CN101200715A - 人cd40l表达体系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人细胞表面分子CD40L(CD154)的表达体系及制备方法。CD40L(CD154)的表达体系含真核启动子的表达载体；编码SEQ ID NO：1的特异性CD40L目的基因片段；表达载体在多克隆位点与CD40L目的基因片段重组。构建该体系的目的是借用基因转染技术，将该基因转入靶细胞，使CD40L在所需细胞中表达，利用CD40L对免疫功能的调节机制，为相应临床免疫研究，尤其是相关抗肿瘤免疫研究奠定基础。

Description

人CD40L表达体系及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种真核表达体系，尤其涉及一种人CD40L DNA表达体系及其制备方法。

背景技术

DNA重组技术(recombinant DNA technology)是生物工程体系中的重要组成部分。是指在基因水平上，根据需要以人工的方法取得供体上某个或某些有用的基因，在体外重组于载体DNA分子，然后将重组DNA转入受体细胞进行无性繁殖或行使正常功能。

DNA重组技术主要包括：①人工合成或从生物基因组中，获取带有目的基因的DNA片段；②选择或改造作为载体的DNA；③将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择标记的载体分子上，即DNA重组；④将重组DNA分子引入受体细胞；⑤从大量的细胞繁殖群体中筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞并扩增，进一步抽提、纯化、扩增得到目的基因；⑥将目的基因克隆到表达载体，导入受体细胞，使之在新的遗传背景下呈现功能表达，产生出人类所需的物质。

该技术已广泛用于基因工程药物及各种疫苗的制备等研究领域。

CD40L(CD154)，是由261个氨基酸构成的II型跨膜糖蛋白。它主要表达于激活态T淋巴细胞，尤其是CD4⁺T淋巴细胞表面。在免疫系统，该分子与相应细胞CD40受体的相互作用对调节体液与细胞免疫反应具有枢纽作用。一定状态下，CD40L与肿瘤细胞表面CD40结合，可以直接抑制肿瘤细胞增殖，增加抗肿瘤制剂的敏感性。更重要的是，CD40L一方面可以诱导DC细胞成熟，延长DC细胞生存期，上调共刺激分子及内源性肿瘤肽表达；另一方面可增加一些免疫刺激因子的分泌。从而提高DC的抗原呈递效应，促进T效应细胞的增殖，增强了宿主抗肿瘤免疫的能力。以CD40L为组件的抗肿瘤疫苗的动物实验研究日益受到重视，诸多资料表明，动物实验中的抑癌效果令人欣慰，有望拓展于临床领域。因此，建立人CD40L表达体系，为进一步的临床研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种人CD40L表达体系，使人CD40L在所需的受体细胞中进行表达，达到以人工的方式适度调整某些免疫反应的目的，为相关临床免疫研究奠定基础，该体系具有以下特征：

含真核启动子的表达载体；

编码SEQ ID NO：1的特异性人CD40L目的基因片段；

所述的表达载体在多克隆位点与CD40L目的基因片段重组。

本发明的优选实施例中，上述的CD40L目的基因片段SEQ ID NO：1序列为NCBI核酸数据库收录的编号为BC071754 CD40L序列中所载取的40至915间基因序列，共876个碱基。

