CN111729088B

CN111729088B - 一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针及其制备方法

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Publication number: CN111729088B
Application number: CN202010846730.9A
Authority: CN
Inventors: 童坤
Original assignee: Jiangsu Shenji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Jiangsu Shenji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2040-08-21
Also published as: CN111729088A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体为一种微小核糖核酸miR‑34a偶联探针及其制备方法，首先将3‑3’二硫代二丙酸进行溶解，并向其中加入二环己基碳二亚胺（DCC）及N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温反应后进行过滤，蒸干溶剂得到中间产物；得到的中间产物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并向其中加入3’‑氨基修饰miR‑34a、3’‑氨基修饰AS1411以及N,N'‑异丙基乙胺（DIPEA）；充分混合反应得到反应物混合液，最后通过高效液相色谱分离得到miR‑34a偶联探针；本发明的技术方案能够提供对细胞毒性影响小、靶向运输快速高效、释放效率高且制备方便的微小核糖核酸miR‑34a偶联探针及其制备方法。

Description

一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针及其制备方法。

背景技术

微小核糖核酸（英文为microRNA, 简称miRNA）是一类细胞内源性的小分子RNA，长度约为22个核苷酸，其可以在转录后水平调控基因的表达。近年相关研究发现，miRNA可以调节约60%的人类基因表达，miRNA的异常表达会引起下游癌相关基因表达的紊乱。因而，对这些异常表达miRNA的调节具有重要的应用价值。

以化学合成的miRNA类似物对细胞内的miRNA类似物进行调节是一种行之有效的策略，且因其长度较短，miRNA类似物的化学合成并不需要复杂工序条件要求，且可以通过化学修饰引入多种功能性基团实现丰富miRNA类似物的生物学特性。然而在实际合成制备中，由于miRNA类似物等寡核苷酸因其亲水及负电性并不能自主跨越细胞膜进入细胞中发挥功能，因而在miRNA类似物的制备过程中，额外的载体不可或缺，常用的载体包括病毒、脂质体以及无机、有机纳米等；但是，病毒类载体具有潜在的生物不安全性，其它载体中因带有过量的阳离子聚合物或金属离子均会对细胞造成显著的毒性；这些载体均可能造成临床药物研发的失败，例如，miR-34a通过脂质体的方式运输在实际应用中就遭遇了强烈的副作用而导致研究终止。因此，发展高效且生物相容好的miR-34a探针以实现运输具有重要意义。

发明内容

本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种对细胞毒性影响小、靶向运输快速高效、释放效率高且制备方便的微小核糖核酸miR-34a偶联探针及其制备方法。

下面关于后续技术方案表述中涉及的专业名词解释如下：

DCC是指二环己基碳二亚胺。

N-NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺。

DMSO是指二甲基亚砜。

AS1411为富含G的寡核苷酸,可形成G-四重结构抗核酸酶降解,并与核仁素特异结合,进入细胞内干扰细胞的正常复制和增殖。

nM为一种物质浓度单位，等同于nmol/l，代表纳摩尔每升。

AMV是逆转录酶的名称，从Avian Myeloblastosis Virus分离出来,经过高度纯化,不含核酸酶，可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。

buffer是指缓冲液。

RT-primer是一种逆转录引物，用于延长miRNA。

dNTP Mixture是由dATP、dTTP、dGTP、dCTP以等摩尔数混合制得，可直接用于PCR、RT-PCR、反转录第一链合成等常规分子生物实验。

DEPC H2O是焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水，是一种RNA酶抑制剂。

PCR是指聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

HindIII及Spel均为常用类别的内切酶。

T4 ligase是指T4连接酶。

SIRT1(英文全名Sirtuin1)是一种依赖于烟酰胺腺苷二核苷酸(NAD+)的去乙酰化酶。

MTT又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

为达到上述目的，本发明采用了如下技术方案。

一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针，具体结构如下：

；

其中，位于结构式左侧的AS1411为核酸适配体且序列为5’- GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGTTTTTTTTTT-3’，可靶向结合肿瘤细胞表面高表达的核仁素；位于结构式右侧的miR-34a为合成miRNA且序列为5’-UGGCAGUGU-CUUAGCUGGUUGU-3’/5’-CAAUCAGCAAGUAUACUGCCC-U-3’，可靶向肿瘤细胞内多种致癌基因；位于结构式中部的中间连接化学基团为肿瘤细胞内还原性微环境响应的二硫键。

