、および上記発現物のキャラクタライゼーシ ョンに基づくものである。上述のように、ＴＧＦ−β受容体１１１ｆｆｉをコー ドする全長ｃＤＮＡがラット血管平滑筋細胞系から構築したＣＤＮＡライブラリ ーから単離されており、ＴＧＦ−βＩＩ型受客受容体−ドする全長ｃＤＮＡがヒ トＣＤＮＡライブラリーから単離されている。ＴＩＩ型遺伝子のヒ１〜の類似体 もクローン化されている。プラスミドｐＢＳＫ中のヒトＴＧＦ−βＩＩＩ型ｃＤ ＮＡの寄託がブダペスト条約の規定に従い寄託番号７５１２７でＡｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（１０／　２１　／　 ９１　）でなされている。上記寄託物の入手可能性に関するすべての制限は、本 願に基づく米国特許が認められると同時に最終的に消失するものとするＴＧＦ− βＩ　Ｉ　Ｔ車受容体の単離とキャラクタライゼーシ二２ 本明細書に説明するとおり、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容鉢受容体ＣＤＮＡのために ２つの異なる手法を用いた。一つのアプローチでは、ＩＩＩ型受客受容体タンパ ク質するモノクローナル抗体を作成して受容体の精製に使い、次いで受容体をミ クロシーフェンシングに付した（実施例１参照）。精製受容体の部分タンパク質 分解で生じた数個のペプチドのミクロシーフェンシングで４つのオリゴペプチド 配列が得られ、これらを用いて縮重オリゴヌクレオチドを構築した。縮重オリゴ ヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するクローン化法にお いてプライマーとして使用するか、ＣＤＮＡライブラリーのスクリーニングにお いてプローブとして使用した。この方式は生産的でないことが判明したが、オリ ゴヌクレオチド配列は第２の方式によって単離した受容体クローンの同一性を確 認する際に作用であった。

ＴＧＦ−β受容体をコードするクローンの単離のための第２のアプローチでは、 ＣＯ８細胞において発現クローン化方式を用いた。すなわち、受容体陽性細胞の 直接可視化を用いて受容体ｃＤＮＡを単離した（実施例２参照）。このアプロー チでは、３つのＴＧＦ−β受容体（■型、■！型、およびＩＩＩ型）すべてを発 現するラット血管平滑筋細胞系Ａ−１０細胞からＣＤＮＡライブラリーを構築し た。サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）転写プロモーターとＳＶ４０ｆｆｌ製起ｌ 奮起持するベクター中の、該ライブラリーｃＤＮＡ成分を移入（ｔｒａｎｓｆｅ ｃｔ）Ｌ／たＣＯＳ細胞をスクリーニングして、正常レベルよりかなり高いレベ ルのＴＧＦ−β受容体を発現する細胞を同定した。上記高レベルのＴＧＦ−β結 合性タンパク質を発現する１つの移入体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）を同定し 、その由来光である発現構築物のオリジナルブールをサブプールに分割し、２ラ ウンド目のスクリーニングに付した。さらに２ラウンドの姉妹選抜を行ったとこ ろ、２．９ｋｂの挿入断片を有する１個のｃＤＮＡクローン（Ｒ３−ＯＦ）が単 離されたが、このものは導入先の細胞の約ｌＯ％において高レベルのＴＧＦ−β 結合性タンパク質を誘導した。２００倍過剰量の非標識競合体ＴＧＦ−β１の添 加が移入細胞（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ）に対する＋２５１−ＴＧ Ｆ−βの結合を強力に低下させるということを示すことによって、ＴＧＦ−β結 合の特異性を確認した。

Ｒ３−０ＦのｃＤＮＡは８１７個のアミノ酸残基より成るオーブンリーディング フレームをコードしたが、終止コドンは含んでいなかった。Ｒ３−０Ｆをプロー ブとして使用して、ラット２０８Ｆライブラリーから全長ｃＤＮＡを単離した。

得られたクローンＲ３−０ＦＦは長さが６ｋｂあり、クローンＲ３−ＯＦと共直 線的な８５３個のアミノ酸から成るタンパク質ヲコードする。Ｒ３−０ＦＦのヌ クレオチド配列を翻訳アミノ酸配列とともに図１に示す。

実施例３に述べたようにして、Ｒ３−０ＦＦによってコードされる受容体のキャ ラクタライゼーションを行った。その結果、モック移入ＣＯＳ細胞（ｍｏｃ−ｔ ｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ＣＯＳ　ｃｅｌｌｓ）の表面上に３つの異なるＴＧＦ− β結合性タンパク質が見られたが、これは他者が報告して、比較的分子量の小さ いＩ型とＩＩ型の２つの受容体（６５ｋＤと８５ｋＤ）および２８０〜３３０ｋ ｄの拡散バンドとして泳動される比較的分子量の大きいＩＩＩ型プロテオグリカ ンが含まれていた。該プロテオグリカンの酵素的除去により、約１００ｋｄのコ アタンパク質が得られた。２００倍過剰量の非標識ＴＧＦ−βｌによって競合さ れたという点で、３つの受容体型いずれに対する結合も特異的である。

単離ｃＤＮＡを移入したところ、ＩＩＩ型受客受容体現が２倍増加した。クロー ンＲ３−０ＦＦを移入したＣＯ８細胞から得た細胞溶解物を脱グリコジル化酵素 で処理したところ、不均一な２８０〜３３０ｋｄのバンドは親のＡＩＯ細胞中に 見られるＩＩＩ型タンパク質コアとともに泳動されるタンパク質コアに変換され た。重要なことに、該組換えタンパク質コアは内生ＣＯ３細胞ＩＩＩ型タンパク 質コアと異なって泳動された。

１１１ＵｃＤＮＡを発現する安定移入細胞を使って、これらの観察結果を確認、 拡張した。Ｌ６ラツト骨格筋筋芽細胞は検出可能なＴ　Ｉ　Ｉ盟ｍＲＮＡや内生 表面ＩＩＩ型受客受容体−ｐｃＤＮＡ−ｎｅｏにおける単離ｃＤＮＡを移入した 。

ＣＭＶプロモーターに対して前後両方向でこのクローンを安定的に発現する細胞 クローンを単離し、リガンド結合測定法によって分析した。

全長クローンＲ３−０ＦＦまたは部分クローンＲ３−０Ｆのいずれかを前方に導 入したところ、ＩＩＩ型受容体力く発現した。逆方向にｃＤＮＡクローンを移入 したＬ６細胞はこのタンパク質を発現しなかった。重要なことに、Ｒ３−０Ｆク ローンで形質転換した細胞におけるＩＩＩ型受客受容体ンノくり質コアの見かけ サイズは、Ｒ３−０ＦＦで形質転換した細胞のものより小さいのであるが、これ は核酸配列から予想されるタンパク質コアサイズの違いと一致する。

驚くべきことに、ＩＴ型受容体への放射標識リガンドの結合はＩＩＩ型ｃＤＮＡ を発現する細胞中で２．５倍増大した。■型骨容体への結合は変化しなかった。

ＩＩ型受容体へのリガンド結合のこの見かけ１特異的なア・ツブレギュレーショ ンは、これまで分析した１５個の安定移入し６細胞系のＩ、Ｘずれにおいても明 白であった。さらに、この効果は、全長クローンによって同等に仲介されている ように思われる。すなわち、ＴＧＦ−βＩＩ＋型受容鉢受容体質ドメインを欠い ている切断クローン（Ｒ３−ＯＦ）が発現された。

ＩＩＩ型受客受容体ｍＲＮＡ現は、ノーザンブロ・スト分析法とＲＮＡプロット 分析法によって判定した。ノーザンゲル分析によって、ＩＩＩ型受客受容体ｍＲ ＮＡ種類のう・ソ）・組織において単一の６ｋｂのｍＲＮＡ分子として発現され ることが示された。数種類の異なる組織培養細胞系のＲＮＡドツトプロット分析 も行った。マウス由来の細胞（ＭＥＬおよびＹＨ１６）は、ブタ、ラット、およ びヒト由来のものより小さい（約５．５ｋｂ）Ｉ　Ｉ　Ｉ盟ｒｎＲＮＡ分子を発 現するようである。これらの細胞のいずれにおいても、網膜芽細胞腫細胞系（Ｙ ７９、Ｗｅｒ　ｉ−１，Ｗｅｒ　１−２４、およびＷｅｒｉ−２７）が顕著な例 外として認められる以外は、ＩＩＩ型ｍＲＮＡの発現または欠損は、検出可能な 細胞表面ＩＩＩ堅受客受容体現または欠損と一致している。これらの細胞は検出 可能なＩＩＩ型受客受容体表面発現いており、既報を確認するものである［キム チら（Ｋｉｍｃｈｉ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：１ ９６−１９８　（＋９８８）コ。容易に検出できるレベルでＩＩＩ型受容体タン パク質を本当に発現するその他の細胞のレベルと同等のレベルでこれらの細胞中 でＩＩＩ型受容体ｍＲＮ八がへ現されることは興味深い。正常網膜芽細胞（ＡＤ 　ｌ　２）においてかなりあるＴＧＦ−β受容体ＩＩＴ型発現は、おそらく転写 後機構によってこれらの網膜芽細胞腫細胞中でダウンレギュレーションされてい るようである。

