KR20160018451A - 캡슐화된 안타고미르를 포함하는 조성물 - Google Patents

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KR20160018451A
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아마데오 페레즈
네우스 벨레라 고타르다
안토니오 로드리게즈 시노바스
이그나시 바르바 베르트
안토니오 다비드 가르시아-도라도 가르시아
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삐에르 파브르 메디까망, 쏘시에떼 아노님
펀다시오 프리바다 인스티튜트 디 레세르카 호스피탈 유니버시타리 발 헤브론
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Abstract

본 발명은 혈관생성에 관련된 적어도 하나의 miRNA, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것이며, 상기 억제자는 폴리머 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어로 미세 캡슐화된다. 또한 본 발명은 국소 빈혈(ischemy)에 의해 유발되는 심장 질환을 포함하는 심장 질환을 예방 또는 치료하기 위한 상기 조성물의 용도와 관련된다.

Description

캡슐화된 안타고미르를 포함하는 조성물{Composition comprising an encapsulated antagomir}
본 발명은 허혈성 심장 질환(cardiac ischemic disorders)을 포함하는 심장 질환을 예방 또는 치료하는 것을 목적으로 하는 약학적 조성물의 분야에 관한 것이다.
소위 심근경색(myocardial infarction) 및 심장 마비(heart attack)으로 일반적으로 알려진, 급성 심근경색(Acute myocardial infarction, AMI)은 전세계에 가장 산업화된 국가에서 주요한 건강 위험 요인을 나타내며 전세계적인 질병(morbidity) 및 사망(mortality)의 주된 원인으로 남아있다.
일반적으로 AMI는 관상 동맥의 협소화 또는 폐색(occlusion)의 통상적 결과인, 심장 조직에 혈류의 급성 및 만성 부족에 의해 유발된다. 적절한 혈액 공급이 없으면, 조직은 허혈성이 되며, 심근(심장 근육 세포) 및 혈관 구조의 사멸을 일으킨다.
최근 수십년간 약학적인 요법과 함께 관상 동맥의 재관류와 주로 관련된, AMI의 치료에 많은 진보가 있었다. 재관류 요법은 경색부(infarcted area)를 감소시킴으로써 AMI의 자연적인 진행을 변화시키고 단기 및 장기 질병 및 사망을 개선시키는데 성공했다. 그러나, 현재 활용 가능한 두가지 재관류 전략의 사용은 실질적인 제한이 있다: 섬유소 분해(fibrinolysis)는 관상동맥 투과성의 낮은 정도를 초래하고 1차 혈관 성형술(primary angioplasty)은 AMI의 발전의 초기 단계(initial hours) 동안 종종 적용될 수 없다. 나아가, 일부 카테터 삽입 환자에서, 일반적인 심외 흐름(epicardial flow) 발생에도 불구하고 "무환류(no reflow)" 현상 또는 미세혈관 재관류의 부재는 불리한(in adverse) 기능적 결과를 초래한다. 이는 재관류 요법이 심실 팽창(ventricular dilatation), 수축성 기능장애(contractile dysfunction) 및 이후 심부전(heart failure)를 초래하는 콜라겐 흉터 형성의 복잡한 고유의 수리 과정, 심근의 해로운 리모델링(deleterious remodeling)의 발생을 예방하지 못함을 의미한다. AMIs의 거의 30% 이내, 이의 발현은 보다 큰 경색 크기, 미세혈관 장애(microvascular obstruction)와 주로 관련되고 바람직하지 못한(unfavourable) 회복 반응은 아직 거의 밝혀지지 않았다.
수리(reparative) 섬유증 및 허혈성 조직의 기능적 회복은 산소가 공급된 혈액을 공급하는 네트워크를 형성하는 것에 의존적하기 때문에, 노력들은(efforts) 기능적 조직의 원위치(in situ)에 상처 부위의 직접 전환(direct conversion)을 수행하기 위한 치료 부위 내 신생혈관생성(neoangiogenesis)을 유도함에 의해 혈관상(vascular bed)을 증진시키도록 하였다.
혈관생성의 요법적 유도는 이러한 현상의 발생을 약화시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 정맥내 신생혈관생성(proangiogenic) 인자와 함께 임상적 진료의 수년의 결과는 만족스럽지 못하였다. 이론으로 연결되지 않고, 이러한 실패를 설명하는 이유 가운데 하나는 정맥 내 경로가 촉진하기 위한 타겟 조직 내에 약물의 효과적인 농도에 이르고 유지할 수 없으며 심하게 손상된(compromised) 심장 상태 하에 기능적인 관 네트워크를 유지하기 때문인 것으로 생각된다.
이러한 문제를 해결하고 포스트-AMI 심장 부전(post-AMI cardiac insufficiency)을 예방하기 위하여, 심장 근육 및 혈관을 재생성(regenerating)의 가능성에 대한 연구가 지난 십년 내에 시작되었다. 다능성 전구 세포(pluripotent progenitor cells)를 투여하고 혈관(vascular) 성장 인자를 융합하는 초기 연구는 유망한 결과를 보였으나 임상적 셋팅(setting)에 변형(translation)은 손상된 심장 근육을 회복하기 위하여 적절한 환경 내에 신생혈관(neovasculature) 재생성하는데 이들 요법의 불능(inability)을 보였다.
현재, 세포 요법 뿐만 아니라 특정한 약물 및 재동기화(resynchronization) 요법으로 손상된 심장의 혈관생성(angiogenesis) 및 재증식(repopulation)은 이러한 현상의 진전을 지연시킬 수 있으나 이의 발현의 예방은 심장 의학에 대한 의문 과제(doubting challenge)로 남아있다. 따라서 부정적인(adverse) 좌심실 리모델링을 예방하기 위한 새로운 치료 전략이 요구된다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 혈관생성에 관련된 적어도 하나의 miRNA, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는 국소 빈혈(ischemy)에 의해 유발되는 심장 질환을 포함하는 심장 질환을 예방 또는 치료하기 위한 상기 조성물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 마이크로 RNAs의 활성 또는 발현을 조절함으로써 심실(ventricular) 리모델링을 역전(reverses) 또는 예방하는 조성물을 투여함으로써 심장의, 바람직하게 허혈성 질환의 치료에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 혈관생성에 포함되는 마이크로RNA의 억제자를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 억제자는 바람직하게 허혈성 타겟 조직에 국소적으로 억제자를 방출할 수 있는 새로운 전달 수송체(vehicle)로 합성된다. 추가적으로, 본 발명은 심실 리모델링을 역전 또는 예방하는 방법 및 상기 방법에 유용한 키트를 제공한다.
본 발명은 혈관생성에 포함되는 적어도 하나의 miRNA, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 억제자는 중합체의(polymeric) 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어로 미세 캡슐화된다.
상기 설명된 조성물의 일부 실시예에서, 상기 miRNA는 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함)를 포함하는 패밀리(family)에서 선택된다.
상기 설명된 조성물의 일부 실시예에서, 상기 miRNA의 억제자는 상기 miRNA, 또는 이의 전구체를 타겟으로 하는 서열을 갖는 8-49 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오티드이다. 특정한 실시예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 타겟 miRNA, 또는 이의 전구체의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드이다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide), 데옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide), 스몰 RNA(small RNA), 안타고미르(antagomir), LNA, CDNA, PNA, 몰폴리노(morpholino) 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
상기 설명된 조성물의 일부 실시예에서, 상기 miRNA의 억제자는 안타고미르(antagomir)로 이루어지며, 바람직하게 본 발명에 설명된 SEQ ID No. 1 내지 58로 이루어진 그룹에서 선택된 서열의 뉴클레오티드에 상보적인 적어도 16개 근접한(contiguous) 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안타고미르로 이루어진다.
상기 설명된 조성물의 일부 실시예에서, 상기 miRNA의 억제자는 서열 SEQ ID No. 59 또는 60 및 이의 염기 치환을 제외하는 변형, 및 이의 적어도 8개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스(subsequences)로 이루어지는 절편을 포함하는 안타고미르로 이루어진다.
상기 설명된 조성물의 일부 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 25 μm를 초과하지 않는 직경을 나타내며, 5 내지 20 μm, 우선적으로(preferentially) 5 내지 15 μm로 구성된 직경을 갖는 마이크로스피어를 포함한다.
상기 설명된 조성물의 일부 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 폴리-d,l-락티드 (PLA)로 이루어진 폴리머로 구성되며, 상기 폴리머는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 다른 폴리머와 혼합된다.
또한, 본 발명은 상기 설명된 조성물의 유효량을 상기 개체(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 개체 내에 심실 리모델링을 역전 또는 예방하기 위한 방법에 관련된다.
또한, 본 발명은 심근 경색증의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어의 개체군(population)과 관련되며, 상기 마이크로스피어는:
- 5 내지 20 μm, 우선적으로 5 내지 15 μm로 구성된 평균 직경을 가지며;
- 폴리-d,l-락티드-코-글리콜라이드 (poly-d,l-lactide-co-glycolide, PLGA) ; 폴리-d,l-락티드 (poly-d,l-lactide, PLA) 또는 이의 혼합물로 구성되며;
- 심실 리모델링을 예방할 수 있는 1% 내지 15% w/w의 치료제를 포함하며,
상기 치료제는 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함) 및 보다 우선적으로 miR-92a, 또는 이의 전구체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miRNA의 억제자로 이루어진다.
본 발명의 조성물은 국소 빈혈에 의해 유발되는 심장 질환을 포함하는 심장 질환을 예방 또는 치료하는데 유용하다.
도 1은 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy)을 통해 결정된 안타고미르-92a - PLGA 마이크로스피어의 형태를 나타낸다;
도 2는 레어지 빛 산란에 의해 결정된 안타고미르-92a - PLGA 마이크로스피어의 크기 분포를 나타낸다;
도 3은 120mg까지 마이크로스피어의 반복된 주사에 의해 혈류역학(hemodynamic) 및 좌심실 수축성(contractibility)에 효과를 나타낸다;
도 4는 240mg까지 마이크로스피어의 반복된 주사에 의해 혈류역학 및 좌심실 수축성에 효과를 나타낸다;
도 5는 본 발명에 따르는 마이크로스피어의 단일 관상동맥내 주사의 분자적 효과의 연구의 프로토콜을 나타낸다;
도 6은 본 발명에 따르는 마이크로스피어에 의한 miR-92a 억제 특이성을 나타낸다;
도 7은 캡슐화된 안타고미르-92a가 경색증 조직 내에 혈관생성을 유도함을 나타낸다. 경색된 구역 내 혈관 밀도는, 혈관의 총 수를 총 경색된 부위로 나누어 계산된다. N=20. * P<0.01;
도 8: 간접 측정(Indirect Measurement). 기초 및 최소의 미세혈관성 내성(microvascular resistance) 지표(index)는 캡슐화된 안타고미르-92a, 플라시보 또는 식염수로 처리된 미니피그의 동맥과 관련된 경색에서, AMI 한달 이후에 측정되었다. (a) 기초 미세혈관 내성 지수(MRI)는 정단(apical) LAD (Pd) 에 위치한 압력선(pressure wire)으로 측정된 압력 (mmHg) 및 LAD의 말단(diatal) 부분에 위치한 센서에 의해 정량된 관상 혈류(coronary flow) (ml/min)를 곱하여 계산되었다. 최소 미세혈관 내성 지수 (MRIhyp)는 대퇴정맥(femoral vein) 12F 시스(sheath)를 통해 투여된 아데노신의 140 micro/Kg/min의 정맥 내 주입으로 수행된 최대 충혈(maximal hyperemia)에서 측정된 동일한 파라미터로 계산되었다. n= 12 * p<0.01 ** p=0.05 (b) 괴저성 부위 내 혈관의 총 수 및 MRI 사이의 상관 관계. R2 0.41, p=0.02, n=12. (c) 괴저성 부위 내 혈관의 총 수 및 최소 MRI 사이의 상관 관계. R2 0.27, p=0.08, n=12;
도 9: 직접 측정(Direct Measurement). 기초 및 진정(true) 미소순환(microcirculatory) 저항은 캡슐화된 안타고미르-92a로 처리 및 비처리된 미니피그의 경색증 관련된 동맥 내에 AMI 한달 이후 측정되었다. (a) 베이스라인 미소순환 저항 (baseline MR)은 정단 LAD (pd)에 위치한 압력선으로 측정된 압력 (mmHg)를 LAD의 말단 부위에 위치한 센서에 의해 정량된 관상 혈류 (ml/min)로 나누어 계산되었다. 베이스라인 mR은 대조군에 비해 처리된 그룹에서 현저하게 감소되었다 (7.47±1.33 vs 19.62±2.98, p=0.005). n=13. 진정 미소순환 저항 (TMR (hvp))는 대퇴정맥 12F 시스(sheath)를 통해 투여된 아데노신의 140 micro/kg/min의 정맥내 주입으로 수행된 최대 충혈 동안 동일한 파라미터로 측정하여 계산되었다. 현저하게 낮은 TMR (hyp)는 대조군에 비해 처리된 그룹에서 관찰되었다 (5.0±1.15 vs 14.49±2.4, p= 0.006). n= 13 (b) 모든 괴사 부위 내 혈관 밀도 및 베이스라인 MR 사이의 상관 관계. R2=0.35, P=0.033, n=13. (c) 모든 괴사 부위 내 혈관 밀도 및 TMR (hyp) 사이의 상관 관계. R2=0.31, P=0.047. n=13.
도 10: AMI 한달 이후, 격막정단 운동장애(septoapical diskynesia)의 존재는 할당된 치료에 블라인드(blind)하여 초음파 심장 검사기(echocardiographer)를 통해 평가되었다. 치료 및 비치료된 동물에서 격막정단 운동장애를 갖는 동물의 백분율이 나타났다 (83.3% vs 16.7%, p=0.03). n=20.
도 11: 인비트로(in vitro)에서 miR92a의 발현에 캡슐화된 안타고미르 92a 및 비캡슐화된 안타고미르 92a의 효과의 평가.
도 12: 그들 각각의 miRNAs에 캡슐화된 안타고미르 17 및 20a의 효과
본 발명의 상세한 설명
본 발명에 포함되는 모든 실시예들의 설명에 관하여 일부 정의가 하기에 주어진다.
마이크로RNAs (miRs)는 생물학적 과정의 주요 조절자로서 나타나는 작은, 비코딩 RNAs이다.
"마이크로RNA", "miRNA" 또는 "miR"은 약 18 내지 약 25 뉴클레오티드 길이의 비코딩 RNA를 의미한다. 이들 miRs는 하기를 포함하는 다중 원천으로부터 유래될 수 있다: miRNA를 코딩하는 개별적인 유전자, 단백질을 코딩하는 유전자의 인트론으로부터, 또는 마이크로RNAs와 매우 관련된, 멀티플(multiple)을 보통 코딩하는 폴리-시스트로닉 전사체로부터.
현재 지식은 miRNAs는 RNA 폴리머라제 II (pol II) 또는 RNA 폴리머라제 III (pol III)에 의해 전사되고 일반적으로 수천개의 염기 길이인, 일차 miRNA 전사체 (pri-miRNAs)로 명명되는, 초기 전사체로부터 발생함을 보여준다. Pri-miRNAs는 약 70 내지 100 뉴클레오티드 헤어핀 형태의 전구체 (pre-miRNAs)로 RNase 드로샤(Drosha)에 의해 핵 내에서 가공된다. 세포질 수송에 따라, 헤어핀 pre-miRNA는 이중 가닥 마이크로RNA를 생산하기 위해 다이서(Dicer)에 의해 추가적으로 가공된다; 가닥의 하나, 소위 성숙 마이크로RNA는, (종종 양쪽 가닥 모두가 사용될 수 있음) 이후, 염기쌍 상보성에 의해 이의 타겟 mRNAs와 관련된, RNA-유도된 사일런싱 복합체 (RISC)로 통합되었다. miRNA 염기가 메신저 RNA (mRNA) 타겟과 완전하게 짝을 짓는 상대적으로 드문 경우에, 이는 mRNA 분해를 촉진한다. 보다 일반적으로, 타겟 mRNAs와 불완전한 이형이중가닥(heteroduplexes)으로부터 마이크로RNAs는 mRNA 안정성 또는 mRNA 번역을 억제하는 것에 영향을 미친다.