本发明的优选实施例中，上述的表达载体含CMV和SV40真核启动子。

本发明的优选实施例中，上述的表达载体在多克隆位点具有Nhe I和Kpn I酶切位点。

本发明的优选实施例中，上述的表达载体为pcDNA3.1(+)载体除去多克隆位点Nhe I与Kpn I之间16个碱基的载体部分。

本发明的优选实施例中，上述的CD40L目的基因片段是由人激活态T淋巴细胞中获取。

本发明的另外一个目的是提供一种制备上述的人CD40L表达体系的方法，制备中所用试剂均为市售分析纯制剂。其主要包含以下步骤：

(1)CD40L目的基因的克隆；

(2)CD40L与pMD-18-T重组克隆载体的构建；

(3)pMD-18-T-CD40L重组克隆载体的鉴定与纯化；

(4)重组CD40L-表达载体的构建；

(5)重组CD40L-表达载体阳性质粒的鉴定与纯化；

(6)重组CD40L-表达载体阳性质粒转染靶细胞株；

(7)靶细胞株中CD40L目的基因表达的检测。

本发明的优选实施例中，上述的CD40L目的基因的克隆引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

其中，为便于定向重组载体的筛选，上述的SEQ ID NO：2所示序列的5’末端和上述的pMD18-T载体分别设有酶切位点Nhe I和Kpn I。

本发明的优选实施例中，上述的重组CD40L-表达载体中的表达载体为pcDNA3.1(+)载体除去多克隆位点Nhe I与Kpn I之间16个碱基的载体部分。

本发明所述的人CD40L表达体系，是借用基因转染技术，将该基因转入靶细胞，使CD40L在所需的细胞中表达，可以利用CD40L对免疫功能的调节机制，研究相应临床免疫，尤其是相关抗肿瘤免疫研究。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1A是人血分离、培养的T淋巴细胞刺激前的示意图；

图1B是人血分离、培养的T淋巴细胞刺激后的示意图；

图2A是激活T细胞总RNA的电泳图；

图2B是CD40LDNA及纯化后产物的电泳图；

图3是pMD-18载体的物理图谱；

图4是菌液CD40LPCR扩增产物电泳图；

图5是CD40LPCR阳性菌液的DNA测序图谱；

图6是pcDNA3.1(+)载体的物理结构图；

图7是pMD18-CD40L和pcDNA3.1(+)载体质粒的电泳图；

图8是pMD18-CD40L和pcDNA3.1(+)载体质粒的酶切、纯化物的电泳图；

图9是pcDNA3.1(+)-CD40L转化菌液的CD40L PCR检测电泳图；

图10是pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1(+)-CD40L、pcDNA3.1(+)-CD40L酶切产物的电泳图；

图11是pcDNA3.1(+)-CD40L的测序图谱；

图12是pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CD40L质粒转染H446细胞的PCR检测电泳图；

图13A是pcDNA3.1(+)转染H446细胞的流式细胞仪测试图；

图13B是pcDNA3.1(+)-CD40L转染H446细胞的流式细胞仪测试图；

图14是重组pcDNA3.1(+)-CD40L转染H446株后的荧光显示图。

具体实施方式

实施例1 CD40L目的基因的克隆

1.引物设计与合成

本发明构建的人CD40L表达体系，以NCBI核酸数据库收录、编号为BC071754的CD40L序列为引物设计的模板，利用primer Premier 5引物设计软件进行引物设计，主要注重以下几点：

1)确保阅读框完整，

2)在包含核心启动子元件TATA盒(起始信号前25-30bp)的前提下，尽量降低或避免引物出现发夹或二聚体结构形成的可能。

3)选择能够较稳定表达外源DNA的，pcDNA3.1(+)质粒真核表达载体，介导本基因在靶定细胞中表达。

4)为确保目的基因的高纯度克隆及在酶切时有良好的酶促反应构象空间，选择T克隆载体作为中间介质。

5)为便于定向重组载体的筛选，设计的酶切位点，一个设于正链引物5′末端，另一个设于T载体。

上游引物5′-TGCCAGAAGATACCATTT-3′，(SEQ ID NO：2所示)

下游引物5′-GCTGTATTATGAAGACTCCC-3′，(SEQ ID NO：3所示)

上游引物5′端加载Nhe I酶切位点。

下游引物的Kpn I酶切位点设在T载体。

2.CD40L目的基因存在细胞的获取

取健康成人外周血约40ml，以淋巴细胞分离液离心得单个核细胞，经贴壁收集非贴壁的淋巴细胞，再经尼龙毛柱过滤得T淋巴细胞。以含有IL-2的10F％-RPMI1640培养液培养6天，再分别加入PMA与ConA使其终浓度分别为10ng/ml与10μg/ml，激刺培养10小时收获激活的T淋巴细胞。刺激前、后的T细胞请分别参照图1A和图1B。