ヌクレオチド配列全長リーディングフレームを全長ｃＤＮＡクローンＲ３−０Ｆ Ｆのフランキング配列とともに決定したものを図１に示す。該リーディングフレ ームは８５３個のアミノ酸残基から成るタンパク質をコードするが、これは完全 脱グリコジル化ＴＧＦ−βＩＩＩＴ型受容体で見られる１００ｋＤのサイズと一 致する。該受容体がＴＧＦ−βＩＩＩ型であることは、単離されたＩＩＩ型受客 受容体クロシークェンシングによって決定したペプチド配列を含む推定転写産物 の断片を探索することによって確認された（実施例１参照）。図１に示したよう に、誘導タンパク質の２つの断片（下線およびイタリック、残基３７８−３８８ および４２７−４３４）は精製ＩＩＩ型受客受容体接生化学的分析によって決定 された２つのペプチド（ＩとＩ　Ｉ　Ｉ）のアミノ酸配列と厳密に一致する。

さらに分析を行ったところ、ＴＧＦ−βＩＩＩ型結合性タンパク質はサイトカイ ン受容体としては珍しい構造を有することが示された。ヒトロバシー分析で、該 タンパク質はＮ末端シグナル配列とそれに続く長い親水性Ｎ末端領域を含むこと が示される。強い疎水性を示すＣ末端側２７残基領域（図１の下線部分、残基７ ８６−８１２）は単一の推定質膜ドメインにあたる。このことは、Ｎ末端細胞外 ドメインである受容体のほぼ全体がそのＣ末端付近の細胞膜に固定されているこ とを示唆している。４１残基から成る比較的小さなＣ末端テイルは細胞質ドメイ ンにあたる。

関連配列の分析は、ＴＧＦ−βＩＩＩ型タンパク質の機能の手掛かりをほとんど 提供しない。今までに記載されたその他の遺伝子のうちの１つだけ、すなわち内 皮細胞によって大量に発現されるエントゲリンと呼ばれる糖タンパク質だけが関 連アミノ酸配列を含んでいる。ＩＩＩ型受客受容体ントゲリンの配列の間の最も 相同な領域（７４％）は主に推定質膜ドメインと細胞質ドメインに存在する。Ｉ ＩＩ型受客受容体体構造同様に、エンドプリンは、おそらく細胞外にある大型の 親水性Ｎ末端ドメインとそれに続く推定質膜ドメインと４７個のアミノ酸残基か ら成る短い細胞質テイルを含む糖タンパク質である。エントゲリンは、エクトド メイン上のｒＲＧＤＪ配列とその他の接着分子の相互作用によって細胞どうしの 認識に関与しているかもしれないことが示唆されているが、エントゲリンの生物 学的役目はいまのところ不明である。

ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体と異なり、エントゲリンはＧＡＧグループを保持しな い。

ＴＧＦ−βＩＩ型受客受容体離 ＣＯ８細胞中での発現クローン化を用い、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体をコードする ｃＤＮＡも単離した。高ストリンジエンシー（ｈｉｇｈ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ）でのハイブリダイゼーションによりヒトＨｅｐＧ２細胞ｃＤＮＡライブラリー から全長ｃＤＮＡ（クローン３ＦＦと命名）を単離した（実施例６参照）。分析 により、対応するｍＲＮＡ分子は異なる細胞系や組織において発現される５ｋｂ のｍＲＮＡ分子であることが示された。配列分析で、該ｃＤＮＡは５７２個のア ミノ酸残基より成るコアタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム を有することが示された。全長ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体ｃＤＮＡクローン３ＦＦ のヌクレオチド配列を図２に示し、アミノ酸配列を図３に示す。

該５７２個のアミノ酸残基より成るタンパク質は、単一の推定質膜ドメインと数 個のコンセンサスグリコジル化部位と１つの推定細胞内セリン／スレオニンキナ ーゼドメインを有する。コードされたタンパク質コアの予想サイズは約６０ｋｄ であるが、これはＩ型ＴＧＦ−β受容体としては大きすぎる。そのかわり、ヨウ 素標識ＴＧＦ−βと一時的にクローン３ＦＦを移入したＣＯ３細胞を用いた架橋 実験で、ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体のサイズに対応する約７０〜８０ｋｄのタンパ ク質の過剰発現が示される。したがって、クローン３ＦＦはＴＧＦ−βと特異的 に結合するタンパク質をコードし、７０〜８０ｋｄの発現タンパク質サイズを有 するが、いずれも１１壓ＴＧＦ−β受容体の特徴である。

クローン化ＴＧＦ−β受容体と関連産物の用途本明細書で説明する研究の結果、 ３つの高親和性細胞表面ＴＧＦ−β受容体のうちの２つをコードするＤＮＡがは じめて単離され、その配列と発現パターンが決定され、コードされたタンパク質 のキャラクタライゼーションが行なわれた。

通常は該受容体を発現しない細胞においてＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現させ 、次いでリガンド結合測定を行ったところ、クローン化されたＩ　Ｉ　Ｔ壓受容 体をコードするＤＮＡ　（すなわち全長クローンＲ３−０ＦＦまたは部分クロー ンＲ３−０Ｆ）が該受容体をコードすることが確認された。また、本明細書で説 明する研究から、ＩＩＩ型ＤＮＡを発現する細胞においてはＴＩ型受容体へのＴ ＧＦ−βの結合が２．５倍増大するという驚くべき知見が得られた。

説明する研究の結果、ＴＧＦ−βＩ　Ｉ　Ｉ車受容体の役目およびそれとＴＧＦ −βＩＩ望受客受容体互作用に関する新たな洞察が得られた。たとえば、ＴＧＦ −β１１１型受容体の役目は不明であるが、近接のシグナル導入受容体へ最終的 に移動させるＴＧＦ−βを引きつけ濃縮するという最も一般的でない機能を果た すとされている。はとんどのサイトカインは単一の細胞表面受容体に結合するが 、ＴＧＦ−βファミリーのメンバーはそれより大きいか小さい親和性をもって３ つの異なる細胞表面タンパク質に結合する。このことは、なぜこれら３種の受容 体がほとんどの細胞型によって発現されるのか、およびそれらが異なる機能を果 たすかどうかという疑問を呼び起こしている。これまでに得られた証拠は、ＩＩ Ｉ型受客受容体型および■■琶の機能と全く異なる機能を果たすかもしれないこ とを示唆している。したがって、ＩＩＩ型はＧＡＧによってかなり修飾されてい るが、■型と１１型はほとんどの成長因子受容体の特徴であるＮ結合（そしてお そらく０結合）側鎖を主に保持すると思われる。また、ＴＧＦ−β誘導増殖阻害 に抵抗する能力を対象として選抜した変異細胞は、ＩＩＩ型受客受容体現し続け ながらＴ型またはＴＩ型受容体の欠損を示す。これらのデータを総合的にみて、 ■型およびＩＩ型受容体は真性の（ｂｏｎａ　ｆ　１ｄｅ）シグナル導入受容体 にあたり、ここて説明するＩＩＩ型受客受容体胞中で別の異なる役目を果たすと 提唱する者もいる。

１１１ｆｆｉ受容体が、近隣のシグナル導入受容体（ｓｉｇｎａｌ−ｔｒａｎｓ ｄｕｃｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）へ最終的に移動させるＴＧＦ−βを引きつ け濃縮するという最も一般的てない機能を果たしているという可能性は依然とし てある。このような機能はタンパク性受容体としてはこれまで報告されていない が、硫酸ヘパリンは、ＦＧＦとその受容体との会合に先立ち、この成長因子と結 合することで塩基性ＦＧＦを活性化することが示されている［ヤヨンら（Ｙａｙ ｏｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　）　、　Ｃｅ１ｌ　６４：８４１−８４８　（１ ９９１）　］　、さらに付は加えるとすれば、ＩＩＩ型受客受容体量の硫酸ヘパ リン側鎖も含有しているので、塩基性ＦＧＦをその受容体に結合させ提示するか もしれない。

ＩＩＩ型受客受容体目と一致する証拠が、本明細書で説明するＬ６ラツト筋芽細 胞の研究から得られる。上記のように、ＩＩＩ型受客受容体剰発現するＬ６細胞 においては、ＩＩ型受容体への放射標識ＴＧＦ−βの結合が、親細胞で見られる ものと比べて数倍増大している。これらの疑問に答えるためにはＴＧＦ−βＩＩ Ｉ梨の機能とＩＩ型およびｌｆｆ１受容体との相互作用をさらに評価する必要が あるが、これは本明細書で説明する材料と方法を使って実施することができる。

同定しようとする受容体をコードするＤＮＡの全体または一部をプローブとして 用い、本明細書で説明する方法を用いれば、ＩＩＩ型とＩＩ型のいずれの型のＴ ＧＦ−β受容体も他の種において同定することができる。たとえば、ＴＧＦ−β Ｔｌｌ型受容体をコードするＤＮＡ配列（図１に示す）の全体または一部、また はＴＧＦ−βＩＩ型受客受容体−ドするＤＮＡ配列（図２に示す）の全体または 一部は、他の動物における同等の配列を同定するために使うことができる。他の 種における同等の配列を同定するために、必要に応じて使用するストリンジエン シー（ｓ　ｔ　ｒ　ｉｎｇｅｎｃｙ）の条件を変更することができる。推定ＴＧ Ｆ−β受容体ＩＩＩ型またはＩＩ型をコードする配列がひとたび同定されれば、 全長クローンＲ３−０ＦＦのｃＤＮＡ挿入断片および部分クローンＲ３−ＯＦの ｃＤＮＡ挿入断片がＩＩＩ型受客受容体−ドすることを確認するために、該配列 がそれぞれの受容体型をコードするかどうか、本明細書で説明するものなど公知 の方法を用いて決定することができる。たとえば、このやり方で単離したＤＮＡ は、本明細書で説明するようにして、受容体ｍＲＮＡや表面受容体を発現しない 適当な宿主細胞（たとえばＬ６ラツト骨格筋筋芽細胞）中で発現させ、リガンド 結合（ＴＧＦ−β結合）測定法によって分析することができる。