"스템-루프(stem-loop) 서열"은 헤어핀 구조를 가지며 성숙 마이크로RNA 서열을 포함하는 RNA를 의미한다. Pre-miRNA 서열 및 스템-루프 서열은 오버랩(overlap)될 수 있다. 스템-루프 서열의 예시는 miRBase로 알려진 마이크로RNA 데이터베이스에서 발견된다.
"마이크로RNA 전구체"는 유전체 DNA로부터 유래되고 하나 이상의 마이크로RNA 서열을 포함하는 비코딩, 구조가 있는(structured) RNA를 포함하는 전사체를 의미한다. 예를 들어, 특정한 실시예에서 마이크로RNA 전구체는 pre-miRNA이다. 특정한 실시예에서, 마이크로RNA 전구체는 pri-miRNA이다.
하기 설명은 대문자가 아닌 "mir-X"는 pre-miRNA를 의미하는 반면, 대문자 "miR-X"는 성숙한 형태를 의미하는 표준 명명(nomenclature) 시스템을 따른다. 두가지 성숙 마이크로RNAs는 동일한 pre-miRNA의 양쪽 암(arms)으로부터 유래하고, 그들은 -3p 또는 -5p 접미사로 나타낸다. 상대적인 발현 수준이 알려졌을 때, 명칭에 따르는 별표(asterisk)는 헤어핀의 반대쪽 암에 마이크로RNA에 상대적인 낮은 수준으로 발현된 마이크로RNA를 지시한다.
하기 설명에서, 달리 구체화되지 않는다면, 표현 miR-X의 용도는, 만약에 있다면, -3p 및 -5p 형태 모두를 포함하는 성숙 miRNA를 의미한다.
의심을 회피하기 위해, 본 발명의 상세한 설명에서, 표현 마이크로RNA, miRNA 및 miR은 동일한 생산물을 지정한다.
본 발명의 맥락에서, 본 발명은 결과적으로, 혈관생성 또는 혈관생성 과정을 조절하는 것을 목적으로 하고, 특히 혈관생성에 관련된 마이크로RNA에 집중한다. 따라서, 본 발명의 목적은 혈관생성의 조절에 관련된 마이크로RNAs의 패밀리에 속하는 적어도 하나의 마이크로RNA를 조절하는 것이다.
표현 "마이크로RNA 패밀리"에 의해, 혈관생성 또는 혈관생성 과정의 조절로 이루어진 관련된 기능을 갖는 마이크로RNAs의 그룹이 의도된다. 보다 특정하게, 상기 마이크로RNAs는 항혈관생성 활성을 나타내는 마이크로RNAs로 이루어진 그룹 내에서 선택되나, 이에 제한되지 않는다.
보다 특히, 이러한 마이크로RNA는 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함) 또는 이의 전구체로 이루어진 그룹 내에서 선택되나, 이에 제한되지 않는다. 혈관생성에 조절(modulating), 우선적으로 길항자(antagonist), 특징을 갖는 어느 miRNA가 상기 마이크로RNA 패밀리의 일부로 고려되는 것은, 본 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하다.
의심을 회피하기 위해, 하기 설명 내 표현 마이크로RNA는, 다르게 지시되지 않으면, 이의 전구체로부터 쪼개진(cleaved) 이후에 성숙 또는 가공된 RNA를 의미한다. 명명 형태에 대하여, 표현 "전구체" 또는 "마이크로RNA 전구체"가 사용된다.
하기 표 1은 본 상세한 설명에 의해 포함되는 마이크로RNA 전구체의 다른 서열을 재그룹화 하였다.
SEQ ID NO: 명칭 서열
1 mir-92a-1 CUUUCUACACAGGUUGGGAUCGGUUGCAAUGCUGUGUUUCUGUAUGGUAUUGCACUUGUCCCGGCCUGUUGAGUUUGG
2 mir-92a-2 UCAUCCCUGGGUGGGGAUUUGUUGCAUUACUUGUGUUCUAUAUAAAGUAUUGCACUUGUCCCGGCCUGUGGAAGA
3 mir-92b CGGGCCCCGGGCGGGCGGGAGGGACGGGACGCGGUGCAGUGUUGUUUUUUCCCCCGCCAAUAUUGCACUCGUCCCGGCCUCCGGCCCCCCCGGCCC
4 mir-17 GUCAGAAUAAUGUCAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAGUGAUAUGUGCAUCUACUGCAGUGAAGGCACUUGUAGCAUUAUGGUGAC
5 mir-503 UGCCCUAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAGUGAGCGAUCGGUGCUCUGGGGUAUUGUUUCCGCUGCCAGGGUA
6 mir-16-1 GUCAGCAGUGCCUUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUUAAGAUUCUAAAAUUAUCUCCAGUAUUAACUGUGCUGCUGAAGUAAGGUUGAC
7 mir-16-2 GUUCCACUCUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUAGUGAAAUAUAUAUUAAACACCAAUAUUACUGUGCUGCUUUAGUGUGAC
8 mir-374a UACAUCGGCCAUUAUAAUACAACCUGAUAAGUGUUAUAGCACUUAUCAGAUUGUAUUGUAAUUGUCUGUGUA
9 mir-374b ACUCGGAUGGAUAUAAUACAACCUGCUAAGUGUCCUAGCACUUAGCAGGUUGUAUUAUCAUUGUCCGUGUCU
10 mir-374c ACACGGACAAUGAUAAUACAACCUGCUAAGUGCUAGGACACUUAGCAGGUUGUAUUAUAUCCAUCCGAGU
11 mir-24-1 CUCCGGUGCCUACUGAGCUGAUAUCAGUUCUCAUUUUACACACUGGCUCAGUUCAGCAGGAACAGGAG
12 mir-24-2 CUCUGCCUCCCGUGCCUACUGAGCUGAAACACAGUUGGUUUGUGUACACUGGCUCAGUUCAGCAGGAACAGGG
13 mir-483 GAGGGGGAAGACGGGAGGAAAGAAGGGAGUGGUUCCAUCACGCCUCCUCACUCCUCUCCUCCCGUCUUCUCCUCUC
14 mir-34a GGCCAGCUGUGAGUGUUUCUUUGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGCAAUAGUAAGGAAGCAAUCAGCAAGUAUACUGCCCUAGAAGUGCUGCACGUUGUGGGGCCC
15 mir-34b GUGCUCGGUUUGUAGGCAGUGUCAUUAGCUGAUUGUACUGUGGUGGUUACAAUCACUAACUCCACUGCCAUCAAAACAAGGCAC
16 mir-34c AGUCUAGUUACUAGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGCUAAUAGUACCAAUCACUAACCACACGGCCAGGUAAAAAGAUU
17 mir-20a GUAGCACUAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAGUGUUUAGUUAUCUACUGCAUUAUGAGCACUUAAAGUACUGC
18 mir-20b AGUACCAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAGUUUUGGCAUGACUCUACUGUAGUAUGGGCACUUCCAGUACU
19 mir-15a CCUUGGAGUAAAGUAGCAGCACAUAAUGGUUUGUGGAUUUUGAAAAGGUGCAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCAAAAAUACAAGG
20 mir-15b UUGAGGCCUUAAAGUACUGUAGCAGCACAUCAUGGUUUACAUGCUACAGUCAAGAUGCGAAUCAUUAUUUGCUGCUCUAGAAAUUUAAGGAAAUUCAU
하기 표 2는, 각 마이크로RNA에 대하여, 상응하는 전구체 서열 (표 1 참조)에 마이크로RNA 및 상응하는 잔기의 서열을 가리킨다.
SEQ ID NO: 명칭 서열 전구체로부터 잔기
21 miR-92a-3p uauugcacuugucccggccugu 48-69
22 miR-92a-1-5p agguugggaucgguugcaaugcu 11-33
23 miR-92a-2-5p ggguggggauuuguugcauuac 9-30
24 miR-92b-3p uauugcacucgucccggccucc
 61-82
25 miR-92b-5p agggacgggacgcggugcagug
 20-41
26 miR-17-3p acugcagugaaggcacuuguag 51-72
27 miR-17-5p caaagugcuuacagugcagguag 14-36
28 miR-503-3p gggguauuguuuccgcugccagg
 46-68
29 miR-503-5p uagcagcgggaacaguucugcag
 6-28
30 miR-16-1-3p ccaguauuaacugugcugcuga
 56-77
31 miR-16-2-3p ccaauauuacugugcugcuuua
 53-74
32 miR-16-5p uagcagcacguaaauauuggcg
 14-35 (for miR-16-1) 또는 10-31 (for miR-16-2)
33 miR-374a-3p cuuaucagauuguauuguaauu
 42-63
34 miR-374a-5p uuauaauacaaccugauaagug
 12-33
35 miR-374b-3p cuuagcagguuguauuaucauu
 41-62
36 miR-374-5p auauaauacaaccugcuaagug
 11-32
37 miR-374c-3p cacuuagcagguuguauuauau
 39-60
38 miR-374c-5p auaauacaaccugcuaagugcu
 13-34
39 miR-24-1-3p uggcucaguucagcaggaacag
 44-65
40 miR-24-1-5p ugccuacugagcugauaucagu
 7-28
41 miR-24-2-3p uggcucaguucagcaggaacag
 50-71
42 miR-24-2-5p ugccuacugagcugaaacacag
 13-34
43 miR-483-3p ucacuccucuccucccgucuu
 48-68
44 miR-483-5p aagacgggaggaaagaagggag
 8-29
45 miR-34a-3p caaucagcaaguauacugcccu
 64-85
46 miR-34a-5p uggcagugucuuagcugguugu
 22-43
47 miR-34b-3p caaucacuaacuccacugccau
 50-71
48 miR-34b-5p uaggcagugucauuagcugauug
 13-35
49 miR-34c-3p aaucacuaaccacacggccagg
 46-67
50 miR-34c-5p aggcaguguaguuagcugauugc
 13-35
51 miR-20a-3p acugcauuaugagcacuuaaag
 44-65
52 miR-20a-5p uaaagugcuuauagugcagguag
 8-30
53 miR-20b-3p acuguaguaugggcacuuccag
 44-65
54 miR-20b-5p caaagugcucauagugcagguag
 6-28
55 miR-15a-3p caggccauauugugcugccuca
 51-72
56 miR-15a-5p uagcagcacauaaugguuugug
 14-35
57 miR-15b-3p cgaaucauuauuugcugcucua
 58-79
58 miR-15b-5p uagcagcacaucaugguuuaca
 20-41
달리 지시되지 않으면, 본 발명에 언급된 전구체 및 마이크로RNA 서열은 인간 서열이다. 그럼에도 불구하고, 일부 경우에, 마이크로RNA 인간 서열은 다른 종으로부터 마이크로RNA 서열에 상동성(homologous)이다.
예를 들어, 인간 miR-92a는 다른 종으로부터 miRs에 상동성(homologous)인 것으로 나타날 수 있다. 보다 특정하게, 인간 miR-92a는 dme (드로소필라 멜라노가스터, Drosophila melanogaster), mmu (무스 무스쿨루스, Mus musculus), rno (라투스 노베기쿠스, Rattus norvegicus), dps (드로소필라 슈도옵스쿠라, Drosophila pseudoobscura), aga (아노펠레스 감비아, Anopheles gambiae), dre (다니오 레리오, Danio rerio), mml (마카카 물라타, Macaca mulatta), xtr (제노푸스 트로피칼리스, Xenopus tropicalis), ame (아피스 멜리페라, Apis mellifera), odi (오이코플루라 디오이카, Oikopleura dioica), cin (시오나 인테스티날리스, Ciona intestinalis), csa (시오나 사비그니, Ciona savignyi), cfa (카니스 파밀리아리스, Canis familiaris) 및 돼지(pig) 또는 ssc (서스 스크로파, Sus scrofa)로부터 miRs에 상동성(homologous)이다.
이의 일반적인 지식에 기초하여, 기술분야의 통상의 기술자는 다른 종으로부터 다른 인간 마이크로RNA 서열 및 마이크로RNA 서열 사이의 상동성(homology)을 용이하게 발견할 수 있다.
본 발명에 설명된 성숙 마이크로RNAs의 뉴클레오티드 서열 및 그들의 상응하는 스템-루프 서열은 miRBase, 마이크로RNA 서열 및 주석을 온라인으로 검색 가능한 데이터베이스에서 발견되는 서열이다. miRBase 서열 데이터베이스 내 목록(Entries)은 성숙 마이크로RNA 서열의 위치 및 서열에 관한 정보와 함께, 마이크로RNA 전사체(스템-루프)의 예견된 헤어핀 부분을 나타낸다. 데이터베이스 내 마이크로RNA 스템-루프 서열은 엄격하게 전구체 miRNAs (pre-miRNAs)가 아니며, 예상되는 일차 전구체로부터 pre-miRNA 및 몇몇 측면(flanking) 서열을 포함하는 일부 경우일 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈관신생의 생리를 통제하는 다른 반응에 포함되는 마이크로RNA의 억제자, 또는 몇몇 마이크로RNAs의 억제자의 조합, 또는 이의 전구체를 포함하는, AMI 이후 심실 리모델링을 치료 또는 예방하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 공개된 연구의 대부분에서, 정맥내 경로는 동물 내에 마이크로RNA 억제자를 투여하기 위해 사용되었다. 혈관 유전자 발현의 조절에 관련된 마이크로RNA의 조작은 허혈성 질환에 새로운 치료학적 타겟을 나타낸다. 생물의학 부문 내에서, 특히 특정한 RNA 서열을 억제하기 위해 설계된 RNA 조절자의 투여에 대한 연구가 기하급수적으로 증가하였다.
Dimmeler et al은 특정한 마이크로RNA 억제자를 전신에 투여함으로써 miR-92a 억제 이후 좌심실 기능의 수축성 및 회복이 개선됨을 보였다. 폴리시스트론(polycistronic) 마이크로RNA 17-92a 클러스터는 종양형성에 연결되고 마이크로RNAs의 세포 형태 편재성(ubiquity) 때문에, miR 또는 항-miRs의 반복 주사로 정맥 투여는 안정성에 대한 문제를 야기시켰다.
마이크로RNAs가 복합체 가공을 조절하고 다양한 세포 경로 내에 존재하는 사실 때문에, 그들은 또한 현저한 부작용을 초래할 개연성이 매우 높다. 현재 다른 것 가운데 한 문제는 miRNA 억제자로 치료가 선택적이지 않은 것이다.
게다가, 이들 분자의 편재(ubiquitousness) 및 낮은 기관 특이성을 고려할 때, 전신(systemic) 투여는, 이러한 miRNAs가 다른 세포 특이적 기능을 갖는 곳 또는 일반적으로 발현되지 않는 곳에서, 조직 내 조절 기능을 발휘하도록 유도할 수 있다. 이러한 잘못된 조절은 부작용을 촉발시키는 것을 쉽게 유도할 것이다. 잠재적 위험 가운데, 마이크로RNA 조작과 관련된 종양형성은 이러한 요법을 인간 병리에 적용할 때 주요한 문제들 중 하나로 남아있다. 게다가, 타겟 세포 내 적절하게 유지되는 농도를 얻기 위해, 마이크로RNA 억제자는 매우 높은 투여량으로 반복 주사되어야 한다. 비록 통제된 환경 내 작은 동물에서 실험이 작은 제한으로 수행되더라도, 인간에의 전환(transposition)은 생물 안전성에 대한 장애물 뿐만 아니라 논리적 및 경제적인 장애도 예상된다.