3.CD40L目的基因的扩增

1)T细胞总RNA提取

收集激活T淋巴细胞以Tripur提取T细胞RNA。取培养7天并刺激10小时的T细胞，从瓶中轻轻吸取所有细胞悬液于离心管，尽量吸净，室温1000rmp离心5分钟，弃上清，取1ml Tripure加至原培养瓶内反复吹打，冲洗，随后将所有Tripure移入已收集细胞的离心管，反复吹打2分钟，将离心管内所有内容移入DEPC处理的EP管内，室温放置5分钟。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置15分钟。4℃12000×g离心15分钟，以100μl移液器，小心吸取水相于另一EP管，加入异丙醇0.5ml，混匀，室温放置10分钟。4℃12000×g离心10分钟，去上清，加无RNase75％乙醇1ml洗涤沉淀。4℃ 7500×g离心5分钟，去上清。电吹风吹离心管，使乙醇挥发，加30μl无RNAase ddH₂O，55-60℃放置10分钟，待沉淀溶解，紫外分光光度计，测其OD值。

RNA电泳：取5μl RNA与6×上样缓冲液1μl混合，于1％琼脂糖凝胶点样，于TAE缓冲液构成的电泳体系进行电泳，设置90V电压，电泳15分钟。电泳图请参照图2A。

2)RT-PCR试剂盒以PR-PCR法，逆转、扩增CD40L目的基因并给予纯化。

A、逆转录反应与条件设置

逆转录反应液组合：

成分	体积
		MgCl210×RT缓冲液无RNase dH2OdNTP混合物(各10mM)RNase抑制剂AMV反转录酶Oligo dT-A接头引物T细胞总RNA	2μl1μl2.75μl1μl0.25μl0.5μl0.5μl2μl
总体积	10μl

逆转录反应条件：

上述成分混匀后，于上述反应条件合成CD40L cDNA。

B、PCR反应与条件设置：

PCR反应液组合：

成分	体积
		5×PCR缓冲液灭菌ddH2OTaKaRaxTaqTM HS上游特异PCR引物(SEQ ID NO：1)下游特异PCR引物(SEQ ID NO：2)	10μl28.75μl0.25μl0.5μl0.5μl
总体积	50μl

将B液与反应后的A液混合，进行PCR反应。

反应条件：

温度	时间	循环次数
			94℃	2分钟	1

反应产物于1％琼脂糖凝胶由TAE缓冲液构成的电泳体系中电泳，设电压60V，电泳时间45分钟。

3)CD40L DNA片段纯化回收：采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收。取5μl电泳鉴定质量。电泳图请参照图2B。图2B中的1和2分别是已经纯化和未纯化的CD40L DNA片段的电泳条带，M为标准DNA DL2000。

实施例2人CD40L与pMD-18-T重组克隆载体的建立

1.以pMD-18-T Vector试剂盒，将已纯化的人CD40L与pMD-18T载体连接，pMD-18-T载体的物理图谱如图3所示。

连接反应体系配制：

成分	体积
		pMD-18-T vertor DNA纯化的CD40LDNAddH2O连接反应液	1μl4μl0μl5μl
总体积	10μl

上述反应体系于16℃反应9小时。

2.重组克隆载体转化于DH 5  感受态菌株

-70℃冰箱取DH5感受态细菌100μl于冰浴冰融，将10μl重组克隆载体连接反应产物加入100μl DH5感受态菌液，轻弹、旋转管底混匀，冰水浴放置30分钟。立即置42℃水浴热休克90秒。立即冰浴3分钟。加Amp^--SOC培养液150μl，于37℃恒温摇床，200rpm振荡孵育1小时。取50μl转化菌液涂布于IPTG⁺-X-gal⁺-Amp⁺SOC琼脂平板。待平板菌液完全被吸收，倒置平板，于37℃孵育箱培养16小时。

3.CD40L重组克隆载体的鉴定。

1)DH5 pMD-18-T-CD40L载体阳性菌液PCR检测

在蓝、白斑筛选培养皿中，挑取白色菌落13株，置Amp⁺SOC液体培养基，振荡培养12小时，每支试管取菌液5μl，热裂解后行PCR检测，编号A3、A5、A6三株菌液有拟似CD40L基因表达，如图4所示，A3、A5为其中的二株，所扩增条带位于标准DNA 750-1000bp之间，与T细胞RT-PCR扩增条带大小相符，推测，该条带为本研究所需目的基因。