本明細書に説明する研究の結果、クローン化ＴＧＦ−β■ＩＩ型またはクローン 化ＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対して特異的な抗体（ポリクローナルまたはモノク ローナル）も公知の方法を用いて製造することができる。該抗体および該抗体を 産生する宿主細胞（たとえばハイブリドーマ細胞）も本発明の対象である。クロ ーン化ＴＧＦ−β受容体に対して特異的な抗体は、ＴＧＦ−β受容体をコードす ると考えられる単離ＤＮＡを発現する宿主細胞を同定するために使用することが できる。また、抗体は、ＴＧＦ−β活性をブロックするか阻害するために使用す ることができる。たとえば、クローン化ＴＧＦ−βＩｌｌ型受容体に対して特異 的な抗体は、受容体へのＴＧＦ−βの結合をブロックするために使うことができ る。それらは、一部の線維症（たとえば皮膚、腎臓、肺の）における場合のよう にＴＧＦ−β結合の低下が望まれる者に投与するすることができる。

本発明の方法は、線維症などＴＧＦ−β１１１型受容体および／またはＴＧＦ− β１１梨受容体へのＴＧＦ−βの異常結合を伴う疾患の診断に使うことができる 。細胞表面におけるＴＧＦ−βＴｌｌ型受容体またはＴＧＦ−βＩＩ型受客受容 体ＴＧＦ−βの異常結合を測定して測定結合値を得ることができ、これを適当な 対照結合値と比較する。対照結合値は、受容体へのＴＧＦ−βの異常結合を有す ることが知られている対照細胞、または正常細胞（たとえばＴＧＦ−β受容体へ のＴＧＦ−β結合が生理的な範囲内にあることを示す証拠）である対照細胞を用 いて得ることができる。対照値は、適当な受容体（すなわちＴＧＦ−βＴｌｌ型 受容体またはＴＧＦ−βＩＴ型受客受容体のＴＧＦ−βの結合程度をめることに よって得ることができ、このような値は測定結合値をめるときに得てもよいし、 あらかじめめ゛ておくこともできる（すなわちあらかじめめた基準値）。異常細 胞から得られた対照結合値に近い測定結合値は、ＴＧＦ−βＴｌｌ型受容体また はＴＧＦ−βＩＩ型受客受容体ＴＧＦ−βの結合が異常であることを示している 。正常細胞から得られた対照結合値に近い測定結合値は、ＴＧＦ−βＴｌｌ型受 容体またはＴＧＦ−β■Ｉ梨受客受容体ＴＧＦ−βの結合が正常であることを示 している。

ＴＧＦ−βＴｌｌ型受容体をコードするＤＮＡとＲＮＡおよびＴＧＦ−βＩＴ型 受客受容体−ドするＤＮＡとＲＮＡが現在入手可能である。本明細書中で使用す る場合、それぞれのＴＧＦ−β受容体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡという用 語は、発現されるとＴＧＦ−β受容体の機能的特徴を有するＴＧＦ−β受容体の 産生をもたらすあらゆるオリゴデオキシヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボ ヌクレオチド配列を包含する。すなわち、本発明は、適当な宿主細胞中で発現さ れると、天然細胞表面上におけるＴＧＦ−βＴｌｌ型受容体のそれと同様のＴＧ Ｆ−β親和性を有する（たとえばすべてのＴＧＦ−βイソタイプに対して同等の 親和性を示す）ＴＧＦ−βＴｌｌ型受容体を産生ずるＤＮＡおよびＲＮＡを包含 する。同様に、本発明は、適当な宿主細胞中で発現されると、天然細胞表面上に おけるＴＧＦ−βｒｌＵ受容体のそれと同様のＴＧＦ−β親和性を有する（たと えば天然ＴＧＦ−βＩＩ型受容体のそれと同様のＴＧＦ−βファミリーリガンド のそれぞれのメンバーに対して異なる親和性を示す）ＴＧＦ−βＩＩ型受客受容 体生ずるＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。該ＤＮＡまたはＲＮＡは適当な宿主細 胞中で製造することができ、または合成的に（たとえばＰＣＲなとの増幅技術に より）あるいは化学的に製造することができる。

本発明はまた、全長Ｒ３−０ＦＦのヌクレオチド配列によってコートされる単離 ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、部分型口容体Ｒ３−ＯＦのヌクレオチド配列によっ てコードされる単離ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、全長型口容体３ＦＦのヌクレオ チド配列によってコードされる単離ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、および実質的に同 じ親和性をもってＴＧＦ−βイソタイプと結合するＴＧＦ−βＴｌｌ型およびＩ Ｉ型受容体を包含する。該単離ＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体は、本明 細書で説明するようにして組替え技術によって製造することができ、それらが天 然にまたは化学合成的に存在するソースから単離することもできる。本明細書中 で使用する場合、クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型およびクローン化ＴＧＦ−βＩ Ｉ型受容体という用語は、本明細書で説明したようにして同定されたそれぞれの 受容体、およびそれぞれの受容体と実質的に同じＴＧＦ−βイソタイプ親和性を 示すＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＴＩ型受容体（たとえばその他の種由来のもの） を包含する。

すでに述べたように、クローン化ＴＧＦ−βＩ　Ｉ　Ｉ！！！受容体が発現され る細胞は、ＩＩＩ型受客受容体然に存在する細胞ど実質的に同しようにしてＴＧ Ｆ−βと結合する。ＴＧＦ−βと受容体の両者の部位特異的突然変異誘発に基づ き、リガンドとクローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の相互作用をさらに分析し て結合に重要な残基を同定することができる。

たとえば、図１の配列を有するＤＮＡは、修飾クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型受 容体をコードする修飾ＤＮＡ配列を製造する目的で、少なくとも１個のヌクレオ チドを付加、欠失、または置換させることによって、変化させることができる。

修飾受容体の機能的特徴（たとえばＴＧＦ−β結合能力や結合と結合によって通 常生じる影響との関係）は、本明細書で説明する方法を用いて判定することがで きる。クローン化ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の修飾は、たとえば、膜結合性でな く、天然受容体と実質的に同じ親和性をもってＴＧＦ−βイソタイプと結合する 能力を保持する、本明細書中で可溶性ＴＧＦ−β受容体と呼ぶ梨のＴＧＦ−βＩ ＩＩ型受容鉢受容体するために実施することができる。このようなＴＧＦ−βＩ ＩＩ型受容鉢受容体知の遺伝子工学技術または合成技術を用いて製造することが できる。それは、天然ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体中に存在する貫膜領域を全く含 むことができないが、その領域の一部分（すなわち可溶性を阻害しない程度に十 分に小さい）だけしか含むことができない。たとえば、それは図１のアミノ酸１ ないし７８５から成るＴＧＦ−βＩＩＩ型配列またはＴＧＦ−β結合能力を保持 するのに十分な該配列の一部（たとえばアミノ酸２４〜７８５、このものは最初 の２３個のアミノ酸中に存在するシグナルペプチド切断部位を含まない）を含み 得る。可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体（た上受容体膜ドメインと細胞質ドメイン を含まないもの）も製造することができる。たとえば、それは、図３を含むアミ ノ酸ｌないし１６６、またはＴＧＦ−βＩＩ型受客受容体れと実質的に同じＴＧ Ｆ−β結合能力を保持するのに十分なその一部を含むことができる。

ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容鉢受容体／または■Ｉ堅受容体は治療目的に使うことが できる。上記のように、ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質は、細胞増殖の調節 、細胞分化の調節、および細胞代謝の制御をはじめとする様々な細胞活性に関与 している。ＴＧＦ−βは細胞機能に不可欠であるかもじれず、はとんどの細胞は ＴＧＦ−βを合成し、ＴＧＦ−β細胞表面受容体を有する。細胞型と環境によっ てＴＧＦ−βの作用は異なり、増殖が刺激されたり阻害されたりし、分化が誘導 されたり中断されたりし、細胞機能が刺激されたり抑制されたりする。ＴＧＦ− βは胚段階から成熟後の段階まで存在するので、生涯を通じてこれらの重要なプ ロセスに影響を及ぼしうる。特定のＴＧＦ−β（たとえばＴＧＦ−βｌ）は種間 および細胞間で顕著な類似性がある。たとえば、特定のＴＧＦ−βのアミノ酸配 列およびソースにかかわらずそれをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は種間 て実質的に同じである。このことは、ＴＧＦ−βが必須プロセスにおいて重要な 役目を果たしていることをさらに示唆している。