이러한 문제를 해결하고 이러한 새로운 치료학적 접근이 환자에게 전이될 수 있도록 하기 위해, 타겟 기관에 직접적으로 마이크로RNA 억제자를 전송하고 그들을 방출하기 위해 방출 수송체를 발생시키는 것이 고려된다. 적절한 수송체는 그에 따라 투여량을 감소시키고, 반복된 주사의 투여를 회피하고 다른 기관에 잠재적으로 원하지 않는 생물학적 효과를 최소화하기 위해 발병된 조직에 곧바로 마이크로RNA 억제자를 향할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 타겟 조직 내에서 마이크로RNA 억제자를 유일하게 방출하는 수단에 의해 이러한 치료의 부작용을 회피하기 위하여 선택성을 향상시키는 것이다. 본 발명에 따라, 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어에 마이크로RNA 억제자를 미세 캡슐화함으로, 이러한 문제는 해결되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈관생성의 조절에 관련된 마이크로RNA 패밀리에 속하며, 상기 마이크로RNA 패밀리는 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함), 또는 이의 전구체를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 적어도 하나의 마이크로RNA의 미세 캡슐화된 억제자를 포함하는 AMI 이후 심실 리모델링의 치료 도는 예방을 위한 조성물을 제공하는 것이다.
마이크로스피어 내 마이크로RNA 억제자를 미세 캡슐화함에 의해, 혈관 성형술(transluminal angioplasty) 이후 동맥 주사가 촉진되고, 그에 따라 마이크로스피어가 오직 손상된 부위의, 미세혈관, 또한 소위 모세혈관(capillaries) 내에 전달되고 유지되며; 이러한 방법으로 캡슐화된 마이크로RNA 억제자는 국소적으로 방출될 수 있다.
AMI의 원인(culprit) 동맥을 통해 관상동맥 내 주사는 관상동맥의 미소순환 내 마이크로스피어의 유지 및 타겟 허혈성 조직 내에 직접적으로 마이크로RNA 억제자의 지속적인 방출을 가능하게 한다. 마이크로RNA 억제자는 손상된 조직의 수축성의 기능적 회복 뿐만 아니라 선호되는 후-경색(post-infarction) 리모델링을 증진시키는 신생혈관생성을 유도한다.
예상과 달리, 본 발명에서, 적절한 마이크로스피어로 미세 캡슐화될 때, 마이크로RNA 억제자 및 특히 혈관생성의 조절과 관련된 마이크로RNA 패밀리에 속하는 마이크로RNA의 억제자, 상기 마이크로RNA는 타겟 마이크로RNA의 생물학적 활성을 차단(block)하기 위하여 심근의 손상된 부위에 성공적으로 방출되는 것으로 나타났다. 본 발명의 실시예에서 나타난 것처럼, 심근 경색을 겪은 개인(individuals)에 폴리머 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어로 미세 캡슐화된, 주어진 마이크로RNA 억제자의, 즉 miR-92a의 비제한적 실시예 억제자와 같은 것의, 선택적인 관상동맥내 경로를 통한, 투여는 심근의 기능적 회복을 유도한다.
따라서, 미세 순환에 유지된 마이크로스피어는 타겟 허혈성 조직 내에 직접적으로 마이크로RNA 억제자를 지속적으로 방출시킨다. 타겟 마이크로RNA의 마이크로RNA 억제자의 지속되는 효과(소위 하향-조절(down-regulation))는 부상 한달 이후 치료 부위 내 현저한 혈관 성장 및 부정적인 리모델링의 억제를 초래한다.
본 발명의 실시예에서 나타난 것처럼, 부정적인 심실 리모델링의 발현은 경색 관련된 동맥 내 투여된 캡슐화된 적절한 마이크로RNA 억제자에 의해 혈관생성의 조절과 관련된 마이크로RNA 패밀리에 속하는 마이크로RNA의 국소적이고 지속되는 억제를 통해 맥관형성(vasculogenesis)을 유도함으로써 예방될 수 있다. 이는 급성 심근 경색을 겪는 환자에게 유전자 조절 치료의 다음 안전성 번역(safety translation)을 촉진하는 새로운 전달 방법을 나타낸다.
이러한 결과는 본 발명에 개시된 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함), 또는 이의 전구체와 같은, 혈관생성의 조절과 관련된 마이크로RNA 패밀리에 속하는 마이크로RNA의 억제자를 포함하는 조성물이 치료학적으로 유효한 양 및 치료학적으로 유효한 방출 속도로 상기 억제자의 효과적인 국소 방출을 허용함을 명확하게 나타낸다.
일 양태에서, 본 발명은 혈관생성에 포함되는 적어도 하나의 마이크로RNA, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하며, 상기 억제자는 폴리머 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어에 미세 캡슐화된, 조성물과 관련된다.
다른 양태에서, 본 발명은 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함), 또는 이의 전구체를 포함하는 패밀리 내에서 선택된 적어도 하나의 마이크로RNA의 억제자의 유효량을 포함하며, 상기 억제자는 폴리머 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어에 미세 캡슐화된 조성물과 관련된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 miR-92a, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하며, 상기 억제자는 폴리머 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어에 미세 캡슐화된 조성물과 관련된다.
표현 "마이크로스피어"는, 1 μm 내지 수백 μm 크기의 구형 입자로 이해된다. 표현 "마이크로입자(microparticles)"는 "마이크로스피어" 및 "마이크로캡슐"을 모두 포함한다. 본 발명의 상세한 설명에서, 표현 "마이크로스피어"가 사용되나, "마이크로캡슐"로 치환이 가능하며 본 기술분야의 통상의 기술자에 따를 때, "마이크로스피어" 및 "마이크로캡슐"은 동등한 것으로 이해되어야 한다.
표현 "캡슐화된" 또는 "미세 캡슐화된"은 보호 또는 변형된 방출을 위한 입자 내에 둘러싸이거나(enclosed) 내장된(embedded) 것으로 이해되어야 한다.
즉, 본 발명은 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어 내에 미세 캡슐화된, 혈관생성에 포함되는 적어도 하나의 마이크로RNA의 억제자의 유효량을 포함하며, 상기 마이크로RNA의 억제자는 바람직하게, miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함), 또는 이의 전구체를 포함하거나 그렇지 않으면 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 약학적 조성물에 관련된다.
즉, 본 발명은 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어 내에 미세 캡슐화된, 적어도 하나의 miR-92a, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하는 약학적 조성물과 관련된다.
"약학적 조성물"은 약학적 제제를 포함하는 개인에 투여하기에 적합한 물질의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 약학적 조성물은 miRNA 억제자 및 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물의 실시예에서, 혈관생성에 관련된 상기 miRNA는 성숙 miRNA로 이루어진다.
본 발명의 조성물의 실시예에서, 상기 마이크로RNA는 하기 성숙된 것으로 이루어진다:
a) SEQ ID No. 21, 22 또는 23로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 21, 22 또는 23의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성(identity)을 갖는 서열을 포함하는 miR-92a;
b) SEQ ID No. 24 또는 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 24 또는 25의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-92b;
c) SEQ ID No. 26 또는 27로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 26 또는 27의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-17;
d) SEQ ID No. 28 또는 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 28 또는 29의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-503;
e) SEQ ID No. 30, 31 또는 32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 30, 31 또는 32의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-16;
f) SEQ ID No. 33, 34, 35, 36, 37 또는 38로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 33, 34, 35, 36, 37 또는 38의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-374;
g) SEQ ID No. 39, 40, 41 또는 42로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 39, 40, 41 또는 42의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-24;
h) SEQ ID No. 43 또는 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 43 또는 44의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-483;
i) SEQ ID No. 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 45, 46, 47, 48, 49 또는 50의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-34;
j) SEQ ID No. 51, 52, 53 또는 54로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 51, 52, 53 또는 54의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-20; 및
k) SEQ ID No. 55, 56, 57 또는 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 55, 56, 57 또는 58의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-15.
본 발명의 조성물의 다른 실시예에서, 상기 miR-92a는 서열 SEQ ID No. 21 또는 SEQ ID No. 21과 적어도 90%, 바람직하게 95%, 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 성숙 miR-92a로 이루어진다.
본 발명의 조성물의 다른 실시예에서, 상기 miR-92a는 서열 SEQ ID No. 22 또는 SEQ ID No. 22와 적어도 90%, 바람직하게 95% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 성숙 miR-92a로 이루어진다.
본 발명의 조성물의 다른 실시예에서, 상기 miR-92a는 서열 SEQ ID No. 23 또는 SEQ ID No. 23과 적어도 90%, 바람직하게 95% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 성숙 miR-92a로 이루어진다.
본 발명의 관점에서, 핵산의 두 서열 사이의 "백분율 상동성(identity)"은 최적의 정렬 이후 수득된, 비교되는 두 서열 사이의 동일한 뉴클레오티드 잔기의 백분율을 의미하며, 이 백분율은 순수하게 통계적이며 두 서열 사이의 차이는 그들의 길이에 따라 무작위로 분포되어 있다. 두 핵산 서열의 비교는 통상적으로 그들을 최적으로 정렬한 이후에 서열을 비교함으로써 수행되며, 상기 비교는 부분(segment)에 의해 또는 "정렬 창(alignment window)"을 사용하여 수행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 수작업에 의한 비교 뿐만 아니라, Smith 및 Waterman (1981)의 부분 상동성(local homology) 알고리즘의 수단에 의해, Neddleman 및 Wunsch (1970의 부분 상동성 알고리즘의 수단에 의해, Pearson 및 Lipman (1988)의 유사성 검색 방법의 수단에 의해 또는 이들 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 (위스콘신 유전적 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package) 내 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, 또는 비교 소프트웨어 BLAST NR 또는 BLAST P에 의해)의 수단에 의해 수행될 수 있다.
두 핵산 서열 사이의 백분율 상동성은 두 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 비교되는 핵산 서열은 두 서열 사이의 최적 정렬을 위해 참조 서열에 비해 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. 백분율 상동성은 뉴클레오티드 잔기가 두 서열 사이, 바람직하게 두 완전한 서열 사이에 동일한 위치의 수를 결정하고, 상기 동일한 위치의 수를 정렬 창 내 위치의 총 수로 나누고, 두 서열 사이 백분율 상동성을 얻기 위해 결과에 100을 곱하여 계산된다.
본 발명에서 의도된 것처럼, 참조 서열에 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열은 상기 참조 서열에 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 조성물의 실시예에서, 상기 혈관생성에 포함되는 miRNA는 마이크로RNA의 전구체로 이루어진다.
본 발명의 실시예에서, 상기 혈관생성에 포함되는 마이크로RNA의 전구체는 하기로 이루어진다:
a) 서열 SEQ ID No. 1, 또는 SEQ ID No. 1과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92a-1;
b) 서열 SEQ ID No. 2, 또는 SEQ ID No. 2와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92a-2;
c) 서열 SEQ ID No. 3, 또는 SEQ ID No. 3과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92b;
d) 서열 SEQ ID No. 4, 또는 SEQ ID No. 4와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-17;
e) 서열 SEQ ID No. 5, 또는 SEQ ID No. 5와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-503;
f) 서열 SEQ ID No. 6, 또는 SEQ ID No. 6과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-16-1; 및
g) 서열 SEQ ID No. 7, 또는 SEQ ID No. 7과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-16-2;
h) 서열 SEQ ID No. 8, 또는 SEQ ID No. 8과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374a;
i) 서열 SEQ ID No. 9, 또는 SEQ ID No. 9와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374b;
j) 서열 SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 10과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374c;
k) 서열 SEQ ID No. 11, 또는 SEQ ID No. 11과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-24-1;
l) 서열 SEQ ID No. 12, 또는 SEQ ID No. 12와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-24-2;
m) 서열 SEQ ID No. 13, 또는 SEQ ID No. 13과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-483;
n) 서열 SEQ ID No. 14, 또는 SEQ ID No. 14와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34a;
o) 서열 SEQ ID No. 15, 또는 SEQ ID No. 15와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34b;
p) 서열 SEQ ID No. 16, 또는 SEQ ID No. 16과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34c;
q) 서열 SEQ ID No. 17, 또는 SEQ ID No. 17과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-20a;
r) 서열 SEQ ID No. 18, 또는 SEQ ID No. 18과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-20b;
s) 서열 SEQ ID No. 19, 또는 SEQ ID No. 19와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-15a, 및
t) 서열 SEQ ID No. 20, 또는 SEQ ID No. 20과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-15b.
일반적으로 말하면, 억제자는 반응 내 끌림(engaging)으로부터 다른 분자를 억제(represses) 또는 예방(prevents)하는 분자이다.
본 발명에서 사용된, 용어 "miR-X, 또는 mir-X의 억제자"는 miR-X, 또는 mir-X, 또는 적어도 하나의 전구체의 발현 및/또는 활성을 감소(decreases) 또는 축소(reduces)시키는 어느 분자 또는 화합물을 의미한다. 이러한 억제는, 결과적으로, 신생혈관생성 억제를 예방하며, 즉 경색 이후 심장 근육의 부정적 리모델링을 예방하기 위해 신생혈관생성을 촉진한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 혈관생성에 포함되는 주어진 마이크로RNA의 억제자는 상기 주어진 마이크로RNA를 타겟으로 하는 서열을 갖는 8-49 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드이며, 상기 마이크로RNA는 바람직하게 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함), 또는 이의 전구체를 포함하는 그룹에서 선택된다.
다른 실시예에서, 상기 miR-92a의 억제자는 상기 miR-92a를 타겟으로 하는 서열을 갖는 8-49 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드이다.
표현 "타겟으로 하는(targeted to)"는 원하는 효과를 유도하기 위해 타겟 핵산에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 의미한다. 특정한 실시예에서, 원하는 효과는 타겟 핵산의 감소 및/또는 억제이다.
"혼성화"는 "뉴클레오티드 상보성", 즉 수소 결합을 통해 비공유결합 쌍을 이루는 두 뉴클레오티드의 능력을 통해 발생하는 상보적인 핵산의 결합(annealing)을 의미한다.
일부 실시예에서, miRNA 억제자 올리고뉴클레오티드는 8 내지 49 뉴클레오티드 길이이다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49 뉴클레오티드 길이, 또는 어떤 범위 내의 이러한 구현예(embodies) 올리고뉴클레오티드를 인식할 것이다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따르는 올리고뉴클레오티드는 10 내지 20 뉴클레오티드 길이이다. 본 기술분야의 통상의 기술자는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 뉴클레오티드 길이, 또는 어떤 범위 내의 이러한 구현예 올리고뉴클레오티드를 인식할 것이다.
특정한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 miRNA 또는 이의 전구체에 상보적인 서열을 갖는다.
본 발명의 조성물의 일 실시예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 혈관생성에 포함되는 타겟 miRNA의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 상기 타겟 miRNA는 우선적으로 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함), 또는 이의 전구체로부터 선택된다.
본 발명의 조성물의 다른 실시예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 miR-92a의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
표현 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정한 뉴클레오티드 서열 (소위 센스 서열)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지며 센스 서열에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다.
"상보성"은 첫번째 핵산 및 두번째 핵산 사이의 뉴클레오티드 짝지음 가능성을 의미한다.
특정한 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA 또는 이의 전구체에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지며, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열이 마이크로RNA 또는 이의 전구체의 보체(complement)에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 것을 의미하거나, 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화되는 것을 의미한다. 따라서, 특정한 실시예에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 이의 타겟 마이크로RNA 또는 전구체 서열에 대하여 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatched) 염기쌍을 가질 수 있으며, 이의 타겟 서열에 혼성화할 수 있다. 특정한 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 마이크로RNA 또는 이의 전구체에 완전히 상보적인 서열을 가지며, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 마이크로RNA의 보체(complement) 또는 이의 전구체와 100% 동일한 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, "상보성"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 또는 49 뉴클레오티드의 영역(region)에 걸쳐, miR-92a의 뉴클레오티드 서열의 보체, 또는 이의 전구체에 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 적어도 99%, 또는 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 의미하거나, 두 서열은 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화한다.