2)CD40L PCR阳性菌液DNA测序

测序结果如图5所示，测得的序列如SEQ ID NO：4所示，经对比，发现NheI和Kpn I酶切位点序列分别位于SEQ ID NO：4序列的5’端和3’端，SEQ ID NO：2引物序列紧跟位于Nhe I酶切位点后面，SEQ ID NO：3引物序列、T载体上19个碱基和紧随其后的Kpn I的酶切位点序列依次位于SEQ ID NO：4序列的3’端，上述两个引物之间的插入序列与NCBI核酸数据库收录的编号为BC071754 CD40L序列中40至915间基因序列完全相符。

实施例3 pcDNA3.1(+)-CD40L表达载体的建立

1.菌液准备

-20℃冰箱取pcDNA3.1(+)载体与重组pMD-18-CD40L载体冻存转化菌，以接种环各取一环菌，于IPTG⁺-X-gal⁺-Amp⁺SOC固体培养基，划线接种，37℃培养箱孵育16小时。次日分别挑取单个菌落于各含5ml Amp⁺SOC液体培基试管，37℃恒温摇床孵育12小时，得OD值约有0.6菌液。pcDNA3.1(+)载体的物理图谱如图6所示。

2.pcDNA3.1(+)载体、pMD18-T-CD40L载体质粒提取

以质粒提取试剂盒分别提取两转化菌中的质粒并进行琼脂糖电泳。电泳图如图7所示，泳道1表示pMD18-T-CD40L载体质粒，泳道2表示pcDNA3.1(+)载体质粒。

3.pcDNA 3.1(+)载体、pMD18-CD40L载体质粒分别酶切并纯化两质粒双酶切反应体系如下：

pMD18-CD40L载体质粒双酶切

反应步骤	成分	体积	反应时间
				A	Kpn IpMD18-CD40L10×L缓冲液ddH2O	3μl45μl6μl6μl	37℃50分钟
B	Nhe I10×M缓冲液A反应液ddH2O总反应体积	3μl7.5μl60μl4.5μl75μl	37℃5小时

pcDNA3.1(+)载体质粒双酶切

反应步骤	成分	体积	反应时间
				A	Kpn IpcDNA3.1(+)10×L缓冲液ddH2O	2μl25μl4μl9μl	37℃50分钟
B	Nhe I10×M缓冲液A反应液ddH2O	2μl5μl40μl3μl	37℃5小时
				总反应体积	50μl

上述pcDNA3.1(+)载体、pMD18-CD40L载体质粒分别酶切纯化后，进行琼脂糖电泳，电泳图如图8所示，其中1和2分别为pMD18-CD40L载体质粒的双酶切、纯化物的电泳条带，3和4分别为pcDNA 3.1(+)载体质粒的双酶切、纯化物的电泳条带。

4.pcDNA 3.1(+)载体质粒与CD4 0L基因片段连接

连接反应体系：

成分

体积

pcDNA 3.1(+)质粒纯化液CD40LDNA片段纯化液1mM rATP10×缓冲液T4 DNA连接酶ddH2O	2μl13.5μl2ul2ul0.25ul0.25ul
		总体积	20ul

16℃反应16小时

5.pcDNA 3.1(+)载体与CD40L连接产物转化于TOP10感受态细菌

-70℃冰箱取TOP10感受态细菌100μl于冰浴冰融，将10μl pcDNA 3.1(+)与CD40L连接产物加入100μl TOP10感受态菌液，轻弹、旋转管底混匀，冰水浴放置30分钟，立即置42℃水浴热休克90秒，再冰浴3分钟，加Amp^--SOC培养液150μl，置于37℃恒温摇床，以200rpm振荡孵育1小时，取50μl转化菌液分别涂布Amp⁺SOC琼脂平板，待平板菌液完全被吸收，倒置平板，于37℃孵育箱培养16小时。

6.pcDNA 3.1(+)-CD4 0L重组阳性质粒的筛选、鉴定

A、Amp抗性菌落筛选：

上述转化菌液于Amp⁺SOC固体培养进行筛选培养，可见有Amp抗性白色菌落生长。

B、pcDNA3.1(+)-CD40L载体转化菌液CD40L PCR筛选：

取分别挑取41株白色菌落，以吸管吸取Amp⁺SOC培养基5ml，将其冲入相应试管内，消毒棉塞封口。37℃振荡培养12小时，进行菌液质粒的CD40L PCR检测。15株存在CD40L插入片段，图9中所示的为其中的9株，扩增条带位于标准DNA 750至1000之间与插入序列大小相符。