一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针制备方法，具体通过如下化学反应步骤制备得到：

；

步骤S1：首先将3-3’二硫代二丙酸进行溶解，并向其中加入二环己基碳二亚胺（DCC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），所添加的配比分别是溶解液的2.2倍当量的二环己基碳二亚胺（DCC）及溶解液的2.2倍当量的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温反应后进行过滤，蒸干溶剂得到中间产物；

步骤S2：将所述步骤S1得到的中间产物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并向其中加入3’-氨基修饰miR-34a、3’-氨基修饰AS1411以及N,N'-异丙基乙胺（DIPEA），上述加入的各反应物重量配比分别为所述中间产物溶解液1倍当量的3’-氨基修饰miR-34a、1倍当量的3’-氨基修饰AS1411以及3倍当量的N,N'-二异丙基乙胺（DIPEA）；

步骤S3：所述步骤S2充分混合反应得到反应物混合液，最后通过高效液相色谱分离得到miR-34a偶联探针。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S1的3-3’二硫代二丙酸是采用二氯甲烷溶解剂进行溶解处理。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S1的室温反应时间设定为不少于1小时。

作为本发明的进一步改进，所述步骤S3中混合反应的温度采用的37℃。

由于上述技术方案的运用，本技术方案具有的有益技术效果：

本技术方案的miR-34a偶联探针通过筛选合适的载体物且反应合成，具有生物影响毒性低、生物相容好、载体靶向精准且运输高效的有益技术效果；通过探针中的AS1411核酸适配体与miR-34a的结合，并借助AS1411核酸适配体的靶向能力及其在药物靶向运输将具有肿瘤抑制功能的miR-34a特异性运输到肿瘤细胞内，可以避免其他纳米颗粒或者高分子聚合物的引入，构建AS1411与miR-34a之间的偶联物，实现特定靶向miR-34a运输和释放；本发明通过多个不同物质按配比及顺序充分反应，并采用液相色谱分离得到miR-34a偶联探针，具有制备工序清晰合理且对制备条件要求低的有益技术效果。

附图说明

图1为HeLa细胞内miR-34a定量分析结果示意图。

图2为293T细胞内miR-34a定量分析结果示意图。

图3为HeLa细胞内荧光素酶表达分析结果示意图。

图4为HeLa细胞内miR-34a靶基因表达分析结果示意图。

图5为HeLa细胞死亡分析结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针，具体结构如下：

；

。

(一)实施例1：miR-34a偶联探针的制备

如上述反应步骤所示，步骤S1：首先将3-3’二硫代二丙酸溶解在二氯甲烷中，向其中加入2.2倍当量的二环己基碳二亚胺（DCC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）；室温反应1小时后，过滤，蒸干溶剂得到中间产物；步骤S2：将中间产物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并向其中加入1倍当量的3’-氨基修饰miR-34a、1倍当量的3’-氨基修饰AS1411以及3倍当量的N,N'-异丙基乙胺（DIPEA）；步骤S3：在37 ℃反应过液中，通过高效液相色谱分离得到miR-34a偶联探针。

(二)实施例2：miR-34a的靶向运输测试分析

将HeLa细胞（核仁素高表达）或者293T细胞（核仁素低表达）植入6孔板中；待细胞密度达到80%，加入终浓度为0-500 nM的miR-34a偶联探针。

共同培养24小时后，提取细胞内RNA进行定量分析；取出5μL的RNA进行逆转录反应制备相应的cDNA样品；具体逆转录反应10 μL体系为：5 x AMV buffer（Takara）2 μl、 AMV（Takara）0.5 μl、 RT primer（ABI）0.5 μl、 dNTP mixture（Takara）1 μl、 DEPC H2O 1 μl、 RNA 5 μl；反应程序依次为：16 ℃反应30min；42 ℃反应30min；85 ℃反应5min；然后在4 ℃进行保存。