"백분율 상보성"은 핵산 내 상보적인 뉴클레오티드의 수를 핵산의 길이로 나눈 것을 의미한다. 특정한 실시예에서, 올리고뉴클레오티드의 백분율 상보성은 타겟 핵산에 상보적인 뉴클레오티드의 수를, 올리고뉴클레오티드의 길이로 나눈 것을 의미한다.
일 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 혈관생성에 관련된 타겟 마이크로RNA의 서열, 우선적으로 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함), 및 더욱 우선적으로 miR-92a, 또는 이의 전구체로부터 선택된 것에 "완전히 상보적"이며, 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각 뉴클레오티드가 타겟 마이크로RNA 또는 이의 전구체의 각각 상응하는 위치에 뉴클레오티드와 쌍을 이룰 수 있다는 것을 의미한다.
특정한 실시예에서, 본 발명에 따르는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기의 서열에 부분적 또는 완전히 상보적인 서열을 갖는다:
a) SEQ ID No. 21, 22 또는 23로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 21, 22 또는 23의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-92a;
b) SEQ ID No. 24 또는 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 24 또는 25의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-92b;
c) SEQ ID No. 26 또는 27로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 26 또는 27의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-17;
d) SEQ ID No. 28 또는 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 28 또는 29의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-503; 및
e) SEQ ID No. 30, 31 또는 32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 30, 31 또는 32의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-16;
f) SEQ ID No. 33, 34, 35, 36, 37 또는 38로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 33, 34, 35, 36, 37 또는 38의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-374;
g) SEQ ID No. 39, 40, 41 또는 42로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 39, 40, 41 또는 42의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-24;
h) SEQ ID No. 43 또는 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 43 또는 44의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-483;
i) SEQ ID No. 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 45, 46, 47, 48, 49 또는 50의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-34;
j) SEQ ID No. 51, 52, 53 또는 54로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 51, 52, 53 또는 54의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-20; 및
k) SEQ ID No. 55, 56, 57 또는 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 55, 56, 57 또는 58의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-15.
특정한 실시예에서, 본 발명에 따르는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기의 서열에 부분적 또는 완전히 상보적인 서열을 갖는다:
a) 서열 SEQ ID No. 1, 또는 SEQ ID No. 1과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92a-1;
b) 서열 SEQ ID No. 2, 또는 SEQ ID No. 2와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92a-2;
c) 서열 SEQ ID No. 3, 또는 SEQ ID No. 3과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92b;
d) 서열 SEQ ID No. 4, 또는 SEQ ID No. 4와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-17;
e) 서열 SEQ ID No. 5, 또는 SEQ ID No. 5와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-503;
f) 서열 SEQ ID No. 6, 또는 SEQ ID No. 6과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-16-1; 및
g) 서열 SEQ ID No. 7, 또는 SEQ ID No. 7과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-16-2;
h) 서열 SEQ ID No. 8, 또는 SEQ ID No. 8과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374a;
i) 서열 SEQ ID No. 9, 또는 SEQ ID No. 9와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374b;
j) 서열 SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 10과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374c;
k) 서열 SEQ ID No. 11, 또는 SEQ ID No. 11과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-24-1;
l) 서열 SEQ ID No. 12, 또는 SEQ ID No. 12와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-24-2;
m) 서열 SEQ ID No. 13, 또는 SEQ ID No. 13과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-483;
n) 서열 SEQ ID No. 14, 또는 SEQ ID No. 14와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34a;
o) 서열 SEQ ID No. 15, 또는 SEQ ID No. 15와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34b;
p) 서열 SEQ ID No. 16, 또는 SEQ ID No. 16과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34c;
q) 서열 SEQ ID No. 17, 또는 SEQ ID No. 17과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-20a;
r) 서열 SEQ ID No. 18, 또는 SEQ ID No. 18과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-20b;
s) 서열 SEQ ID No. 19, 또는 SEQ ID No. 19와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-15a, 및
t) 서열 SEQ ID No. 20, 또는 SEQ ID No. 20과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-15b.
특정한 실시예에서, 본 발명에 따르는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mir-92a-1 (SEQ ID NO: 1)의 서열에 부분적으로 상보적인 서열을 갖는다.
특정한 실시예에서, 본 발명에 따르는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mir-92a-1 (SEQ ID NO: 1)의 서열에 완전히 상보적인 서열을 갖는다.
특정한 실시예에서, 본 발명에 따르는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mir-92a-2 (SEQ ID NO: 2)의 서열에 부분적으로 상보적인 서열을 갖는다.
특정한 실시예에서, 본 발명에 따르는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mir-92a-2 (SEQ ID NO: 2)의 서열에 완전히 상보적인 서열을 갖는다.
일 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 백본(backbone)을 포함한다. 이러한 백본의 예시는 몰폴리노(morpholino) 백본, 카바메이트(carbamate) 백본, 실록산(siloxane) 백본, 설파이트(sulphide), 설폭사이드(sulfoxide) 및 설폰(sulfone) 백본, 폼아세틸(formacetyl) 및 티오폼아세틸(thioformacetyl) 백본, 메틸렌폼아세틸(methyleneformacetyl) 백본, 리보아세틸(riboacetyl) 백본, 알켄 포함 백본, 설파메이트(sulfamate), 설포네이트(sulfonate) 및 설폰아미드(sulphonamide) 백본, 메틸렌이미노(methyleneimino) 및 메틸렌히드라지노(methylenehydrazino) 백본, 및 아미드 백본에 의해 제공된다.
몰폴리노 올리고뉴클레오티드는 DNA의 디옥시리보스 당이 육원자 고리로 교체되고 포스포디에스터 결합이 포스포로디아미데이트(phosphorodiamidate) 결합으로 교체된, 전하를 띠지 않은 백본을 갖는다. 몰폴리노 올리고뉴클레오티드는 효소 분해에 저항성을 가지며, RNase H를 활성화시키는 것보다, 번역(translation)을 저지하거나 pre-mRNA 스플라이싱을 방해함으로써 안티센스 제제로서 기능을 나타낸다.
변형된 백본은 전형적으로 뉴클레아제(nuclease) 저항성을 증가시키는 것을 선호한다. 변형된 백본은 또한, 비변형된 백본에 비해 타겟 서열에 대한 이의 변형된 친화성 ?문에, 바람직할 수 있다. 비변형된 백본은 RNA 또는 DNA일 수 있다.
다른 적절한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 폴리아미드 백본을 갖는, 펩타이드 핵산(Peptide Nucleic Acid, PNA)를 포함한다. PNA-기초의 분자는 염기쌍 인식의 관점에서 DNA 분자의 진정한 모방(mimics)이다. PNA의 백본은 펩타이드 결합에 의해 연결된 7V-(2-아미노에틸)-글리신(7V-(2-aminoethyl)- glycine) 단위로 구성되며, 상기 핵염기는 메틸렌 카보닐 결합에 의해 백본에 연결된다.
추가로 적절한 백본은 리보스 또는 디옥시리보스 당이 육원자 몰폴리노 링에 의해 교체된, 몰폴리노 뉴클레오티드 유사체(analog) 또는 동등물(equivalent)을 포함한다. 가장 바람직한 뉴클레오티드 유사체 또는 동등물은, 리보스 또는 디옥시리보스 당이 육원자 몰폴리노 링에 의해 교체되고, 근접한 몰폴리노 링 사이에 음이온성 포스포디에스터 결합이 비이온성 포스포로디아미데이트 결합에 의해 교체된, 포스포로디아미데이트 몰폴리노 올리고머(phosphorodiamidate morpholino oligomer, PMO)를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스터 결합 내 비가교(non-bridging) 산소의 하나의 치환을 포함한다. 이러한 변형은 염기쌍을 조금 불안정하게 만드나 뉴클레아제 분해에 대한 현저한 내성을 추가한다.
본 발명의 추가적인 적절한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 -OH; -F; 하나 이상의 헤테로 원자에 의해 방해받을 수 있는, 치환된 또는 비치환된, 선형 또는 낮은 분지형(branched lower) (CI- CIO) 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 알릴, 아릴, 또는 아랄킬(aralkyl); 0-, S-, 또는 N-알킬; 0-, S-, 또는 N-알케닐; 0-, S- 또는 N-알키닐; 0-, S-, 또는 N-알릴; O-알킬-O알킬, -메톡시, -아미노프로폭시; -아미녹시; 메톡시에톡시; -디메틸아미노옥시에톡시; 및 -디메틸아미노에톡시에톡시와 같이 2', 3' 및/또는 5' 위치에 일(mono)- 또는 이치환된(disubstituted) 하나 이상의 당 일부분(moieties)을 포함한다.
당 일부분은 피라노스 또는 이의 유도체, 또는 디옥시피라노스 또는 이의 유도체, 바람직하게 리보스 또는 이의 유도체, 또는 디옥시리보스 또는 이의 유도체일 수 있다. 이러한 바람직한 유도된(derivatized) 당 일부분은 봉쇄된 핵산(Locked Nucleic Acid)을 포함한다.
LNA는 변형된 RNA 뉴클레오티드이며 상기 LNA 뉴클레오티드의 리보스 일부분은 2' 및 4' 탄소를 연결하는 추가적인 브릿지(bridge)로 변형된다. 이는 염기 중첩 및 사전 구성(pre-organization)을 증진시키며, 열적 안정성을 현저하게 증가시킨다. 상기 브릿지는 3'-엔도(endo) 구조적 형태 내 리보스를 "봉쇄"하며, DNA 또는 RNA의 A-형태에서 종종 발견된다. 본 발명에서 사용된 LNA 뉴클레오티드는 필요할 때 마다 올리고뉴클레오티드 내 DNA 또는 RNA 염기로 혼합될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 스몰 RNA, 안타고미르, LNA, CDNA, PNA, 몰폴리노 올리고뉴클레오티드 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
다른 실시예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안타고미르로 이루어질 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 실시예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안타고미르로 이루어진다.
안타고미르는 내생(endogenous) 마이크로RNA를 침묵(silence)시키는데 사용되는 화학적으로 설계된 올리고뉴클레오티드이다. 안타고미르는 쪼개짐(cleavage) 부위에 짝짓기 오류(mispairing) 또는 쪼개짐을 방지하는 염기 변형의 어떤 종류와 함께 특정한 마이크로RNA 타겟에 완전히 상보적인 작은 합성 RNA 또는 DNA이다. 보통, 안타고미르는 분해에 보다 내성을 가지고 세포 내재화(internalization)를 촉진하기 위해 변형의 어떤 종류를 갖는다. 안타고미르화(antagomirization) (안타고미르가 마이크로RNA 활성을 억제하는 과정)가 어떻게 작동하는지 불분명하지만, 마이크로RNA에 비가역적으로 결합함으로써 억제하는 것으로 여겨진다. 안타고미르는 특정한 마이크로RNAs의 활성을 본질적으로 억제하는데 사용된다.
본 발명의 실시예에서, 상기 안타고미르는 마이크로RNA, 또는 이의 전구체에 상보적인 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 근접한 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 상기 마이크로RNA는 SEQ ID No. 1 내지 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 갖는다.
본 발명의 실시예에서, 상기 안타고미르는 SEQ ID NO. 1, 2 또는 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열의 mir-92a에 상보적인 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 근접한 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 실시예에서, 상기 안타고미르는 SEQ ID NO. 21, 22 또는 23으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열의 miR-92a에 상보적인 적어도 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 근접한 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, 상기 안타고미르는 서열 SEQ ID No. 21의 뉴클레오티드에 상보적인 적어도 16개 근접한 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 실시예에서, 상기 안타고미르는 DNA 백본을 소유한다.
본 발명의 조성물의 상기 실시예에서, 상기 안타고미르는 서열 SEQ ID No. 59 및 이의 염기 치환을 제외하는 변형, 및 이의 적어도 8개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59의 서브시퀀스로 이루어진 절편을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 안타고미르는 RNA 백본을 소유한다.
본 발명의 조성물의 상기 실시예에서, 상기 안타고미르는 서열 SEQ ID No. 60 및 이의 염기 치환을 제외한 변형, 및 이의 적어도 8개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 안타고미르는 이의 적어도 8개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 안타고미르는 이의 적어도 9개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 안타고미르는 이의 적어도 10개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 안타고미르는 이의 적어도 11개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 안타고미르는 이의 적어도 12개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 안타고미르는 이의 적어도 13개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 안타고미르는 이의 적어도 14개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편이다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 안타고미르는 이의 적어도 15개 근접한 뉴클레오티드의 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스로 이루어진 절편이다.
다른 실시예에서, 상기 서열 SEQ ID No. 59 또는 60의 안타고미르는 근접한 뉴클레오티드 사이 포스포티오에이트(phosphotioate) 결합(들)에 의한 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 변형된 뉴클레오티드(들)을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 안타고미르는 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 콜레스테롤 그룹 또는 어느 유사한 또는 동등한 변형을 포함할 수 있다.
일반적으로, 만약 핵산, 펩타이드 및 단백질을 포함하는 약학적 제형이 경구 또는 비경구로 투여된다면, 이는 체내에서 효소에 의해 분해되며, 약학적 조성물의 효과는 빠르게 소멸된다. 상기 문제를 극복하기 위해 다양한 시도가 있었다. 그 가운데 하나는 오랫동안 방출이 지속되는 주사가능한 제제이다.
실제로, 연구는 마이크로RNAs의 선택적인 투여를 위한 시스템으로써 스텐트(stents)의 사용에 대하여 수행되었다. 그러나, 스텐트의 빠른 내피화(endothelialisation)는 특히 장기적인 유전자 조작을 요구하는 생물학적 과정을 위하여, 마이크로RNAs의 지속적인 방출에 관한 문제를 제기할 수 있다. 추가적으로, 리포좀 및 나노입자는 개발되고 인비보(in vivo)에서 사용되었으나 심각한 부작용의 위험을 갖는 순환계 시스템을 통과하는 것은 피할 수 없었다. 추가적으로, 사전 대동맥 크램프(aortic clamp) 없이 피부를 통한 관상동맥내 투여 이후 효율 및 안정성을 설명한 연구는 없었다.
본 발명의 다른 양태는 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어의 용도에 기초한다.
본 발명에 따르면, 생체적합성 생분해성 폴리머를 갖는 상기 올리고뉴클레오티드의 미세 캡슐화에 기초하는, 심장 영역 내 올리고뉴클레오티드의 국소적인 방출을 위해 적절한 방출 시스템은 설계 및 제조되었다. 본 발명은 높은 캡슐화 효율을 가지며 분자 변형/분해가 없는, 올리고뉴클레오티드가 상당하게 로드된(loaded) 마이크로스피어를 수득할 수 있다. 본 발명에 따르면, 분자의 순도 및 질은, 안정화제 또는 보존 물질(retention substance)을 첨가하지 않고, 사용된 제조 조건, 특히 생성된 유화액의 특징, 폴리머 용액의 농도 및 미세 캡슐화 과정에 관련된 단계(phases)의 부피 사이의 관계 덕분에, 보존된다. 추가로, 마이크로스피어는 동맥 색전(arterial emboliation)을 유발하지 않고 대식세포의 식세포 작용에 의해 파괴되지 않고, 경색 부위의 미세 혈관 내에 그들이 유지될 수 있도록 적절한 입자 크기 분포를 갖는다.
본 발명의 목적은 짧은 사슬 디옥시리보핵산 또는 짧은 사슬 리보핵산을 안정하게 캡슐화시키며, 특정한 단백질, 특히 이의 억제가 질병과 관련된 단백질의 발현을 장기간 억제할 수 있는, 방출이 지속되는 마이크로스피어를 제공하는 것이다.
일반적으로 말하면, "생체적합성"은 살아있는 세포, 조직, 기관 또는 시스템과 호환되며, 상처, 독성, 또는 면역 시스템에 의한 거부가 없는 것을 의미한다. 생체적합성 마이크로스피어는 마이크로스피어, 및 마이크로스피어의 어느 분해 생산물이 대상자(recipient)에게 비독성이며, 또한 주사 부위에 면역학적 반응과 같이, 대상자의 몸에 현저하게 해로운 또는 예상치 못한 효과를 발생시키지 않는 것을 의미한다.