C、pcDNA3.1(+)载体与pcDNA3.1(+)-CD40L载体大小的比较及重组质粒酶切：

分别提取空载pcDNA 3.1(+)与重组载体pcDNA 3.1(+)-CD40L质粒并对重组质粒酶切，电泳结果如图10所示，1，2，3分别是pcDNA 3.1(+)质粒、pcDNA 3.1(+)-CD40L质粒、pcDNA 3.1(+)-CD40L质粒酶切产物的电泳泳道。泳道‘ 2’质粒大于泳道‘1’质粒与设想的结果相符，泳道‘2’重组质粒经双酶切得泳道‘3’可见两个大小不等的DNA片段，其一位于5500bp附近与pcDNA 3.1(+)载体相符，其二略小于1000bp与本研究插入CD40L相符，两条酶切片段与本研究设想结构的大小基本一致。

D、pcDNA3.1(+)-CD40L质粒的DNA序列测定：

测序结果如图11所示，测得的序列如SEQ ID NO：5所示，经对比，SEQ IDNO：2引物序列位于SEQ ID NO：5序列的5’端，SEQ ID NO：3引物序列、T载体上的序列依次位于SEQ ID NO：5序列的3’端，上述两引物之间的插入序列与NCBI核酸数据库收录的编号为BC071754 CD40L序列中40至915间基因序列完全相符。

实施例4  H446细胞株质粒载体转染及CD40L表达的鉴定

1.H446细胞株质粒载体转染：

将1.5×10⁵个H446细胞500μl接种于24孔培养板，培养24小时，当细胞融合至85％-90％，将脂酯体Lipofectamine^TM2000 2ul分别与pcDNA 3.1(+)及pcDNA 3.1(+)-CD40L各1ug混合，混合物100μl加入相应培养孔，转染8小时，更换培养液，继续培养48小时。

2.转染细胞CD40L表达的检测

1)质粒转染细胞的CD40L mRNA转录的检测：

转染细胞总RNA的提取

去除空载与重组转柒细胞培养液，每孔加Tripure 0.5ml，吸管吹打，使细胞脱壁并裂解，将裂解产物移入1.5ml DEPC处理的EP管内，室温放置5分钟。加入0.1ml氯仿/管，剧烈振荡15秒，室温放置15分钟。4℃10000×g离心15分钟，以100μl移液器，小心吸取250ul水相于另一EP管。加入0.25ml异丙醇，混匀，室温放置于10分钟。4℃12000×g离心10分钟，去上清，加75％乙醇0.5ml漂洗沉淀。4℃7500×g离心5分钟，去上清。以电吹风吹离心管，使其乙醇挥发，加20μl/管无RNase水，55-60℃放置10分钟溶解沉淀。溶解后，取空载与重组转染细胞总RNA各5μl与6×上样缓冲液1μl混合，于含1％琼脂糖凝胶的TAE缓冲液构成的电泳体系进行电泳。

CD40L RT-PCR检测：

A、逆转录反应：

成分	体积(空载)	体积(重组)
			MgCl210×RT缓冲液无RNase ddH2OdNTP混合物(各10mM)RNase抑制剂AMV反转录酶Oligo dT-A接头引物空载总RNA重组总RNA	4μl2μl7.5μl2μl0.5μl1.0μl1.0μl2μl	4μl2μl7.5μl2μl0.5μl1.0μl1.0μl2μl
总体积	20μl	20μl

逆转录反应条件：

上述成份混匀后，按上述条件反应。

B、PCR反应，按以下组成配制PCR反应液分为4组

成分	重组-CD40L体积	重组-β-actin体积	空载-CD40L体积	空载-βactin体积
					5×PCR缓液ddH2OTaKaRax TaqTMHS	10μl28.75μl	10μl28.75μl	10μl28.75μl	10μl28.75μl