制备好的cDNA再用探针法（Taqman）PCR对miR-34a进行实时定量。Taqman PCR反应体系为：10x buffer（Takara）2 μl；MgCl2 (25 mM)（Takara）1.2 μl；Taq（Takara） 0.3 μl；dNTP mixture（10 mM）0.4 μl；Probe（ABI）0.33 μl；cDNA 1 μl；Distilled H2O 14.77 μl。PCR反应程序为95 ℃反应5 min，95 ℃ 反应15s后60 ℃反应1min，40个循环扩增，实时荧光信号均在每个循环的60 ℃采集。

如图1所示，可见在HeLa细胞中，当miR-34a偶联探针的浓度逐渐增加时，细胞内miR-34a的表达量也逐渐增加；而当采用低表达AS1411受体低表达的293T细胞时，如图2所示，并没有观察到类似的现象。上述这些数据表明，miR-34a偶联探针可选择性的向目标细胞（AS1411受体高表达）中选择性且高效运输miR-34a。

(三)实施例3：荧光素酶实验

步骤1：报告质粒的构建

使用HindIII 和Spel内切酶剪切Luciferase （荧光素酶）报告质粒的3’ UTR端，将得到的片断进行电泳分离纯化。miR-34a的互补序列分别通过DNA连接酶，T4 ligase，插入到纯化得到的luciferase 报告质粒中，并转化到感受态大肠杆菌内，再通过含有氨苄的筛选平板筛选得到可能的阳性质粒；最终将该报告质粒进行测序确认其正确性。

步骤2：荧光素酶实验分析

将带有miR-34a互补序列的荧光素酶报告质粒通过转染进入HeLa细胞中，首先将HeLa细胞种到24 孔板中，当细胞密度达到70%-80%时，将0.25 μg miR-34a 报告质粒和0.15 μg β-galactosidase 内参质粒用Lipofectamine 2000试剂转染进细胞，转染操作遵循Invitrogen 产品说明。在转染4小时后，加入0至300 nM miR-34a 偶联探针，继续培养48小时后，测定luciferase和β-galactosidase 内参信号。

如图3所示，当在HeLa细胞中加入miR-34a偶联探针后，荧光素酶的信号显著降低，表明在HeLa细胞内，miR-34a可从偶联探针中释放并发挥功能。

(四)实施例4：蛋白印迹实验验证

将HeLa细胞植入6孔板中，待细胞密度达到80%，加入终浓度为0至300 nM的miR-34a偶联探针；共培养48小时后，提取细胞内蛋白进行蛋白印迹分析；所选取SIRT1为miR-34a下游致癌基因，GAPDH（磷酸甘油醛脱氢酶）为内参，非miR-34a靶基因。

如图4所示，当在HeLa细胞中加入miR-34a偶联探针后，SIRT1的表达显著降低，表明在HeLa细胞内，miR-34a可从偶联探针中释放并发挥功能。

(五)实施例5：细胞存活实验验证

将HeLa细胞植入96孔板中；待细胞密度达到80%，加入终浓度为0-300 nM的miR-34a偶联探针；共培养48小时后，采用噻唑蓝（MTT）对细胞存活进行检测：每孔加入20 ulMTT溶液（5mg/ml），继续培养4小时，小心吸去孔内培养液，孔加入150ul DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。

如图5所示，当在HeLa细胞中加入miR-34a偶联探针后，随着探针浓度的增加，细胞存活也显著降低。这些结果表明在HeLa细胞内，miR-34a可从偶联探针中释放并发挥功能，促进肿瘤细胞的死亡。

以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims

1.一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针，其特征在于，具体结构如下：

；

2.如权利要求1所述的一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针制备方法，其特征在于，具体通过如下化学反应及步骤制备得到：

；

3.根据权利要求2所述的一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针制备方法，其特征在于：所述步骤S1的3-3’二硫代二丙酸是采用二氯甲烷溶解剂进行溶解处理。

4.根据权利要求2所述的一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针制备方法，其特征在于：所述步骤S1的室温反应时间设定为不少于1小时。

5.根据权利要求2所述的一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针制备方法，其特征在于：所述步骤S3中混合反应的温度采用的37℃。