일반적으로 말하면, "생분해성"은 생물학적 제제의 활성에 의해 분해될 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 정의된 생분해성 마이크로스피어는 보다 작은 화학적 종을 형성하기 위해 인비보(in vivo)에서 분해 또는 침식되는 것을 의미한다. 분해는 예를 들어, 효소적, 화학적 및/또는 물리적 과정에 의해 초래될 수 있다.
적절한 생체적합성, 생분해성 폴리머는 예를 들어, 폴리(락티드)(poly(lactide)s), 폴리(글리콜라이드)(poly(glycolide)s), 폴리(락티드-코-글리콜라이드)(poly(lactide-co-glycolide)s), 폴리(락트산)(poly(lactic acid)s), 폴리(글리콜산)(poly(glycolic acid)s), 폴리(락트산-코-글리콜산)(poly(lactic acid-co-glycolic acid)s), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리에스터아미드(polyesteramides), 폴리언하이드라이드(polyanhydrides), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 폴리오르쏘에스터(polyorthoesters), 폴리아세틸(polyacetyls), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리에터에스터(polyetheresters), 폴리(디옥사논)(poly(dioxanone)s), 폴리(알킬렌 알킬레이트)(poly(alkylene alkylate)s), 폴리에틸렌 글리콜의 코폴리머 및 폴리오르쏘에스터(polyorthoester), 생분해성 폴리우레탄(polyurethanes), 이의 혼합물 및 코폴리머를 포함한다.
미세입자를 생산하기 위한 많은 기술은 선행 기술에서 설명되었다.
미세입자에 대한 약물 방출 프로파일(profile)은 사용된 폴리머의 물리화학적 특성, 폴리머-약물 첨가제 사이의 상호작용 및/또는 결과 미세입자의 형태학 및 조성물을 포함하는, 다양한 인자에 의존한다.
마이크로스피어가 심근 모세관에 의해 유지될 수 있도록 대식세포에 의한 식세포 작용을 통한 그들의 파괴가, 한편으로는, 또는 동맥의 색전(embolization), 다른 한편으로는, 최소화되기 위해, 그들은 반드시 매우 특정한 크기 분포를 가져야 한다; 생분해성, 생체적합성 폴리머를 사용하는 미세 캡슐화는 최대 2-3 주, 후기-AMI 심실 리모델링 발생 동안 주요 기간에 대한 초기 시간으로부터 생산물의 조절된 방출을 가능하게 한다.
본 발명의 맥락에서, 관상동맥 내 경로가 선호되는 것처럼, 이들 마이크로스피어의 평균 크기는 심근 모세관의 크기를 허용한다: 상기는 동맥 색전을 예방하기 위해 25 마이크론 보다 우세한(superior) 입자 없이, 심장 영역에 유지되기 위해, 5 내지 20, 바람직하게 5 내지 15 마이크론으로 다양하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 25 μm를 초과하지 않는 직경을 나타낸다.
일 실시예에서, 마이크로스피어의 50 내지 100%는 5 내지 25 μm의 범위로 구성되며 입자가 25 μm 초과하지 않는다.
바람직한 실시예에서, 마이크로스피어의 60 내지 100%는 5 내지 25 μm의 범위로 구성되며 입자가 25 μm 초과하지 않는다.
다른 바람직한 실시예에서, 마이크로스피어의 70 내지 100%는 5 내지 25 μm의 범위로 구성되며 입자가 25 μm 초과하지 않는다.
보다 바람직한 실시예에서, 마이크로스피어의 80 내지 100%는 5 내지 25 μm의 범위로 구성되며 입자가 25 μm 초과하지 않는다.
본 발명에 따르면, 마이크로스피어의 평균 직경은 5 내지 20 μm 범위이다.
본 발명에 따르면, 마이크로스피어의 평균 직경은 5 내지 15 μm 범위이다.
대안적인 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 8 내지 11 μm의 평균 직경을 나타낸다.
본 발명에 따른 마이크로스피어는 경색 부위에 약물의 지속적인 방출을 위해 생분해성 및 생체적합성 폴리머 내에 상기 마이크로RNA의 억제자의 고용량을 로드(load)한다.
마이크로RNA의 억제자 로딩(loading)은 약 1 내지 20% (w/w), 바람직하게 1 내지 15% (w/w), 및 더욱 바람직하게 1 내지 10 및 더욱 더 바람직하게 5 내지 10% 이다. 약물 온전함(integrity)은 보전되었다.
일 실시예에서, 본 발명에 따르는 마이크로스피어는 1% 내지 15% w/w의 억제자를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명에 따르는 마이크로스피어는 5% 내지 15% w/w의 억제자를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 따르는 마이크로스피어는 1% 내지 10%, 바람직하게 5% 내지 10% w/w의 억제자를 포함한다.
본 발명의 다른 특징은 마이크로스피어의 발생을 위해 사용되는 폴리머의 성질과 관련된다.
본 발명의 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 폴리-d,l-락티드 (PLA)로 이루어지는 폴리머로 구성된다. 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 단 하나의 폴리머로서 PLA로 구성된다. 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 하나 이상의 다른 생체적합성 폴리머와 혼합된 PLA로 구성된다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 폴리-d,l-락티드-코-글리콜라이드 (poly-d,l-lactide-co-glycolide, PLGA)로 이루어진 코폴리머로 구성된다. 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 단일한 폴리머로서 PLGA로 구성된다. 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 하나 이상의 다른 생체적합성 폴리머와 혼합된 PLGA로 구성된다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 마이크로스피어는 폴리-d,l-락티드-코-글리콜라이드 (PLGA) 및 폴리-d,l-락티드 (PLA)로 이루어진 폴리모의 혼합물로 구성된다.
표현 "혼합(blend)"은, 동일한 유기 용매 속으로 상기 혼합물의 용해 전에 둘 이상의 폴리머의 혼합물이 실현되는 것으로 이해되어야 한다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 PLGA 코폴리머에 대조적으로, PLA 폴리머 내 락티드(lactide):글리콜리드(glycolide)의 비율이 100:0 몰비로 구성되는 것을, 용이하게 이해할 것이다.
PLGA 코폴리머에 대하여, PLGA 폴리머 내 락티드:글리콜라이드의 비율은 50:50 내지 95:5 몰비로 구성된다.
바람직한 실시예에서, PLGA 코폴리머 내 락티드:글리콜라이드의 비율은 50:50 내지 90:10 몰비, 및 바람직하게 50:50 내지 80:20 몰비로 구성된다.
본 발명의 실시예에서, 폴리머의 내재 점도(inherent viscosity)는 0.1 내지 0.7 dl/g으로 구성된다.
바람직한 실시예에서, 폴리머의 내재 점도는 0.15 내지 0.7 dl/g, 바람직하게 0.15 내지 0.5 dl/g으로 구성된다.
이러한 양태는 내재 점도가 폴리머 분자량과 관련되는 의미에서 이로우며, 따라서, 폴리머 마이크로스피어로부터 억제자 방출 속도에 영향을 미친다.
따라서, 본 발명의 목적은 또한 어떠한 어쥬번트(adjuvant)도 포함하지 않고 폴리머 조성물의 관점에서 입자의 단일 개체군으로 이루어진, miR-92a의 미세 캡슐화된 억제자를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 양태는 하기를 포함하는 폴리머 마이크로스피어 내 마이크로RNA의 억제자를 미세 캡슐화하는 방법이다: (a) 어떤 안정제(stabilizer) 없이, 정제수 내에 마이크로 RNA의 억제자를 용해시키는 단계 (b) 유기 용매 내에 폴리머를 용해시키는 단계; (c) 첫번째 유화액(emulsion)을 생산하기 위해 (b)에 (a)를 첨가하는 단계; (d) 두번째 유화액을 생산하기 위해 계면활성제 및 삼투제(osmotic agent)를 포함하는 수용액에 단계 (c)의 유화액을 첨가하는 단계; (e) 단계 (d)의 생산된 마이크로스피어를 경화시키고 수득하는 단계; 및 (f) 건조 단계.
보다 구체적으로, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 설명된 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다:
a) 어떤 안정제 없이, 정제수 내에 miRNA의 억제자를 용해시키는 단계;
b) 유기 용매 내에 폴리머를 용해시키는 단계;
c) 첫번째 유화액을 생산하기 위해 (b)에 (a)를 첨가하는 단계;
d) 두번째 유화액을 생산하기 위해 계면활성제 및 삼투제를 포함하는 수용액에 단계 (c)의 유화액을 첨가하는 단계; 및
e) 단계 (d)의 생산된 마이크로스피어를 경화시키고 수득하는 단계; 및
f) 수득된 마이크로스피어를 건조하는 단계.
본 발명의 다른 양태는 심근 경색의 치료에 본 발명에 따르는 조성물의 용도로 이루어진다.
즉, 본 발명은 적어도 하나의 마이크로RNA, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하는 조성물과 관련되며, 상기 억제자는 심근 경색의 치료에 사용을 위한 폴리머 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어로 미세 캡슐화된다.
바람직한 실시예에서, 상기 심근 경색은 급성 심근 경색으로 이루어진다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 설명된 조성물의 유효량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 개체 내에 심실 리모델링을 역전 또는 예방의 방법과 관련된다.
즉, 본 발명은 적어도 하나의 마이크로RNA, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하는 조성물과 관련되며, 상기 억제자는 이가 필요한 개체 내에 심실 리모델링을 역전 또는 예방의 방법에 사용하기 위한 폴리머 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어로 미세 캡슐화된다.
상기 설명된 바와 같이, 본 발명에 따르는 조성물은 관상동맥 경로에 의한 투여를 위해 적절하다.
관상동맥 경로에 의한 투여를 위해, 마이크로스피어는 식염수 용액 (PBS)과 함께 또는 계면활성제가 없는 적절한 수송체, 또는 정맥내 투여를 위한 다른 적절한 담체 내에 현탁되어야 한다. 적절한 분산제는 예를 들어, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 폴리옥시에틸렌 하이드로제네이티드 캐스터 오일 60, 카르복시메틸셀룰로오스와 같은 계면활성제, 또는 소듐 아르기네이트와 같은 폴리사카라이드를 포함한다; 또한 예를 들어, 소듐 클로라이드, 만니톨, 솔비톨 또는 글루코스와 같은 등장화 제제(isotonizing agent)를 첨가하는 것이 가능하다. 관상 동맥의 주어진 크기, 투여 매체(medium) 내 마이크로스피어의 농도는 혈류 변화를 제한하고 동맥 색전의 위험을 예방하기 위해 조절된다. 이러한 농도는 0.05% 내지 1%, 바람직하게 0.1% 내지 0.5%로 다양할 수 있다. 투여는 단일 주사 또는 반복된 주사에 의할 수 있고, 선택적으로 식염수 주사가 따랐다. 투여는 동일한 카테터를 사용하여, 제한되지 않고, 경피적 관상동맥 성형술(percutaneous coronary angioplasty) 이후 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 투여가 관상동맥 경로에 의한 투여로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
이러한 양태는 안타고미르와 같은 올리고뉴클레오티드와 같은 화합물의 직접 정맥내 투여의 몇몇 예상되는 제한을 다루는 것에 특히 이롭다. 다른 예상되는 제한 가운데, i) miRNAs의 편재 및 낮은 기관 특이성에 의한 낮은 수준의 생물 안전성, ii) 이의 효과를 나타내기 위해 마이크로RNA 억제자의 높은 투여량 및 반복된 주사, 및 iii) 계획된 정맥내 투여의 높은 이론적 비용이 언급될 수 있다.
놀랍게도, 이것이 하기 실시예의 이해 이후에 명백해 지는 것처럼, 모든 이들 문제는 본 발명에 의해 다루어진다.
보다 구체적으로, 이는 하기로 설명된다:
a) 발병된 조직을 공급하는 동맥 내 캡슐화된 안타고미르를 선택적으로 관리할 수 있다 (실시예 5 참조);
b) 마이크로스피어는 관상 동맥 내 보존된다. (실시예 6 참조);
c) 마이크로스피어의 동맥 내 투여는 선택적으로 활성의 방출 물질과 조합되어, 영구적인 혈류 방해를 가능하게 하며 종양 진행을 예방하여, 종양 색전에 대해 사용된다. 이들 인자를 고려할 때, 색전의 위험의 존재가 고려된다. 이러한 이유로, 연구는 마이크로스피어가 심장 근육에 손상을 유발하지 않거나 관상 동맥 혈류 속도에 어떠한 현저한 변화도 생성하지 않음을 확인하는 목적으로 계획되었다. (실시예 7 참조);
d) 수송체 내 마이크로RNA의 억제자의 우수한 안정성 및 마이크로스피어로부터 상기 억제자의 지속적인 방출; 이는 투여 10일 이후 마이크로RNA를 억제하는 동안 이의 생물학적 효과에 의해 설명된다 (실시예 8);
e) miRNA 억제자와 함게 마이크로스피어의 투여는 손상된 조직의 수축성 회복을 촉진하며 부정적인 후기-경색 리모델링의 발현을 예방한다. (실시예 9 참조);
f) 마이크로스피어의 부분적인(localised) 투여와 함께, 억제자 투여량은 잠재적인 부작용의 현저한 감소 및 비용의 명백한 감소가 예상되는, 단일 주사로 감소될 수 있다.
본 발명에 따르는 마이크로RNA 억제자의 조절된 투여, 전달 및 방출을 위해 적절한 수송체/시스템의 유용성은 하기 장점들을 갖는다:
- 증진된 생물 안전성은, 치료 타겟이 아닌 조직 및 기관에 의한 약물의 생물 분포(bio-distribution) 때문에, 제한됨
- 반복된 정맥내 주사를 회피 i) 환자 지원의 질을 증진시킴으로써, 병원 입원 및 외래환자 병원 방문을 감소, ii) 약물 투여에 대한 연장된 정맥 주사(mainlining)에 대한 필요 뿐만 아니라 이로부터 초래되는 잠재적 위험을 회피 및iii) 생산물의 정맥 내 투여에 내재하는 위험을 최소화 (감염, 국소 반응...)
- 투여량 감소는 투여량 의존적인 부정적 효과를 감소시킴
- 필요한 투여량의 감소에 의한 비용 뿐만 아니라 반복된 주사에 필요한 직원 및 장비의 감소
다른 실시예에서, 본 발명은 심근 경색 이후 심실 리모델링의 치료 또는 예방에 사용을 위한 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어의 개체군과 관련되며, 상기 마이크로스피어는:
- 5 내지 15 μm를 포함하는 평균 직경을 가지며;
- 폴리-d,l-락티드-코-글리콜라이드 (PLGA) ; 폴리-d,l-락티드 (PLA) 또는 이의 혼합물로 구성되며;
- 심실 리모델링을 예방할 수 있는 치료제의 1% 내지 10%로 포함되며
상기 치료제는 혈관생성에 포함되는 마이크로RNA, 우선적으로 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함) 및 보다 바람직하게 miR-92a로 이루어진 그룹, 또는 이의 전구체로부터 선택된 마이크로RNA의 억제자로 이루어지며, 상기 마이크로RNA의 억제자는 우선적으로 안타고미르이다.
본 발명은 또한 적어도 i) 본 발명에 따르는 조성물 및/또는 마이크로스피어 및 ii) 조성물이 배치되는(disposed) 주사기 또는 바이알 또는 앰플을 포함하는 키트와 관련된다.
실시예에서, 본 발명의 키트는 추가로 용매 용기 내 배치된 용매를 포함한다. 상기 용매 용기는 바이알, 앰플 또는 미리 충전된(prefilled) 주사기일 수 있다
마이크로스피어 및 용매는 이중 구획 미리 충전된 주사기 내에 배치될 수 있다.
실시예에서, 본 발명의 키트는 바이알 내 마이크로스피어 및 별도의 바이알 내 용매를 포함할 수 있다.