上游特异物(SEQ IDNO：2)下游特异引物(SEQID NO：3)上游特异引物(人βacti售)下游特异引物(人βacti售)重组A反应液体空载A反应液体	0.25μl0.5μl0.5μl10μl	0.25μl0.5μl0.5μl10μl	0.25μl0.5μl0.5μl10μl	0.25μl0.5μl0.5μl10μl
					总体积	50μl	50μl	50μl	50μl

反应条件：

脂质体Lipofectamine^TM2000分别介导pcDNA3.1(+)与pcDNA3.1(+)-CD40L转染肺小细胞肺癌细胞株H446，转染后48小时，PR-PCR法分别对两种载体转染的H446细胞进行CD40L mRNA转录表达的检测，结果如图12所示，重组pcDNA 3.1(+)-CD40L转染细胞有CD40L mRNA的表达；空载pcDNA3.1(+)转染细胞无CD40L mRNA的表达。

2)H446重组体转染后流式细胞仪测试CD40L表达率

PE标记CD40L单抗对转染细胞染色，流式细胞仪检测PE标记CD40L单抗与转染细胞结合的百分率。设双复管，空载转染细胞结合率分别为3.7％、2.8％，如图13A所示，考虑为非特异结合，重组载体转染细胞结合率分别为72.42％、63.69％如图13B所示。重组转染细胞被被染色后，于萤光显微镜可见抗CD40L与胞膜上CD40L结合后形成的环形红色萤光标记，如图14所示。说明重组pcDNA 3.1(+)-CD40L表达载体通过脂质体介导，顺利转染于H446细胞，并且该载体在H446细胞能正常执行功能，使CD40L得到有效地转录、翻译与表达。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

序列表

<110>田坤

<120>人CD40L表达体系及其制备方法

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>876

<212>DNA

<213>CD40L目的基因序列

<400>1

tgccagaaga taccatttca actttaacac agcatgatcg aaacatacaa ccaaacttct      60

ccccgatctg cggccactgg actgcccatc agcatgaaaa tttttatgta tttacttact     120

gtttttctta tcacccagat gattgggtca gcactttttg ctgtgtatct tcatagaagg     180

ttggacaaga tagaagatga aaggaatctt catgaagatt ttgtattcat gaaaacgata     240

cagagatgca acacaggaga aagatcctta tccttactga actgtgagga gattaaaagc     300

cagtttgaag gctttgtgaa ggatataatg ttaaacaaag aggagacgaa gaaagaaaac     360

agctttgaaa tgcaaaaagg tgatcagaat cctcaaattg cggcacatgt cataagtgag     420

gccagcagta aaacaacatc tgtgttacag tgggctgaaa aaggatacta caccatgagc     480

aacaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgaccg ttaaaagaca aggactctat     540

tatatctatg cccaagtcac cttctgttcc aatcgggaag cttcgagtca agctccattt     600

atagccagcc tctgcctaaa gtcccccggt agattcgaga gaatcttact cagagctgca     660

aatacccaca gttccgccaa accttgcggg caacaatcca ttcacttggg aggagtattt     720

gaattgcaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat     780

ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctgaa cagtgtcacc ttgcaggctg     840

tggtggagct gacgctggga gtcttcataa tacagc                               876

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成的扩增CD40L目的基因的上游引物

<400>2

gctagctgccagaaga taccattt                                             18

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成的扩增CD40L目的基因的下游引物

<400>3

gctgtattat gaagactccc                                                 20

<210>4

<211>907

<212>DNA

<213>pMD-18-CD40L转化阳性菌插入CD40L DNA测序序列(含有酶切位点)

<400>4

gctagctgcc agaagatacc atttcaactt taacacagca tgatcgaaac atacaaccaa      60

acttctcccc gatctgcggc cactggactg cccatcagca tgaaaatttt tatgtattta     120

cttactgttt ttcttatcac ccagatgatt gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcat     180

agaaggttgg acaagataga agatgaaagg aatcttcatg aagattttgt attcatgaaa     240

acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga tccttatcct tactgaactg tgaggagatt     300

aaaagccagt ttgaaggctt tgtgaaggat ataatgttaa acaaagagga gacgaagaaa     360

gaaaacagct ttgaaatgca aaaaggtgat cagaatcctc aaattgcggc acatgtcata     420

agtgaggcca gcagtaaaac aacatctgtg ttacagtggg ctgaaaaagg atactacacc     480

atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat gggaaacagc tgaccgttaa aagacaagga     540