具体的には、ＴＧＦ−βは抗炎症および免疫抑制能力を有していて、骨形成にお いて重要な役目を果たしく骨芽細胞活性を増大させることによる）、培養中の癌 細胞増殖を阻害し、前立腺の腺細胞の増殖を抑えることが示されている。その結 果、ある種の免疫系応答を変化させるうえて（およびおそらくは免疫関与疾患を 緩和するうえで）、全身性骨疾患（たとえば骨相誹症）および骨成長を強化させ たい状態（たとえば骨折部の修復）を治療するうえて、および癌細胞の増殖と転 移を抑えるうえて、可能と思われる治療用途がある。また、ＴＧＦ−βは、ある 種の細胞型が分裂を起こすが起こさないかを決定する際、ひとつの役目を果たし ているようである。この点て、ＴＧＦ−βは組織修復において重要な役目を果た しているのかもしれない。一部の疾患や状態は、ＴＧＦ−βの産生の低下や慢性 的な産生過剰を伴っているようである。（たとえば、動物実験の成績で、ＴＧＦ −βの過剰産生と肺、腎臓、肝臓またはウィルス関与免疫発現における線維症を 特徴とする疾患の間に相関があることが示唆されている。

明らかに、ＴＧＦ−βは身体プロセスおよび関連する創傷治癒、癌、免疫療法、 骨療法における多くの可能と思われる臨床的すなわち治療的用途において重要な 役目を有している。ＴＧＦ−β受容体遺伝子、コード物、およびそれらをイン・ ビトロおよびイン・ビボで用いる方法が利用可能となれば、体内のＴＧＦ−βの 活性と作用をさらに制御または調節することができる。たとえば、本発明のＩＩ 盟またはＩ　Ｉ　Ｉ車受容体遺伝子によってコードされるＴＧＦ−βＩｌｕまた はＩＩＩ型受客受容体ＴＧＦ−βの作用を変えるために（たとえば、体内のＴＧ Ｆ−βの作用を強化したり、その作用を（完全にまたは部分的に）阻害または低 下させるために）適宜使うことができる。ＴＧＦ−βが可溶性ＴＧＦ−βＩ　Ｉ 　Ｉ車受容体などのＴＧＦ−βＴ　Ｉ　Ｉ車受容体に結合している者に投与する ことも可能である。本発明は、ＴＧＦ−β作用剤とＴＧＦ−β拮抗剤の両方を提 供する。これらの目的のためには、ＴＧＦ−βＩＩ型またはＩ　Ｉ　Ｉｕ受容体 全体をコードするＤＮＡ遺伝子、コードされたＩｌｌまたはＩＩＩ型受客受容体 たはどちらか一方の受容体の可溶性型を使うことができる。あるいは、これらの 配列に基づいて設計されたかそれらに対して特異的な抗体またはその他のリガン ドをこの目的に使うことができる。

ＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＩＩ型受容体のアミノ酸配列がわかれば、それらの構 造の理解を深めるとともに、受容体のＴＧＦ−βとの結合を阻害する化合物を設 計することができる。それは、既存化合物の同定およびＩＩＩ型および／または ＴＩ型受容体拮抗剤である新規化合物の設計を可能にする本発明のＩＩＩ型およ び／またはＩＩ型受容体を発現する細胞は、受容体へのＴＧＦ結合を阻害（完全 にまたは部分的にブロックする）能力を対象として化合物をスクリーニングする ために使うことができる。たとえば、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容型金容体しないが （たとえばＬ６ラツト骨格筋筋芽細胞）適当なベクターに保持させたＩＩＩ型ｃ ＤＮＡを挿入することによってそうなるように修飾させた細胞は、この目的に使 うことができる。たとえば、判定しようとする化合物を標識化ＴＧＦ−βととも にＩＩＩ型発現細胞を含む組織培養シャーレに加える。対照として、同濃度の標 識化ＴＧＦ−βを同種細胞を含む組織培養シャーレに加える。受容体へのＴＧＦ −βの結合が起きるのに十分な時間が経過した後、公知の方法（たとえばガンマ カウンターによる）を用いて細胞への標識化ＴＧＦ−βの結合を判定し、判定し ようとする化合物の存在下と非存在下でのその発生程度を測定する。２つの値を 比較すると、試験化合物が受容体へのＴＧＦ−β結合をブロックしたかどうかが わかる（すなわち、化合物の非存在下での場合より存在下の場合の方が結合が少 ないということは、試験化合物がＴＧＦ−βＩＩＩ型受容型金容体ＧＦ−βの結 合をブロックしたことの証拠である）。

あるいは、ＴＧＦ−β受容体を発現する細胞系または顕微注入されたＴＧＦ−β 受容体ＲＮＡを発現する細胞は、受容体へのＴＧＦ−β結合をブロックする能力 について、化合物を判定するために使うことができる。本態様においては、判定 しようとする化合物をＴＧＦ−βとともに顕微注入されたＴＧＦ−β受容体ＲＮ Ａ発現細胞系の細胞を含む組織培養シャーレに加える。対照として、ＴＧＦ−β のみをＩｊＩ微注入されたエンドセリン受容体ＲＮＡを発現する同種の細胞に加 える。受容体へのＴＧＦ−βの結合が起きるのに十分な時間が経過した後、判定 しようとする化合物の存在下と非存在下での結合程度を測定する。２つの値を比 較すると、該化合物が受容体へのＴＧＦ−β結合をブロックしたかどうかがわか る。ＴＧＦ−βＩＩＩ型およびＴＩ型受容体は、ＴＧＦ−β様物質を同定したり 、ＴＧＦ−βを精製したり、それぞれの受容体への結合の原因となっているＴＧ Ｆ−β領域を同定したりするために使うことがてきる。たとえばＩＩＩ型受客受 容体ＴＧＦ−βの場合と同様に受容体と結合する物質を同定するために親和性に 基づく方法において使うことができる。

以下の実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定 されない。

実施例 実施例１〜５で使用した材料および方法を以下に説明する材料 以下は本明細書で説明する研究で使用した材料の説明である。

組替えヒトＴＧＦ−β１は、ジエネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）のリック ・プリンク（Ｒｉｋ　Ｄｅｒｙｎｃｋ）から提供された。Ｃ０５−Ｍ６細胞は、 マサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｈ ｏ５ｐｉｔａｌ）のブライアン・シード（Ｂｒｉａｎ　５ｅｅｄ）およびプリス トルーマイヤーズースクィブ社（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−３ｑｕｉｂｂ） のアレジャンドロ・アルーフ１　（Ａｌｅｊａｎｄｒｏ　Ａｒｕｆｆｏ）から提 供された。ヘパリチナーゼは、ＭＩＴのテラヒト・コジマ（Ｔｅｔｓｕｈｉｔｏ 　Ｋｏｊｉｍａ）およびロバート・ローゼンバーグ（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｒｏｓｅｎ ｂｅｒｇ）から提供された。ＬＬＣＰＫ＋細胞は、マサチューセッツ総合病院（ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　ＧｅｎｅｒａＩ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）のデニス・ アウシｘ　口（Ｄｅｎｎｉｓ　Ａｕ５ｉｅｌｌｏ）の贈与物であった。ＹＨ−１ ６細胞は、マサチューセッツ総合病院（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｇｅｎｅ ｒａｌ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ）の工′ドワード・イー（Ｅｄｗａｒｄ　Ｙｅｈ）の 贈与物であった。３−４細胞は、ホワイトヘッド生化学研究所（Ｗｈｉｔｅｈｅ ａｄ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ） のニージン・カシ（εｕｇｅｎｅ　Ｋａｊｉ）の贈与物であった。注記ある場合 を除き、その他の細胞系はいずれもＡＴＣＣより購入し、販売者の指定とおりに 培養した。

ｃＤＮＡライブラリーの構築とプラスミドプールの作成プロテイナーゼーＫ　／ 　Ｓ　Ｄ　Ｓ法によりＡＩＯ細胞から１０μｇのポリアデニル化ｍＲＮＡを調製 した［ゴングら（Ｇｏｎｄａ　ｅｔ　ａｌ、）、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　 Ｂｉｏｌ、　２：６１７−６２４　（１９８２）］　、二重ら旋ｃＤＮＡを合成 し、既報［シードとアルーフォ（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ａ、　Ａｒｕｆｆ ｏ）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾　８４：３ ３６５−３３６９　（１９８７）　］に従い非パリンドロームＢｓｔＸｌアダプ ターに結合させた。アダプターを結合させた（ａｃａｐｔｏｒｅｄ）ｃＤＮＡを ５ないし２０％酢酸カリウム勾配上でサイズ分画し、ｌｋｂより大きい挿入断片 をプラスミドベクターｐｃＤＮＡ−１につなぎ、大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３中で エレクトロポレーションしたところ、力価＞１０’個組替え体を有する一部ライ ブラリーが得られた。ｃＤＮＡの一部を、７．５ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンと １２．５ｍｇ／ｍＩアンピシリンを含有するルリアーブロス寒天を入れた１５ｃ ｍベトリ皿上で培養した約１ｘｌＯ’個組替え細菌コロニーのプールとして平板 培養した。１０ｍ１のルリアーブロス中で細胞を平板からかきとり、プールした 細菌のグリセリン液を一７０°Ｃで保存した。残りの細菌は、アルカリ溶菌ミニ −ブレツブ法［サムプルツクら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、）、 　Ｍ。

Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、　２ｄ　Ｅｄ、　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１ ９８９）］を用いてプラスミドＤＮＡを精製するために使った。