실시예에서, 본 발명의 키트는 바이알 내 마이크로스피어 및 별도의 앰플 내 용매를 포함할 수 있다.
실시예에서, 본 발명의 키트는 바이알 내 마이크로스피어 및 미리 충전된 주사기 내 용매를 포함할 수 있다.
실시예에서, 본 발명의 키트는 미리 충전된 주사기 내 마이크로스피어 및 별도의 바이알에 용매를 포함할 수 있다.
실시예에서, 본 발명의 키트는 미리 충전된 주사기 내 마이크로스피어 및 별도의 앰플 내 용매를 포함할 수 있다.
실시예에서, 본 발명의 키트는 이중 구획 주사기 내 마이크로스피어 및 용매를 분리하여 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 관하여 보다 잘 이해될 수 있을 것이다.
실시예 1: 안타고미르 -92a가 로드된(loaded) 마이크로스피어의 제조
마이크로스피어는 자유 카르복실 말단 기를 포함하는, 약 0.2 dL/g의 내재 점도, 50:50 PLGA 코폴리머 를 사용하여 w/o/w 유화액/용매 증발 방법을 통해 제조되었다. 메틸렌 클로라이드의 3 ml는 0.6 g 또는 PLGA에 첨가되었다. 정제수 내 안타고미르-92a의 농축 용액 (I-Ssc-miR-92a; 분자량: 5366 g/mol (소위 Da); 서열: CCGGGACAAGTGCAAT; DNA 염기: 9; LNA 염기: 7; 제조자: IDT (Exiqon)) (222 mg/ml)의 0.3 ml가 PLGA 유기 용액에 첨가되고 20초 동안 초음파 처리에 의해 유화되었다. 상기 일차(primary) 유화액은 1% (w/v) 폴리비닐 알코올의 수용성 용액 및 소듐 클로라이드의 1% (w/v)로 이루어진 외상(external phase)에 첨가되고 약 10300 rpm에서 60초 동안 균질화되었다. 수득된 두번째 유화액 (w/o/w)은 정제수의 용적에 첨가되고 상기 메틸렌 클로라이드는 교반(stirring)에 의해 증발되었다. 수득된 마이크로스피어는 원심분리에 의해 수집되었고, 정제수로 두번 세척 이후 동결 건조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 9 μm, (5-25 μm 82% 및 25 μm 초과 0%) 한편 캡슐화 효과는 74%이다.
수득된 마이크로스피어의 사진을 도 1에 나타내었다.
도 2는 마이크로스피어 크기의 분포를 나타낸다.
실시예 2: RNA가 로드된 마이크로스피어의 제조
마이크로스피어는 자유 카르복실 말단 기를 포함하는, 약 0.2 dL/g의 내재 점도, 50:50 PLGA 코폴리머를 사용하여 w/o/w 유화액/용매 증발 방법을 통해 제조되었다. 메틸렌 클로라이드의 3 ml가 0.6 g 또는 PLGA에 첨가되었다. RNAsa 없는 정제수 내 RNA (222 mg/ml) (RNA Sigma 5000-10000Da)의 농축된 용액의 0.3 ml가 PLGA 유기 용액에 첨가되고 20초 동안 초음파 처리에 의해 유화되었다. 이러한 일차 유화액은 1% (w/v) 폴리비닐 알코올의 RNAsa 없는 수용액 및 만니톨의 5% (w/v)로 이루어진 외상에 첨가되고 약 10300 rpm에서 60초 동안 균질화되었다. 수득된 두번째 유화액 (w/o/w)는 RNAsa 없는 정제수의 용적에 첨가되고 메틸렌 클로라이드는 교반에 의해 증발되었다. 수득된 마이크로스피어는 원심분리에 의해 수집되고, RNAsa 없는 정제수로 두번 세척되고, 이후 동결 건조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 10 μm, (5-25 μm 86% 및 25 μm 초과 0%) 한편 캡슐화 효과는 73% 였다.
실시예 3: 플라시보 (placebo) 마이크로스피어의 제조
마이크로스피어는 자유 카르복실 말단 기를 포함하는, 약 0.2 dL/g의 내재 점도, 50:50 PLGA 코폴리머를 사용하여 w/o/w 유화액/용매 증발 방법을 통해 제조되었다. 메틸렌 클로라이드의 3 ml는 0.6 g 또는 PLGA에 첨가되었다. 정제수의 0.3 ml가 PLGA 유기 용액에 첨가되고 20초 동안 초음파 처리에 의해 유화되었다. 이러한 일차 유화액은 1% (w/v) 폴리비닐 알코올의 수용액 및 소듐 클로라이드 1% (w/v)로 이루어진 외상에 첨가되었으며 약 10300 rpm에서 60초 동안 균질화되었다. 수득된 두번째 유화액 (w/o/w)은 정제수의 용적에 첨가되고 메틸렌 클로라이드는 교반에 의해 증발되었다. 수득된 마이크로스피어는 원심분리에 의해 수집되고, 정제수로 두번 세척 이후, 동결 건조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 7 μm, (5-25 μm 84% 및 25 μm 초과 0%).
실시예 4: 알부민 플루오레세인 이소티오시아네이트(albumin fluorescein isothiocyanate)로 로드된 마이크로스피어의 제조
마이크로스피어는 자유 카르복시 말단 기를 포함하는, 약 0.2 dL/g의 내재 점도, 50:50 PLGA 코폴리머를 사용하여 w/o/w 유화액/용매 증발 방법을 통해 제조되었다. 메틸렌 클로라이드의 1 ml가 0.2 g 또는 PLGA에 첨가되었다. 알부민 플루오레세인 이소티오시아네이트 수용액 (20 mg/ml)가 PLGA 유기 용액에 첨가되고 15초 동안 초음파 처리에 의해 유화되었다. 이러한 일차 유화액은 1% (w/v) 폴리비닐 알코올의 수용액 및 1% (w/v)로 이루어진 외상에 첨가되고 약 10300 rpm에서 60초 동안 균질화되었다. 수득된 두번째 유화액 (w/o/w)은 정제수의 용적에 첨가되고 메틸렌 클로라이드는 교반에 의해 증발되었다. 수득된 마이크로스피어는 원심분리에 의해 수집되었고, 정제수로 두번 세척한 후, 동결 건조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 9 μm, (5-25 μm 91% 및 25 μm 초과 0%).
실시예 5: 타겟 조직을 공급하는 동맥 내 선택적 투여에 대한 연구
큰 흰색 돼지(Large White pig) 내 AMI를 촉발시킨 이후, 실시예 4에서 지시된 것처럼 제조된 형광(fluorescent) 알부민을 포함하는 마이크로스피어의 30 mg이 경색 부위를 공급하는, AMI에 원인이 있는 동맥 내 위치한 2.5/12 동축 벌룬(coaxial balloon)의 수단에 의해, 관상 동맥 내 경로를 통해 투여되었다. 마이크로스피어는 Tween-80을 포함하는 생리 식염수의 10 ml 내 인시추(in situ) 현탁되었다; 투여는 5 ml의 2 연속적인 주사로 수행되었고, 각각 생리 식염수의 5 ml가 뒤따랐다. 실험은 캡슐화된 안타고미르가 발병된 조직을 공급하는 동맥 내 선택적으로 투여될 수 있음을 보였다.
실시예 6: 혈류에 유출을 허용함이 없이 발병된 조직의 모세 혈관 내 마이크로스피어의 유지의 연구
돼지 모델에서, 4 실험은 내측 전방 하향 분지(medial anterior descending branch) 내 위치한 동축 벌룬을 통한 관상동맥 내 경로에 의한 투여, 실시예 4에 따라 제조된 형광 마이크로스피어의 각각 5 ml와 함께 2 주사에 의해 수행되었다. 4 동물은 안락사되었고 전방 하향 분지 부근의 조직의 심근 샘플 및 다른 관상 동맥에 의해 세척된 대조군 조직이 수득되었다. 샘플은 광학 형광 현미경을 통해 관찰되었고, 마이크로스피어의 존재는 손상된 심장 근육의 모세 혈관에 유지될 뿐만 아니라, 대조군 조직 내 그들의 부재도 설명되었다.
전신 생체분포(systemic biodistribution)를 배제하고, 이전 동물의 둘에, 게다가 허혈성 및 대조군 심근 조직, 폐, 비장 및 간으로부터 5 복제 샘플이 수득되고 라이트 B와 함께 광학 현미경에 의해 시각화되었다. 형광은 전방 심근 벽에서 독점적으로 검출되었다. 이러한 분석은 마이크로스피어가 안타고미르92a의 전신 방출을 회피하여 (부작용의 감소) 심장 내 유지됨을 나타낸다.
실시예 7: 타겟 조직 그 자체에 손상 없이 발병된 조직의 모세 혈관 내 마이크로스피어의 유지의 연구
실험은 잠재적인 국소적 심장 독성 및 투여량의 치료학적 안전 범위를 조사하기 위해 수행되었다. 심장 근육에 국소적인 허혈성 손상을 검출하기 위해, 국소 빈혈(ischemia)을 검출하는데 그들의 능력이 매우 민감한, 2 쌍의 압전 결정(piezoelectric crystals)이 채용되었다. 심장 근육 조직이 국소 빈혈에 의해 영향을 받을 때, 잔여 조직은 이상 운동성(dyskinetic)이 되고 팽창(swells)한다; 이는, 잔여 근접한 건강한 조직에 의해 생성된 혈압에 따라, 미세 결정의 분리를 유발하고 각각으로부터 보다 멀어지도록 움직인다. 개흉(thoracotomy) 및 심막절제술(pericardiectomy)을 수행한 이후에 두마리 돼지에, 마이크로스피어가 투여된 것을 통해, 미세 결정 두쌍, 측면(lateral) 영역에 하나의 대조군 쌍 및 전방 하향 분지에 의해 공급된 전방 영역 내 한 쌍이 삽입되었다. 중간(medium) 결정의 각 쌍에 대하여, 심장 주기 동안 두 포인트에서 그들 사이에 거리가 측정되었다: 엔드-디아스톨(end-diastole, EDL) 및 엔드-시스톨(end-systole, ESL). EDL 및 ESL 사이의 관계는 파라미터 SS (심장수축 단축(systolic shortening): (EDL-ESL) /EDL에 의해 표현된다. 좌심실 수축이 완전히 소멸될 때 EDL = ESL 및 SS = 0. 정상치는 0.2 ± 0.1 사이의 범위이다. 첨부된 설명에 나타난 것과 같이, 몇초 동안 지속되는 각 주사 이후에 최소 및 일시적인 진동(oscillations)은 첫번째 및 두번째 주사에 상응하는, 본 연구의 투여량과 함께 유도되었다. 게다가 놀랍게도, 본 연구의 14회 투여량에 이르는 실시예 4에 따라 제조된 형광 마이크로스피어의 반복된 관상동맥 내 주사에 국소적인 부작용은 관찰되지 않았다. 제한이 없는 최대 투여량은 비가역적인 허혈성 손상, 혈류역학적 영향(hemodynamic repercussion) 또는 부정맥(arrhythmias)과 관련된다.
추가로, 관상 동맥 혈류의 변화를 탐지하기 위해, 혈류 센서는 관상 동맥 혈류를 측정하는 중간(middle) LAD에 위치한다. 관상 동맥 혈류에 현저한 변화는 관상동맥 내 주사 이후에 관찰되지 않았다.
결과는 마이크로스피어의 120mg가 주사된 것은 도 3에, 마이크로스피어의 240 mg가 주사된 것은 도 4에 설명되었다.
실시예 8: 작은 안타고미르 투여량을 갖는 마이크로스피어의 단일 관상 동맥 내 주사의 분자적 효과의 연구
미세 캡슐화된 안타고미르의 작은 투여량이 분자 반응을 발생시킬 수 있는지 입증하기 위해, 허혈성 및 대조군 조직 내, 인비보(in vivo) miR-92a 발현이 관상 동맥 내 캡슐화된 안타고미르-92a 투여 이후에 측정되었다. 3 돼지 내, 실시예 1 (0.1 mg/Kg)에 따라 제조된 안타고미르-92a를 포함하는 마이크로스피어의 60 mg이 LAD 내 전달되었다. 동물들은 miR-92a의 치료 및 발현 일(one), 삼(three) 및 10일 이후 안락사되었고 대조군으로서 내생 마이크로RNA (miR-123, 203, 및 126)이 총 RNA 분리 및 특정한 프라이머를 사용한 실시간 정량적 RT-PCR에 의해 경색된 2 복제(replicate) 및 대조군 샘플 내에 정량되었다 (도 5 참조).
경색된 조직 내, miR-92a 발현은 대조군 조직에 비해 8배 하향 조절을 초래한 반면 내생 miRs의 발현은 치료에 의해 영향을 받지 않았다. 억제는 이미 첫째날 나타나기 시작했고 대조군 부위에 비해 5배 낮은 발현 수준으로, 10일째에도 여전히 나타났다.
현저한 조절은 내생 miRs에서 발견되지 않았다. 이들 결과는 수송체/시스템이 안타고미르-92a의 조절된 전달 및 방출을 가능하게 하는 적절한 조건을 제공하며, 그에 따라 단일 관상 동맥 내 투여와 함께 마이크로RNA-92a의 지속적인 억제를 생성함을 나타낸다.
도 6에 나타난 이들 결과는, 또한 안타고미르가 마이크로스피어 제조 과정 동안 분해되지 않음을 확인한다.
실시예 9: 안타고미르의 낮은 투여량을 포함하는 마이크로스피어의 단일 관상 동맥 내 주사의 생물학적 효과에 대한 연구
마이크로스피어 전송된 안타고미르-92a의 분자적 효과가 생물학적 효과에 의해 동반되는지 입증하기 위해, 전임상 연구가 26 성체 미니피그로 수행되었다. 본 연구의 목적은 선택적인 관상 동맥 내 캡슐화된 안타고미르-92a 투여에 의한 mir-92a의 억제가 경색 부위 내 혈관 생성의 증진을 유도하는지, 및 그에 따라 심실 리모델링의 발생을 예방하지는지 조사하는 것이다.
세가지 제형이 투여되었다:
- 식염수 (대조군 제형)
- 실시예 3에 따라 제조된 플라시보 마이크로스피어
- 3 mg/미니피그의 하나의 안타고미르 투여량에서, 실시예 1에 따라 제조된 안타고미르-92a 마이크로스피어.
치료 4주 이후, 괴저성 부위 내 현저하게 높은 혈관 밀도가 대조군에 비해 캡슐화된 안타고미르-92a를 받는 동물 내에서 검출되었고, 따라서 이전 연구에서 관찰된 안타고미르-92a의 신생혈관생성(proangiogenic) 활성을 확인하였다 (161.57±58.71 vs 68.49±23.56 플라시보 그룹 내 vs 73.91±24.97 식염수 그룹 내, p=0.001) ii) 혈관 밀도 (도 7 참조).
미세혈관성(Microvascularity)은 경색 부위 및 경색 주위 가장자리(peri-infarct rim) 모두에서 증가되었다. 치료된 동물 내 낮은 미세혈관 내성 지수가 지속적으로 입증되었고 (200.67±104.46 vs 511.73±202.1 대조군 내, p=0.007) 이는 혈관 밀도와 현저하게 연관된다 (R2 0.41, p=0.02). (도 8 참조).
베이스라인 미소순환 내성 (베이스라인 MR) 및 진정(true) 미소순환 내성 (TMR (hyp))는 대조군에 비해 치료된 그룹에서 현저하게 낮았다 (7.47±1.33 vs 19.62±2.98, p=0.005 및 5.0±1.15 vs 14.49±2.4, p= 0.006 각각). 베이스라인 및 진정 미소순환 내성은 혈관 밀도와 현저하게 연관된다 (R2 0.35, p=0.033 및 R2 0.31, p=0.047 각각 (도 9 참조).