ctctattata tctatgccca agtcaccttc tgttccaatc gggaagcttc gagtcaagct     600

ccatttatag ccagcctctg cctaaagtcc cccggtagat tcgagagaat cttactcaga     660

gctgcaaata cccacagttc cgccaaacct tgcgggcaac aatccattca cttgggagga     720

gtatttgaat tgcaaccagg tgcttcggtg tttgtcaatg tgactgatcc aagccaagtg     780

agccatggca ctggcttcac gtcctttggc ttactcaaac tctgaacagt gtcaccttgc     840

aggctgtggt ggagctgacg ctgggagtct tcataataca gcaatctcta gaggatcccc     900

gggtacc                                                               907

<210>5

<211>895

<212>DNA

<213>pcDNA3.1(+)-CD40L质粒转化阳性菌插入CD40L测序序列(不含酶切位点)

<400>5

tgccagaaga taccatttca actttaacac agcatgatcg aaacatacaa ccaaacttct      60

ccccgatctg cggccactgg actgcccatc agcatgaaaa tttttatgta tttacttact     120

gtttttctta tcacccagat gattgggtca gcactttttg ctgtgtatct tcatagaagg     180

ttggacaaga tagaagatga aaggaatctt catgaagatt ttgtattcat gaaaacgata     240

cagagatgca acacaggaga aagatcctta tccttactga actgtgagga gattaaaagc     300

cagtttgaag gctttgtgaa ggatataatg ttaaacaaag aggagacgaa gaaagaaaac     360

agctttgaaa tgcaaaaagg tgatcagaat cctcaaattg cggcacatgt cataagtgag     420

gccagcagta aaacaacatc tgtgttacag tgggctgaaa aaggatacta caccatgagc     480

aacaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgaccg ttaaaagaca aggactctat     540

tatatctatg cccaagtcac cttctgttcc aatcgggaag cttcgagtca agctccattt     600

atagccagcc tctgcctaaa gtcccccggt agattcgaga gaatcttact cagagctgca     660

aatacccaca gttccgccaa accttgcggg caacaatcca ttcacttggg aggagtattt     720

gaattgcaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat     780

ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctgaa cagtgtcacc ttgcaggctg     840

tggtggagct gacgctggga gtcttcataa tacagcaatc tctagaggat ccccg          895

Claims (10)

1.一种人CD40L表达体系，其特征在于该体系：

含真核启动子的表达载体；

编码SEQ ID NO：1特异性人CD40L目的基因片段；

所述表达载体在多克隆位点与CD40L目的基因片段重组。

2.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于所述的CD40L目的基因片段SEQID NO：1的序列是NCBI核酸数据库收录的编号为BC071754 CD40L序列中所载取的40至915间基因序列。

3.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于所述的表达载体含CMV和SV40真核启动子。

4.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于所述的表达载体在多克隆位点具有Nhe I和Kpn I酶切位点。

5.根据权利要求1，3或4所述的表达体系，其特征在于所述的表达载体为pcDNA3.1(+)载体除去多克隆位点Nhe I与Kpn I之间16个碱基的载体部分。

6.根据权利要求1所述的表达体系，其特征在于所述的CD40L目的基因片段是由人激活态T淋巴细胞中获取。

7.一种制备权利要求1所述的人CD40L表达体系的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)CD40L目的基因的克隆；

(2)CD40L目的基因与pMD-18-T载体的重组克隆载体的构建；

(3)pMD18-T-CD40L重组克隆载体的鉴定与纯化；

(4)CD40L-表达载体的构建；

(5)CD40L-表达载体重组阳性质粒的鉴定与纯化；

(6)CD40L-表达载体重组阳性质粒转染靶细胞株；

(7)靶细胞株中CD40L目的基因表达的检测。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于CD40L目的基因的克隆引物为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述的SEQ ID NO：2所示序列的5’末端和pMD18-T载体分别设有酶切位点Nhe I和Kpn I。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的CD40L-表达载体中的表达载体为pcDNA3.1(+)载体除去多克隆位点Nhe I与Kpn I之间16个碱基的载体部分。

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