ＣＯＳ細胞移入と結合測定 シードとアルーフｔ　（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ａ、　Ａｒｕｆｆｏ）　ｆ ：よッテプラスミドブール（それぞれ約１ｘｌＯ’個のクローンを含む）をＣ０ ３−Ｍ６　（ＣＯ３−７細胞Ｃ）”ｊ−’ｊ’１　ロー：／）　ｆ移入した。移 入後４８時間目に、細胞を５０ｐＭの”’　１−　ＴＧＦ−Ｂｌ　（＋００ない し２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともに４°Ｃで４時間インキュベートし、実質的に 既報［ゲアリングら（Ｇｅａｒｉｎｇ、　Ｄ、Ｐ、　ｅｔ　ａｔ、）、　ＥＭＢ ＯＪ、　し３６６７−３６７６　（１９８９）］ど同様にしてＮＴ−Ｂ２写真乳 剤［コダック社（Ｋｏｄａｋ）］を用いて移入細胞のオートラジオグラフィー分 析を行なった。スライドガラス現像後、細胞を風乾し、マウンティング剤ととも にカバーガラスでマウントした。暗視野照明用分解トランスイルミネーターを使 用して、オリンパス。Ｍ−ＴＩ倒立位相差ＷＯＯ鏡下でスライドガラスを分析し た。

陽性プールの小分は スクリーニングした８６個のプールのうち１個のプール（＃１３）が陽性と判定 され、このプールに対応する細菌グリセリン液を滴定し、１ｏｏｏ個のクローン の２５個のプールを作成し、これらのプール由来のミニプレツブプラスミドを上 記のようにしてＣｏｓ細胞に移入した。１０００個のうち数個の陽性プールが同 定され、１個を１００１１１のコロニーの２５枚プレートとして再び平板培養し た。この陽性プレートの複製を作成し、集菌した。陽性プールが同定されたら、 個々のコロニーを対応するマスタープレートから取り上げ、３ｍｌの液体培地中 で１夜培養した。１００個のコロニーに相当する２次元格子を作成し、単一のク ローンＲ３−０Ｆを単離した。

Ｒ３−０ＦＦのクローニング ラムダＺＡＰＩＩ［ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）コに保持させた ２０８ＦラットｍＰ４芽細胞ライブラリーをクローンＲ３−ＯＦ挿入断片によっ て、高ストリンジエンシーでスクリーニングし、約６ｋｂの挿入断片を有する数 個のクローンを単離したが、そのうちの１つをＲ３−０ＦＦと呼フ。

ＤＮＡ配列決定と配列分析 シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）試薬［ユナイテッドステーツバイオケミ カルズ社（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　］を用 いるジデオキシチェーンターミネータ−法により二重ら旋ＤＮＡの配列を決定し た。ＢＬＡＳＴ　［アルドジュールら（ＡＩＴＧＦ−βのヨウ素標識 既報のクロラミン−Ｔ法Ｕチャイフエツッとアンビル（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ、Ｓ、 ａｎｄ　Ｊ、Ｌ、Ａｎｄｒｅｓ）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６３：１６ ９８４−１６９９１　（１９８８）］を用いてＴＧＦ−β１をヨウ素標識した。

化学的架橋 １０ｃｍベトリ皿上で培養した移入ＣＯ８細胞または３゜５ｃｍベトリ皿上で培 養したサブコンフルーエンドな（５ｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）　Ｌ　６およびＡ −１０１Ｈ胞を＋２’ｒ−ＴＧＦ−βＩとともに結合緩衝液（２０ｍＭ　Ｈｅｐ ｅｓ、ｐＨ７，５，５ｍＭ　Ｍｇ５Ｏｔ、０．５％ＢＳＡで緩衝したフレブス・ リンゲル液）中でインキュベートし、ＢＳＡ不含氷冷結合緩衝液で４回洗い、６ Ｏｔｇ／ｍｌジスクシニミジルスベラートを含有するＢＳＡ不合結合緩衝液とと もに４°Ｃ１回転速度一定下で１５分インキュベートした。結合緩衝液に７％シ ョ糖を加えることによって架橋を停止させた。細胞をかきとり、集め、遠心分離 によりベレット化し、次いて溶菌緩衝液（１０ｍＭｈリス、ｐＨ７，４，１ｍＭ 　ＥＤＴＡ、ｐＨ８゜０．１％トリトン−Ｘ１００．ＩＯμｇ／ｍｌペプスタチ ン、ＩＯμｇ／ｒｎＪロイペプチン、ＩＯａｇ／ｍＩアンチパイン、１００μｇ ／ｍｌ塩酸ベンズアミジン、１１００ａ／ｍｌダイズトリプシンインヒビター、 ５０μｇ／ｍｌアブロトニン、および１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオラ イド）に再懸濁した。可溶化物を７％５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、−７０ °ＣてＸ−ＡＲフィルム「コダック社（Ｋｏｄａｋ）」に密着させてオートラジ オグラフィー分析に付した。

既報［チャイフェッツとアンビル（Ｃｈｅｉｆｅｔｚ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｊ、Ｌ 、　Ａｎｄｒｅｓ）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：１６９８４ −１６９９１（１９８８）　、セガリニとセイエジン（Ｓｅｇａｒｉｎｉ、　Ｐ 、Ｒ，ａｎｄ　Ｓ、Ｍ、　５ｅｙｅｄｉｎ）。

イチナーゼとへパリチナーゼによる可溶化ＴＧＦ−β受容体の消化を行なった。

安定細胞系の作成 Ｌ６筋芽細胞を１０ｃｍペトリ皿に１０分の１づつ分割し、翌日、リン酸カルシ ウム法［チェノとオカヤマ（Ｃｈｅｎ、　Ｃ。

ａｎｄ　Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ）　、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、７ ：２７４５−２７５２　（１９８７）］により、ベクターｐｃＤＮＡ−ｎｅｏ　 ［インビトロゲン社（［ｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）　］に保持させたクローンＲ３− ＯＦとＲ３−０ＦＦを前後両方向に移入した。細胞は、肉眼で個々のコロニーが 見える様になるまで数週間、Ｇ４１８［ゲネチシン（ＧｅｎｅｔｌｃＩｎ）、　 ギブコ社（ＧＩＢＣＯ））の存在下の選抜に付した。これらのクローンを単離、 増幅した。

ＲＮＡプロット分析 塩化リチウム／尿素法［アラフレーとラウゲオン（Ａｕｆｆｒｅｙ、　Ｃ，ａｎ ｄ　Ｆ、　Ｒａｕｇｅｏｎ）　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 　１０７：３０３−３１３　（＋９８０）］によりラット組織ポリアデニル化ｍ ＲＮＡを調製した後、オリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィー［アビブとレ ゾル（Ａｖｉｖ　ａｎｄ　Ｌｅｄｅｒ）　、　１９７２］を行なった。複数の細 胞系からポリアデニル化ｍ　ＲＮ　Ａをプロテイナーゼに／ＳＤＳ法［ゴングら （Ｇｏｎｄａ、　Ｔ、　Ｊ、　ｅｔ　岨、）、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、２：６１７−６２４　（１９８２）］により調製した。ｍＲＮＡの試 料を１％アガロース−２，２Ｍホルムアルデヒドゲル上の電気泳動によって分析 し、ナイロン膜［パイオドリンス（Ｂｉｏｔｒｎｓ）、ＩＣＮ社］上にプロット し、ランダムプライミングにより３２ｐで標識したクローンＲｅ−０Ｆの２．９ ｋｂ挿入断片をプローブとしてインキュベートした［サムブロックら（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、）、　）Ｊｏｌｅｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ ：　Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　２ｄ　Ｅｄ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９）］　、　５０％ホルムアミド を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中４２°Ｃで１夜ノ１イプリダイゼー シヨンを行ない、−７０°ＣでＸ−ＡＲフィルムに密着させる前に、プロットを ５５℃で０．２Ｘ　ＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで洗った。

実施例１．　抗１１１Ｌ！受容体タンパク質抗体の製造と精製ＩＩＩ型受客受容 体分タンパク質分解によって生じたペプチドのミクロシーフェンシング まず、細胞性プロテオグリカンをヒト胎盤から精製し、次いで、ヘパリチナーゼ とコンドロイチナーゼによる酵素的脱グリコジル化に付した。１００−１３０キ ロダルトンの分子量範囲のタンパク質コアを調製用ゲル電気泳動によりさらに精 製した。これらのものはＩＩＩ型受客受容体んでいるはずであった。この部分精 製物をマウスの抗原として用いた。免疫化マウスから得られた８５０個のハイブ リドーマ系のスクリーニング後、３系が１００〜１２０ｋＤの脱グリコジル化ポ リペプチドを特異的に認識し免疫沈降させる抗体を産生することがわかった。こ のものは、全細胞を”’Ｉ−ＴＧＦ−βとともにインキュベートした後で共有架 橋を行なうことによって放射標識することができた。そのサイズはＩＩＩ型受客 受容体いて既報のタンパク質コアサイズと一致している［マツサーブら（Ｍａｓ ｓａｇｕｅ、　Ｊ、）　、　Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

６：５９７−６４１　（１９９０）コ　。

モノクローナル抗体９４を用いてアフィニティークロマトグラフィーによりラッ ト肝臓からＩＩＩ型受客受容体製した。精製受容体を部分タンパク質分解に付し 、生じたペプチドを高速液体クロマトグラフィーで分析した。数個のペプチドを ミクロシーフェンシングに付したところ、以下のすりゴペプチド配列が得られた 。

ペプチドＩ・ＩＬＬＤＰＤＨＰＰＡＬ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

、５） ペプチドＩＩ：ＱＡＰＦＰＩＮＦＭＩＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６） ペプチドＩＩＩ：ＱＰＩＶＰＳＶＱ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