이들 데이터는 캡슐화된 안타고미르-92a가 인비보(in vivo) 지속적인 혈관 생성을 유도함을 가리킨다.
성장 혈관을 발견하고, AMI 이후 발생하는 치료 과정 내 이의 잠재적인 이익은 그에 따라 추가로 조사되었다. 심실 리모델링에 캡슐화된 안타고미르-92a의 효과를 결정하기 위해, 치료된 및 비치료된 그룹 내, 엑스 비보(ex vivo) 자기공명이미지 (magnetic resonance imaging, CMR)에 의해 형태학적 및 구조적 파라미터 및 혈관 내 초음파 심장 검진 (IVE)에 의해 분석된 기능적 파라미터가 비교되었다. 전방 및 중격정단(septoapical) 운동 장애를 갖는 동물의 현저하게 많은 백분율은 또한 부상 심실 벽의 현저하게 높은 티닝(thinning)과 함께 대조군 내 IVE에 존재하며 (p=0.03) (특히 도 10 참조) 부정적인 리모델링 형태 계측(morphometry)은 치료된 동물에 비해 엑스-비보(ex-vivo) CMR 내 좌심실 내에서 변한다 (표 3).
보다 구체적으로, 도 10은 혈관 내 초음파 심장 검진 (IVE)에 의해 부분적인(regional) 벽 운동 기능 장애의 분석 결과를 나타낸다. IVE는 Vivid Q 초음파 이미징 머신(ultrasound imaging machine) (GE Healthcare, Belford, UK) 및 우심실의 정점에(apex) 위치한 AcuNav 10F 초음파 카테터 (Siemens)를 사용하여 수행되었다.
본 연구의 결과는 안타고미르-92a 마이크로스피어의 투여가 급성 심근 경색이 따르는 부정적인 리모델링을 통계적으로 현저하게 감소시키는 것과 관련됨을 나타낸다.
CMR 내 좌심실 리모델링의 파라미터
식염수
(N=6)		 플라시보 ME
(N=5)		 안타고미르-92a ME
(N=6)		 P
경색된CMR 슬라이스의 수 4.8±0.3 4.8±0.4 5.3±0.2 0.38
Tmax 경색된 벽 내(Tmaxinfarctedwall), mm 6.07±0.9 5.61±0.5 9.01±0.6 0.006
T일반 후벽(Tnormal posterior wall), mm 13.23±0.5 13.52±1.8 11.82±0.7 0.49
최소 티닝(minimumthinning)의 백분율, % 54.79±4.9 56.74±4.1 22.71±5.5 0.000
Tmin 경색된 벽 내(Tmininfarctedwall), mm 3.17±0.4 4.02±0.9 4.35±0.5 0.33
최대 티닝(maximumthinning)의 백분율, % 76.40±2.18 69.86±4.72 62.54±4.19 0.05
티닝 벽의 길이(Length of the thinning wall), mm 32.2±1.8 31.7±4 20.5±3.6 0.03
DR /DN 1.93±0.2 2.02±0.2 1.29±0.1 0.03
DN,mm 14.88±0.68 13.78±1.59 17.5±1.37 0.12
부정적인(Adverse) 리모델링% (n) 83.3 (5) 80 (4) 16.7 (1) 0.03
캡슐화된 안타고미르-92a는 급성 심근 경색 한달 이후 부정적인 좌심실 리모델링을 예방한다. 각 미니피그 내 엑스비보(ex-vivo) CMR의 모든 경색된 슬라이스(slices) 내에서 계산된 다른 리모델링 파라미터가 결정되었다. 네마리 미니피그의 대표적인 L2 슬라이스 (L1 정점인)을 나타내었다. Tmax infarcted wall = 각 슬라이스 내 최대 경색 벽 두께의 를 영향을 받은 슬라이스의 수로 나누어 계산된 최대 경색된 벽 두께의 평균; Tnormal posterior wall = 각 영향을 받은 슬라이스 내 벽 후방 두께의 를 영향을 받은 슬라이스의 수로 나누어 계산된 후방 유두근(papillary muscle)의 삽입 옆에 측정된 일반 후방 벽의 평균 두께; [100 - (Tmax infarcted wall/T normal posterior Wall x100)]로 계산된 최소 티닝의 평균 백분율; Tmin infarcted wall = 각 영향을 받은 슬라이스 내 최소 경색 벽 두께의 를 영향을 받은 슬라이스의 수로 나누어 계산된 최소 경색 벽 두께의 평균; [100 - (Tmin infarcted wall/T normal posterior wallx100)]로 계산된 최대 티닝의 평균 백분율; DR: 각 경색된 슬라이스 내 경색된 벽 사이의 최대 직경의 를 영향을 받은 슬라이스의 수로 나누어 계산된 경색된 벽 및 반대쪽(contralateral) 일반 벽 사이에 평균 최대 직경; DN : 각 경색된 슬라이스 내 일반 벽 사이의 최대 직경의 를 영향을 받은 슬라이스의 수로 나누어 계산된, DR과 오른쪽 각을 형성하며 가장 가까운 심실강(ventricularcavity)의 중심에 끌린(drawn) 일반 벽 사이에 평균 최대 직경; DR/ DN : 각 경색된 슬라이스의 DR/ DN의 를 영향을 받은 슬라이스의 수로 나누어 계산된 평균 구형 지수(sphericity index). 표의 데이터는 평균 ± s.e.m으로 표현된다.
대표적인 CRM의 결과는 하기를 나타낸다:
A : 미니피그 14 ( AMI의 유도 이후 즉시 죽음)의 심장 NMR 및 IVE : AMI 이후 즉시 죽음의 발생 덕분에, 리모델링 과정이 촉발되기에 충분한 시간이 없었다. 이는 동심(concentric) 좌심실이 왜 모든 부분(segments)에서 유사한 면적(dimensions)을 갖는 것으로 나타나는지 그 이유이다.
B : 후- AMI 20 내지 30일 미니피그의 심장 NMR 및 IVE : 부정적 심실 리모델링의 증거: AMI 한달 이후, 전방 및 중격 부위(sections)의 극도의 수척(emaciation) 뿐만 아니라 후-AMI 부정적 리모델링의 전형적인 IVE에 운동 장애와 함께 동맥류(aneurysm) 형성이 CMR에서 발견되었다.
C : 후- AMI 22 내지 30일 미니피그의 심장 NMR 및 IVE : 심실 리모델링 없음: AMI 한달 이후, 전방 및 중격 부위 내 정수리 영역(parietal region)의 근소한 감소가 동맥류 형성 없이 IVE 내 운동 장애 없이 관찰되었다. 이는 AMI 이후 유리한 수리 반응의 전형적인 경우이다.
실시예 10: 캡슐화된 안타고미르 -92a의 혈관 종양의 유도 또는 단기 사망률(mortality)에 효과의 연구
혈관 종양은 모든 동물에서 수행된 부검(necropsy) 분석에서 관찰되지 않았고, 그에 따라 먼 거리의 다른 기관 내 마이크로RNA-92a의 이소성(ectopic) 전신 억제의 부재를 제시하였다. 본 연구의 사망률(mortality)은 23%였다. 단기 사망률에 차이가 관찰되지는 않았다. 단 하나의 미니피그가 캡슐화된 안타고미르92a에 할당되고 죽었다 (p=0.39).
N= 26 식염수
(n=9)		 플라시보 ME (n=9) 안타고미르-92a ME (n=8)
한달 후
(1 month follow-up)		 6 7 7
죽음 3 2 1
실시예 11: 캡슐화된 안타고미르 -92a의 심장부정맥 촉진( proarrhythmic ) 프로필의 연구.
캡슐화된 안타고미르-92a의 부정맥 잠재성을 알기 위하여, 절차 중 모든 부정맥 이벤트는 Collect 5S software (GE)를 통해 기록 및 분석되었다. 게다가, 이 문제를 해결하기 위해, 삽입가능한 루프 레코더는 경색 후 및 치료 한달에, 희생될 때까지 부정맥의 잠재적인 에피소드를 검출하기 위해 본 연구의 26 미니피그의 10에 무작위로 이식되었다. 해로운(maligne) 반박성 부정맥(tachyarrhythmias) 또는 부정서맥(bradiarrhythmias)의 수는 대조군과 비교하여 처리된 군에서 높게 관찰되지 않았으며, 관상 동맥 내 캡슐화된 안타고미르-92a는 심장부정맥 촉진 효과를 발휘하지 않는 것을 가리켰다.
본 연구 동안 검출된 부정맥
식염수 (n=9) 플라시보 ME (n=9) 안타고미르-92a ME (n=8) p
허혈성 상( Ischemic phase) (n= 26)
부정맥 없음, n(%)
부정맥, n(%)
PVC, n
NSVT, n
심실 섬유화(fibrilation), n		 2 (22.2)
7 (77.8)
5
0
3		 0
(100)
7
1
3		 1 (12.5)
7 (87.5)
5
1
3		 0.37
재관류 상( Reperfusion phase) (n=26)
부정맥 없음, n(%)
부정맥, n(%)
부비동 정지(Sinusal pauses),
결절 리듬(Nodal rhythm),n
IVR, n
PVC, n
NSVT, n		 5 (55.6)
4 (44.4)
1
1
0
4
0		 3 (33.3)
6 (66.7)
1
0
2
3
0		 3 (37.5)
5 (62.5)
0
0
1
3
1		 0.6
AMI 이후 30일 동안 ( n=10)
주입가능한 루프 레코더 n=4 n=3 n=3 0.88
부정맥 없음, n(%)
부정맥, n(%)
부비동 빈맥(Sinusal taquicadia)
부비동 정지(Sinusal pausa)
PVC 또는 PSVC
평가 불가		 0 (0)
2 (50)
2
0
0
2 (50)		 0 (0)
3 (100)
3
1
0
0		 0 (0)
3 (100)
3
0
1
0		 0.38
PVC: 조숙(premature) 심실 복합체, NSVT: 비-지속적인 심실 빈맥,
IVR: 심실 고유의 리듬,
PSVC: 조숙 상심실(supraventricular) 복합체
AMI: 급성 심근 경색
실시예 12: 인비트로 ( in vitro ) miR92a의 발현에 캡슐화된 안타고미르 92a 및 비캡슐화된 안타고미르 -92a의 효과의 평가.
12.1: 재료 및 방법(Material and Method)
a. 세포
폐 세포 A549 (ATCC® CRL-2922TM)의 티오구아닌(thioguanine) 내성 클론과 함께 인간 제대 정맥(umbilical vein) 세포를 융합시켜 제조된 인간 제대 정맥 세포 라인, EA.hy926이 사용되었다.
b. 처리(Treatment)
약 500 000 EA.hy926 세포가 여섯개 웰 플레이트에 시드되었고(seeded) 10% 소태아혈청 (FBS) 및 2 mM L-글루타민 (Sigma, L'Isle d'abeau, France)이 보충된 RPMI 1640 내 표준 조건 (37°C, 5% CO2) 하에서 배양되었다 매체는 이후 각각의 안타고미르 및 그들이 각각의 대조군(PBS 또는 마이크로스피어)을 포함하는 신선한 완성된 RPMI 배지에 의해 교체되었다. EA.hy926 세포는 10 및 150 nM에서 안타고미르 92a (안타고미르92a 마이크로스피어의 자유 및 세 배치(batches)), 캡슐화된 안타고미르 17 또는 캡슐화된 안타고미르 20으로 처리되었다. 세포는 RNA 추출을 위해 수확하기 전에 추가로 24시간 동안 배양되었다. 총 RNA는 추출되었고 miRNAs의 발현은 정량적 RT-PCR의 평균에 의해 정량되었다.
c. RNA 추출
miRNAs는 Qiagen RNeasy mini-preps (ref. 74106) 및 RNeasy+ universal kits (ref. 73404)를 사용하여, 각각, 제조자의 지시에 따라 (Qiagen, Courtaboeuf, France), EA.hy926 세포 및 미니피그 조직으로부터 분리되었다. 추출된 RNA의 양 및 순도 NanoDrop ND 1000 분광광도계 (Labtech International, Paris, France)를 사용하여 측정되었다.
d. miRNAs의 역전사
miRNAs는 총 RNA의 5 ng 및 특정한 miRNA 프로브를 포함하는 15 μl의 최종 부피 내, TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, ref. 4366596)를 사용하여, 역전사되었다. 샘플은 16°C에서 30분 동안 및 42°C에서 30분 동안 배양되었고, 역전사효소는 85°C에서 5분 동안 가열 및 4°C에서 계속 냉각하여 비활성화되었다.
e. 실시간 RT- PCR
이론적 기초 . 정량적 값은 Ct 수로부터 수득되었고 PCR 생산물의 기하급수적인 증가와 관련된 신호의 증가는 검출되기 시작하였다 (제조자의 지시에 따라 QuantStudio 6 및 7 Flex Software 사용). 시작 물질의 양에 차이를 조절하기 위해, 데이터는 2 내생 대조군(miRNA103 및 miRNA191)의 기하학적 평균으로 일반화되었고, 발현 수준은 처리의 기능과 같이 변화하지 않는 것으로 경험적으로 나타났다. 타겟 miRNA의 값은 대조군 내 타겟 miRNA의 값과 1의 값이 동일한 것과 같이 나중에 일반화되었다. 결과는 △△Ct 계산 방법(RQ analysis software, Applied Biosystems®)을 사용하여 표현되었다.
PCR 증폭 . 모든 PCR 반응은 QuantStudio™ 6 Flex 실시간 PCR 시스템 및 TaqMan 프로브 (Applied Biosystems®)를 사용하여 수행되었다. 열적 사이클링(cycling) 조건은 95°C에서 10분 동안 초기 변성(denaturation) 단계 및 95°C에서 15초 동안 및 65°C에서 1분 동안 45 사이클을 포함한다. 샘플은 반복(duplicate)하여 실험되었다.
12.1: 결과
miR-92a 발현은 약 90% 감소로 10 nM에서 자유 및 캡슐화된 안타고미르-92a 모두에 의해 억제되었다.
miR-92a 발현은 150 nM에서 자유 및 캡슐화된 안타고미르-92a 모두 이후에 검출되지 않았다.
miR-17 또는 miR-20a 발현은 안타고미르-92a 처리에 의해 현저하게 감소되지 않았다.
이들 데이터는 도 11에 요약되었다.
실시예 13: miRs의 그들 각각 발현에 세가지 캡슐화된 안타고미르(안타고미르 17, 20a 및 92a)의 효과의 인비트로 ( in vitro ) 평가.
13.1 안타고미르 -17로 로드된 마이크로스피어의 제조
마이크로스피어는 50:50 PLGA 코폴리머 (i.v. 0.2 dL/g)를 사용하여 유화액/용매 증발 방법에 의해 제조되었다. 안타고미르-17의 용액 (HSA-miR-17-5p; 분자량: 5305Da; 서열: CTGCACTGTAAGCACT; Exiqon으로부터)은 PLGA 유기 용액 내에 유화되었다. 수득된 유화액은 분산 수상 내 차례로 합성되고 원하는 입자 크기를 얻기 위해 균질화되었다. 최종적으로, 용매 증발 이후, 수득된 마이크로스피어는 동결 건조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 10 mm이며 안타고미르-17 양은 7.3%이다.
13.2 안타고미르 -20a로 로드된 마이크로스피어의 제조
마이크로스피어는 50:50 PLGA 코폴리머 (i.v. 0.2 dL/g)를 사용하여 유화액/용매 증발 방법을 통해 제조되었다. 안타고미르-20a의 용액 (HSA-miR-20a; 분자량: 5289Da; 서열: CTGCACTATAAGCACT; Exiqon으로부터) PLGA 유기 용액 내 유화되었다. 수득된 유화액은 분산 수상에서 차례로 합성되고 원하는 입자 크기를 얻기 위해 균질화되었다. 최종적으로, 용매 증발 이후, 수득된 마이크로스피어는 동결 건조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 10 mm이며 안타고미르-20a 함량은 6.8% 였다.