ペプチドＩＶ：ＦＹＶＥＱＧＹＧＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

これらのペプチド配列を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使うクロー ニング法におけるプライマーとして、またはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ ングにおけるプローブとして機能する縮重オリゴヌクレオチドを横築した。この 方式は生産的ではなかったが、オリゴペプチド配列は、第２の代替法（実施例２ 参照）によって単離された受容体クローンの確認において有用であることがわか った。

実施例２．　１１Ｉ！！受容体ｃＤＮＡの発現クローニングＣＯ８細胞における 発現クローニング方法として、移入を受けたＣＯ８細胞中て個々のｃＤＮＡが顕 著な増幅を示すことを利用する手順をＴＧＦ−β受容体クローンを単離する代替 法として用いた。上記増幅は、ｃＤＮＡベクター中でＳＶ４０複製起点と相互作 用するＣＯ３細胞によって発現されたＳＶ４０大型Ｔ抗原が介在する［ゲアリン グら（Ｇｅａｒｉｎｇ。

（１９９］）　；　７シユーズとバーー（Ｍａｔｈｅｗｓ、　Ｌ、Ｓ、　ａｎｄ 　Ｖａｌｅ、　Ｗ。

Ｗ、）　、Ｃｅ１ｌ　６５：９７３−９８２　（！９９１）　コ　。

この方式は、３つの高親和性ＴＧＦ−β受容体のいずれも発現するラット血管平 滑筋細胞系であるＡ−ＩＱ細胞からＣＤＮパライブラリ−を構築することより成 るものであった。

生じたｃＤＮＡは、ＣＭＶ転写プロモーターとＳＶ４０複製起点を保持するベク ターｐｃＤＮＡ−１に挿入した。次いで、生じたライブラリーをそれぞれｔｏ、 ｏｏｏ個の独立の組替え体のプールに分割し、ガラスフラスケラト上で培養した １、５ｘ１０’１ｌｉｌ（７）ＣＯ３−７細胞に各プール由来（７）ＤＮＡをＤ ＥＡＥ−デキストラン移入法［アルーフオとシード（Ａｒｕｆｆｏ、　Ａ、　ａ ｎｄ　５ｅｅｄ、　Ｂ、）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８４：８５７３−８５７７（１９８７）　；ゲアリングら（Ｇｅａｒ ｉｎｇ、　Ｄ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ。

）　、　ＥＭＢＯＪ、　虹３６６７−３６７６　（１９８９）　；　７シユーズ とバーー（ｌＪａｔｈｅｗｓ、　Ｌ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｖａｌｅ、　Ｗ、Ｗ、）、 Ｃｅ１ｌ　６５：９７３−９８２　（１９９１）］によって移入した。移入され た細胞は４８〜６０時間培養し、次いで放射標識ＴＧＦ−β１に４時間曝露した 。この処理の後で、これらの細胞をのせたスライドガラスをよく洗い、固定した 。これらのスライドガラスを液体写真乳剤に漬け、暗視野顕微鏡で調へた。この 方法によってこれまでクローン化された受容体遺伝子はいずれも、ＣＯ３細胞中 での発現は検出不可能または低濃度レベルであるが、非移入ＣＯ３細胞がすでに 相当量のＩ　Ｔ　Ｉ梨ＴＣ；Ｆ−β受容体を発現しているという事実に当惑した 。！細胞あたり約２ｘｌＯ’個の受容体分子と推定される上記発現が、容認でき ないほど高レベルのバックグランド結合をもたらしたのかもしれない。しかし、 上記検出法は放射標識リガンドの個々の細胞上での結合を可視化するものである ので、本質的により高レベルのベクターニード化受容体を発現する偶発的細胞を 同定することが可能であると期待された。この期待は初期実験において正しいこ とが判明した。

このやり方による１００万個近いｃＤＮＡクローンのスクリーニングの後、２０ 個の陽性移入体を含むスライドガラスが同定された。１つの上記移入体の由来本 であるオリジナルの発現構築物プールを、それぞれ１０００個のクローンより成 る２５個のサブプールに分割し、これらを２ラウンド目のスクリーニングに付し た。さらに２ラウンドの姉妹選抜を行なったところ、その移入光であるｃｏｓ細 胞のうちの約ｌθ％において高レベルのＴＧＦ−β−結合性タンパク質を誘導し た２、９ｋｂの挿入断片を有するｃＤＮＡクローン（Ｒ３−ＯＦ）が生じた。

この結合の特異性は、２００倍過剰量の未標識ＴＧＦ−β競合体の添加が移入細 胞への”’Ｉ−ＴＧＦ−βの結合を強力に低下させることを示すことによって確 認した。１０％という移入効率と高いバックグランドの内生受容体結合を考慮に 入れ、各スライドガラスのこのｃＤＮＡクローンを移入した細胞への１！５Ｉ− ＴＧＦ−β結合の合計のレベル（図ＩＣ）は、モック移入体で見られるレベル（ データは示さない）より２倍高いだけであると計算した。それにもかかわらず、 このわずかなリガンド結合の増大はこのバックグランドレベルの受容体を発現す る多数の細胞のなかから数少ない移入体を同定するのに十分であった。

Ｒ３−０ＦのｃＤＮＡは、そのうちの３′側１８個がベクター配列によってコー ドされた８３６個のアミノ酸残基がら成るオーブンリーディングフレームをコー ドしたが、このことは、クローンＲ３−０Ｆはアラニン８１Ｂ特定コドンの位置 で未成熟終止してしまう不完全なｃＤＮＡ挿入断片であることをはっきりと示し ている（図４）。Ｒ３−ＯＦをプローブとして用いてラット２０８Ｆラムダフア ージライブラリーから全長ｃＤＮＡを単離した。このクローンをＲ３−０ＦＦと 名付けたが、長さは６ｋｂで、８５３個のアミノ酸から成るタンパク質をコード した。その配列はクローンＲ３−０Ｆのそれと共直線的であった。

３つのＴＧＦ−β受容体のうちのどれを特定するかを決めるために、全長クロー ンＲ３−０ＦＦ産物のキャラクタライゼーションを行なった。そうするために、 ＣＯ８移入体を放射標識ＴＧＦ−βとともにインキュベートし、化学架橋剤を加 え、標識化受容体をポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。

このやり方で細胞表面ＴＧＦ−β受容体を標識したところ、３つの異なる型が検 出された。これらには、分子量のより小さいｌ型およびＩＩ型の２つの受容体（ ６５ｋＤと８５ｋＤ）および２８０〜３３０ｋｄの拡散バンドとして泳動される 分子量のより大きいＩＩＩ型プロテオグリカンが含まれていた。該プロテオグリ カンをコンドロイチナーゼとヘパリチナーゼで酵素処理したところ、約１００ｋ ｄのコアタンパク質が得られた。２００倍過剰量の未標識ＴＧＦ−βｌによって 競合されたという点で、３つの受容体型すべてに対する結合が特異的であった。

Ｒ３−０ＦＦのｃＤＮＡの移入は、ＩＩＩ型受客受容体現の２倍増大をもたらし た。クローンＲ３−０ＦＦを移入したＣＯ３細胞から得た細胞溶解物を脱グリコ ジル化酵素で処理したところ、不均一な２８０〜３３０ｋｄのバンドは未移入Ａ ＩＯ細胞で見られるＩＩＩ型タンパク質コアとともに泳動されるタンパク質コア に変換された。重要なことに、該組替えタンパク質コアは内生ＣｏＳ細胞ＩＩＩ 型タンパク質コアと異なって泳動された。

これらの観察は、Ｒ３−０ＦＦｃＤＮＡを発現する安定移入細胞を用いた実験で 確認され拡張された。Ｌ６ラツト骨格筋筋芽細胞は、検出可能なＩＩＩ型ｍ　Ｒ Ｎ　Ａや内生ＩＩＩ型受客受容体現しないのが普通である（放射標識リガンド結 合測定による）。上記細胞にベクターｐｃＤＮＡ−ｎｅｏに保持させた単離ｃＤ ＮＡを移入した。ＣＭＶプロモーターに対して前後両方向でこのクローンを安定 的に発現する細胞クローンを単離し、リガンド結合測定法によって分析した。

全長クローンＲ３−０ＦＦまたは部分クローンＲ３−０Ｆを前方に導入したとこ ろ、ＩＩＩ型受客受容体規発現をもたらした。逆方向にｃＤＮＡを移入したＬ６ 細胞はこのタンパク質を発現しなかった。Ｒ３−０Ｆクローンを移入した細胞中 のＩ　Ｉ　ｌｆｆ１受容体のタンパク質コアの見かけサイズは、Ｒ３−０ＦＦ移 入細胞によって発現されるものより小さいが、これはそれぞれの核酸配列（図１ ）から予想されるタンパク質コアのサイズの違いと一致する。

予想外にも、ＩＩ型受容体に架橋される放射標識リガンドの量はＩＩＩ型ｃＤＮ Ａを発現する細胞中で２．５倍増大するのに対し、Ｉ型費容体に架橋される量は 変化しなかった。

この見かけ１特異的なＩＩ壓受容体へのリガンド結合のアップレギュレーション は、これまで分析した１５個の安定移入Ｌ６細胞系のいずれの場合も検出可能で あった。この効果は、全長クローンＲ３−０ＦＦだけでなく細胞質領域を欠く切 断クローンＲ３−ＯＦも関与しているようである。

実施例４．　ＩＩＩ型受客受容体現 ノーザンプロット分析によって、ＩＩＩ型受客受容体ｍＲＮＡ種類のラット組織 中で単一の６ｋｂのｍＲＮＡ分子として発現されることが示された。肝臓中のｍ ＲＮＡ発現レベルはその他の組織中より低かったが、この結果は放射性ヨウ素標 識ＴＧＦ−βｌを用いて行なわれた様々な組織の、より以前の研究から予想され たことである。この情報に基づけば、約６ｋｂのｃＤＮＡ挿入断片を有するクロ ーンＲ３−０ＦＦは全長ラットＩＩＩ型ｃＤＮＡクローンに該当すると思われる 。

マウス由来の細胞（ＭＥＬおよびＹＨ１６）は、ブタ、ラット、およびヒト由来 のものより小さい（約５．５ｋｂ）１１１型ｍＲＮＡ分子を発現するようである 。網膜芽細胞腫細胞系（Ｙ７９、Ｗｅｒ　ｉ−１，Ｗｅｒ　１−２４、およびＷ ｅｒｉ−２７）が顕著な例外として認められる以外は、これらの細胞のいずれに おいてもＩＩＩ型ｍＲＮＡの発現または欠損は検出可能細胞表面ＩＩＩ型受客受 容体現または欠損と一致している。これらの細胞は、検出可能なＩ　Ｉ　ＸＭ受 容体表面発現を欠いていることがすでに示されており、この結果はわれわれ自信 の未発表研究によって確認されている。容易に検出できるレベルでＩＩＩ型受容 体タンパク質を本当に発現するその他の細胞のレベルと同等のレベルでこれらの 細胞中でｌ１ｌｆｆｌ受容体ｍＲＮＡが発現されることは興味深い。現時点では 、正常網膜芽細胞（ＡＤ　ｌ　２）においてかなりあるＴＧＦ−β受容体ＩＩＩ 型発現は、おそらく転写後機構によってこれらの網膜芽細胞腫細胞中でダウンレ ギュレーションされていると結論づけることができるだけである。

実施例５．　全長ＴＴＴ型ｃＤＮＡの配列分析実施例４で説明する全長ｃＤＮＡ クローン（Ｒ３−ＯＦＦ）を配列分析に付した。全長リーディングフレームをフ ランキング配列とともに図１に示す。このリーディングフレームは８５３個のア ミノ酸残基から成るタンパク質をコードするが、これは完全脱グリコジル化ＴＧ Ｆ−β１１１１型受容体で見られる１００ｋＤのサイズと一致する。

誘導タンパク質配列の２つの断片（下線およびイタリック、残基３７８−３８８ および４２７−４３４）は、精製受容体タンパク質の直接生化学的分析によって すでに決定されているものと厳密に一致する。このことから、この単離ｃＤＮＡ クローンがラットＩＩＩ型受容体をコードすることも確認された。

このＴＧＦ−β結合性タンパク質はサイトカイン受容体としては珍しい構造を有 する。ヒトロバシー分析で、Ｎ末端シグナル配列とそれに続く長い親水性Ｎ末端 領域が示される［端側２７残基から成る領域（下線部分、残基７８６−８１２） は単一の推定質膜ドメインにあたる。このことは、受容体のほぼ全体が、Ｃ末端 付近の細胞膜に固定されたＮ末端細胞外ドメインから成ることを示唆するもので ある。４１残基から成る比較的小さなＣ末端テイルは推定細胞質ドメインにあた る。

クローンＲ３−ＯＦも分析し、同一のオーブンリーディングフレームを有するが 最後のコード化残基がアラニン８１８であるＲ３−０ＦＦの切断体であることが わかった（図１）Ｒ３−ＯＦＦには、６個のコンセンサスＮ結合グリコジル化部 位と１５個のシスティンが存在する（図１に示す）。セリン５３５の位置に少な くとも１個のコンセンサスグリコサミノグリカン付加部位が存在し［ベルンフィ ールドとホッパｅｒ−Ｇｌｙ残基も存在する。コンセンサスタンパク質キナーゼ Ｃ部位も残基８１７に存在する。

今までに記載された唯一のその他の遺伝子、すなわち内皮細胞によって大量に発 現されるエンドプリンと呼ばれる糖タンパク質［ボウゴスとレタルテ（Ｇｏｕｇ ｏｓ　ａｎｄ　Ｌｅｔａｒｔｅ）　、　１９９０コだけが関連アミノ酸配列を含 んでいる。総じて、６４５個のアミノ酸残基から成るエンドプリンの全長にわた りＩＩＩ型受客受容体３０％の相同性がある。ＩＩＩ型受客受容体ントゲリンの 配列の間で最も相同性が高い領域（７４％相同）は主に推定質膜ドメインと細胞 質ドメインに存在する。ｌＩＩ型受客受容体体構造同様に、エントゲリンは、お そらく細胞外にある大型の親水性Ｎ末端ドメインとそれに続く推定質膜ドメイン と４７個のアミノ酸残基から成る短い細胞質テイルを含有する糖タンパク質であ る。エントゲリンはエクトドメイン上のｒＲＧＤＪ配列とその他の接着分子の相 互作用によって細胞どうしの認識に関与しているかもしれないことが示唆されて いるが、エントゲリンの生物学的役目は不明である。ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体 と異なり、エントゲリンはＧＡＧグループを保持しない。

均等物 当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述べた発明の具体的態様 に対する多くの均等物を認識しまた確認し得るであろう。そのような均等物は下 記のクレームの範嗜に含まれるものである。

ＡＴＧ　ＧＣｋ　ＧＴＧ　ＡＣＡ　ＴＣＣＣＡＣＣＡＣＡＴＧ　ＡＴＣＣＣＧ　 ＧＴＧ　ＡＴＣＧＴＴ　ＧＴＣＣＴＧ　ＡＴＧ　４ｅＭａｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｍｅｔ　Ｘ１ｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　 Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｍａｔ@１６ ＡにＣＧＣＣＴＧＣＣＴに　ＧＣＣＡＣＣＧＣＣＧＧＴ　ＣＣＡ　ＧＡＧ　ＣＣ ＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＴ　ＣＡＡ　９６ＣＴＧ　ＴＣＡ　ＣＣＡ　ＡＴＣＡ ＡＣＧＣＣＴＣＴ　ＣＡＣＣＣＡ　ＧＴＣＣＡＧ　ＧＣＣＴＴＧ　ＡＴＣＧＡＧ 　ＡＣＣ１４４Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　工ｌｅ　Ａ＋ｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｈ Ｌｍ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　５＊ｒ@４ ８ ＴＴＣＡＣＣＧＴＴ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　にＧＣＴＧＴ　ＧＣＣＡにＣＡＧＡ　Ｇ ＧＣＡＣＣＡＣＣにＧ１ｆｆ　ＣＴＣＣＣＡ　１９２Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｌｅｕ　５ｅｒ　にＡｙ　Ｃｙｓ　ＡＩＪＩ　ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ 　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒ潤@６４ ＡＧＯにＡＧ　ＧＴＣＣＡＴ　ＧＴＣＣＴＡ　ＡＡＣＣＴＣＣＣＡ　八ＧＴ　Ａ ＣＡ　ＣＡＴ　ＣＡＧ　ＧＣＡ　ＣＣＡ　ＧＧｃ　２４０Ａｒｇ　にＧＬｕ　Ｖ ａｌ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　５ｅｒ　丁ｈｒ　Ａ ｓｐ　Ｇｉｎ　にＧｌｙ　Ｐｒｏ　にfｌｙ　８０ ＣＡＧ　ＣＯＧ　ＣＡＧ　ＡＧＡ　にＡＧ　ＧＴＴ　ＡＣＣＣＴＧ　ＣＡＣＣＴ Ｇ　ＡＡＣＣＣＣＡＴＴ　ＧＣＣＴＣＧ　ＧＴＧ　２Ｂ８Ｇｌｎ　ｋｒｑ　Ｇｉ ｎ　ｋｒｑ　Ｇｌｕ　Ｖａｌτｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ 工ｌｅ　Ａｌａ　５ｅｒ　Ｖａｌ　９U ＣＡＣＡＣＴ　ＣＡＣＣＡＣＡＡＡ　ＣＣＴ　ＡＴＣにＴＯＴｒＣＣＴＣＣＴＣ 入ＡＣ丁ＣＣＣＣＣＣＡＧ　ＣＣＣ３３６Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　）Ｉｉｓ　ＨＬｍ　 Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　工ｌｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓ＠ｒ　 Ｐｒｏ　（ｉｌｎ　Ｐ窒潤@１１２ ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＣＡＴ　ＣＴＧ　ＡＡに　ＡｃＧ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　 ＣＴＣＧＣＣＧＣ’ｒ　にＣＴ　ＧＴＣＣＣＣＡＣＡ　コ８S Ｌｓｕ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　ｔｉｌｌ　Ｌ＠１１　ＬＹＩＩ　Ｔｈｒ　ＧＬｕ　Ａ ｒｇ　Ｌ＠ｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　`Ｊ−ｑ　１２８ ＣＴＣＴＴＣＣＴＧ　にＴＴ　ＴＣＧ　にＡＧ　ＧＣ；Ｔ　ＴＣＴ　ＧＴＧ　Ｃ ＴＣＣＡＣＴＴＴ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　入＾Ｃ４３２ＴＴＣＴＣＣ７７に 　ＡＣＡ　ＧＣｋ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　八ＧＯＡＡＴ　ＴＴＣＣ ＣＴ　ＣＡＡ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　４８０Ｐｈｅ　ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌ ａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ｃｌｕ　ｈｔｑ　八８ｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｉ ｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ@１６０ にＭ　ＣＡＴ　ＣＴＣＣＴＧ　ＣＧＣτｃｃ　ｃｃｅ　ｃＡＡ　ＡＡＧ　ＧＡＡ 　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＡＣＴ　ＴＣＧ　５２a Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　八ｒｇ　Ｔｒｐ　八ｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｃ１ｙ　ｘｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ@１７６ ＴＴＣへＣＴＧへ＾　ＣＴＣＭＧ　ＡＴＡ　にＣＡ　Ｍ；Ａ　ＡＡＣＡＴＣＴＡ Ｔ　ＡＴＴ　入ＡＡ　ＧＴＧ　Ｇｌｌ；Ａ　Ｃ；八Ａ　５７U Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　にＧＬｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙ＋ｉ　Ｉｌｅ　八１ａ　八【９　八！ Ｉｎ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　ＸＬｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　にＧｌｙ@Ｇｌｕ　１９２ 補正書の写しく翻訳文）提出ｉ！（特許法第１８４条の８）平成６年４月２７１