13.3 결과
재료 및 방법은 실시예 12의 구절( salme )과 같음.
- miR-17은 10 nM에서 캡슐화된 안타고미르-17에 의해 76%로 억제되었다. miR17 발현은 150 nM에서 캡슐화된 안타고미르-17 처리에 의해 완전히 폐지되었다(abolished).
- miR-20a는 10nM에서 캡슐화된 안타고미르-20a에 의해 7% 및 150 nM에서 캡슐화된 안타고미르-20a 처리에 의해 87%로 억제되었다. 결과는 도 12에 나타났다.
실시예 14: 로드(load), 사이즈 및 락티드/ 글리콜라이드 비율의 특징과 함께, 안타고미르92a 마이크로스피어의 세가지 배치(batches)의 인비트로 ( in vitro ) 평가.
14.1 낮은 안타고미르 -92a 로딩을 갖는 마이크로스피어의 제조 (L13250 : 폴리머 : RESOMER RG502H )
마이크로스피어는 실시예 1에 설명된 것처럼 50:50 PLGA 코폴리머 (i.v. 0.2 dL/g)를 사용하여 유화액/용매 증발 방법을 사용하였으나, 낮은 안타고미르-92a 함량을 갖는 보다 작은 마이크로스피어를 제조하기 위해 약물의 낮은 초기 용량 및 높은 교반(agitation) 속도를 사용하여 제조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 7 mm이며 안타고미르-92a 함량은 1.5% 였다.
14.2 높은 안타고미르 -92a 로딩을 갖는 마이크로스피어의 제조 (L13262 : 폴리머 : RESOMER RG502H )
마이크로스피어는 실시예 1에 설명된 것처럼 50:50 PLGA 코폴리머 (i.v. 0.2 dL/g)를 사용하여 유화액/용매 증발 방법을 사용하였으나, 높은 안타고미르-92a 함량을 갖는 보다 큰 마이크로스피어를 제조하기 위해 약물의 높은 초기 용량 및 낮은 교반 속도를 사용하여 제조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 15.6 mm이며 안타고미르-92a 함량은 9.8% 였다.
14.3 장기 지속성(long-lasting) 폴리머를 사용하여 안타고미르 -92a로 로드된 마이크로스피어의 제조 (L13230: Polymer　: LACTEL B6006)
마이크로스피어는 실시예 1에 설명된 유화액/용매 증발 방법을 통하였으나, 늦은 약물 방출을 위해 높은 분자량 (i.v. 0.64 dL/g)를 갖는 85:15 PLGA 코폴리머를 사용하여 제조되었다. 마이크로스피어의 평균 직경은 12 mm이며 안타고미르-92a 함량은 3.1% 였다.
14.4 결과
로드, 크기 및 락티드/글리콜라이드 비율의 특징을 갖는, 안타고미르-92a 마이크로스피어의 세가지 배치(batches)는 실험되었다.
마이크로스피어 함량에 따라 L13250은 2 및 30 nM에서, L13262는 14 및 210 nM에서, 및 L13230은 4 및 66 nM에서 실험되었고,
L13250, L13262 및 L13230은 miR92a 발현을 완전히 폐지하였다.
SEQUENCE LISTING <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT FUNDACIO HOSPITAL UNIVERSITARI VALL D'HERBRON-INSTITUT DE RECERCA <120> Composition comprising an encapsulated antagomir <130> IMP152559FR <150> EP 13 305 082.3 <151> 2013-01-24 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 78 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 cuuucuacac agguugggau cgguugcaau gcuguguuuc uguaugguau ugcacuuguc 60 ccggccuguu gaguuugg 78 <210> 2 <211> 75 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 ucaucccugg guggggauuu guugcauuac uuguguucua uauaaaguau ugcacuuguc 60 ccggccugug gaaga 75 <210> 3 <211> 96 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 cgggccccgg gcgggcggga gggacgggac gcggugcagu guuguuuuuu cccccgccaa 60 uauugcacuc gucccggccu ccggcccccc cggccc 96 <210> 4 <211> 84 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 gucagaauaa ugucaaagug cuuacagugc agguagugau augugcaucu acugcaguga 60 aggcacuugu agcauuaugg ugac 84 <210> 5 <211> 71 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 ugcccuagca gcgggaacag uucugcagug agcgaucggu gcucuggggu auuguuuccg 60 cugccagggu a 71 <210> 6 <211> 89 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 gucagcagug ccuuagcagc acguaaauau uggcguuaag auucuaaaau uaucuccagu 60 auuaacugug cugcugaagu aagguugac 89 <210> 7 <211> 81 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 guuccacucu agcagcacgu aaauauuggc guagugaaau auauauuaaa caccaauauu 60 acugugcugc uuuaguguga c 81 <210> 8 <211> 72 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 uacaucggcc auuauaauac aaccugauaa guguuauagc acuuaucaga uuguauugua 60 auugucugug ua 72 <210> 9 <211> 72 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 9 acucggaugg auauaauaca accugcuaag uguccuagca cuuagcaggu uguauuauca 60 uuguccgugu cu 72 <210> 10 <211> 70 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 10 acacggacaa ugauaauaca accugcuaag ugcuaggaca cuuagcaggu uguauuauau 60 ccauccgagu 70 <210> 11 <211> 68 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 11 cuccggugcc uacugagcug auaucaguuc ucauuuuaca cacuggcuca guucagcagg 60 aacaggag 68 <210> 12 <211> 73 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 cucugccucc cgugccuacu gagcugaaac acaguugguu uguguacacu ggcucaguuc 60 agcaggaaca ggg 73 <210> 13 <211> 76 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 gagggggaag acgggaggaa agaagggagu gguuccauca cgccuccuca cuccucuccu 60 cccgucuucu ccucuc 76 <210> 14 <211> 110 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 ggccagcugu gaguguuucu uuggcagugu cuuagcuggu uguugugagc aauaguaagg 60 aagcaaucag caaguauacu gcccuagaag ugcugcacgu uguggggccc 110 <210> 15 <211> 84 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 gugcucgguu uguaggcagu gucauuagcu gauuguacug uggugguuac aaucacuaac 60 uccacugcca ucaaaacaag gcac 84 <210> 16 <211> 77 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 agucuaguua cuaggcagug uaguuagcug auugcuaaua guaccaauca cuaaccacac 60 ggccagguaa aaagauu 77 <210> 17 <211> 71 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 17 guagcacuaa agugcuuaua gugcagguag uguuuaguua ucuacugcau uaugagcacu 60 uaaaguacug c 71 <210> 18 <211> 69 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 18 aguaccaaag ugcucauagu gcagguaguu uuggcaugac ucuacuguag uaugggcacu 60 uccaguacu 69 <210> 19 <211> 83 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 19 ccuuggagua aaguagcagc acauaauggu uuguggauuu ugaaaaggug caggccauau 60 ugugcugccu caaaaauaca agg 83 <210> 20 <211> 98 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 20 uugaggccuu aaaguacugu agcagcacau caugguuuac augcuacagu caagaugcga 60 aucauuauuu gcugcucuag aaauuuaagg aaauucau 98 <210> 21 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 21 uauugcacuu gucccggccu gu 22 <210> 22 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 agguugggau cgguugcaau gcu 23 <210> 23 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 ggguggggau uuguugcauu ac 22 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 uauugcacuc gucccggccu cc 22 <210> 25 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 agggacggga cgcggugcag ug 22 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 acugcaguga aggcacuugu ag 22 <210> 27 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 caaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 28 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 gggguauugu uuccgcugcc agg 23 <210> 29 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 uagcagcggg aacaguucug cag 23 <210> 30 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 ccaguauuaa cugugcugcu ga 22 <210> 31 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 ccaauauuac ugugcugcuu ua 22 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 uagcagcacg uaaauauugg cg 22 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 cuuaucagau uguauuguaa uu 22 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 uuauaauaca accugauaag ug 22 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 cuuagcaggu uguauuauca uu 22 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 auauaauaca accugcuaag ug 22 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 cacuuagcag guuguauuau au 22 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 auaauacaac cugcuaagug cu 22 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 uggcucaguu cagcaggaac ag 22 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 ugccuacuga gcugauauca gu 22 <210> 41 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens 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Homo sapiens <400> 53 acuguaguau gggcacuucc ag 22 <210> 54 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 caaagugcuc auagugcagg uag 23 <210> 55 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 caggccauau ugugcugccu ca 22 <210> 56 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 uagcagcaca uaaugguuug ug 22 <210> 57 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 cgaaucauua uuugcugcuc ua 22 <210> 58 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 59 <211> 16 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Antagomir <400> 59 ccgggacaag tgcaat 16 <210> 60 <211> 16 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Antagomir <400> 60 ccgggacaag ugcaau 16

Claims (27)

  1. 혈관생성(angiogenesis)에 관련된 적어도 하나의 miRNA, 또는 이의 전구체의 억제자의 유효량을 포함하며, 상기 억제자는 폴리머(polymeric) 생분해성 및 생체적합성 마이크로스피어 내에 미세 캡슐화된, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 miRNA는 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함)를 포함하는 패밀리 내에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 miRNA는 하기 성숙된 것으로 이루어지는 조성물:
    a) SEQ ID No. 21, 22 또는 23로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 21, 22 또는 23의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-92a;
    b) SEQ ID No. 24 또는 25로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 24 또는 25의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-92b;
    c) SEQ ID No. 26 또는 27로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 26 또는 27의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-17;
    d) SEQ ID No. 28 또는 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 28 또는 29의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-503;
    e) SEQ ID No. 30, 31 또는 32로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 30, 31 또는 32의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-16;
    f) SEQ ID No. 33, 34, 35, 36, 37 또는 38로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 33, 34, 35, 36, 37 또는 38의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-374;
    g) SEQ ID No. 39, 40, 41 또는 42로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 39, 40, 41 또는 42의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-24;
    h) SEQ ID No. 43 또는 44로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 43 또는 44의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-483;
    i) SEQ ID No. 45, 46, 47, 48, 49 또는 50으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 45, 46, 47, 48, 49 또는 50의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-34;
    j) SEQ ID No. 51, 52, 53 또는 54로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 51, 52, 53 또는 54의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-20; 및
    k) SEQ ID No. 55, 56, 57 또는 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 또는 SEQ ID No. 55, 56, 57 또는 58의 하나와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 miR-15.
  4. 제1항에 있어서, 상기 miRNA의 전구체는 하기로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물:
    a) 서열 SEQ ID No. 1, 또는 SEQ ID No. 1과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92a-1;
    b) 서열 SEQ ID No. 2, 또는 SEQ ID No. 2와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92a-2;
    c) 서열 SEQ ID No. 3, 또는 SEQ ID No. 3과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-92b;
    d) 서열 SEQ ID No. 4, 또는 SEQ ID No. 4와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-17;
    e) 서열 SEQ ID No. 5, 또는 SEQ ID No. 5와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-503;
    f) 서열 SEQ ID No. 6, 또는 SEQ ID No. 6과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-16-1; 및
    g) 서열 SEQ ID No. 7, 또는 SEQ ID No. 7과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-16-2
    h) 서열 SEQ ID No. 8, 또는 SEQ ID No. 8과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374a
    i) 서열 SEQ ID No. 9, 또는 SEQ ID No. 9와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374b
    j) 서열 SEQ ID No. 10, 또는 SEQ ID No. 10과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-374c
    k) 서열 SEQ ID No. 11, 또는 SEQ ID No. 11과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-24-1
    l) 서열 SEQ ID No. 12, 또는 SEQ ID No. 12와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-24-2
    m) 서열 SEQ ID No. 13, 또는 SEQ ID No. 13과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-483
    n) 서열 SEQ ID No. 14, 또는 SEQ ID No. 14와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34a
    o) 서열 SEQ ID No. 15, 또는 SEQ ID No. 15와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34b
    p) 서열 SEQ ID No. 16, 또는 SEQ ID No. 16과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-34c
    q) 서열 SEQ ID No. 17, 또는 SEQ ID No. 17과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-20a
    r) 서열 SEQ ID No. 18, 또는 SEQ ID No. 18과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-20b
    s) 서열 SEQ ID No. 19, 또는 SEQ ID No. 19와 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-15a, 및
    t) 서열 SEQ ID No. 20, 또는 SEQ ID No. 20과 적어도 90% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 서열을 포함하는 mir-15b.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA의 억제자는 상기 miRNA, 또는 이의 전구체를 타겟으로 하는 서열을 갖는 8-49 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 타겟 miRNA, 또는 이의 전구체의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 스몰 RNA, 안타고미르(antagomir), LNA, CDNA, PNA, 몰폴리노(morpholino) 올리고뉴클레오티드 또는 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 안타고미르로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 안타고미르는 SEQ ID No. 1 내지 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열의 뉴클레오티드에 상보적인 적어도 16개 근접한 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 안타고미르는 서열 SEQ ID No. 59 또는 60 및 이의 염기 치환을 제외한 변형, 및 SEQ ID NO: 59 또는 60의 서브시퀀스(subsequences)의 적어도 8개 근접한 뉴클레오티드로 이루어진 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 25 μm를 초과하지 않는 직경을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로 스피어의 적어도 50%는 5 내지 20 μm, 바람직하게 5 내지 15 μm로 포함되는 직경을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 1% 내지 15% w/w의 억제자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 1% 내지 10% w/w의 억제자를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 폴리-d,l-락티드 (PLA)로 이루어진 폴리머로 구성되며, 상기 폴리머는 하나 이상의 다른 폴리머와 선택적으로 혼합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 폴리-d,l-락티드-코-글리콜라이드 (PLGA)로 이루어진 코폴리머로 구성되며, 상기 폴리머는 하나 이상의 다른 폴리머와 선택적으로 혼합되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 폴리-d,l-락티드-코-글리콜라이드 (PLGA) 및 폴리-d,l-락티드 (PLA)로 이루어진 폴리머의 혼합물로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 PLGA 폴리머 내 락티드:글리콜라이드의 비율은 50:50 내지 95:5 몰비로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머의 내재(inherent) 점도는 0.1 내지 0.70 dl/g으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 심근 경색(myocardial infarction)의 치료 용도로 사용되기 위한 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 심근 경색은 급성 심근 경색으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 이것이 필요한 개체(subject) 내에, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따르는 조성물의 유효량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심실 리모델링을 역전 또는 예방(preventing)하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 투여는 관상 동맥 경로에 의한 투여로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 심근 경색을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 생분해성 및 생체적합성 마이크로폴리머의 개체군(population), 상기 마이크로스피어는:
    - 5 내지 15 μm로 포함되는 평균 직경을 가지며;
    - 폴리-d,l-락티드-코-글리콜라이드 (PLGA) ; 폴리-d,l-락티드 (PLA) 또는 이의 혼합물로 구성되며;
    - 심실 리모델링을 예방할 수 있는 1% 내지 15% w/w의 치료제를 포함하며,
    상기 치료제는 miR-92 (miR-92a-1, miR-92a-2 및 miR-92b 포함), miR-17, miR-503, miR-16 (miR-16-1 및 miR-16-2 포함), miR-374 (miR-374a, miR-374b 및 miR-374c 포함), miR-24 (miR-24-1 및 miR-24-2 포함), miR-483, miR-34 (miR-34a, miR-34b 및 miR-34c 포함), miR-20 (miR-20a 및 miR-20b 포함), miR-15 (miR-15a 및 miR-15b 포함) 및 보다 바람직하게 miR-92a로 이루어진 그룹, 또는 이의 전구체로부터 선택된 miRNA의 억제자로 이루어짐.
  25. 제24항에 있어서, 상기 억제자는 안타고미르인 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
  26. 적어도 i) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따르는 조성물 및/또는 제24항 또는 제25항에 따르는 마이크로스피어 및 ii) 상기 조성물이 배치된(disposed) 주사기 또는 바이알(vial) 또는 앰플(ampoule)을 포함하는 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 키트는 용매 용기 내에 배치된 용매를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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