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．脊椎動物由来のＴＧＦ−β受容体をコードする単離されたＤＮＡ又はそれに 対してハイブリダイズする及び脊椎動物由来のＴＧＦ−β受容体をコードするＤ ＮＡ。
2. ２．ＴＧＦ−β受容体がＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体又はＴＧＦ−βＩＩ型受容体 である請求項１の単離されたＤＮＡ。
3. ３．哺乳類由来の請求項２の単離されたＤＮＡ。
4. ４．ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするネズミ若しくはヒト由来の単離され たＤＮＡ又はそれに対してハイブリダイズするＤＮＡ。
5. ５．図１のヌクレオチド配列又はＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするのに充 分なそれの一部分を有する請求項４の単離されたＤＮＡ。
6. ６．ＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするネズミ若しくはヒト由来の単離された ＤＮＡ又はそれに対してハイブリダイズするＤＮＡ。
7. ７．図２のヌクレオチド配列又はＴＧＦ−βＩＩ型受容体をコードするのに充分 なそれの一部分を有する請求項６の単離されたＤＮＡ。
8. ８．哺乳類由来の単離されたＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体。
9. ９．図１のアミノ酸配列又は実質的に類似のアミノ酸配列を有する請求項８の単 離されたＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体。
10. １０．哺乳類由来の単離されたＴＧＦ−βＩＩ型受容体。
11. １１．図３のアミノ酸配列又は実質的に類似のアミノ酸配列を有する請求項１０ の単離されたＴＧＦ−βＩＩ型受容体。
12. １２．哺乳類由来の組み換えＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体。
13. １３．図１のアミノ酸配列又は実質的に類似のアミノ酸配列を有する請求項８の 組み換えＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体。
14. １４．哺乳類由来の組み換えＴＧＦ−βＩＩ型受容体。
15. １５．図４のアミノ酸配列又は実質的に類似のアミノ酸配列を有する請求項１０ の組み換えＴＧＦ−βＩＩ型受容体。
16. １６．可溶性ＴＧＦ−β受容体。
17. １７．可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体である請求項１６の可溶性ＴＧＦ−β受 容体。
18. １８．アミノ酸配列が図１のアミノ酸１から７８５までを含めた、若しくは実質 的に類似のアミノ酸配列である請求項１７の可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体。
19. １９．可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体である請求項１６の可溶性ＴＧＦ−β受容 体。
20. ２０．アミノ酸配列が図３のアミノ酸の約１から１６６までを含めた、若しくは 実質的に類似のアミノ酸配列である請求項１９の可溶性ＴＧＦ−β受容体。
21. ２１．哺乳類由来のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を特異的に認識する抗体。
22. ２２．モノクローナル抗体である請求項２１の抗体。
23. ２３．哺乳類由来の可溶性ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を特異的に認識する抗体。
24. ２４．哺乳類由来の可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を特異的に認識する抗体。
25. ２５．可溶性ＴＧＦ−β受容体及びＴＧＦ−βの結合に適した条件下で、可溶性 ＴＧＦ−βＩＩ型若しくはＩＩＩ型受容体を細胞と結合させることからなる、細 胞表面上のＴＧＦ−βＩＩ型若しくはＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性を 変える方法。
26. ２６．ＴＧＦ−βの結合性が阻害される請求項２５の方法。
27. ２７．ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の発現及びＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受 容体との結合に適した条件下で、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体の発現に適切な発現 系において、細胞をＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体をコードするＤＮＡと結合させる ことからなる、細胞表面上のＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性 を変える方法。
28. ２８．ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性、ＴＧＦ−βＩＩ型受 容体へのＴＧＦ−βの結合性、若しくはその両方を改変するのに充分な量におい て、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩ ＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体と結 合するＴＧＦ−β若しくはその組み合わせからなる群から選ばれたＴＧＦ−β受 容体を哺乳類に投与することからなる、哺乳類においてＴＧＦ−βの効果を制御 する方法。
29. ２９．治療に用いられる、請求項８〜２０いずれか記載のＴＧＦ−β受容体。
30. ３０．治療に用いられる、請求項２１〜２４いずれか記載の抗体。
31. ３１．細胞表面上のＴＧＦ−βＩＩ型若しくはＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの 結合性を改変（例えば、阻害）する薬剤の製造のための、請求項８〜２０いずれ か記載のＴＧＦ−β受容体の使用。
32. ３２．哺乳類においてＴＧＦ−βの影響を制御する際に用いられる薬剤の製造の ための、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ− βＩＩＩ型受容体、可溶性ＴＧＦ−βＩＩ型受容体、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体 と結合するＴＧＦ−β若しくはその組み合わせからなる群がら選ばれたＴＧＦ− β受容体の使用。
33. ３３． ａ） １）ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現する哺乳類の細胞、 ２）標識化ＴＧＦ−β、及び ３）評価される化合物、 を結合し、 ｂ）ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体に結合するのに充分な条件下で（ａ ）の生産物を維持し、ｃ）評価される化合物の存在下でＴＧＦ−βのＴＧＦ−β ＩＩＩ型受容体への結合性の程度を測定し、並びにｄ）（ｃ）でなされた測定と 評価される化合物の非存在下で起きたＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へ の結合性の程度とを比較する、 工程からなる、ここで、もしＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性 が、評価される化合物の非存在下においてより評価される化合物の存在下におい ての方が小さいなら、評価される該化合物はＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧ Ｆ−βの結合を妨害することになる、ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体へのＴＧＦ−β の結合を妨害する化合物の能力の評価方法。
34. ３４．ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現する細胞が一つの細胞系である請求項３ ３の方法。
35. ３５．ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現する細胞がＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を 発現するように改変された細胞である請求項３４の方法。
36. ３６．ＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体を発現するように改変された細胞が、適切なベ クター中のＴＧＦ−β受容体ｃＤＮＡがそれらに組み込まれた若しくはＴＧＦ− β受容体ＲＮＡを顕微注入された細胞である請求項３５の方法。
37. ３７． ａ） １）ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する哺乳類の細胞２）標識化ＴＧＦ−β、及 び ３）評価される化合物、 を結合し、 ｂ）ＴＧＦ−βがＴＧＦ−βＩＩ型受容体に結合するのに充分な条件下で（ａ） の生産物を維持し、ｃ）評価される化合物の存在下でＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩ Ｉ型受容体への結合性の程度を測定し、並びにｄ）（ｃ）でなされた測定と評価 される化合物の非存在下で起きたＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合 性の程度とを比較する、 工程からなる、ここで、もしＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結合性が 評価される化合物の非存在下においてより、評価される化合物の存在下において の方が小さいなら、評価される該化合物はＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ− βの結合を妨害すると評価される、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体へのＴＧＦ−βの結 合を妨害する化合物の能力の評価方法。
38. ３８．ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する細胞が一つの細胞系である請求項３７ の方法。
39. ３９．ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現する細胞がＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現 するように改変された細胞である請求項３８の方法。
40. ４０．ＴＧＦ−βＩＩ型受容体を発現するように改変された細胞が、遺切なベク ター中のＴＧＦ−β受容体ｃＤＮＡがそれらに組み込まれた若しくはＴＧＦ−β 受容体ＲＮＡを顕微注入された細胞である請求項３９の方法。
41. ４１．ａ）結合性が評価される個体から得られたサンプル中の細胞によるＴＧＦ −βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容体若しくはＴＧＦ−βＩＩ型受容体への結合の程 度を測定し、それによってテスト結合値を取得し、及び ｂ）（ａ）の結果と、対照結合値となる、ＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容 体若しくはＴＧＦ−βＩＩ型受容体への異常な結合が既に知られた細胞である対 照細胞の細胞表面において起こる結合の程度とを比較する、ことからなる、ここ で、対照待合値と同程度のテスト結合値はＴＧＦ−βのＴＧＦ−βＩＩＩ型受容 体若しくはＴＧＦ−βＩＩ型受容体への異常な結合を示す、細胞表面上のＴＧＦ −βＩＩＩ型受容体又はＴＧＦ−βＩＩ型受容体に対するＴＧＦ−βの異常結合 の検出方法。